KR101485840B1 - 마우스 인공염색체 벡터 - Google Patents

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야스히로 카즈키
마사토 타키구치
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도쿠리츠 다이가쿠 호우진 돗토리 다이가쿠
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Abstract

본 발명은 마우스 염색체 유래의 천연형 중심체 (cetromere), 중심체 근방의 마우스 염색체 장완 부위로부터 장완 원위 삭제한 마우스 염색체 유래의 장완 단편 및 텔로미어 서열을 포함하는 것, 및 포유류의 세포 및 개체 조직에서 안정적으로 보유되는 것을 특징으로 하는 마우스 인공 염색체 벡터, 상기 벡터를 보유하는 세포 또는 비인간 동물, 및 상기 세포 또는 비인간 동물의 사용에 관한 것이다.

Description

마우스 인공염색체 벡터{Mouse artificial chromosome vector}
본 발명은 설치류 체내에서 안정적으로 보유되며, 후손으로 전달가능한 마우스 인공염색체 벡터에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 마우스 인공염색체 벡터를 보유하는 세포에 관한 것이다.
아울러, 본 발명은, 상기 마우스 인공염색체 벡터를 보유하는, 마우스 등의 비인간 동물에 관한 것이다.
유전자도입 마우스는 유전자탑재 벡터를 도입함으로써 목적유전자와 발현 산물을 이용하기 위해서 널리 사용되고 있다. 그렇지만, 지금까지 유전자도입 마우스에서, 유전자가 도입되는 부위가 랜덤이며, 도입된 위치 효과에 의해 도입 유전자의 발현이 억제될 수 있으며, 또한 종래의 유전자도입법에서는 복제수를 제어를 할 수 없고, 사이즈도 200 kb정도가 한도이다. 이러한 이유로, 포유 동물의 유전자로서는 드물지 않은 200 kb를 넘는 크기의 유전자나 유전자 클러스터는 제어 영역을 포함하여 벡터에 클로닝하는 것이 어려웠다. 따라서, 종래의 유전자도입법에서는, 도입 유전자 본래의 기능을 재현 및 검증할 수 없는 한계를 가지고 있었다. 이러한 문제가 존재하는 가운데에서, 본 발명자들은 염색체 수준에서 유전자도입이라는 새로운 염색체도입법을 이용한 염색체도입 마우스의 제작 기술로 개발하였다(비특허문헌 1). 상기 기술에 의해 인간 염색체 또는 그 단편을 마우스 배아줄기(ES)세포에 도입해 키메라 마우스를 제작하였으며, 인간 염색체 단편이 독립적으로 보유되고, 복수의 인간 유전자가 조직 특이적으로 발현되며, 세포의 감소 분열을 통해 단편적으로 자손 전달가능한 인간 염색체가 존재하는 것을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은, 인간 21번 염색체 전장(약 35 Mb)을 마우스에 도입하고, 실용적으로도 가치가 높은 다운증후군(Down's syndrome) 모델 마우스를 제작하였다(비특허문헌 2). 상기 마우스를 분석한 결과, 도입된 인간 21번 염색체상의 유전자는 생리적인 발현 양상을 재현함으로써 염색체 벡터의 효과를 확인하였다.
또한, 본 발명자들은, 염색체 공학기법인 인공 텔로미어 서열을 사용한 텔로미어 절단 기술에 의한 염색체 삭제 및, Cre/loxP 시스템에 의한 염색체 클로닝(cloning)을 이용하여 원하는 영역만을 포함하는 인간 인공 염색체의 구축을 가능하게 하고, 그 결과, 메가베이스(Mb) 사이즈의 특정 인간 염색체영역을 포함하는 인간 인공염색체(HAC, Human Artificial Chromosme)벡터의 구축에 성공하고, 상기 벡터가 마우스 개체에서도 기능 하는 것을 확인하였다(비특허문헌 3). 또한, 상기 기술을 응용해서 알려진 유전자를 포함하지 않는 새로운 HAC벡터를 구축하였다(비특허문헌 4). 또한, 본 발명자들은 상기 배경에 기초를 두고, 목적유전자를 탑재한 HAC 벡터를 모든 세포에 도입하고, 목적유전자의 안정적 발현에 성공하고 있다. 또한, HAC 벡터의 인간형 모델 마우스에서의 적용예로는, 인간 7번 염색체상의 약물대사효소 CYP3A 유전자 클러스터(1Mb)와 인간 X 연쇄형 근위축증의 원인 유전자인 인간 DMD 유전자(2.5Mb)를 각각 HAC 벡터에 클로닝(CYP3A-HAC, DMD-HAC)하여, 마우스 ES 세포에 도입해서 마우스를 제작하였다(특허문헌 1 및 비특허문헌 5).
CYP3A-HAC를 도입한 마우스의 조직 보유 비율과 발현 분석으로부터, HAC 상의 CYP3A 유전자 클러스터는 마우스의 각각의 조직에서 보유되고 있으며(특허문헌 1의 그림 8), 그 발현 양상은 인간 조직에서의 패턴과 동일하게, 간장, 소장 특이적이었다. 또한, DMD-HAC 도입 마우스의 조직 보유 비율과 발현 분석으로부터, 마우스의 각각의 조직에서 DMD-HAC가 보유되는 것을 확인하였으며(비특허문헌 5의 도 4A), 인간에서 조직 특이적 발현한다고 알려져 있는 스플라이징 아이소폼(splicing isoform) 중 적어도 3종이 인간과 동일하게 발현되는 것이 확인되었다. 이러한 일련의 결과를 통해, 종래의 유전자도입 마우스를 대신하는 새로운 유전자(군)도입 방법으로서 HAC 도입 마우스의 유용성이 시사되었다.
인간 인공염색체를 포함하는 포유류 인공염색체 벡터는 종래의 벡터계(바이러스, YAC, BAC, PAC, 코스미드(cosmid), 플라스미드(plasmid))에는 없는 장점을 가지고 있기 때문에, 새로운 유전자의 기능을 분석하거나, 인간형 모델 동물의 제작에 유용하게 사용되는 것이 기대되고 있다. 예를 들면, 특허문헌 2 및 3에서는, 인간 14번 염색체와 인간 21번 염색체를 수정하고, 그 사이즈를 축소한 염색체의 단편으로 구성된 세포에서 비교적 안정하게 보유되는 HAC 벡터가 공개되고 있다.
그러나 종래의 유전자 조작 마우스에서는 불가능한 Mb 단위의 유전자도입을 가능하게 한 인간 21번 염색체도입 마우스(다운증후군(Down's syndrome) 모델 마우스)이나 HAC 벡터 도입 마우스에서는 이러한 인간 염색체 벡터의 보유 비율의 저하, 조직 간이나 개체간에 차이가 생기는 것, 자손 전달의 빈도의 불안전 등의 문제가 존재한다. 따라서, HAC 벡터와 같은 보유 비율을 항상 고려할 필요가 있고, 또한, 특정한 유전자영역이 가지는 기능이나 질환과의 관계에 대해서 연구할 경우, 목적유전자의 발현 상태나 발현 산물을 조직 세포 수준으로 상세 동시에 정확하게 해석하는 것이 어려울 경우도 있어, 재현성이 높은 균일적인 해석의 장해가 된다.
그리고 또한, 마우스 세포와 인간 세포를 세포 융합할 때, 마우스 세포 내에서는 인간 염색체는 불안정한 것이 알려져 있다. 이처럼, 인간 인공염색체 벡터를 포함하는 인간 염색체는 마우스 세포 내에서는 보유 비율이 일정하지 않기 때문에, 인간 인공염색체 벡터를 마우스 세포에 도입할 경우, 및 유전자도입 마우스를 제작할 경우에 있어서, 인공염색체 벡터로서의 이점을 충분히 발휘되지 않고 않다. 유전자도입 마우스 세포 또는 유전자도입 마우스를 제작하는데 있어서, 앞으로는 도입 유전자의 보유 비율을 향상 및 일정하게 함으로써, 보다 상세하고 정확하며 재현성이 높은 유전자기능의 해석 또는 유전자발현 산물의 효율적인 회수를 가능하게 한다.
선행 기술문헌
특허 문헌
특허문헌 1 국제공개 WO 2009 / 063722 호 전단
특허 문헌 2 국제공개 WO 2004 / 031385 호 전단
특허 문헌 3 특개 2007-295860 호 공보
비특허문헌
비특허문헌 1 Tomizuka et al, Nat Genet, 16:133-143, 1997
비특허문헌 2 Shinohara et al, HMG, 10:1163-75, 2001
비특허문헌 3 Kuroiwa et al, Nat Biotech, 18:1086-1090, 2000
비특허문헌 4 Katoh et al, BBRC, 321:280-290, 2000
비특허문헌 5 Hoshiya et al, Mol Ther, 17:309-17,2009
지금까지 보고된 포유류 인공염색체의 대부분이 인간 인공염색체(특개 2005-230020; 특개 2008-54501; 특개 2007-306928; 특개 2007-295860)이지만, 마우스 인공염색체에 관한 보고도 지극히 조금이지만 존재하고, 상기 인공염색체에서는 센트로미어(Centromere)의 일부의 서열을 이용하는 것을 특징으로 하고 있다(S. Stewart et al. (2002) Gene Therapy 9:719-723).
천연의 인간 염색체 단편을 마우스 세포에 도입하면, 상기 상술한데로, 인간 염색체 단편은 마우스 세포 내에서 불안정하다(예를 들면, Shinohara et al. (2000) Chromosome Research, 8:713-725). 이것은 마우스 개체 내에서도 동일하게, 마우스 각 조직에 있어서 인간 인공염색체는 불안정해서, 마우스 조직 세포에서 보유되고 있는 인간 인공염색체의 비율(보유율)이 저하되는 경향에 있어, 마우스 조직 세포의 보유율이 일정하지 않다. 또는, 마우스 개체간에 있어서도 동일하게, 마우스 개체간에서의 인간 인공염색체의 보유율이 일정하지 않게 된다. 이러한 마우스 조직 간이나 개체간에서의 불균일한 보유율로 의해, 인간 인공염색체에 의해 목적유전자(군)를 도입한 마우스 세포 또는 마우스 개체를 사용하여 도입 유전자의 상세하고 정확하며 재현성이 높은 해석을 하는 것이 곤란하다.
마우스를 포함한 설치류 유래의 인공염색체에 대해서는 상기와 같이 관련된 보고는 대단히 적은 동시에, 설치류 세포내 또는 개체 내에서 안정하게 보유되는 인공염색체는 존재하지 않는다. 본 발명의 목적은, 도입되는 목적유전자(군)가 설치류 세포내 또는 설치류 개체 내에서 안정하게 보유되어, 이를 통해 상세하고 정확하며 재현성이 높은 해석을 가능하게 하는 마우스 인공염색체 벡터를 제공하는 것에 있다.
본 발명은 요약하면 하기와 같은 특징을 포함한다.
(1) 마우스 염색체 유래의 천연형 센트로미어(Centromere), 센트로미어 근방의 마우스 염색체 장완의 부위로부터 장완원위를 제거한 마우스 염색체 유래의 장완 단편, 텔로미어(telomere) 서열을 포함 및 포유류의 세포 및 조직에 있어서 안정하게 보유되는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(2) 마우스 염색체가 1∼19번 염색체 중 하나인, 상기(1)에 기재된 마우스 인공염색체 벡터.
(3) 마우스 염색체 유래의 장완 단편이, 마우스 1∼19번 염색체 중 하나의 장완에서 그 모든 내재성 유전자 수의 적어도 99.5%가 삭제되고 남은 부분으로 이루어진, 상기 (1) 또는 (2)에 기재된 마우스 인공염색체 벡터.
(4) 기탁 세포주 DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)에 포함된 마우스 인공염색체를 기본구조로 포함하는, 상기 (1)∼ (3) 중 하나로 기재된 마우스 인공염색체 벡터.
(5) 포유류가 설치류인, 상기 (1)∼ (4) 중 하나로 기재된 마우스 인공염색체 벡터.
(6) 설치류가 마우스, 래트 또는 햄스터인, 상기 (5)로 기재된 마우스 인공염색체 벡터.
(7) 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 1개 이상의 DNA 서열 삽입 부위를 추가적으로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
(8) 상기 (7)에 있어서, DNA 서열 삽입 부위는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위인 것을 특징으로 하는 마우스 인공 염색체 벡터.
(9) 상기 (7) 또는 (8) 있어서, DNA 서열 삽입 부위는 loxP 서열, FRT 서열, ΦC31 attB 및 ΦC31 attP 서열, R4 attB 및 R4 attP 서열, TP9011 attB 및 TP9011 attP서열, 또는 Bxb1 attB 및 Bxb1 attP 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 리포터 유전자, 선택 마커 유전자 또는 둘 모두를 추가적으로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 외래 DNA 서열을 추가적으로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
(12) 상기 (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 외래 DNA 서열의 사이즈가 200kb이상인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(13) 상기 (11) 또는 (12)에 있어서, 외래 DNA 서열이 인간 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(14) 상기 (11) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 외래 DNA 서열이, 약물대사 관련 유전자의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(15) 상기 (14)에 있어서, 약물대사 관련 유전자는 제1상 반응 또는 제2상 반응에 영향을 미치는 효소를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(16) 상기 (15)에 있어서, 제1상 반응에 영향을 미치는 효소는, CYP1A, CYP1B, CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP2J, CYP3A, CYP4A, CYP4B, 및 이의 서브 패밀리 CYP 및 CES로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(17) 상기 (15)에 있어서, 제2상 반응에 영향을 미치는 효소는, UGT1 및 UGT2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(18) 상기 (14)에 있어서, 약물대사 관련 유전자는 트렌스포터(Transporter)를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(19) 상기 (18)에 있어서, 트랜스 포터를 코딩하는 유전자는 MDR1, MDR2, MRP2, OAT, OATP, OCT 및 BCRP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(20) 상기 (14)에 있어서, 약물대사 관련 유전자는 핵내 수용체를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(21) 상기 (20)에 있어서, 핵내 수용체를 코딩하는 유전자는 PXR, AhR, CAR 및 PPARα로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(22) 상기 (11) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 외래 DNA 서열은 인간 염색체의 장완 또는 단완의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(23) 상기 (11) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 외래 DNA 서열은 제1상 반응에 영향을 미치는 효소를 코딩하는 유전자, 제2상에 관계되는 효소를 코딩하는 유전자, 트랜스포터를 코딩하는 유전자 및 핵내 수용체를 코딩하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 유전자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(24) 상기 (22)에 있어서, 인간 염색체는 질병 유전자의 원인 영역을 포함하는 인간 염색체의 장완 또는 단완의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(25) 상기 (11) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, 외래DNA 서열이, 사이트카인류, 호르몬류, 성장인자류, 영양인자류, 조혈인자류, 혈액응고·용해인자류, 면역글로불린류, G 단백질결합수용체류, 효소류 등의 폴리펩티드류를 코딩하는 유전자 또는 DNA의 서열, 또는 종양, 근위축증, 혈우병, 신경퇴행성 질환, 자기면역질환, 알레르기성 질환, 유전성 질환 등의 질환에 관련되는 치료용 유전자 또는 DNA의 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(26) 상기 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 세포는 간세포, 장세포, 신장세포, 비장세포, 폐세포, 심장세포, 골격근세포, 뇌세포, 골수세포, 림프구세포, 거대핵세포, 정자 또는 난자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(27) 상기 (1) 내지 (25) 중 어느 하나에 있어서, 조직은 간장, 장, 신장, 비장, 폐, 심장, 골격 근육, 뇌, 골수, 고환 또는 난소 유래의 조직인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
(28) 상기 (1) 내지 (27) 중 어느 하나에 기재된 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포.
(29) 상기 (28)에 있어서, 세포는 체세포, 비인간 생식 계열세포, 줄기세포 및 전구 세포로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포.
(30) 상기 (29)에 있어서, 줄기세포는 배아줄기(ES)세포 또는 인공 다능줄기(iPS)세포인 것을 특징으로 하는 세포.
(31) 상기 (28) 내지 (30) 중 어느 하나에 있어서, 세포는 초대배양 세포, 계대 세포 또는 주화세포인 것을 특징으로 하는 세포.
(32) 상기 (28) 내지 (32) 중 어느 하나에 있어서, 세포는 인간 항체 생산이 가능한 것을 특징으로 하는 세포.
(33) 질환치료용 외래 DNA 서열을 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 상기 (28) 내지 (32) 중 어느 하나의 세포를 포함하는 의약조성물.
(34) 상기 (1) 내지 (27) 중 어느 하나에 있어서, 마우스 인공염색체 벡터를 보유하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
(35) 상기 (34)에 있어서, 비인간 동물은 질환 모델 동물인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
(36) 상기 (34)에 있어서, 비인간 동물은 외래 인간 약물 대사 관련 유전자를 발현하는 동물인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
(37) 상기 (34)에 있어서, 비인간 동물은 인간 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
(38) 상기 (34) 내지 (37) 중 어느 하나에 있어서, 마우스 인공염색체 벡터에 포함되는 외래 DNA에 대응하는 내재 유전자가 파괴되고 또는 내재 유전자의 발현이 저하되고 있는 비인간 동물.
(39) 외래 DNA 서열을 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 상기 (28) 내지 (32) 중 어느 하나의 세포를 배양하여 생산된 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 회수하는 것을 포함하는 단백질의 생산 방법.
(40) 인간 항체 유전자를 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 상기 (37) 또는 (38)의 비인간 동물을 이용해서 인간 항체를 생산하고, 상기 인간 항체를 회수하는 것을 포함하는 인간 항체의 제조 방법.
(41) 질환 모델 동물인 상기 (35)의 비인간 동물에게 후보약제를 투여하고, 상기 약제의 치료 효과를 평가하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는데도 유효한 물질을 스크리닝하는 방법.
(42) 인간 약물 대사 관련 유전자를 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 상기 (36) 또는 (38)의 비인간 동물 또는 상기 동물 유래의 세포, 기관 또는 조직에, 약물 또는 식품을 투여하고, 상기 약물 또는 식품의 약리작용 및/또는 대사 및/또는 독성을 측정하는 것을 포함하는, 약물 또는 식품의 약리작용 및/또는 대사 및/또는 독성의 시험 방법.
(43) 인간 약물 대사 관련 유전자를 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 상기 (36) 또는 (38)의 비인간 동물로부터 얻을 수 있었던 마이크로좀(microsome) 또는 마이크로좀 S9 분획을, 배양 세포 또는 세균과, 약물 및/또는 식품과 함께 배양하고, 약물 또는 식품이 상기 세포 또는 세균에게 끼치는 영향을 측정하는 것을 포함하는, 약물 또는 식품의 독성의 시험 방법.
(44) 상기 (1) 내지 (27) 중 어느 하나의 마우스 인공 염색체 벡터를 사용하고, 200 kb이상의 큰 사이즈의 외래 DNA를 설치류 세포 또는 설치류 개체 내에서 90% 이상의 보유비율로 안정하게 보유시키는 것을 포함하는, 세포 또는 개체 내에서의 큰 사이즈 DNA의 안정화 방법.
본 발명에 DNA 서열 삽입 부위를 가지는 마우스 인공염색체 벡터는, 목적유전자(군)를 설치류 세포내 또는 설치류 개체 내에 도입할 경우에, 종래 곤란했던 모든 세포 또는 조직에 있어서, 목적유전자(군)를 안정하게 또한 동일한 보유비율로 보유시키는 것이 가능해지고, 또한 목적으로 하는 외래의 DNA 서열이나 유전자를 함께 리포터 유전자를 삽입할 수 있으므로 벡터 도입 세포를 가시화할 수 있고, 상세하고, 정확하게 재현성이 높은 분석 또는 발현 산물의 효율적인 회수를 가능하게 한다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원 2010-1425호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 실시예 1 및 2 단계의 모식도를 나타낸다. 도면에 있어서, 세포 이름은 다음 형식으로 나타낸다. 세포명(세포내 유전자조작; 보유염색체 단편 이름, 도입 유전자-보유 염색체 이름). 도면에 있어서, 기호 등은 다음과 같다. BSr :블라스티시딘(Blasticidin)(BS) 내성유전자, puro: 퓨로마이신(Puromycin) 내성유전자, 인공 텔로미어(Telomere): 인공텔로미어(TTAGGG) 반복 서열, EGFP: 녹색 형광 단백질 발현 유전자, neo: 네오마이신(neomycin)(G418) 내성유전자, loxP: 부위 특이적 DNA서열 삽입 부위, 3'HPRT: HPRT 유전자의 3번째에서 9번째까지의 엑손(Exon) 서열.
도 2는 실시예 3 단계의 모식도를 나타낸다. 도면에 있어서, 세포이름은 다음 형식으로 나타낸다. 세포명(세포내 유전자조작; 보유염색체 단편 이름, 도입 유전자-보유 염색체 이름). 도면에 있어서, 기호 등은 다음과 같다. hChr7: 인간 7번 염색체, CYP3A 클러스터(cluster): 인간 CYP3A 유전자 클러스터, 5'HPRT: HPRT유전자의 1번째와 2번째의(exon)서열, loxP: 부위 특이적 DNA 서열 삽입 부위, hyg:히그로마이신(hygromycin) 내성유전자, hisD: 히스티놀(Histidinol) 내성유전자, 인공 텔로미어: 인공 텔로미어 (TTAGGG)반복 서열, EGFP: 녹색 형광 단백질 발현 유전자, neo: 네오마이신(neomycin)(G418) 내성유전자, 3'HPRT: HPRT 유전자의 3번째로부터 9번째까지의(exon) 서열, puro: 퓨로마이신(Puromycin) 내성유전자.
도 3은 실시예 4 단계의 모식도를 나타낸다. 도면에 있어서, 세포이름은 다음 형식으로 나타낸다. 세포 이름(세포내 유전자조작; 보유 염색체 단편 이름, 도입 유전자 - 보유 염색체 이름). 도면에 있어서, 기호 등은 다음과 같다. puro: 퓨로마이신 내성 유전자, 인공 텔로미어: 인공 텔로미어(TTAGGG) 반복 서열 5'HPRT: HPRT 유전자의 첫 번째 및 두 번째 엑손(exon) 서열, hyg: 히그로 마이신 내성 유전자, loxP: 부위 특이적 DNA 서열 삽입 부위.
도 4는 실시예 5 단계의 모식도를 나타낸다. 도면에 있어서, 세포이름은 다음 형식으로 나타낸다. 세포 이름(세포내 유전자 조작; 보유 염색체 단편 이름, 도입 유전자 - 보유 염색체 이름). 도면에 있어서, 기호 등은 다음과 같다. puro: 퓨로마이신 내성 유전자, 인공 텔로미어: 인공 텔로미어(TTAGGG) 반복 서열, neo: 네오 마이신(G418) 내성 유전자, loxP: 부위 특이적 DNA 서열 삽입 부위, 3'HPRT: HPRT 유전자의 3 번째에서 9 번째까지 엑손(exon) 서열.
도 5는 실시예 6 단계의 모식도를 나타낸다. 도면에 있어서, 세포이름은 다음 형식으로 나타낸다. 세포 이름(세포내 유전자 조작; 보유 염색체 단편 이름, 도입 유전자 - 보유 염색체 이름). 도면에 있어서, 기호 등은 다음과 같다. neo: 네오 마이신(G418) 내성 유전자, loxP: 부위 특이적 DNA 서열 삽입 부위, 3'HPRT: HPRT 유전자의 3 번째에서 9 번째까지 엑손 서열, puro: 퓨로마이신 내성 유전자, 인공 텔로미어: 인공 텔로미어(TTAGGG) 반복 서열, EGFP: 녹색 형광 단백질 발현 유전자, 5'HPRT: HPRT 유전자의 첫 번째 및 두 번째 엑손 서열.
도 6은 마우스 A9 세포(mouse A9(neo))(왼쪽) 및, 마우스 A9 세포 및 마우스 섬유아 세포(mouse embryonic fibroblast(mChr11-BSr))의 세포 융합 클론(mouse A9xmouse embryonic fibroblast hybrid (neo; mChr11-BSr))를 나타낸다.
도 7은 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 했을때, DT40(mChr11-Bsr) 클론의 FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 8은 닭 DT40 세포 내에 도입된 마우스 염색체(mChr11-BSr)가 마우스 11 번 염색체임을 나타내는 SKY FISH 분석 결과(왼쪽), 및, SKY FISH 염색 상(오른쪽)을 나타낸다.
도 9는 마우스 11 번 염색체의 AL671968 영역에서 텔로미어 절단용 벡터, 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 한 마우스 11 번 염색체 대립 유전자(allele) 부분 구조를 나타낸다.
도 10은 pBS-TEL/puro_MAC 벡터를 사용하여 마우스 11번 염색체 영역 AL671968에서 텔로미어가 절단된 마우스 인공 염색체 MAC의 대립 유전자(allele)를 포함하는 DT40 (MAC) DT40 (B6bT -1)] 클론의 mono-color FISH 분석 결과(오른쪽)를 나타낸다. 왼쪽의 DT40(mChr11-BSr)는 텔로미어를 절단 전인 DT40(mChr11-BSr) 클론을 나타낸다.
도 11은 GFP-neo-loxP-3'HPRT 유형 loxP 타겟팅 벡터(pMAC1), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 한 마우스 인공 염색체 MAC의 대립 유전자(allele) 부분 구조를 나타낸다.
도 12는 마우스 Cot-1 DNA 및 GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 카세트를 프로브로 한 때 DT40(MAC1) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 13은 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때, CHO(HPRT-; MAC1) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 14는 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 했을때 mouse ES(MAC1) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 15는 인간 7 염색체상의 CYP3A 유전자좌의 매우 근방인 중심체(cetromere) 쪽(약 300 Kb 센토로메아 쪽)에 위치하고 AC004922 영역에 loxP를 삽입하는 타겟팅 벡터(pMPloxPHyg), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합이 수행된 사람 7 번 염색체 대립 유전자(allele)의 부분 구조를 나타낸다(도 15a). 또한, 도 15b는 선형화된 상기 벡터로 형질전환한 사람 7 번 염색체 단편을 보유한 DT40 세포 클론의 히그로마이신(hygromycin) 내성 주에 대한 서던 하이브리다이제이션 (Southern hybridization)의 상동 재조합체의 분석 결과를 나타낸다. 도 15b의 화살촉에 있어서, 위의 화살 촉은 비상동 재조합(약 10.9 kb)을 나타내고, 아래 화살촉은 상동 재조합(약 8.9 kb)을 나타낸다.
도 16은 인간 7 염색체상 CYP3A 유전자좌의 매우 가까운 텔로미어 측(약 150 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AC073842 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하는 타겟팅 벡터(pTELhisD-PT), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 수행한 사람 7 번 염색체 대립 유전자(allele)의 부분 구조를 나타낸다.
도 17은 마우스 Cot-1 DNA와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로한 때 CHO(HPRT-, MAC1 + hChr7-loxP-tel) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 18은 인간 CYP3A 유전자 클러스터 영역 주변(AC004922-인간 CYP3A 유전자 클러스터-AC073842)의 약 1 Mb를 MAC1에 전좌 클로닝 마우스 인공 염색체 CYP3A-MAC의 구축을 나타낸다.
도 19는 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 Cot-1DNA을 프로브로한 때 CHO(CYP3A-MAC, hChr7-△CYP3A) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 20은 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2를 구축하기 위한 타겟팅 벡터 (pMAC2), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 한 마우스 인공 염색체 MAC의 대립 유전자(allele)의 부분 구조를 나타낸다.
도 21은 마우스 Cot-1DNA 및 5'HPRT-loxP-PGK hygro 카세트를 프로브로 한 때 DT40(MAC2) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 22는 마우스 Cot-1DNA 및 5'HPRT-loxP-PGK hygro 카세트를 프로브로 한 때 CHO(HPRT-; MAC2) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 23은 마우스 minor satellite DNA를 프로브로했을 때 mouse ES(HPRT-, MAC2) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 24는 PGKneo-loxP-3'HPRT 유형 loxP 타겟팅 벡터(pMAC3), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 한 마우스 인공 염색체 MAC3의 대립 유전자(allele)의 부분 구조를 나타낸다.
도 25는 마우스 Cot-1DNA 및 mouse minor satellite DNA를 프로브로 한 때 DT40(MAC3) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 26은 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때 CHO(HPRT-; MAC3) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 27은 마우스 minor satellite DNA를 프로브로한 때 약제 내성 클론 B6 (HPRT-; MAC3)의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 28은 B6(HPRT-; MAC3) 클론의 장기 배양의 보유 비율 분석 결과를 나타낸다. 실선은 B6(HPRT-: MAC3)-3, 점선은 B6(HPRT-: MAC3)-s6의 MAC 벡터 보유 비율을 각각 나타낸다.
도 29는 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3 특정 유전자(예를 들면 GFP)를 Cre-loxP 법으로 부위 특이적 유전자 삽입하는 방법을 설명, GFP 삽입을 위한 벡터, 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 수행한 마우스 11 번 염색체 대립 유전자 (allele)의 부분 구조를 나타낸다.
도 30은 마우스 Cot-1DNA 및 X6.1EGFP를 프로브로 할 때 마우스 인공 염색체 GFP-MAC을 보유하는 CHO인 CHO(GFP-MAC) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 31은 mouse minor satellite DNA 및 GFP를 프로브로 할 때 마우스 ES 세포(B6-ES 주) 중의 마우스 인공 염색체 GFP-MAC의 장기 배양 후 FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 32는 B6(GFP-MAC) 클론의 장기 배양의 보유 비율 분석 결과를 나타낸다. 다이아몬드는 약제를 선택한 장기 배양, 사각형은 약제를 선택하지 않은 장기 배양의 보유 비율을 각각 나타낸다.
도 33은 마우스 인공 염색체 벡터(GFP-MAC) 보유 키메라 마우스에서 태어난 자손 전달 개체를 나타낸다.
도 34는 장기 배양 후(25 PDL)의 CHO 세포에 있어서의 21HAC1, 또는 21HAC2 및 MAC1의 보유 비율을 나타낸다.
도 35는 장기 배양 후(75 PDL)의 ES 세포에서의 21HAC2 또는 MAC1의 보유 비율을 나타낸다.
도 36은 TC(MAC1) 마우스(암컷) 조직의 실체 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 37은 TC(MAC1) 마우스 또는 TC(21HAC2) 마우스 골수 유래 세포의 혈액 계 세포에서의 GFP 양성률을 나타낸다.
도 38은 TC(MAC1) 마우스 또는 TC(21HAC2) 마우스 비장 유래 세포의 혈액 계 세포에서의 GFP 양성률을 나타낸다.
도 39는 마우스 minor satellite DNA 프로브를 이용한 TC(MAC1) 마우스 유래의 꼬리 섬유아 세포의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 40은 CYP3A-BAC(RP11-757A13) 및 마우스 minor satellite DNA 프로브를 이용한 A9(CYP3A-MAC)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 41은 CYP3A-BAC(RP11-757A13) DNA 프로브를 이용한 TT2F(CYP3A-MAC)의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 42는 장기 배양 후(100PDL)의 ES 세포에서 CYP3A-MAC의 보유 비율을 나타낸다.
도 43은 TC(CYP3A-MAC) 마우스(수컷) 조직의 실체 형광 현미경 이미지를 보여준다.
도 44는 TC (CYP3A-MAC) 마우스 또는 TC(CYP3A-HAC△) 마우스 골수 유래 세포의 혈액계 세포에서의 GFP 양성률을 나타낸다.
도 45는 TC(CYP3A-MAC) 마우스 또는 TC(CYP3A-HAC△) 마우스의 각 조직에서 CYP3A-MAC 또는 CYP3A-HAC△의 보유 비율을 나타낸다.
도 46은 CYP3A-BAC(RP11-757A13) DNA 프로브를 이용한 TC(CYP3A-MAC) 헤테로 마우스 또는 TC(CYP3A-MAC) 호모 마우스에서의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 47은 TC(CYP3A-MAC) 마우스의 각 조직에서 CYP3A 유전자 클러스터의 조직 특이적인 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 그림이다. GAPDH은 글리세르알데히드 - - 인산 탈수소 효소(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)를 나타낸다.
도 48은 TC(CYP3A-MAC) 마우스 간장의 CYP3A 유전자 클러스터의 시기 특이적인 유전자 발현 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 49는 CYP3A-BAC(RP11-757A13) 및 마우스 Cot-1 DNA 프로브를 이용한 쥐 ES(CYP3A-MAC)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 50은 마우스 Cot-1 DNA 및 인간 Cot-1 DNA를 프로브를 이용한 CHO(HPRT-; MAC1, hChr21-loxP)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 51은 hChr21q 영역의 약 33 Mb를 MAC1에 전좌 클로닝한 마우스 인공 염색체 hChr21q-MAC의 구축을 보여준다.
도 52는 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 Cot-1DNA을 프로브로 한 때 CHO(hChr21q-MAC, hChr21-hChr21q) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 53은 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 minor satellite DNA 프로브를 이용한 TT2F(hChr21q-MAC) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 54는 장기 배양 후(50PDL)의 ES 세포에서의 hChr21q-MAC의 보유 비율을 나타낸다.
도 55는 hChr21q-MAC을 보유하는 키메라 마우스의 형광 사진을 나타낸다.
도 56은 인간 21 번 염색체(hChr21)의 DSCR(다운 증후군 질환 원인 영역 클러스터)의 근위의 AP001721에 loxP 서열을 삽입하기 위한 타겟팅 벡터 (pCKloxPHyg), 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 보여준다.
도 57은 DT40(hChr21q22.12-loxP)의 서던 블롯 분석 결과를 나타낸다.
도 58은 인간 Cot-1 DNA 및 히그로마이신 DNA를 프로브로 한 때 DT40 (hChr21q22.12-loxP) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 59는 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 Cot-1DNA을 프로브로 한 때 CHO(HPRT-; MAC1, hChr21q22.12-loxP) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 60은 hChr21q22.12-qter 영역의 약 12 Mb를 MAC1에 전좌 클로닝한 마우스 인공 염색체 hChr21q22.12-MAC의 구축을 보여준다.
도 61은 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 Cot-1DNA을 프로브로 한 때 CHO(hChr21q22.12-MAC, hChr21-hChr21q22.12) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 62는 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 minor satellite DNA 프로브를 이용한 TT2F(hChr21q22.12-MAC) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 63은 장기 배양 후(50PDL)의 ES 세포에서의 hChr21q22.12-MAC의 보유율을 나타낸다.
도 64는 장기 배양 후(25PDL)의 CHO 세포에서의 21HAC1, 또는 21HAC2 및 MAC2의 보유율을 나타낸다.
도 65는 1 카피 FVIII-PAC의 구조를 나타낸다.
도 66은 1부터 16 카피 FVIII-PAC의 구축 방법을 보여준다.
도 67은 CHO(FVIIIx1-MAC) 1-3 및 CHO(FVIIIx1-HAC) 1-2의 장기 배양 후 클로팅 분석(Clotting assay)(FVIII의 활성 비교) 결과를 나타낸다.
도 68은 CHO(FVIIIx1-MAC) 및 CHO(FVIIIx16-MAC)의 클로팅 분석 결과(FVIII의 활성 비교)를 나타낸다.
도 69는 복수 유전자 탑재 부위(multi-integrase platform) 카세트 구축을 위한 도입 벡터(entry vector) 구축 방법을 보여준다.
도 70은 복수 유전자 탑재 부위(multi-integrase platform) 카세트 구축 방법을 보여준다.
도 71은 MI-MAC 벡터의 구축 방법을 보여준다.
도 72는 MI-MAC 벡터로 유전자 삽입 방법을 보여준다.
도 73은 PXR-MAC의 구축 방법을 보여준다.
도 74는 마우스 cot-1 DNA 및 인간 PXR-BAC 유래의 DNA(RP11-169N13) (CHORI)를 프로브로 한 때 CHO(PXR-MAC) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 75는 인간 PXR-BAC 유래의 DNA(RP11-169N13)(CHORI)를 프로브로 한 때 TT2F(PXR-MAC) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 76은 GFP-5'HPRT-loxP-hyg 유형 loxP 타겟팅 벡터(pMAC4), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 한 마우스 인공 염색체 MAC4의 대립 유전자의 부분 구조를 나타낸다.
도 77은 마우스 cot-1 DNA 및 GFP-5'HPRT-loxP-hyg 카세트를 프로브로 한 때 DT40(MAC4) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 78은 마우스 Cot-1DNA를 프로브로 한 때 CHO(HPRT-; MAC4) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 79는 인간 4 염색체상의 UGT2 유전자좌의 매우 가까운 텔로미어 측(약 150 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AC1252392 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하는 타겟팅 벡터(pTELpuro-UGT2), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 수행한 사람 4 번 염색체 대립 유전자의 부분 구조를 나타낸다.
도 80은 인간 cot-1 DNA 및 퓨로마이신 DNA를 프로브로 이용한 DT40(hChr4-tel)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다. 왼쪽 그림은 개변 전의 DT40 (hChr4)를 나타내고, 오른쪽 그림은 개변 후의 DT40(hChr4-tel)을 나타낸다.
도 81은 인간 4 번 염색체의 AC074378에 loxP 서열을 삽입하기 위한 타겟팅 벡터(pUGT2loxPneo), 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 보여준다.
도 82는 인간 cot-1 DNA 및 네오마이신 DNA를 프로브로 이용한 DT40(hChr4-loxP-tel)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 83은 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 Cot-1DNA을 프로브로 한 때 CHO(HPRT-; MAC4, hChr4-loxP-tel) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 84는 인간 UGT2 유전자 클러스터 영역 주변(AC074378-인간 UGT2 유전자 클러스터-AC125239) 2 Mb를 MAC4에 전좌 클로닝한 마우스 인공 염색체 UGT2-MAC의 구축을 보여준다.
도 85는 UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI) DNA 및 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때 CHO(UGT2-MAC, hChr4-△UGT2) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 86은 UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI) 및 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 한 때 A9(UGT2-MAC) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 87은 UGT2-BAC(RP11-643N16)(CHORI) DNA를 프로브로 한 때 TT2F(UGT2-MAC) 클론의 mono-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 88은 장기 배양 후(75PDL)의 ES 세포에서의 UGT2-MAC의 보유율을 나타낸다.
도 89는 인간 10 염색체 CYP2C 유전자좌의 매우 가까운 텔로미어 측(약 150 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AL157834 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하는 타겟팅 벡터(pTELpuro-CYP2C), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 수행한 한 인간 10 번 염색체 대립 유전자의 부분 구조를 나타낸다.
도 90은 인간 cot-1 DNA 및 퓨로마이신 DNA를 프로브로 이용한 DT40 (hChr10-tel)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다. 왼쪽 그림은 개변 전의 DT40(hChr10)를 나타내고, 오른쪽 그림은 개변 후의 DT40(hChr10-tel)를 나타낸다.
도 91은 인간 10 번 염색체의 AL138759에 loxP 서열을 삽입하기 위한 타겟팅 벡터(pCYP2CloxPneo), 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 보여준다.
도 92는 마우스 Cot-1 DNA 및 인간 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때(HPRT-; MAC4, hChr10-loxP-tel) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 93은 인간 CYP2C 유전자 클러스터 영역 주변(AL138759-인간 CYP2C 유전자 클러스터-AL157834) 380 kb를 MAC4에 전좌 클로닝한 마우스 인공 염색체 CYP2C-MAC의 구축을 보여준다.
도 94는 CYP2C-BAC(RP11-466J14) (CHORI) DNA 및 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때 CHO(CYP2C-MAC, hChr10-ΔCYP2C) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 95는 인간 7 번 염색체 AC005045에 loxP 서열을 삽입하기 위한 타겟팅 벡터(pMDR1loxPbs), 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 보여준다.
도 96은 인간 7 염색체 MDR1 유전자좌의 매우 가까운 텔로미어 측(약 50 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AC003083 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하는 타겟팅 벡터(pTELpuro-MDR1), 및 상기 벡터에 의해 상동 재조합을 수행한 사람 7 번 염색체 대립 유전자의 부분 구조를 나타낸다.
도 97은 인간 cot-1 DNA 및 퓨로마이신 DNA를 프로브에 이용한 DT40(hChr7M-loxP-tel)의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 98은 마우스 Cot-1 DNA 및 인간 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때 CHO(HPRT-; MAC4, hChr7M-loxP-tel) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
도 99는 인간 MDR1 유전자 영역 주변(AC005045-인간 MDR1 유전자-AC003083) 210 kb를 MAC4 벡터 전좌 클로닝한 마우스 인공 염색체 MDR1-MAC의 구축을 보여준다.
도 100은 MDR1-BAC(RP11-784L5)(CHORI) DNA 및 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 때 CHO(MDR1-MAC, hChr7-△MDR1) 클론의 two-color FISH 분석 결과를 나타낸다.
본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상기와 같이, 본 발명은 제 1 태양에 있어서, 마우스 염색체 유래의 천연형중심체(cetromere), 중심체 근방의 마우스 염색체 장완 부위에서 장완 원심을 제거한 마우스 염색체 유래의 장완 조각 및 텔로미어 (Telomere) 서열을 포함하는 것, 및 포유류의 세포 및 개체 조직에서 안정적으로 보유되는 것을 특징으로 하는 마우스 인공 염색체 벡터를 제공한다.
본 명세서에서 사용하는 「마우스 염색체 유래의 천연형 중심체(cetromere)」라는 용어는 임의의 하나의 마우스 염색체의 중심체 전체(전체 중심체)를 가리킨다. 따라서 이러한 중심체는 마우스 염색체의 중심체 서열의 일부를 사용하여 우발적 또는 인공적으로 얻은 중심체 기능을 갖는 구조체 및 다른 동물 종의 염색체의 중심체는 포함되지 않는다.
본 명세서에서 사용하는 「마우스 인공 염색체」또는「마우스 인공 염색체 벡터」는 하향식 접근 방식으로 만들어진 인공 염색체이며, 상향식 접근 방식으로 만들어진 인공 염색체가 아니다. 하향식 접근 방식은 자연 염색체에서 유전자 영역을 염색체 변경에 의해 삭제하여 천연 중심체(cetromere)를 인공 염색체 벡터로 만드는 방법이다. 샹향식 접근 방식은 중심체(cetromere) 서열의 일부를 클론의 DNA로 검색하여 포유류 세포에 형질 전환하여 중심체 기능을 가진 인공 염색체를 만드는 방법이다.
명세서에서 사용하는「중심체 (cetromere) 근방의 마우스 염색체 장완 부위에서 장완 원심을 제거한 마우스 염색체 유래의 장완 단편」은 본 발명의 벡터가 마우스의 세포 또는 개체 조직의 안정 보유 되도록 하며 마우스의 개체 발생과 자손 전달에 방해가 되지 않도록 가능한 내재 유전자의 영향을 배제하는 것이 바람직하고, 이를 위해 마우스 염색체 장완 중의 내재 유전자를 제거하도록 중심체에 가까운 장완 부위를 제거하여 얻은 장완 단편을 가리킨다. 이것은 전체 내재 유전자(수)의 적어도 99.5 %, 바람직하게는 적어도 99.7 %, 보다 바람직하게는 적어도 99.8 %, 가장 바람직하게는 99.9 ~ 100%가 제거되도록 중심체에 가까운 장완 부위에서 제거해서 얻어진 장완 단편을 가리킨다.
본 명세서에서「DNA」는 특별히 한정하지 않는 한, 유전자 또는 유전자 자리, cDNA, 화학적 DNA를 포함한 모든 종류의 DNA 핵산을 사용하는 것으로 한다. 본 명세서에서 사용하는 「보유 비율」은 배양 세포 또는 마우스 조직 세포에서 인공 염색체가 존재하는 세포의 비율을 가리킨다.
본 발명의 염색체 벡터가 「안정하게 보유된다」는 세포 분열시 상기 염색체 벡터의 누락을 일으키기 어렵고, 즉 분열 후라도 세포 내에서 안정하게 보유되는 것, 따라서, 상기 염색체 벡터가 딸 세포와 후손 마우스에 효율적으로 자손 전달되는 것을 의미한다.
마우스 염색체는 마우스 염색체 1 ~ 19, X 및 Y 중 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 1 번 ~ 19 번 염색체 중 하나이다. 하기의 실시예에서는, 11 번 염색체를 예시하고 있지만, 이러한 구성을 가지는 한, 다른 염색체라도 동일하게 마우스 인공 염색체 벡터를 제작하는 것이 가능하다.
마우스 11 번 염색체 단편 유래의 인공 염색체 벡터의 경우에는, 상기 장완 단편은 예를 들면, 상기 11 번 염색체 장완의 AL671968 혹은 BX572640(AL671968 또는 중심체 측에 위치한다.), CR954170(AL671968 및 BX572640 또는 중심체 측에 위치한다) 또는 AL713875(AL671968 또는 중심체 측에 위치한다.) 또는 말초 영역이 삭제된 장완 단편으로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 또는 상기 장완 단편은, 명세서 내에서 DT40(MAC)인, 기탁 세포주 DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)에 포함된 마우스 인공 염색체를 기본 구조로 포함할 수 있다(도 1, 3 및 4 참조). 다른 예를 들어 마우스 15 번 염색체 단편 유래의 인공 염색체 벡터의 경우, 상기 장완 조각은 예를 들면, AC121307, AC161799 등의 위치보다 말초 영역이 삭제된 장완 조각으로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 마우스 16 번 염색체 단편 유래의 인공 염색체 벡터의 경우, 상기 장완 조각은 예를 들면, AC127687, AC140982 등의 위치보다 말초 영역이 삭제된 장완 조각으로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 이러한 기본 구조는 외래 DNA 또는 유전자를 삽입하는 loxP 같은 DNA 서열 삽입 부위를 더 포함할 수있다(예를 들면, MAC1, MAC2, MAC3, MAC4 등; 도 1, 3 및 4 참조).
본 발명의 벡터는 외래 DNA 또는 유전자 서열을 삽입하는 부위를 포함할 수 있기 때문에, 상기 부위에 목적 외래 DNA 또는 유전자를 포함하여, 상기 벡터가 모든 세포에 도입되었을 때에 상기 목적의 외래 DNA 또는 유전자를 발현하는 것이 가능하고, 따라서 단백질 생산, 치료용 약물의 스크리닝, 약물 대사 시험, DNA의 기능 해석, iPS 세포 유도, 유전자 치료, 유용한 아닌 인간 동물 제작 등의 응용에 사용이 가능하다(예를 들어, CYP3A-MAC, GFP-MAC 등; 도 2, 5 참조).
본 발명의 벡터는 또한, 마우스 염색체를 변경하고, 마우스 유래의 천연형 중심체를 그대로 벡터 제작을 위해 이용하고 있다. 기존 공지의 마우스 인공 염색체 벡터로, 중심체 서열의 일부를 이용하여 제작된 위성(satellite) DNA 베이스 포유류 인공 염색체(Aces 및 SATAC 이라 칭한다)로 알려져 있지만, 마우스 염색체의 중심체 전체를 이용하여 제작된 마우스 인공 염색체는 지금까지 제작된 적이 없다. 또한, 상기 포유류 인공 염색체는 HAC 벡터와 마찬가지로 마우스 개체의 조직 보유율이 안정되지 않는다(Co Do 등, Chromosome Res 2000; 8 (3) :83-91).
본 발명의 벡터 유용하고, 유의적인 특징으로, 마우스, 랫트, 햄스터 등의 설치류를 포함하는 포유류의 세포 또는 개체 조직에 있어서, 보유율을 향상시키고 이를 통해 세포 내에서 안정적으로 보유되고, 따라서 목적 유전자(군)를 장기간 안정하게 보유할 수 있으며, 설치류의 개체 간 또는 조직 간에 있어서 도입 유전자 양에 편차가 없이 장기간 발현시킬 수 있으며, 분화 다능성 세포(예를들면 ES 세포, iPS 세포 등)를 통한 설치류의 개체 발생 및 자손 전달의 효율성을 향상시킬 수 있는 등의 특성이 있다. 인간 인공 염색체(HAC)와 비교되는 흥미있는 특성으로서, HAC의 보유율이 20% 미만으로 매우 낮은 혈액계 조직을 포함하여, 조직 간의 격차가 극단적으로 적고, 보유율은 시험 조직 어디에서도(예, 간, 창자, 신장, 비장, 폐, 심장, 골격 근육, 뇌 또는 골수 유래의 조직) 90% 이상이고, 또한 본 발명의 마우스 인공 염색체는 HAC보다 효율적으로 번식 가능하며, HAC에서는 불가능했던 세포에서 다중 카피의 보유를 가능하게 한다.
정의:
본 명세서로 사용하는 용어의 정의는, 당업계에서 사용되는 일반적인 의미에 더해서, 구체적으로 하기의 의미를 포함하는 것으로 한다.
본 명세서에서 「마우스 인공 염색체」또는「마우스 인공 염색체 벡터」라고 칭하는 경우, 이 용어는 상기 예시와 같은 마우스 유래의 염색체 단편으로부터 제작된 상기의 특징을 가진 인공 염색체를 가리키며, 하향식 접근으로 만들어진 인공 염색체이며, 상향식 접근 방식으로 구축되어 있지 않다. 구체적으로, 하향식 접근 방식은 자연 염색체에서 유전자 영역을 염색체 개변에 의해 삭제하여 자연적인 중심체를 인공 염색체 벡터로 만드는 방법이다.
한편, 상향식 접근 방식은 중심체 서열의 일부를 클론화 DNA로 취득하여 포유류 세포에 형질 전환하여 중심체 기능을 가진 구조를 구축하는 방법이다. 인공 염색체는 도입해야 할 세포 본래의 염색체에서 독립한 염색체로서 안정적으로 복제 및 분배가 가능하다. 마우스 유래의 염색체 단편은 마우스 1 ~ 19 번, X 및 Y 염색체 중 어느 임의의 염색체의 단편(장완의 모든 내재 유전자 수는 적어도 99.5%가 삭제된 장완 단편)이고, 상기 단편에는, 상기 정의한 것과 같은, 중심체 근방의 마우스 염색체 장완 부위에서 장완 원심이 삭제된 장완 단편이 포함된다. 본 발명의 인공 염색체의 제작에 대해서는 하기의 실시예, 특히 실시예 1 ~ 5, 도 1 ~ 도 4에 기재되어 있고, 마우스 11 번 염색체 단편으로부터 인공 염색체를 제작하는 방법이 예시되어있다. 다른 염색체 단편으로부터 마우스 인공 염색체의 제작도 동일하게 실시할 수 있다.
마우스의 염색체 서열 정보는 DDBJ/EMBL/GenBank, Santa Cruz Biotechnology, Inc. 같은 Chromosome Databases에서 입수 가능하다.
본 명세서의 염색체 「장완」는 마우스 염색체의 중심체 측면에서 유전자 영역을 포함하는 염색체 영역을 가리킨다. 한편, 마우스 염색체는 단완이 거의 존재하지 않는다.
본 명세서에서 「원위」는 중심체에서 먼 영역(즉, 텔로미어 쪽)을 의미한다. 반대로, 중심체에 가까운 영역(즉, 중심체 측)은 「근위」라고 칭한다. 장완 원위는 장완의 특정 부위보다 텔로미어 측에 위치하는 공간을 의미하고, 장완 근위은 장완의 특정 부위보다 중심체 측에 위치하는 공간을 의미한다. 이 특정 부위는 마우스 유래의 단일 염색체 장완에 존재하는 모든 내재 유전자(수)의 적어도 99.5%, 바람직하게는 적어도 99.7%, 보다 바람직하게는 적어도 99.8%, 가장 바람직하게는 99.9 ~ 100% 삭제되는 위치이다.
본 명세서에서 「보유율」은 배양 세포 또는 마우스 조직 세포에서 인공 염색체가 존재하는 세포의 비율을 가리킨다.
본 명세서에서「DNA 서열 삽입 부위」는 인공 염색체에 있어서, 목적 DNA (유전자 포함한다) 서열을 삽입할 수 있는 부위, 예를 들면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위 등을 의미한다. 이러한 인식 부위에는, 예를 들면 loxP(Cre 재조합효소(recombinase) 인식부위), FRT (Flp 재조합효소 인식부위) ΦC31attB 및 ΦC31attP (ΦC31 재조합효소 인식부위) R4attB 및 R4attP (R4 재조합효소 인식부위) TP901-1attB 및 TP901-1attP (TP901-1 재조합효소 인식부위) 혹은 Bxb1attB 및 Bxb1attP (Bxb1 재조합효소 인식부위) 등이 포함된다.
본 명세서에서 「부위 특이적 재조합 효소」는 이러한 효소의 인식 부위에 특이적으로 원하는 DNA 서열과 재조합을 일으키기 위한 효소이다. 그 예는 Cre 인터레이트(cre integrate)(Cre 재조합 효소이라고도 칭한다.) ΦC31 인터레이트, R4 인터레이트, TP901-1 인터레이트, Bxb1 인터레이트 등이다.
본 명세서에서「텔로미어 서열」는 동종 또는 이종의 천연 텔로미어 서열 또는 인공 텔로미어 서열이다. 여기서 동종은 인공 염색체 벡터의 염색체 단편이 유래 되는 마우스와 동종의 동물을 의미하고, 한편, 이종은 상기 마우스 이외의 포유 동물(이것은 인간을 포함한다)을 의미한다. 또한, 인공 텔로미어 서열(TTAGGG) n 서열(n은 반복을 의미한다.) 등의 인공적으로 제작된 텔로미어 기능을 갖는 서열을 가리킨다. 인공 염색체에 텔로미어 서열의 도입은, 예를 들면 국제공개 WO 00/10383에 명시된 같은 텔로미어 절단(텔로미어 서열의 치환)에 의해 할 수 있다. 텔로미어 절단은 본 발명의 인공 염색체의 제작에 있어서 염색체의 단축을 위하여 사용할 수 있다.
본 명세서에서 「외래 유전자」 또는 「외래 DNA」는 벡터 유전자 삽입 부위에 삽입하는 벡터에 탑재하는 목적 유전자 또는 DNA이며, 대상 세포에 본래 존재하지 않으나, 대상 세포 내에서 발현되게 해야 할 유전자나 DNA 혹은 그 서열을 의미한다.
본 명세서에서 「포유 동물」이라는 용어는 인간, 원숭이, 침팬지 같은 영장류, 쥐, 쥐, 햄스터, 기니피그 등의 설치류, 소, 돼지, 양, 염소 등 유제류 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서 「배아 줄기 세포」 또는 「ES 세포」는 포유동물 유래의 수정란의 배반포의 내부 세포 덩어리에서 수립된 분화 다능성 및 반영구적인 증식능을 갖춘 줄기세포이다(MJ Evans and MH Kaufman (1981) Nature 292:154-156; JA Thomson et al (1999) Science 282:1145-1147; JA Thomson et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :7844-7848; JA Thomson et al (1996) Biol. Reprod. 55:254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998) Curr. Top. Dev. Biol. 38:133-165). 이 세포와 유사한 특성을 가진 체세포를 재프로그래밍에 의해 인위적으로 유도된 세포 「인공 다능성 줄기 세포」또는「iPS 세포」이다(K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell 126 :663-676; K. Takahashi et al (2007) Cell 131:861-872; J. Yu et al (2007) Science 318:1917-1920).
마우스 인공 염색체 벡터의 제작 및 용도 :
다음은 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터의 제작 및 그 용도를 설명한다. 구체적으로는 아래의 실시예 1 ~ 5 (도 1-4)에 절차를 기재하였다.
(1) 마우스 인공 염색체 벡터의 제작
본 발명의 인공 염색체 벡터는 하기와 같은 단계 (a) ~ (c) :
(a) 마우스 염색체를 보유하는 세포를 얻는 공정,
(b) 내재 유전자(수)의 대부분 (99.5% 이상 100% 이하)를 포함하지 않도록 마우스 염색체 장완 원심을 제거하는 공정, 및
(c) 장완 근위 1 개 이상의 DNA 서열 삽입 부위를 삽입하는 공정을 포함하는 방법에 따라 제작할 수 있다. 여기서 공정 (b) 및 (c) 순서 반대로 수행하여도 된다.
공정 (a) :
본 발명의 인공 염색체 벡터를 제작하려면 먼저 마우스 염색체를 보유하는 세포를 제작한다. 예를 들어, 약제 내성 유전자(예를 들면, blasticidin S registance gene(BSr))로 표시된 마우스 염색체를 보유하는 마우스 섬유아 세포인 mouse embryonic fibroblast(mChr11-BSr)과 G418 내성 유전자인 neo 유전자를 도입한 마우스 A9 세포(ATCC VA20110-2209)인 mouse A9(neo)와 세포 융합 약제 내성 유전자로 표시된 마우스 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포인 mouse A9x mouse embryonic fibroblast(neo; mChr11-BSr)로부터, 그 염색체를 상동 재조합율이 높은 세포에 이입하여 제작할 수 있다. 마우스 섬유아 세포는 문헌에 기재된 방법을 통해 구할 수 있으며, 예를 들어, 마우스 섬유아 세포는 일본 클레어사나, 입수 가능한 C57B6 계통의 마우스로도 수립 가능하다. 상동 재조합율이 높은 세포로서, 예를 들면, 닭 DT40 세포 (Dieken et al., Nature Genetics, 12:1 74-182, 1996)을 이용할 수 있다. 그리고 또 위의 입은 공지의 염색체 입 법 예 미소 핵 세포 융합 법 (Koi et al., Jpn. J. Cancer Res., 80 : 413-418, 1973)에 의해 할 수 있다.
공정 (b) :
마우스 유래의 단일 염색체를 보유하는 세포에서, 상기 마우스 염색체 장완 원심을 삭제한다. 이때, 중요한 것은 장완에 존재하는 내재 유전자의 대부분을 삭제(또는 제거 또는 결실)하여 마우스 중심체를 보유하는 인공 염색체를 만드는 것이다. 이것은 장완에 존재하는 모든 내재 유전자의 적어도 99.5 %, 바람직하게는 적어도 99.7 %,보다 바람직하게는 적어도 99.8 %, 가장 바람직하게는 99.9 ~ 100%를 삭제(또는 제거 또는 결실)하도록 절단 위치를 결정하는 것이다. 이렇게 함으로써, 인공 염색체가 도입된, 설치류 등의 포유 동물 유래의, 바람직하게는 마우스 유래의 세포, 조직 또는 개체에서 안정적이고 높은 보유율로 보유되며, 목적 유전자(군)를 정확성 군 분석, 물질 생산 등에 이용할 수 있다. 상기 내재 유전자 삭제는, 예를 들어, WO 00/10383호에 기재된 텔로미어 절단에 의해 할 수 있다. 구체적으로, 마우스 염색체를 보유하는 세포에 있어서, 인공 텔로미어 서열을 보유하는 타겟팅 벡터를 구축하고, 상동 재조합은 염색체의 원하는 위치에 (인공)텔로미어 서열을 삽입한 클론을 수득하고, 이에 따라 텔로미어 절단에 의해 결실 돌연변이 수득할 수 있다. 즉, 원하는 위치(또는 부위)가 삭제되는 장완 말초 절단 위치이며, 이 위치에 인공 텔로미어 서열이 상동 재조합에 의해 치환, 삽입되어서 장완 원심이 삭제된다. 이 위치는 타겟팅 벡터를 구축하기 위한 표적 서열의 설계에 의해 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들어, 하기의 실시예에서는 마우스 11 번 염색체 장완의 AL671968(GenBank 등록 번호)의 DNA 서열을 기반으로 표적 서열을 설계하고 그 표적 서열부터 텔로미어 측에서 텔로미어(Telomere) 절단이 일어나게 설정 되고 있다(도 9 참조). 따라서 내재 유전자의 대부분이 삭제된 마우스 11 번 염색체 단편이 얻어진다. 다른 염색체의 경우에도 마찬가지로 텔로미어 절단을 실시할 수 있다.
공정 (c) :
DNA 서열 삽입 부위로서, 바람직하게는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입할 수 있다. 즉, 어떤 종류의 효소가 특정한 인식 부위를 인식해서 특이적으로 그 인식 부위에서 DNA의 재조합을 일으키는 현상이 알려져 있으며, 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터에서는, 이러한 효소와 그 효소의 인식 부위로부터 구성된 조직을 이용하여 목적 유전자 또는 DNA 서열을 삽입, 장착할 수 있다. 이러한 조직으로, 예를 들면, 박테리오 파지 P1 유래 Cre 효소와 그 인식 부위인 loxP 서열의 조직(Cre/loxP 조직; B. Sauer in Methods of Enzymology; 1993, 225:890-900)과 출아 효모(budding yeast) 유래의 Flp 효소와 그 인식 부위인 FRT(Flp Recombination Target) 서열의 조직(Flp/FRT 조직)과 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 파이지 유래의 ΦC31 인터레이트와 그 인식 부위인 ΦC31attB/attP 서열 조직, R4 인터레이트와 그 인식 부위인 R4attB/attP 서열 조직, TP901-1 인터 레이트와 그 인식 부위인 TP901-1attB/attP 서열 조직, Bxb1 인터레이트와 그 인식 부위인 Bxb1attB/attP 서열 조직 등을 들 수 있지만, DNA 서열 삽입 부위 역할을 할 수 있다면 위의 시스템에 국한되지 않는다.
이러한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위의 삽입을 위해서는 공지된 방법, 예를 들면, 상동 재조합 방법을 사용할 수 있고, 삽입 위치 및 개수는 장완 근위 및 단완 근위에 따라 적절하게 설정 수 있다.
본 발명에서는 한 종류의 인식 부위 또는 다른 종류의 인식 부위를 하나 삽입하는 것도 가능하다. 인식 부위 설정에 의해, 외래 유전자 또는 외래 DNA의 삽입 위치를 특별히 정할 수 있기 때문에, 삽입 위치가 일정하게 되고 예상치 못한 위치 효과(position effect)를 받지 않게 된다. 하기의 실시예에 예시하는 마우스 인공 염색체의 경우에는 마우스 11 번 염색체 BX572640에 삽입되는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위 loxP 서열에 있어서 삽입된 유전자를 조직 특이적으로 발현하는 것을 가능하게 한다(도 11, 도 20, 도 24).
본 발명의 DNA 서열 삽입 부위가 있는 마우스 인공 염색체 벡터는, 바람직하게는 목적 유전자 또는 DNA 서열의 삽입 부위를 남기고, 리포터 유전자를 미리 삽입해 두어도 무방하다. 리포터 유전자로는, 특별히 제한하는 것은 아니지만, 예를 들어. 형광 단백질(예를 들면, 녹색 형광 단백질(GFP 또는 EGFP) 유전자, 노란색 형광 단백질(YFP) 등), 태그 단백질 코드 DNA, β-galactosidase 유전자 루시페라제 유전자 등을 들 수 있지만, GFP 또는 EGFP가 바람직하다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터는 또한 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 선택 마커는, 상기 벡터로 형질 전환된 세포를 선별하는 데 효과적이다. 선택 마커 유전자로는 포지티브 선택 마커 유전자 및 네거티브 선택 마커 유전자 중 하나 또는 둘 모두가 여기서 포함된다. 포지티브 선택 마커 유전자는 약제 내성 유전자, 예를 들면 네오 마이신 내성 유전자, 암피실린 내성 유전자, 블라스티시딘 (Blasticidin) S (BS) 내성 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 게네티신(Geneticin)(G418) 내성 유전자 히그로마이신 내성 유전자를 포함한다. 또한, 네거티브 선택 마커 유전자, 예를 들어 허피스 심플렉스 바이러스-티미딘 키나아제(Herpes simplex virus-thymidine kinase;HSV-TK) 유전자, 디프테리아 톡신 A 단편 (DT-A) 유전자 등이 포함된다. 일반적으로 HSV-TK는 간시클로비르(Ganciclovir) 또는 아시클로버(aciclovir)와 함께 사용된다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터, 리포터 유전자, 원하는 외래 유전자 또는 DNA를 삽입하는 방법으로는 바람직하게 상동 재조합 방법을 사용할 수 있다. 상동 재조합은, 마우스 염색체의 삽입 위치의 5 '말단 영역 및 3' 말단 영역의 염기 서열(각각 약 1 ~ 4 kb, 바람직하게는 약 2 ~ 4 kb)과 상동적인 두 서열(5'arm 및 3'arm) 사이에, 삽입해야할 DNA 카세트를 연결하여 얻은 타겟팅 벡터를 이용하여 할 수 있다. 이 목적으로 사용되는 벡터로는, 예를 들어 플라스미드, 파지, 코스미드(cosmid), 바이러스 등을 사용할 수 있고, 바람직하게는 플라스미드이다. 타겟팅 벡터 구축을 위한 기본 플라스미드의 예로는 V907 또는 V913(Lexicon Genetics) 등이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 기본 벡터에는 프로모터, 인핸서, 선택 마커 유전자 복제 시작점 같은 벡터 구축에 있어서 일반적으로 삽입되는 하나 또는 둘 이상의 서열 또는 요소가 포함되어 있어도 좋다.
위의 방법으로 제작된 마우스 인공 염색체는 마우스 유래의 염색체 단편(여기에는, 천연 형식 중심체가 적어도 99%, 바람직하게는 적어도 99.5%의 내재 유전자가 제거된 장완 단편 및 (존재할 경우) 단완이 포함된다.)과 인공 텔로미어 서열을 포함한다. 또한, 상기 중심체은 인공 염색체의 제작을 위해 이용되는 마우스 염색체의 중심체 구조의 전체이다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터의 예로는 하기의 실시예에서 제작된 마우스 인공 염색체 벡터이며, 이러한 인공 염색체는 마우스 11 번 염색체에서 장완 원심을 AL671968에서 제거하여 얻은 벡터이다(도 1, 도 3, 도 4, 도 9, 도 10). 이러한 벡터는 본 명세서 중에서의 DT40(MAC)인, 기탁세포주 DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)에 포함되는 마우스 인공 염색체를 기본 구조로 포함한다. 기본 구조이기 때문에, 이 DNA 구조 중에 다음과 같은 DNA 서열 삽입 부위, 선택 마커 유전자, 외래 유전자(또는 DNA) 등을 삽입할 수 있다.
상기 마우스 인공 염색체 벡터에는, 바람직하게는 1 개 또는 복수의 DNA 서열 삽입 부위, 예를 들면 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위(예를들면 Cre 효소 인식 부위인 loxP 서열)를 포함한다(도 1, 도 3, 도 4, 도 11, 도 20, 도 24). 여기에서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 예를 들면 GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 서열 또는 5'HPRT-loxP-hyg 타입, PGKneo-loxP -3'HPRT 타입의 loxP 서열, GFP-5'HPRT-loxP-PGKhyg 타입 loxP 서열이 있지만, 이에 한정되지 않는다. 여기서 GFP는 녹색 형광 단백질 유전자이며, PGKneo은 포스포글리세르산인산화효소(phosphoglycerate kinase) 프로 모터/네오마이신 내성 유전자 카세트이며, HPRT는 히포크산틴(hypoxanthine)-구아닌 포스포리보실전달효소(guanine phosphoribosyltransferase) 유전자이며, hyg은 히그로마이신 내성 유전자이다.
상기 마우스 인공 염색체 벡터에는 리포터 유전자 또한 선택 마커 유전자 (포지티브 선택 마커 유전자, 네거티브 선택 마커 유전자 등)를 포함할 수 있다. 상기 벡터에는 추가적으로 목적으로 하는 외래 유전자 또는 DNA 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터의 장점으로는, 기존의 인공 염색체 벡터의 이점인 1) 숙주 염색체에 삽입되지 않고 독립적으로 보유되기 때문에 숙주 유전자를 파괴하지 않고, 2) 일정의 카피수(다중(多) 카피 가능)에서 안정적으로 보유되고, 숙주 세포의 생리적 발현 제어를 받는 것으로부터, 삽입된 유전자의 과잉 발현과 발현 소실이 일어나지 않으며 3) 도입 가능한 DNA 크기에 제약이 않기 때문에 발현 조절 영역을 포함하는 유전자 또는 복수 유전자/이소폼(isoform)의 도입이 가능하게 될 뿐만 아니라, 설치류 세포 또는 설치류 개체 중의 보유율이 기존의 인공 염색체에 비해 향상, 및 도입 유전자의 장기간의 안정 발현을 실현하고, 자손 전달률이 향상하는 것으로 유전자 도입 마우스의 제작 효율 향상시키고, (4) 벡터 도입 후 조직 간의 편차가 적고, 즉 보유율은 어떤 조직에서도 90% 이상이고 HAC의 경우 20% 미만 보유 비율인 혈액계 조직에서조차도 90% 이상의 보유 비율을 나타내는 등의 장점을 들 수 있다.
2) 외래 유전자 또는 DNA의 도입
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터에는 외래 유전자 또는 DNA를 도입할 수 있다.
외래 유전자 또는 DNA 서열의 크기에는 특별히 제한되지 않고, 20 kb 이하일 수도 있고, 20 kb 이상일 수도 있으며, 예를 들어 50 kb 이상, 100 kb 이상, 200 kb 이상, 500 kb 이상, 700 kb 이상, 1 Mb 이상, 10 Mb 이상, 20 Mb 이상, 30 Mb 이상, 40 Mb 이상, 또는 50Mb 이상이어도 된다. 본 발명의 벡터는 HAC 벡터와 마찬가지로 BAC, PAC, YAC 등의 인공 염색체 벡터에서는 어려운 크기, 즉 1 Mb 이상의 외래 DNA(염색체 단편)를 탑재할 수 있다. 게다가, 본 발명의 벡터는 200 kb 이상, 예를 들면 1 Mb 이상의 큰 크기의 외래 유전자 또는 DNA를 HAC보다 안정적이고, 높은 보유율(90% 이상)로 포유류의 세포, 조직 또는 비인간 동물 개체 내, 바람직하게는 설치류의 세포내, 조직내 또는 개체 내에 보유하는 것을 가능하게 한다.
본 발명의 실시 형태의 하나로서, 본 발명은 200 kb 이상의 거대한 크기의 외래 유전자 또는 DNA를 설치류 세포 또는 설치류 개체에서 90% 이상의 보유율에서 안정적으로 보유할 수 있는 벡터 및, 상기 벡터를 제작하는 방법을 제공한다.
외래 유전자 또는 DNA는 대상 세포에 있어서 외부에서 도입되는 핵산 서열인 것이 바람직하나, 특별히 한정되는 것이 아니고, 임의의 생물 유래 또는 임의의 조직 또는 세포 유래의 유전자 또는 DNA이고, 바람직하게는 포유 동물 유래의 유전자 또는 DNA이며, 보다 바람직하게는 인간 유래의 유전자 또는 DNA이다. 상기 유전자 또는 DNA는 사이토카인류, 호르몬류, 성장인자류, 영양인자류, 조혈인자류, 면역 글로불린(Immunoglobulin)류, G 단백질 결합 수용체류, 효소류 등 폴리펩티드류를 코딩하는 유전자 또는 DNA, 기타, 종양, 근위축증, 혈우병, 신경 변성 질환(예를들면, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병 등), 자가 면역 질환, 알레르기성질환, 유전 질환 등 여러 가지 질환 관련 치료 유전자 또는 DNA, (인간)약물 대사 효소 유전자(군) 또는 DNA 나, (인간)약물 대사 관련 유전자 인간 염색체 장완 또는 단완의 DNA, (인간) 게놈 라이브러리 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.
사이토카인 류에는, 예를 들면, 인터페론 류(예를들면, IF-α, IF-β, IF-γ 등), 인터루킨류(예를 들어 IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-11, IL-12 등), 종양 괴사 인자(예를들면, TNF-α, TNF-β), TGF-β 패밀리 단백질(예를 들면, 뼈 형성 촉진 단백질(BMP) 등) 등이 포함된다.
호르몬 류에는, 예를 들면, 성장 호르몬, 사람융모성고나도트로핀(human chorionic gonadotropin; hCG), 인간태반성락토젠(human placental lactogen; hPL), 인간 뇌하수체성 생식선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬(TSH), 황체 형성 호르몬 방출 인자, 인슐린, 글루카곤, 소마토스태틴(somatostatin), 프로랙틴(prolactin) 등이 포함된다.
성장 인자류 또는 영양 인자류에는, 예를 들면, 인슐린 성장 인자 뇌 유래 신경 영양 인자(BDNF), 알부민 융합 융모 다양한 신경 영양 인자, 혈소판 유래 신경 영양 인자 (PDNF), 형질 전환 성장 인자, 신경 성장 인자 (NGF), TNF 성장 인자 등이 포함된다.
혈액 응고·용해 인자류에는, 예를 들면, 제 VII 인자, 제 VIII 인자, 제 X 인자, t-PA 등이 포함된다.
조혈 인자 류에는, 예를 들어, 에리트로포이에틴(erythropoietin), (과립구) 콜로니 형성 자극 인자, 트롬보포이에틴(thrombopoietin) 등이 포함된다.
면역 글로불린류에는, 예를 들어 다양한 항원에 대한 인간 항체류, 인간화 항체류, 키메라 항체 종류, 합성 항체류, 재조합 항체류 등이 포함된다.
G 단백질 결합 수용체 류에는, 아드레날린 수용체, 무스카린(muscarine)성 아세틸콜린 수용체, 아데노신 수용체, GABA 수용체(B 형), 안기오텐신(angiotensin), 콜레시스토키닌(cholecystokinin) 수용체, 도파민 수용체, 글루카곤 수용체, 히스타민 수용체, 후각 수용체, 오피오이드(opioid) 수용체, 세크레틴(secretin) 수용체, 소마토스태틴 (somatostatin) 수용체, 가스트린(gastrin) 수용체, P2Y 수용체가 포함된다.
효소류에는 예를 들어, 아스파라기나제(asparaginase), 수퍼옥사이드 디스뮤타제(Superoxide dismutase), 우리카아제(Uricase), 스트렙토키나아제(streptokinase), 도파민 합성 효소, 아데노신 데아미나아제(adenosine deaminase) 등이 포함된다.
종양, 근위축증, 신경 변성 질환(예를들면, 알츠하이머병, 헌팅턴병, 파킨슨병 등), 자가 면역 질환, 알레르기 질환, 유전 질환 등 각종 질병에 관련된 치료용 유전자에는 예를 들어, 디스트로핀(dystrophin) 유전자, IL-12 유전자, TNF-α 유전자, 종양 억제 유전자, 도파민 합성 계 효소 유전자, 유전 결손 효소의 유전자류 등이 포함된다. 구체적으로
약물 대사 효소는 약물이나 독극물 등의 이물질을 분해·배출하기 위한 대사 반응에 관련되는 효소이며, 제 1단계 반응(산화, 환원, 가수 분해)에 관련되는 효소 및 제 2단계 반응(포합)에 관련 효소를 포함한다. 제 1단계 반응에 관련되는 효소로는, 예를 들어 시토크롬(cytochrome)P450(「CYP」)와 같은 공지의 효소, 구체적으로 CYP1A, CYP1B, CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP2J, CYP3A, CYP4A, CYP4B 및 이의 서브 패밀리, 및 CES 등이 포함된다. CYP 서브 패밀리로서는, 예를 들어 CYP3A의 서브 패밀리는 CYP3A4, CYP3A43, CYP3A5, CYP3A7 등이 포함되며 또한, CYP2C 서브 패밀리는 CYP2C8, CYP2C9, CYP2C18, CYP2C19 등이 포함된다. 덧붙여서 하기의 실시예에 명시된 CYP3A-MAC은 CYP3A 클러스터를 의미하며, CYP3A4, CYP3A43, CYP3A5 및 CYP3A7로 구성된다. 한편, 제2번 단계 반응(포합)에 관련되는 효소로, 예를 들어 UGT1 및 UGT2 등이 포함된다.
약물 대사 관련 유전자에는, 예를 들면 트랜스 포터를 코딩하는 유전자, 핵내 수용체를 코딩하는 유전자를 포함한다. 트랜스 포터를 코딩하는 유전자 예로는 MDR1, MDR2, MRP2, OAT, OATP, OCT, BCRP 등이며, 핵 수용체를 코딩하는 유전자의 예로는 PXR, AhR, CAR, PPARα 등이다.
따라서, 본 발명의 벡터에 도입 가능한 약물 대사에 관계되는 외래 DNA 서열은, 제 1단계 반응에 관련된 효소를 코딩하는 유전자, 제 2단계에 관련된 효소를 코딩하는 유전자, 트랜스 포터를 코딩하는 유전자와 핵내 수용체를 코딩하는 유전자로 구성된 그룹에서 선택되는 적어도 하나의 유전자 서열 또는 두 개 이상의 유전자 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터에 있어서의 외래 유전자 또는 외래 DNA 삽입 부위 근처 또는 삽입 부위의 양쪽에 적어도 하나의 인슈레이터(insulator) 서열을 존재시킬 수 있다. 인슈레이터 서열은 강화 차단(enhancer-blocking) 효과 (즉, 인접한 유전자가 서로 영향을 받지 않는) 또는 염색체 경계(boundary) 효과(유전자 발현을 보증하는 영역과 유전자 발현이 억제되는 영역을 사이에 두고 구분한다)를 가진다. 이러한 서열에는, 예를 들면 인간 β 글로빈(globin) HS1 ~ HS5, 닭 β 글로빈 HS4 등이 포함된다.
외래 유전자 또는 DNA의 도입은, 상기 DNA 서열 삽입 부위로 삽입되고, 상기 예시하는 같은, 부위 특이적 재조합 효소계를 이용하여 할 수 있다. 예를 들어, Cre 효소의 인식 부위인 loxP 서열과 외래 유전자 또는 DNA를 보유하는 타겟팅 벡터, Cre 효소의 인식 부위인 loxP 서열을 삽입한 외래 유전자 또는 DNA를 보유하는 염색체 단편을 구축하고, 본 발명 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포에서 Cre 효소를 발현시킴으로써 loxP 서열에서 상기 타겟팅 벡터 혹은 상기 염색체 단편과의 부위 특이적 재조합에 의해, 외래 유전자 또는 DNA를 도입할 수 있다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터에는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위(예를들면, loxP 서열, FRT 서열 등)를 보유하는 환상 DNA를 삽입할 수 있고, 대장균을 숙주로 하는 플라스미드나 효모를 숙주로 한 환상 YAC 등을 기존 벡터에 의해 클론화된 DNA를 삽입할 수 있다. 바람직한 loxP 서열은 P1 파지 유래 야생의 서열이며, Cre 효소에 의한 인공 염색체 벡터상의 loxP 서열에 대한 환상 인서트 삽입 반응은 가역적이다. 일단 환상 인서트를 삽입하게 되면, 인공 염색체 벡터에 두 개의 loxP 서열이 남는다. 따라서 다시 Cre 효소를 발현하게 되면 환상 인서트를 자르는 시작하는 역반응이 일어날 가능성도 있고, 이차적으로 인서트를 삽입과 같은 새로운 인공 염색체 벡터 변경이 곤란해진다. 그러나 염기 치환을 한 변이 loxP 서열이나 ΦC31 인터레이트의 인식 부위인 attB / attP 서열 조합 등에 따라 역반응을 일으키지 않고 여러 환상 인서트를 순차적으로 삽입하는 과정도 구축할 수 있다.
(3) 마우스 인공 염색체 벡터의 세포에 이입 및 비인간 동물의 개발
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터, 혹은 외래 유전자 또는 DNA를 포함하는 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터는 임의의 세포에 이입 또는 도입할 수 있다. 따라서 기술에는, 예를 들면, 미소 핵 세포 융합법, 리포펙션(lipofection)법, 인산칼슘(calcium phosphate), 미량주사법(microinjection), 전기천공법(electroporation) 등이 포함되지만, 바람직한 방법은 미소 핵 세포 융합법이다.
미소 핵 세포 융합 방법은 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터를 함유하는 미소 핵형성능을 가진 세포(예를 들면 마우스 A9 세포)와 다른 원하는 세포의 미소 핵 융합에 의해 상기 벡터를 상기 세포에 채우는 방법이다. 미소 핵형성능을 가진 세포는 배수체 촉진제(예를들면, 콜세미드(colcemid), 콜히친(cholchicine))로 처리해서 미소 핵 다핵 세포를 형성하고, 사이토칼라신(cytochalasin) 처리하여 미소 핵체를 형성하는 작업을 수행한 이후에 원하는 세포와 세포 융합을 실시한다.
상기의 벡터 도입 가능한 세포는, 동물 세포, 바람직하게는 인간 세포를 포함한 포유 동물 세포, 예를 들면 계란 모세포, 정자 세포 등 생식 계열 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 정자 줄기(GS)세포, 신체 줄기세포와 같은 줄기세포, 체세포, 태아 세포, 성체 세포, 정상 세포, 질환 세포, 초대 배양 세포, 계대 세포 또는 주화 세포 등을 포함한다. 줄기 세포에는, 예를 들면 ES 세포, 배아 생식(EG) 세포, 배아 암종 (EC) 세포, mGS 세포, 인간 간엽(Mesenchymal) 줄기 세포와 같은 만능 줄기 세포, 인공 다능성 줄기(iPS) 세포, 핵 이식 클론 배아 유래 배아 줄기(ntES) 세포 등이 포함된다. 바람직한 세포는 포유 동물(바람직하게는, 마우스를 포함한 설치류) 유래의 체세포, 비인간 생식 계열 세포, 줄기 세포 및 전구 세포로 구성된 군그로부터 선택된다. 세포가 설치류 등 포유류의 세포이면 본 발명의 벡터가 도입된 포유류(예를들면, 마우스와 같은 설치류)의 세포 또는 조직에 있어서, 벡터가 보다 안정적으로 보유되는, 즉 세포에서 벡터의 탈락이 유의하게 감소하거나 탈락이 일어나지 않는다.
세포, 예를 들면, 간세포, 장 세포, 신장 세포, 비장 세포, 폐 세포, 심장 세포, 골격근 세포, 뇌세포, 골수 세포, 림프구 세포, 거핵공 세포, 정자, 난자 등이다.
조직은, 예를 들면 간, 창자, 신장, 비장, 폐, 심장, 골격 근육, 뇌, 골수, 정소, 난소 등의 조직이다,
ES 세포는 대상 동물의 수정란의 배반포에서 내부세포 덩어리를 꺼내고, 마이토마이신(mitomycin) C 처리 마우스 태아 섬유아 세포를 피더하고 수립 보유할 수있다(MJ Evans와 MH Kaufman (1981) Nature 292 :154-156).
iPS 세포는 체세포(체성 줄기 세포를 포함한다)에 특정 재프로그램화 인자 (DNA 또는 단백질)를 도입하고 적당한 배지에서 배양, 계대 배양하여 약 3 ~ 5주 콜로니를 생성한다. 재프로그램화 인자, 예를 들면 Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc 이루어진 조합; Oct3/4, Sox2와 Klf4 이루어진 조합; Oct4, Sox2, Nanog와 Lin28 이루어진 조합; 또는 Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc, Nanog와 Lin28 이루어진 조합 등이 알려져 있다(K. Takahashi and S. Yamanaka, Cell 126:663-676 (2006); WO 2007 / 069666; M. Nakagawa et al. , Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008); K. Takahashi et al., Cell 131:861-872 (2007); J. Yu et al., Science 318:1917-1920 (2007); J. Liao et al., Cell Res. 18, 600-603 (2008)). 배양 예로는 마이토마이신 C 처리한 마우스 태아 섬유아 세포는(예를들면, STO) 피더세포로, 상기 피더세포 층에서 ES 세포 배지를 사용하여 벡터 도입 체세포(약 104 ~ 105 세포 /cm2) 약 37℃의 온도에서 배양하는 것을 포함한다. 피더 세포는 반드시 필요한 것은 아니다(Takahashi, K. et al., Cell 131:861-872 (2007)). 기본 배지의 예를 들면, 둘베코변형이글배지(dulbecco’s modified eagle medium; DMEM), 햄 F-12( Ham's F12) 배지, 이들의 혼합 배지 등이며, ES 세포 배지, 마우스 ES 세포 배지, 영장류 ES 세포 배지(리프로셀(ReproCELL) 사) 등을 사용할 수 있다.
ES 세포와 iPS 세포는, 생식 계열에 기여하는 것으로 알려져 있기 때문에 목적 유전자 또는 DNA를 포함하는 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터를 도입한 이들 세포를, 상기 세포에서 유래하는 유사한 포유 동물의 배아 배반포에 주입하고, 이 배아를 대리부모의 자궁에 이식하고 출산하는 것을 포함하는 기법에 의해, 비인간 동물(또는, 형질 전환 동물(인간을 제외))을 만들 수 있다. 그리고 상기 수득한 암수의 형질 전환 동물을 교배하여 호모 접합성에 동물, 또는 그 자손 동물 수득할 수 있다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터를 통해 ES 세포나 iPS 세포 등의 분화 다능성 세포, 기타 위의 세포 류에 인간 항체 유전자 질환 치료용 유전자, 약물 대사 관련 유전자와 같은 외래 유전자 또는 DNA를 도입하여 인간 항체를 생산가능하게 하는 세포와 비인간 동물을 제작할 수 있도록, 또한 치료용 단백질을 생산 가능하게 하는 세포를 제작하는 수 있고, 또한 약물 대사 관련 질환 등의 질환 모델 아닌 인간 동물을 제작할 수 있다.
그러한 비인간 동물에서는, 마우스 인공 염색체 벡터에 포함되는 외래 유전자에 대응하는 내재 유전자가 파괴되고 또는 내재 유전자의 발현이 저하되는 것이 바람직할 수 있다. 파괴의 방법으로는 진 타겟팅 방법을 사용할 수 있다. 내재 유전자의 발현 저하법에는 RNAi 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 외래 유전자의 예로는 약물 대사 관련 유전자, 인간 항체 유전자 등을 들 수 있다. 내재 유전자가 파괴된 비인간 동물은 외래 유전자를 포함하는 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 키메라 비인간 동물 또는 그 자손, 이에 해당하는 내재 유전자 클러스터째 결시시킨 키메라 동물 또는 자손을 교배시킴으로 얻어진다. 상기 내재 유전자 헤테로가 결실된 동물끼리 더욱 교배시켜서 수득할 수 있다.
위의 방법은 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포 및 유전자 변형 비인간 동물을 제작할 수 있다. 구체적인 비인간 동물 예제는 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 마우스와 쥐 등 설치류이다.
즉, 본 발명은 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 것을 특징으로 하는 세포와 비인간 동물을 제공한다.
또한, 본 발명이 비인간 동물에서 얻은 세포, 조직 또는 기관은 이들로부터, 외래 유전자에 의해 발현되는 단백질을 생산하는 세포주를 제작하는 데 사용하는 것도 가능하다.
(4) 유용한 단백질의 생산 방법
본 발명은 또한 외래 DNA 서열을 발현 가능하게 포함하는 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포를 배양하여 생산된 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 수득하는 것을 포함하는 단백질의 생산 방법을 제공한다.
단백질로, 예를 들면, 상기의 의료, 농업 등의 산업상 유용한 단백질 또는 폴리펩티드류를 들 수 있다. 이러한 단백질 또는 폴리펩티드류를 코딩하는 DNA를 프로 모터(및, 필요한 경우, 인핸서)의 존재 하에서 발현 가능하도록 마우스 인공 염색체 벡터에 삽입하고 적절한 세포로 형질 전환한다. 상기 수득한 세포를 배양하여 상기 DNA를 발현시켜 상기 단백질이나 폴리펩타이드를 생산하고 이것을 세포 또는 배지에서 회수한다.
세포는 포유 동물 세포 외에 Sf 세포와 같은, 곤충 세포, 조류 세포, 효모 세포, 식물 세포와 같은 진핵 세포의 사용도 가능하다.
배지를 포함한 배양 조건은 세포의 종류에 따라 선택하여 공지의 조건으로 배양 조건을 사용할 수 있다. 예를 들어, 동물 세포 배지로는 MEM 배지, DMEM 배지, Ham's F12 배지, Eagle's MEM 배지, 이스코브(Iscove) EME 배지, RPMI1640 배지 이러한 혼합 배지 등이 포함된다.
단백질 또는 폴리펩티드류의 회수(또는 분리)는 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, HPLC, FPLC 등 크로마토그래피 법, 염석법, 황산 암모늄 침전법, 유기 용매 침전법, 한외 여과법, 결정화 등 공지의 방법을 단독으로 또는 조합하여 실시할 수 있다.
(5) 인간 항체의 제조 방법
본 발명은 또한 인간 항체 유전자를 포함하는 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 상기 비인간 동물을 이용한 인간 항체를 생산하고, 상기 인간 항체를 회수하는 것을 포함한 인간 항체의 제조 방법을 제공한다.
인간 항체 유전자는 인간 IgG, IgM, IgA, IgD, IgE의 클래스 중 하나 또는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 중 하나의 서브 클래스를 코딩하는 유전자이다. 바람직한 인간 항체 유전자는 IgG 클래스 및 그 서브 클래스이다.
인간 항체는 2 개의 동일한 서열의 중쇠사슬(H)과 2 개의 동일한 서열의 경쇄사슬(L)로 구성되어 있으며, H 사슬도 L 사슬도 함께 가변 영역과 고정 영역으로 구성되어 있다. 인간 H 사슬 및 L 사슬의 가변 영역은 모두 세 가지 초 가변 영역 (N 말단에서 C 말단에 CDR1, CDR2, CDR3 순서)이라고 4 개의 프레임 워크 영역(N 말단에서 C 말단에 FR1 , FR2, FR3, FR4 순서)으로 이루어지고, 인간 H 사슬 및 L 사슬의 각각 3 개씩의 CDR 서열에 의해 항체 특이성이 결정된다.
인간 IgG 항체의 경우, 중쇄사슬인 μ사슬과 경쇄사슬인 λ 사슬 또는 κ 사슬로 구성되어 있으며, 이러한 항체 사슬 유전자는 각각, 인간 14 번 염색체, 22 번 염색체, 2 번 염색체에 존재한다. 본 발명에서 사용하는 인간 항체 유전자로서는 각 항체 유전자 자리를 포함하는 인간 염색체 단편을 사용하고, 이들을 다른 또는 동일한 마우스 인공 염색체에 통합한다. 항체 유전자 서열은 NCBI(미국) 데이터베이스 등에서 구할 수 있다. 상기 일련의 방법은 예를 들어 특개 2005-230020 호 공보에 기재되는 기술의 개량이다.
완전 인간 항체를 생산할 수 있는 비인간 동물은, 인간 μ 사슬 유전자 자리를 포함한 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 비인간 동물과 인간 λ사슬 유전자 좌 그리고/또는 인간 κ 사슬 유전자 자리를 포함한 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 동종의 비인간 동물과 교배하여 두 H 사슬과 L 사슬 유전자 자리를 보유하는 키메라 비인간 동물 및 그 자손 동물을 얻을 수 있다.
이렇게 제작되는 완전 인간 항체를 생산 가능한 비인간 동물(예를 들면, 마우스와 같은 설치류)에 특정 항원 펩티드 또는 항원 폴리펩티드를 면역하고 상기 동물의 혈액으로부터 인간 항체를 분리 것을 포함하는 방법으로 인간 항체를 생산할 수 있다.
혹은 특정 항원으로 면역 비인간 동물의 비장을 적출하고, 골수 세포와 융합시켜 단일 클론 항체를 생산하는 융합세포(hybridoma)를 얻는 것도 가능하다.
(6) 치료 물질의 스크리닝 방법
본 발명은 또한 질환 모델 동물인 상기 비인간 동물에 후보 약물을 투여하고, 상기 약품의 치료 효과를 평가하는 것을 포함하는 상기 질환을 치료하는데 효과적인 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
질환 모델 비인간 동물은 어떤 종류의 단백질의 결손, 변이 등에 의한 생물 기능 이상, 약물 대사 이상, 염색체 이상 등의 이상을 원인으로 하는 질환으로 인공적으로 제작된 동물이다. 염색체 이상을 가진 인간 동물 모델의 예로는 하기와 한정되지 않지만, 인간 18 번 또는 21 번 염색체 삼체성(Trisomy)을 가진 동물이다.
상기와 같은 비인간 동물은 유전자나 염색체에 상기와 같은 이상을 포함하는 유전자나 염색체 단편을 제작하고, 이를 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터에 내장하고, ES 세포 또는 iPS 세포에 도입하여 수정란의 배반 포에 주입하고 이 세포를 비인간 동물의 대리부모 자궁에 이식하고 출산하는 것을 포함하는 방법에 의해 수득할 수 있다.
위와 같이하여 제작된 비인간 동물에 후보에 약물을 투여하고, 상기 약물의 치료 효과를 평가하여, 상기 질환을 치료하는데 효과적인 물질을 스크리닝할 수 있다.
후보 약물은 예를 들면, 저분자 화합물, 고분자 화합물, (당)단백질, 펩티드,(인 또는 당) 지질, 당류 등이 있으나 이에 한정되지 않는다.
7) 약물 또는 식품의 약리 작용, 대사 또는 독성 시험 방법
본 발명의 실시예에 따르면, 본 발명은 또한 인간 약물 대사 관련 유전자를 포함하는 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 상기 비인간 동물 또는 상기 동물 유래 세포, 기관 또는 조직에 약물 또는 음식을 투여하고, 상기 약품 또는 식품의 약리 작용 및/또는 대사 및/또는 독성을 측정하는 것을 포함하여 약물 또는 식품의 약리 작용 및/또는 대사 및/또는 독성 시험 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 인간 약물 대사 관련 유전자를 포함 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 상기 비인간 동물에서 얻은 마이크로좀(microsome) 또는 마이크로좀 분획 S9를 배양 세포 또는 세균을 약물 또는/및 식품과 함께 배양하여 약물 또는 식품이 상기 세포 또는 세균에 미치는 (악)영향(예를 들어 변이 등)을 측정하는 것을 포함하여 약물 또는 식품의 독성 시험 방법을 제공한다.
인간 약물 대사 관련 유전자는 상기에서 예시한 것이다. 또한, 비인간 동물의 개발 방법도 상기 기재한 것과 마찬가지이다.
인간 약물 대사 관련 유전자를 가진 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 상기 비인간 동물을 이용하는 상기 방법에서는, 예를 들면, 상기 동물의 상태를 관찰, 장기 및 염색체에 미치는 영향의 시험 등에 따라 약물 또는 식품의 약리 작용, 대사 또는 독성을 판정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 방법은 상기 비간 동물에서 얻은 마이크로좀 또는 마이크로좀 분획 S9(9000g 분획이며 가수 분해, 환원, 산화, 결합 등을 촉매하는 다수의 효소를 포함하는 분획)를 배양 세포(특히 동물 세포, 바람직하게는 포유류 세포) 또는 박테리아(바람직하게는 살모넬라균)과 함께 약물 및/또는 식품의 존재하에서 배양한다. 약물 또는 식품의 세포 독성 검출은 목적(aims) 시험 또는 소핵 시험으로 할 수있다. 목적 시험에서는 살모넬라균 변종에 따라 독성을 판정한다. 소 핵 시험은 세포 핵의 염색체 이상을 기반으로 독성을 판정한다. 이 시험법은 잘 알려져 있으며, 본 발명의 방법으로 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명의 범위는 하기 구체적인 예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
[실시예 1]
마우스 인공 염색체 벡터 MAC 구축
마우스 염색체에 텔로미어(Telomere) 절단을 수행하여 내재 유전자를 포함하지 않는 마우스 인공 염색체 MAC[DT40 (B6bT)를 구축하였다(도 1).
[A] A9 세포와 마우스 섬유아 세포(neo; mChr11-BSr) 하이브리드 세포 수립
약제 내성 유전자(Bsr 유전자)로 표시된 마우스 11 번 염색체를 함유하는 마우스 섬유아 세포인 mouse embryonic fibroblast(mChr11-BSr)과 공지 마우스 A9 세포에 G418 내성 유전자인 neo 유전자를 삽입한 mosue A9(neo)를 세포 융합하고, 약제 내성 유전자로 표시된 마우스 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포인 mouse A9xmouse embryonic fibroblast hybrid(neo; mChr11-BSr)를 수립한다. 약제 내성 유전자로 표시된 마우스 염색체를 미세 핵세포 융합법에 의해 상동조환 빈도가 높은 닭 DT40 세포에 도입하기 위해서, 미소 핵 형성율이 높은 것으로 알려진 마우스 A9 세포에 약제 내성 유전자로 표지 된 마우스 염색체를 세포 융합에 의해 도입하였다.
[A.1] 세포 융합 및 이중 약제 내성 클론의 단리
일본 클레어사로부터 사용 가능한 C57B6 계통의 마우스 태아를 수립하고, 약제 내성 유전자(Bsr 유전자)를 마우스 염색체에 삽입한 마우스 섬유아 세포인 mouse embryonic fibroblast(mChr11-BSr)과 G418 내성 유전자인 neo 유전자가 삽입되어있는 마우스 A9 세포인 mosue A9 (neo)를 각각 PBS (-)로 세포 표면을 세척한 후, 트립신 첨가하여 세포를 분산하고 배양액 (10 % FBS, DMEM)에 현탁하고, 각각의 세포 1×106개를 배양 플라스크(25cm2)에 동시에 심어 하루 동안 배양하였다. PBS (-)로 세포 표면을 두 번 세척 후 3 ml의 PEG(1:1.4) 용액 [5 g, PEG1000, cat : 165-09085, wako를 무혈청 DMEM 6 ml에 용해시켜 디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide) 1 ml를 가하고 여과 및 멸균한다] 1 분간 처리하고, 3 ml의 PEG(1:3) 용액 [5g, PEG1000, cat : 165-09085, wako를 무혈청 DMEM 15 ml에 용해시켜 여과 멸균한다]으로 바꾸어 1 분간 처리했다. PEG 용액을 흡입 후, 무혈청 DMEM으로 3 회 세척하고 일반 배양액(10 % FBS, DMEM)에서 하루 동안 배양하였다. PBS (-)로 세포 표면을 세척한 후 트립신 첨가하여 세포를 분산, G418 (800 μg/ml) 및 블라스티시딘(Blasticidin) S (4μg/ml)를 포함한 이중 선택 배양액(10 % FBS, DMEM)에 현탁한 세포를 플라스틱 배양 접시에 심어 2 ~ 3 주 선택 배양하였다. 2회의 세포 융합에서 얻은 총 3 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석에 사용하였다(클론 이름: mouse A9xmouse embryonic fibroblast hybrid (neo; mChr11-BSr)).
[A.2] 잡종 세포의 선택
[A.2.1] PCR
이중 약제 내성으로 클론에서 게놈 DNA를 추출하고, 하기의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 약제 내성 유전자(Bsr 유전자)로 표시된 마우스 염색체가 보유되는 것을 확인하였다.
Bsr R1: 5'CATGTGGGAGCGGCAATTC3 '(서열 번호 1)
Bsr L1: 5'TTGAGTGGAATGAGTTCTTCAATCG3 '(서열 번호 2)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold(Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도, 사이클 조건은 95℃ 10분의 가열 변성 후, 94℃ 30 초, 60℃ 30 초, 72℃ 30 초를 35 사이클 수행하였다. PCR 결과 3 클론 중 3 클론이 양성이었다.
Figure 112012061265489-pct00001
[A.2.2] 퀴나쿠린(Quinacrine) · 훽스트(Hoechst) 이중 염색
상기 PCR 분석을 통해 양성이었던 클론에 대해 퀴나쿠린·훽스트 이중 염색을 실시하였다. 퀴나쿠린·훽스트 이중 염색은 먼저 50 ml의 맥클베인(McIlvaine) 용액[구연산(citric acid) 수화물 11.18 g과 인산수소이나트륨(disodium hydrogen phosphate) 13.29 g을 1L의 물에 용해시켜 오토클레이브 한다]에 염색체 슬라이드를 담그고, 이어 50 ml의 맥클베인 용액이 60 μg/ml가 되도록 퀴나쿠린[cat : Q2876, SIGMA]을 용해한 것에 20 분간 담그고, 수돗물로 염색체 슬라이드 뒷면을 세척한 후, 맥클베인 용액에 담그고 50 ml의 맥클베인 용액에 0.5 μg/ml이 되도록 훽스트[cat: B-2883]를 용해한 것을 15 분 담근 후, 커버 유리로 덮었다. 형광 현미경으로 관찰한 결과, 3 클론 모두에서 정상 핵형인 2n 부분이, 대부분의 핵형이 4n 이상이 되어 있었다. 특히 클론 A9(21-B6b) 7에 있어서, 약제 내성 유전자 (Bsr 유전자)로 표시된 마우스 염색체를 보유하는 마우스 섬유아 세포와 G418 내성 유전자인 neo 유전자가 삽입되어있는 마우스 A9 세포가 일 대 일로 세포 융합한 것을 확인하였다(도 6).
Figure 112012061265489-pct00002
이상의 결과에서, mouse A9xmouse embryonic fibroblast hybrid(neo; mChr11-BSr)에 있어서, 표지 된 마우스 염색체를 보유하고 있다고 결론 지었다.
[B] 약제 내성 유전자로 표지 된 마우스 염색체의 DT40 세포에 도입
약제 내성 유전자로 표지 된 마우스 염색체를 함유하는 마우스 A9 잡종 세포인 mouse A9xmouse embryonic fibroblast hybrid(neo; mChr11-BSr)에서 약제 내성 유전자로 표지 된 마우스 염색체를 닭 DT40 세포인 DT40에 도입하였다. 마우스 염색체 번호 동정 및 인공 텔로미어 삽입에 의한 염색체 부위 특이적 절단이 있는 텔로미어 절단, 및 상동 재조합에 의해 마우스 염색체 DNA 서열 삽입 부위인 loxP 서열의 삽입을 효율적으로 하기 위하여, 약제 내성 유전자로 표지 된 마우스 염색체를 미세 핵 세포 융합법에 의해 상동재조합이 높은 닭 DT40 세포인 DT40에 도입한다.
[B.1] 미소 핵 세포 융합 및 약제 내성 클론의 단리
염색체 동정 및 염색체 개변을 효율적으로 수행하기 위해서, 마우스 염색체 A9 잡종 세포 클론인 A9xmouse embryonic fibroblast hybrid(neo; mChr11-BSr) 7로부터 상동 재조합 빈도가 높은 닭 DT40 세포인 DT40에 도입하였다. 플라스크 × 24로 배양하고 있던 공여세포(donor cell)인 A9xmouse embryonic fibroblast hybrid (neo; mChr11-BSr) 7이 각각의 플라스크에서 70 % 컨플루언트(confluent) 된 시점에서 콜세미드 처리(콜세미드(colcemid) 0.05 μg/ml, 20 % FCS, DMEM)를 37℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 수행하였다. 콜세미드 작업이 끝나면 플라스크의 m배지를 뽑아내고(aspirate), 상기 플라스크의 9 정도의 분량까지 시토칼라신 (cytochalasin) B로 채웠다. 플라스크를 대형 고속 원심 분리기(BECKMAN) 전용에 용기에 넣고, 온탕(34 ℃)에 플라스크가 잠기지 않을 정도로 한 후, 추가 원심분리 (Rortor ID10.500 8,000 rpm, 1h, 34 ℃)를 수행하였다. 원심 분리 후, 시토칼라신 B를 회수하여 각 플라스크의 펠렛을 각각 2 ml의 무혈청 배지 DMEM에서 15 ml 튜브로 회수했다. 8μm → 5μm → 3μm 필터 순서대로 천천히 필터레이션 후 각각의 튜브를 원심분리(1,200 rpm, 5 분 R.T)하여 상청을 뽑아낸 후, 각 튜브의 펠렛을 정리하여 5 ml의 무혈청 배지 DMEM 회수, 현탁하고 원심분리(2000rpm, 5 분)를 수행하였다.
수용자(recipient) 세포인 DT40 세포는 부유 세포이기 때문에, 일단 부착 상태로 할 필요가 있다. DT40을 6 구멍 플레이트(Nunc) 중 1 구멍에 부착시키기 위해 50 μg/ml으로 조정한 폴리-L-리신(SIGMA) 1.5 ml로 1 구멍을 37℃, 야간에 배양한 것으로 코팅하였다. 폴리-L-라이신을 회수하고 플레이트를 PBS(-)로 세척하고, 약 1×107 개의 DT40 세포를 2 ml의 무혈청 배양액(DMEM)에서 플레이트에 조용히 고정하였다. 플레이트마다 원심 분리기(Beckman)를 설정하고 37℃, 1200 rpm, 3 분간 원심 분리하여 부착 DT40 수득하였다.
정제한 미소 핵 세포를 PHA-P(SIGMA)를 포함 무혈청 배양액 2 ml에 다시 현탁하여 무혈청 배양액(DMEM)을 제거한 부착 DT40에 조용히 접종했다. 플레이트를 37℃, 1200 rpm, 3 분간 원심분리 하였다. 상청을 제거하고 PEG1000(Wako) [5 g의 PEG1000를 무혈청 DMEM 배지에 완전히 용해하고, 디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide)를 1 ml 첨가하여 여과 멸균] 용액을 1 ml하고 정확하게 1 분간 융합했다. 무혈청 배양액(DMEM)을 4 ml로 4 회 세척하고, 일반적인 DT40의 배양액 3 ml로 피펫팅하여 부착 DT40을 부유 상태로 되돌리고, 37℃, 24 구멍 플레이트 2장에 접종하고 밤 동안 배양하였다. 블라스티시딘(Blasticidin) S를 1500 μg/ml되도록 첨가하여 3 ~ 4 주 선택 배양하였다. 1회의 미소 핵 세포 융합으로 얻은 총 2 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석했다(클론 이름: DT40 (mChr11-BSr)).
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] FISH 분석
상기에서 수득한 DT40(mChr11-BSr)의 클론에 대하여 Shinohara의보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 수행 결과, DT40 (mChr11-BSr) -1에서 95%로 정상 핵형 (2n) 당 마우스 염색체 수가 1 카피이었기 때문에, 이후의 분석을 실시하였다(도 7).
Figure 112012061265489-pct00003
[B.2.2] DT40에 도입된 약제 내성 유전자로 표시된 마우스 염색체의 동정
Kai 등(Cell Res, 19:247-58, 2009)의 보고에 기록된 방법으로 SKY-FISH를 실시했는데, 닭 DT40 세포에 도입된 마우스 염색체는 마우스 11 번 염색체 것으로 나타났다 (도 8).
[C] 닭 DT40 세포 내의 마우스 11 번 염색체 영역 AL671968부터 윈위의 텔로미어 절단의 부위 특이적 절단
마우스 인공 염색체 벡터로서 도입 목적 유전자 이외의 내재 유전자는 적은 것이 실험에 미치는 영향이 감소되고, 내재 유전자 중에 각인유전자(imprinted gene)처럼 마우스 개체 발생 유전자 발현 량의 변화에 따른 영향을 미치는 유전자를 최대한 남기지 않는 것이 필요하기 때문에 마우스 장완의 대부분을 제거한다.
[C.1] 텔로미어 (Telomere) 절단 벡터 제작
단완 근위 부위 특이적 절단용 기본 벡터는 pBS-TEL/puro 컨스트럭트(construct)(Kuroiwa et al. Nature Biotech 2002)를 이용했다. GenBank 데이터베이스에서 얻은 마우스 11 번 염색체 장완 근위의 염기 서열(AL671968)에서 상동 재조합 표적 서열을 디자인했다. DT40 (mChr11-BSr)에서 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 하고, 상동 재조합 표적 서열을 PCR 증폭하기 위한 프라이머의 서열은 다음과 같다.
m11 17L: 5'-CGAGGATCCCACATTGGTAGTCTTTTCACTGCCATCA-3 '(서열 번호 3)
m11 17R: 5'-CGAGGATCCCCACTTAACTTTTCCAGGCTTACGGAGA-3 '(서열 번호 4)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600을, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 권장 조건을 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분열변성 후, 98℃ 10 초, 65℃ 8 분을 35 사이클 반복하여, PCR 산물을 BamHI (TAKARA)에서 절단하고, 아가 로스겔에 의해 분리 정제 후, pBS- TEL/puro의 BamHI 사이트에 클로닝 하였다(벡터 명: pBS-TEL/puro_MAC). 타겟팅 벡터 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자(allele)를 도 9에 나타내었다.
[C.2] 상동 재조합체의 선별
마우스 11 번 염색체 영역 AL671968에서 원위에 부위 특이적으로 절단하는 벡터는 상기 pBS-TEL/puro_MAC를 이용하여 형질 전환을 실시하고, 퓨로마이신(Puromycin) 내성 및 블라스티시딘(Blasticidin) S 비내성 클론의 분리 및 상동 재조합체를 선별하였다. 그 결과, 마우스 11 번 염색체 영역을 절단할 수 있는 5 클론을 확인하였다(클론명: DT40 (MAC)). 타겟팅 벡터 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 9에 나타내었다.
[C.3] mono-color FISH 해석에 의한 약제 내성 클론의 선별
상기 실시예를 통해 수득한 DT40(MAC) 5 클론에 대하여 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA를 프로브한 FISH 분석을 수행한 결과, 5 클론 중 2 클론에서 마우스 11 번 염색체 장완 부분이 중심체 근처에서 절단되는 것을 확인하였다(도 10).
Figure 112012061265489-pct00004
이상의 결과에서, 추가 마우스 염색체 장완이 제거된 마우스 인공 염색체 MAC을 구축할 수 있다고 결론 지었다. 마우스 인공 염색체 벡터 MAC를 보유하는 닭 DT40 세포인 DT40 (MAC)-1은, 식별 명칭을 DT40 B6bT-1로서, 독립 행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물기탁센터(일본국 이바라키현 쓰쿠바시 동 1 쵸메 1 번지 1 중앙 제 6)에 2009년 5월 14일자로 부다페스트 조약의 규정에 따라 국제 기탁하고, 수탁 번호 FERM BP-11128을 부여받았다.
[실시예 2] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 구축
마우스 인공 염색체 MAC에 DNA 삽입 서열로 GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 서열을 삽입하는 것으로, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1를 구축하고, MAC1의 마우스 ES 세포에서의 안정성을 검증하고, MAC1을 도입한 자손 전달 마우스를 제작하는 것으로, 개체 조직의 안정성을 검증하였다.
[A] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC에 GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 서열의 삽입
[A.1] GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 타겟팅 벡터 제작
DT40 (MAC)에 loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V913 (Lexicon genetics)을 이용하였다. loxP 삽입 부위인 마우스 11 번 염색체의 DNA 서열은 GenBank 데이터베이스에서 확인하였다(BX572640.9). 약제 내성 클론에서 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 하고, 상동재조합의 두 표적 서열의 증폭에 사용된 프라이머(primer)의 서열은 다음과 같다.
m11 5L : 5'-TGACAGAGAGCTTCCTCCTGCCTCTGTA-3 '(서열 번호 5)
m11 5R : 5'-CTAAAGACCCTCATGCTCCTGTGTGGAA-3 '(서열 번호 6)
m11 6L : 5'-GTTCAACCTGAGCTCCACATCATGCTC-3 '(서열 번호 7)
m11 7R : 5'-CACTCTTTACCCCTCACCGCTAACCTTG-3 '(서열 번호 8)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분 열변성 후, 98℃ 10 초, 68℃ 5 분을 35 사이클 반복하였다.
각각의 PCR 산물을 BglII (TAKARA)에서 절단하여 아가로스겔에 의해 분리 정제한 후, V913의 BglII 또는 BamHI 사이트에 클로닝 하였다(벡터명: VH21-12). 3'HPRT-loxP는 V820(Lexicon genetics)의 XbaI 사이트에 올리고 합성 loxP 서열을 클로닝했다. HPRT 유전자의 3 번째에서 9 번째 엑손(exon)인 3'HPRT-loxP를 V907 (Lexicon genetics)의 EcoRI과 AscI에 클로닝 하였다(벡터 명: X3.1). 또한, X3.1의 KpnI 사이트와 EcoRI 사이트에 KpnI과 NotI으로 자른 PGKneo 서열을 클로닝 하였다(벡터명: X4.1). X4.1에서 KpnI과 AscI으로 자른 PGKneo-loxP-3'HPRT를 V913의 KpnI 사이트 및 AscI 사이트에 클로닝했다(벡터 명: pVNLH). pVNLH의 EcoRV 사이트에 NotI과 SalI로 절단한 후 평활화를 행한 HS4-CAG-EGFP-HS4(오사카, 오카베 박사와 NIH, Felsenfeld 박사로부터 분배)를 클로닝했다(벡터 명: pVGNLH). pVGNLH에서 SalI과 AscI으로 자른 GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 카세트를 VH21-12 XhoI 사이트 및 AscI 사이트에 클로닝 하였다(벡터 명: pMAC1). 타겟팅 벡터는 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 11에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 G418 내성 클론의 단리
닭 DT40 세포의 배양은 10% 소 태아 혈청(기부코 이하, FBS로 한다), 1% 닭 혈청(기부코), 10 - 4 M 2 - 메르캅토 에탄올(mercaptoethanol)(시그마)을 첨가한 RPMI1640 배지(기부코)에서 실시했다. DT40(MAC) -1의 약 107개의 세포를 무첨가 RPMI1640 배지에 한번 세척하고, 0.5 ml의 무첨가 RPMI1640 배지에 현탁하고, 제한 효소 NotI(TAKARA)에서 선형화된 타겟팅 벡터 pMAC1을 25μg 더하고, 전기천공법 (electroporation)의 큐벳트(cuvette)(바이오 래드)로 옮겨 실온에서 10 분간 방치했다. 큐벳트를 진 펄스(Gene Pulser)(바이오 래드)로 설정하고, 550V, 25μF 조건에서 전압을 공급하였다. 실온에서 10 분간 정치한 후, 24 시간 배양하였다. G418 (1.5 mg/ml)를 포함하는 배지로 교체하고 96 웰(well) 배양 접시 2 개에 분주하여 약 2 주간의 선택 배양하였다. 2 번의 형질 전환으로 얻은 총 14 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (MAC1)).
[A.3] 상동재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
G418 내성주의 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 마우스 11 번 염색체에서 부위 특이적 재조합 일어나고 있는지 확인했다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
kj neo : 5'-CATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACG-3 '(서열 번호 9)
m11 7R (상기 기재)
m11 5L (상기 기재)
EGFP-F (L) 5'-CCTGAAGTTCATCTGCACCA-3 '(서열 번호 10)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부 된 권장 조건에 따라 실시하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분 열변성 후, 98℃ 10 초, 68℃ 7 분 35 사이클 반복하였다. PCR 결과, 88 클론 중 2 클론이 모든 프라이머 세트 양성이었기 때문에 이 두 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00005
[A.3.2] two-color FISH 분석
상기 실시예에서 수득한 DT40 (MAC1)-52와 DT40 (MAC1)-58에 있어서, two-color FISH 분석을 마쓰바라등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA 및 GFP-PGKneo-loxP-3'HPRT 카세트를 프로브로하여 FISH 분석을 실시한 결과, loxP 서열이 타게팅되는 마우스 11 번 염색체 단편의 중심체 부근에 프로브 유래 FITC 신호가 검출되었고, 네거티브 컨트롤의 타겟팅하기 전에 마우스 11 번 염색체 단편(예 DT40 (MAC) -1)에서는 나타나지 않은 신호가 검출된 것부터, 부위 특이적 재조합이 일어난 것을 시각적으로 확인할 수 있었다(그림 12). 이러한 결과에서, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 보유하는 DT40 세포 클론을 수득할 수 있다는 결론을 얻을 수 있었다.
Figure 112012061265489-pct00006
[B] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 DT40 세포에서 MAC1의 CHO 세포에 도입
CHO 세포를 통해서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1을 마우스 ES 세포에 도입하기 위하여, 또는 CHO 세포에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1의 DNA 서열 삽입 부위인 loxP를 통해 안정적으로 목적 유전자 (군) 등, 예 CYP3A 클러스터 등을 삽입하기 위해 CHO 세포에 도입한다.
[B.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40 (MAC1) 52 및 58을 사용하여, 상기와 같이 CHO hprt 결손 세포(인간 과학 연구 자원 뱅크에서 입수, 등록 번호 JCRB0218)인 CHO(HPRT-)에 미소 핵 세포 융합법을 수행하였다. 2회 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 24 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC1))
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
G418 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 재조합체를 선별하기 위하여, 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 인공 염색체 MAC1을 CHO 세포에 도입되어 있는지 확인하였다. 프라이머 서열은 다음과 같다.
kj neo (상기 기재)
m11 7R (상기 기재)
m11 5L (상기 기재)
EGFP F (L) (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 권장 조건에 따라 수행하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분 열변성 후, 98℃ 10초, 68℃ 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과 24 클론 중 20 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 20 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00007
[B.2.2] mono-color FISH 분석
상기 실시예에서 수득한 CHO(HPRT-; MAC1) 20 클론에 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 20 클론 중 5 클론에서 95%의 비율로 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1이 CHO 세포에 도입되는 것을 확인하였다(도 13).
Figure 112012061265489-pct00008
이상의 결과에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1이 CHO 세포에 도입될 수 있는 것을 확인하였다.
[C] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1을 보유하는 CHO 세포로부터 마우스 ES 세포로 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 도입
마우스 ES 세포 및 마우스 개체 내에서의 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1의 안정성을 검증하기 위하여, 마우스 인공 염색체 MAC1을 마우스 ES 세포에 도입하고, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 키메라 마우스 및 자손 전달 마우스를 제작하였다.
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 CHO (HPRT-; MAC1)-3, 5, 8, 22를 세포 배양 접시에서 배양하고 컨플루언트(confluent)된 시점에서, 20 % FBS, 0.1μg/ml 콜세미드 (colcemid)를 첨가한 F12 배지로 교체하고, 48 시간 배양 후, 20 % FBS, 0.1μg/ml 콜세미드를 첨가한 F12 배지에서 배지 교환하고, 오버 나이트로 배양한 후, 마이크로셀(microcell)을 형성시켰다. 배양액을 제거하고, 미리 37℃로 보온한 사이토 칼라신(cytochalasin) B (10μg/ml, 시그마) 용액을 원심분리용 플라스크에 채우고 34℃, 8000 rpm, 1 시간 동안 원심분리를 수행하였다. 마이크로셀을 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여, 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후, 2000 rpm, 10 분간 원심 분리하여, 무혈청 DMEM 배지 5 ml에 현탁하였다. 마이크로셀을 5 ml의 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여, 8μm, 5μm, 3μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 2000 rpm, 10 분간 원심분리 하였다.
공여 세포에는 C57B6 계통 마우스의 ES 세포인 B6-ES, 및 B6-ES 세포에 6TG 처리한 HPRT 결핍 변이인 B6(HPRT-), 및 C57B6xCBA 계통 F1 마우스의 ES 세포인 TT2F, 및 TT2F 세포에 6TG를 처리한 HPRT 결핍 변이인 KO56 (HPRT-)를 이용하였다. 배양에는 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium-high glucose : SIGMA), 10% FCS, LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor), 1×10-5M 2-ME (2-mercaptoethanol: SIGMA), L-글루타민(3.5g/ml: GIBCO), Sodium pyruvate solution (3.5g/ml: GIBCO), MEM Nonessential amino acid(0.125mM : GIBCO)를 첨가하여 5 % CO2, 37℃에서 배양을 수행하였다. 마우스 ES 세포를 PBS (-)에서 세포 표면을 두 번 세척 후, 트립신(trypsin) 처리에 의해 세포를 분산시켜, DMEM 배지에 10% FBS를 첨가한 배양액에서 회수하고, 1500 rpm에서 원심 분리하여 상청을 제거하고, 무혈청 배양액 5 ml에 다시 현탁하여 마이크로셀을 원심분리 후 펠렛을 포함하는 무혈청 배지에 조용히 첨가하고, 1200 rpm에서 원심분리하였다. 상청을 제거하고 PEG1000(Wako) 용액[5g의 PEG1000를 무혈청 DMEM 배지에 완전히 용해, 디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide)을 1 ml 첨가하여 여과 멸균]을 0.5 ml로 정확하게 1분 30초 동안 융합하였다. 13 ml의 무혈청 배양액(DMEM)을 조용히 첨가하여, 1200 rpm에서 원심분리를 수행하였다. 상청을 제거하고 일반 마우스 ES 세포에 배양액을 첨가하고, 마이토마이신(mitomycin)을 처리한 G418 내성 마우스 태생 섬유아 세포를 피더(feeder) 세포로 사용하고, 직경 10 cm 세포 배양 접시 2장에 파종하고 오버나이트 동안 배양하였다. G418을 250 μg/ml되도록 첨가하여 3 ~ 4 주간 선택 배양하였다(클론 명: B6-ES (MAC1) 및 B6(HPRT-; MAC1) 및 KO56(HPRT-; MAC1)). B6-ES(MAC1) 및 B6(HPRT-; MAC1) 및 KO56(HPRT-; MAC1)는 각각 2 회의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 32 개의 내성 콜로니를 분리 증식시킨 이후 분석했다. TT2F (MAC1)은 4 개의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 30 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, FISH 분석 이후의 분석을 수행하였다.
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
G418 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여, 마우스 인공 염색체 MAC1이 마우스 ES 세포에 도입되어 있는지 확인하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 5L (상기 기재)
EGFP F (L) (상기 기재)
kj neo (상기 기재)
m11 7R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 권장 조건에 따라 수행하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변성 후, 98℃, 10 초, 68℃, 10 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 32 클론 중 30 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 중 14 클론에서 이후 분석을 수행하였다.
Figure 112012061265489-pct00009
[C.2.2] mono-color FISH 분석
상기 실시예에서 수득한 B6-ES(MAC1) 및 B6(HPRT-; MAC1) 및 KO56(HPRT-; MAC1)의 클론에 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 14 클론 모든 클론에서 85% 이상의 비율로 MAC1가 마우스 ES 세포에 도입되고 있는 것을 확인하였다. 또한, 정상 핵형인 내재 마우스 염색체의 갯수가 B6-ES의 경우 40 개 또는 KO56의 경우 39 개임을 확인하였다. B6(HPRT-; MAC1)의 경우 40 개의 핵형 클론을 얻을 수 없었다. 또한, 마찬가지로 TT2F(MAC1)은 7 클론에 대해 분석 7 클론 중 모든 클론에서 90% 이상의 비율로 도입되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라, 정상 핵형인 내재 마우스 염색체의 갯수가 39 개인 것을 7 클론 중 3 클론에서 확인하였다.
이상의 결과에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1가 마우스 ES 세포에 도입할 수 있었던 결론을 내렸다(도 14).
Figure 112012061265489-pct00010
[실시예 3] 마우스 인공 염색체 벡터 CYP3A-MAC 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 인간 약물 대사 효소 유전자 군인 CYP3A 클러스터 Cre/loxP 시스템을 이용하여 전좌 클로닝하고, CYP3A-MAC를 구축한다. 또한, CYP3A-MAC 마우스 ES 세포의 안정성을 검증하고 CYP3A-MAC을 도입한 자손 전달 마우스를 제작하는 것으로, 개체 조직의 안정성을 검증하였다. 또한, 자손 전달 마우스에서 CYP3A 유전자의 조직 특이적 유전자 발현을 확인하였다(도 2).
[A] 인간 7 번 염색체 AC004922에 loxP 서열의 부위 특이적 삽입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 loxP 서열을 통하여 전좌 삽입하기 위해서, DT40 세포 내에서 인간 7 번 염색체(hChr7)의 CYP3A 유전자 클러스터 근위의 AC004922에 loxP 서열을 삽입하였다.
[A.1] 타겟팅 벡터 pMPloxPHyg 제작
인간 7 번 염색체 CYP3A 유전자상의 매우 가까운 위치하고, 동시에 중심체 측(약 300 Kb 중심체 쪽)에 위치하는 AC004922 영역에 Cre 재조합 효소의 인식 서열 loxP를 삽입하기 위한, 타겟팅 벡터 pMPloxPHyg을 하기와 같이 제작하였다. 먼저, AC004922 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
p450loxP7L; 5'-GGCCTAGAGCCTGGACTCATTCATTCAA-3 '(서열 번호 11)
p450loxP7R; 5'-GACAGATGTCATGCCCCAGGTAGGTATG-3 '(서열 번호 12)
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V901(Lexicon genetics)을 이용하였다. PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq(타카 라 주조(takarashuzo))를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변성 후, 98℃, 20 초, 68℃, 7 분 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제(proteinase) K(GIBCO)를 처리한 후, CHROMASPIN-TE400(클론 텍)에서 젤 여과하였다. 그런 다음, 제한 효소 BamHI(베링거) 및 EcoRI(니뽄진(nippon gene)) 및 BglII (니뽄진(nippon gene))로 절단하여 CHROMASPIN-TE1000 (클론 텍)에서 젤 여과하였다. 이 PCR 단편(3.7 kb 및 3.0 kb)를 V901 플라스미드 EcoRI과 BamHI 또는 BglII 사이트에 클로닝 하였다(벡터 명: V901-NP21). 그런 다음, V901-NP21을 제한 효소 AscI(NEB) 및 KpnI로 절단하고, 카세트 벡터 5'HPRT-loxP-Hyg-TK(Kazuki등, Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에서 제한 효소 AscI 및 KpnI에서 loxP를 포함하는 DNA 단편을 잘라, 라이게이션하였다. loxP 서열 방향이 클로닝한 AC004922 게놈 단편과 같은 방향으로 타겟팅 벡터 pMPloxPHyg를 제작하였다. 최종 loxP 삽입 컨스트럭트(construct)의 크기는 12 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 (도 15a)에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
상기에서 설명한 것과 마찬가지로, 상기 실시예에서 제작한 타겟팅 벡터 pMPloxPHyg를 제한 효소 NotI (TAKARA)로 선형화한 후, W0 01/011951에 명시된 방법으로 제작된 인간 7 번 염색체 단편(AF006752 자리에서 부위 특이적으로 절단된다)을 보유하는 닭 DT40 세포(클론 DF141)에 형질 전환하고, 히그로마이신 (hygromycin) B (1.5 mg / ml)가 포함된 배지로 교체하고 96 웰 배양 플레이트 3 개에 분주하고 약 2 주간의 선택 배양하였다. 5 회 형질 전환에서 얻은 총 96 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (hChr7-loxP)).
[A.3] 상동 재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
히그로마이신(hygromycin) 내성 클론으로부터 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System 사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하고, 하기 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다.
이하, 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다.
p450loxP14L; 5'-AGTTCTTTTGAGGGCCTAGAGCCTGGAC-3 '(서열 번호 13)
p450loxP14R; 5'-AAAGGACAGAAGGAGGGAGCAACAGGAT-3 '(서열 번호 14)
p450loxP16L; 5'-TCTGGGCATCAGTGTCCTCTCCAGTAAA-3 '(서열 번호 15)
p450loxP16R; 5'-TTGGCGACATCCAATGCTAGTGCTATTC-3 '(서열 번호 16)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변성 후 98℃, 10 초, 68℃, 4 분 35 사이클 수행하였다. 96 클론을 선별 결과, 36 클론이 상동 재조합체로 동정 되었다.
[A.3.2] 서던 블롯 분석
상기 PCR 분석에서 재조합을 확인한 6 클론에 대해 다음과 같이 서던 블롯 분석을 실시하였다. 이 게놈 DNA를 제한 효소 EcoRI(TAKARA)로 처리, 0.8% 아가 로스 겔에 전기 영동하고, GeneScreen PlusTM 하이브리다이제이션 (hybridization) 전송 멤브레인(NENTM Life Science Products, Inc.)에 알카리 블롯팅(alkali blotting)을 수행하였다. 이 필터에 대하여 AC004922의 유전자 서열을 PCR에 의해 증폭한 MPp 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)을 수행하여, 상동 재조합체를 동정하였다. MPp 프로브의 제작은 다음의 프라이머를 이용해 DF141의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 실시하여 그 PCR 산물을 주형으로 임의로 프라이밍(priming)에 의한 32P 표식 DNA 프로브를 제작하였다(아머샴(Amersham) 첨부 프로토콜에 따라 수행하였다).
MPp 프로브 제작용 프라이머:
MPp6L; 5'-TGGAGACGTTGTTTAGCCTCTCCTCCTC-3 '(서열 번호 17)
MPp6R; 5'-CACAGCTTAGAGGCCATTCCCATAGTCC-3 '(서열 번호 18)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 EX Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 93℃, 5 분 열변성 후, 93℃, 1 분, 54℃, 1 분, 72℃ 1 분을 1 사이클로 35 사이클 반복하였다. 서던하이브리다이제이션(Southern hybridization)에 의해 비상동 재조합체는 약 10.9 kb, 상동 재조합은 약 8.9kb 밴드가 검출되는 것으로 예측되었다(도 15b). 서던 하이브리다이제이션(Southern hybridization)의 결과, 6 클론 중 모든 클론이 목적 상동 재조합체였다.
[A.3.3] two-color FISH 분석
FISH 분석 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기 실시예에서 재조합을 확인한 클론 중 6 클론을 사람 cot-1 DNA 및 히그로마이신(hygromycin)를 프로브하고 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 7 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌 하지 않고, 7q22 근처에 히그로마이신 (hygromycin) 유래의 신호가 감지된 것부터 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다. 이상으로부터, 부위 특이적으로 삽입됐다고 결론 지었다. 결과는 인간 7 번 염색체 단편에 유전자 도입부위인 loxP 서열이 도입되었다.
[B] hChr7-loxP에 있어서의 사람 7 번 염색체 영역 AC073842에서의 부위 특이적 절단
WO 2009/063722(PCT/JP2008/068928)에 있는 것처럼, 인간 7 번 염색체의 CYP3A 유전자 클러스터에서 원위 쪽의 마우스 개체의 발생에 강하게 관여하는 유전자를 제거하기 위해 부위 특이적 염색체를 제거하기 위한 텔로미어(Telomere)를 절단하였다.
[B.1] 타겟팅 벡터 pTELhisD-PT 제작
인간 7 염색체 CYP3A 유전자 자리의 매우 근위하고 동시에, 텔로미어 측(약 150 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하는 AC073842 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하기 위한 타겟팅 벡터 pTELhisD-PT은 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AC073842 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
PT1L; 5'-TGCGGTGAAGGTCCAAGGAGATAGATTT-3 '(서열 번호 19)
PT2R; 5'-TCTAGCAGAGAGATGGTGGCAGGATTCA-3 '(서열 번호 20)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp9600를, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건으로 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변성 후 98℃, 20 초, 68℃ 8 분 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제(proteinase) K (GIBCO) 처리 후 CHROMASPIN-TE400(클론 텍)에서 젤 여과했다. 그럼 다음, 제한 효소 BamHI(베링거) 및 BglII (닛뽄진)로 절단하고, CHROMASPIN-TE 1000(클론 텍)에서 젤 여과했다. 이 PCR 단편을 플라스미드 pTELhisD(Kuroiwa 등, Nature Biotech., 20:88,2002)의 BamHI 부위에 클로닝 하였다. AC073842 게놈 시퀀스의 방향은 텔로미어(Telomere)→ 중심체(cetromere)이므로, 클로닝된 AC073842 게놈 단편이 사람 텔로미어 서열과 같은 방향 것으로 목표 타겟팅 벡터 pTELhisD-PT 제작하였다. 최종 장완 근위 부위 특이적 절단용 컨스트럭트(construct)의 크기는 14.4 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자는 (도 16)에 나타내었다.
[B.2] 형질 전환 및 히스티놀(Histidinol) 내성 클론의 단리
상기에서 설명한 것과 동일하게, 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pTELhisD-PT를 제한 효소 SrfI(도요(Toyobo))에서 선형화한 후, 상기에서 제작한 클론 DT40 (hChr7-loxP) 122로 형질 전환하고, 히스티놀 (Histidinol)(0.5 mg/ml)를 포함하는 배지로 교체하고, 96 웰w 배양 접시 10 장에 분주하여 약 2 주간의 선택 배양하였다. 5 회 형질 전환에서 얻은 총 335 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 이름 : DT40 (hChr7-loxP-tel)).
[B.3] 상동 재조합 체의 선별
[B.3.1] PCR 분석
히스티놀(Histidinol) 내성주는 게놈 DNA를 주형으로 재조합체를 선별하기 위하여, 일차 스크리닝으로서 절단 부위보다 텔로미어 쪽에 위치하는 하기 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 부위 특이적 절단이 일어난 있는지 확인했다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
COPS6-1L; 5'-TGAGGGTACTTGAAGGGCTGATG-3 '(서열 번호 21)
COPS6-1R; 5'-CAGGGGCTGCTCCCCTTTTATTA-3 '(서열 번호 22)
AP4M1-1L : 5'-CCTAACATCGTGTCCCAGCTCA-3 '(서열 번호 23)
AP4M1-1R : 5'-TCCTTTCAGACCCCTTCATCTTAG-3 '(서열 번호 24)
LRCH4-2L : 5'-TTCAGCCCCAACCAAAGACACTA-3 '(서열 번호 25)
LRCH4-1R : 5'-GCCCCGAACCCCTACAAATATAGA-3 '(서열 번호 26)
STAG3-1L : 5'-GGGCCTCCAATAAGTGTCCCATA-3 '(서열 번호 27)
STAG3-1R : 5'-TTGCTGACTTAGTTGCAGCAGGA-3 '(서열 번호 28)
PILRB-2L : 5'-CCCATTGGCAAGATACATGGAGA-3 '(서열 번호 29)
PILRB-2R : 5'-AGTGTGGATGCTCCTGGATGAAG-3 '(서열 번호 30)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 95℃, 10 분 가열 변성 후, 95℃, 20 초, 55℃, 30 초, 72℃ 30 초 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 433 클론 중 2 클론 양성이었다.
다음 상기 프라이머에서 검출되지 않은 433 클론 중 2 클론에 대해 다음의 프라이머를 이용하여 부위 특이적 상동 재조합이 일어나고 있는지 PCR에서 확인했다. 서열은 아래와 같다.
PT2R; (상기 기재)
hisD2 : 5'-GTAAACGCCCTCAAGGAGCAAGCATGA-3 '(서열 번호 31)
hisD3 : 5'-TGTGACCAAAGATTTAGCGCAGTGCGT-3 '(서열 번호 32)
상기 프라이머는 PCR은 LATaq(타카 라 주조(takarashuzo))를 이용하고 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분 열변성 후 98℃, 20 초, 68℃, 8 분 35 사이클 반복하였다. 부위 특이적 재조합이 일어난 2 클론에서만 약 8 kb의 밴드가 검출되었다. 네거티브 컨트롤의 DT40, DT40 (hChr7-loxP)에서는 밴드가 발견되지 않았다.
Figure 112012061265489-pct00011
[B.3.2] two-color FISH 분석
FISH 분석은 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기 실시예에서 재조합을 확인한 클론 중 2 클론을 사람 cot-1 DNA 및 히스티놀 (Histidinol)를 프로브한 FISH 분석을 실시한 결과, loxP 서열이 삽입된 사람 7 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 사람 7 번 염색체 단편 끝에 히스티놀 유래의 신호가 감지되었음을, 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다.
이상의 결과에서, 클론 DT40(hChr7-loxP-tel) 608 및 748에서 CYP3A 유전자 클러스터 영역보다 텔로미어 측의 AC073842로부터 원위에 있어서 절단할 수 있다고 결론을 내렸다.
Figure 112012061265489-pct00012
[C] hChr7-loxP-tel 함유 DT40로부터 hChr7-loxP-tel의 MAC1 함유 CHO 세포에 도입.
CHO 세포 내에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 loxP 서열을 통하여 인간 CYP3A 유전자 클러스터 영역을 전좌 삽입하기 위하여 hChr7-loxP-tel 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 CHO 세포에 도입하였다.
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40(hChr7-loxP-tel) 608 및 748을 사용하여, 상기와 동일하게 MAC1 함유 CHO hprt 결손 세포(인간 과학 연구 자원 뱅크에서 입수, 등록 번호 JCRB0218)인, CHO(HPRT- ; MAC1)에 미소 핵 세포 융합법을 실시하였다. 5 회 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 48 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다(클론명: CHO (HPRT-; MAC1, hChr7-loxP-tel)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
히그로마이신(hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출해서 주형으로서 재조합 체를 선별하기 위하여 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여, 사람 7 번 염색체 단편이 MAC1 함유 CHO 세포에 도입되고 있는지를 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 5L (상기 기재)
EGFP (F) L (상기 기재)
kj neo (상기 기재)
m11 6R : 5'-CCCAGGAATCAGTCAGGAAGGCTGTAA-3 '(서열 번호 33)
P450 loxP 14L : (상기 기재)
hyg F (244) : 5'-GAATTCAGCGAGAGCCTGAC-3 '(서열 번호 34)
hyg R (696) : 5'-GATGTTGGCGACCTCGTATT-3 '(서열 번호 35)
P450 loxP 16R : (상기 기재)
CYP3A4 R : 5'-GGCTGCATCAGCATCATCTA-3 '(서열 번호 36)
CYP3A4 F : 5'-GCAAGACTGTGAGCCAGTGA-3 '(서열 번호 37)
CYP3A5 R : 5'-TCAGCTGTGTGCTGTTGTTTGC-3 '(서열 번호 38)
CYP3A5 F : 5'-ATAGAAGGGTCTGTCTGGCTGG-3 '(서열 번호 39)
CYP3A7 R : 5'-GAGTTAATGGTGCTAACTGGGG-3 '(서열 번호 40)
CYP3A7 F : 5'-ACCCTGAAATGAAGACGGGC-3 '(서열 번호 41)
3A4 4L : 5'-TCCCCCTGAAATTAAGCTTA-3 '(서열 번호 42)
3A4 3R : 5'-TGAGGTCTCTGGTGTTCTCA-3 '(서열 번호 43)
3A7 3L : 5'-TCCCCCTGAAATTACGCTTT-3 '(서열 번호 44)
3A7 3R : 5'-CATTTCAGGGTTCTATTTGT-3 '(서열 번호 45)
PT2R : (상기 기재)
hisD1 : 5'-GTATTGGTCACCACGGCCGAGTTTCCGC-3 '(서열 번호 46)
hisD2 : (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, DGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후 98℃, 10 초, 68℃ 7 분 30 사이클 수행하였다. PCR 결과, 48 클론 중 19 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 중 음성 1 클론을 포함하여 20 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00013
Figure 112012061265489-pct00014

[C.2.2] two-color FISH 분석
상기 실시예에서 수득한 CHO(HPRT-; MAC1, hChr7-loxP-tel)의 19 클론에 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA 와 인간 Cot-1 DNA를 프로브한 FISH 분석을 실시한 결과, 상기 음성 1 클론을 제외한 18 모두에 대해 MAC1 및 hChr7-loxP-tel가 CHO 세포에 1 카피 또는 2 카피로 도입되어 있는 것을 확인하였다(도 17).
Figure 112012061265489-pct00015
Figure 112012061265489-pct00016

이상의 결과에서 hChr7-loxP-tel이 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 CHO 세포에 도입할 수 있었다고 결론 지었다.
[D] CHO(HPRT-; MAC1, hChr7-loxP-tel) 클론에 있어서, 인간 CYP3A 유전자 클러스터 영역 주변(AC004922-인간 CYP3A 유전자 클러스터-AC073842) 1 Mb의 MAC1 벡터에 부위 특이 전좌
1 Mb 크기의 DNA인 인간 CYP3A 유전자 클러스터를 마우스 개체에서 안정적으로 보유하기 위해 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1의 전좌에 삽입하였다(도 18).
[D.1] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
상기 실시예에서 수득한 CHO(HPRT-; MAC1, hChr7-loxP-tel) - 6, 9, 12, 47에 리포펙션(lipofection)법을 이용하여 유전자에 도입하고, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태가 된 6 웰 세포에 대해여, Cre 3 μg를 시판(인비트로젠(invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양에서 2 주간 배양하면, 내성 콜로니가 출현하고, 4 회 도입으로 수득한 총 42 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: CHO (CYP3A-MAC1, hChr7-△CYP3A)).
[D.2] 약제 내성 클론의 선별
[D.2.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 상호 전좌 클론을 선별하기 위해서, 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 사람 7 번 염색체 단편과 MAC1에서 염색체 상호 전좌가 발생하는지 확인하였다. 상기 프로이머 서열은 다음과 같다.
P450 loxP 16R (상기 기재)
hyg R (696) (상기 기재)
kj neo (상기 기재)
P450 loxP 14L (상기 기재)
m11 5L (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
CYP3A4 R (상기 기재)
CYP3A4 F (상기 기재)
CYP3A5 R (상기 기재)
CYP3A5 F (상기 기재)
CYP3A7 R (상기 기재)
CYP3A7 F (상기 기재)
3A4 4L (상기 기재)
3A4 3R (상기 기재)
3A7 3L (상기 기재)
3A7 3R (상기 기재)
TRANS L1 : 5'-TGGAGGCCATAAACAAGAAGAC-3 '(서열 번호 47)
TRANS R1 : 5'-CCCCTTGACCCAGAAATTCCA-3 '(서열 번호 48)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후 98℃, 10 초, 68℃, 7 분 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 42 클론 중 27 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 27 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00017
[D.2.2] two-color FISH 분석
상기 실시예에서 수득한 CHO(CYP3A-MAC1, hChr7-△CYP3A) 27 클론에 대하여 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA와 인간 Cot -1 DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 27 클론 중 25 클론에서 50% 이상의 비율로 loxP 서열을 포함하는 마우스 11 번 염색체 단편으로 구성된 MAC1에 사람 7 번 염색체 유래의 신호가 관찰되는 것을 확인하였다(도 19).
Figure 112012061265489-pct00018
Figure 112012061265489-pct00019
Figure 112012061265489-pct00020

이상의 결과에서, loxP 서열이 삽입된 사람 7 번 염색체 단편상에서 CYP3A 클러스터 1 Mb가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 상호 전좌에 의한 클로닝이 있었다고 결론 지었다.
[실시예 4] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2의 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC에 DNA 삽입 서열로 5'HPRT-loxP-PGKhyg 타입의 loxP 서열을 삽입한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2를 구축하였다(도 3). 5'HPRT-loxP-PGK hyg 타입의 loxP 서열은 Kazuki 등의 보고(Gene Therapy: PMID: 21085194,2010)에 기재된 21 번 염색체 유래의 GFP 탑재 HAC 벡터(21HAC2)에 삽입되며, HAC와 MAC의 유전자 발현을 같은 벡터에서 비교할 수 있다. 또한, 21HAC2에 삽입을 위한 유전자 도입 벡터를 벡터 제작 단계를 거치지 않고 그대로 이용 가능하다.
[A] 마우스 인공 염색체 MAC에 5'HPRT-loxP-PGKhyg 유형 loxP 서열 삽입
[A.1] 5'HPRT-loxP-PGKhyg 유형 loxP 타겟팅 벡터 제작
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드는 상기 실시예에서 제작한 VH21-12를 이용하였다. 상기 X6.1로부터 KpnI과 AscI에 의해 자른 5'HPRT-loxP-PGKhygro 카세트를 V907(Lexicon genetics)의 KpnI과 AscI 사이트에 클로닝 하였다 (벡터 명: p V907-AML). 또한 p V907-AML로부터 5'HPRT-loxP-PGK hygro 카세트를 XhoI과 SalI으로 잘라 VH21-12 XhoI 사이트에 클로닝 하였다(벡터 명: pMAC2). 타겟팅 벡터 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 20에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
상기 실시와 동일하게 제작한 타겟팅 벡터 pMAC2를 제한 효소 NotI(TAKARA)에서 선형화한 후에, 상기 실시예에서 제작한 클론 DT40(MAC)에 형질전환하고 히그로마이신(hygromycin)(1.5 mg/ml)을 포함한 배지로 교체하고, 96 웰 배양 플레이트 2 장에 분주하여 약 2 주간의 선택 배양하였다. 1 회의 형질전환으로 얻은 총 45 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (MAC2)).
[A.3] 상동 재조합체 선별
[A.3.1] PCR 분석
히그로마이신(hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합 체를 선별하기 위해서 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC에서 부위 특이적 재조합 일어나는지를 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
TRANS-L (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
m11 7R (상기 기재)
m11 4L : 5'-ACTCCTAAGGGAGTTGGTGCTGTTGGTG-3 '(서열 번호 49)
m11 5L (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
hygR (696) : (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃ 7 분 35 사이클 반복하였다. PCR 결과, 45 클론 중 8 클론이 모든 프라이머 세트 양성이었기 때문에, 이 8 클론에서 임의로 선택한 6 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00021
Figure 112012061265489-pct00022

[A.3.2] two-color FISH 분석
상기로부터 수득한 DT40(MAC2) 6 클론에 있어서, two-color FISH 분석을 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA 및 5'HPRT-loxP-PGK hygro 카세트를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 네거티브 컨트롤을 타겟팅 하기 전에, 마우스 11 번 염색체 단편인 마우스 인공 염색체 벡터 MAC에서는 분명히 프로브 유래의 신호가 감지되는 비율이 10% 이었던 반면에, DT40 (MAC2) 6 클론에서 50% 이상의 비율로 프로브 유래의 신호가 감지된 것부터, 상기 6 클론에 있어서, 부위 특이적 재조합이 일어나는 것이 시각적으로 확인되었다(도 21). 이러한 결과에서. 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2을 보유하는 DT40 세포 클론을 얻을 수 있었다고 결론을 내렸다.
Figure 112012061265489-pct00023
[B] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2 함유 닭 DT40 세포에서 MAC2의 CHO 세포에 도입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC2를 마우스 ES 세포에 안정적으로 도입하기 위하여 CHO 세포에 도입하였다. 또한, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2의 DNA 서열 삽입 부위인 loxP를 통해 안정적으로 목적 유전자 등(예를 들면 GFP 유전자 등)을 삽입하기 위해 CHO 세포에 도입하였다.
[B.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40 (MAC2) -5 및 17을 사용하여, 상기와 동일하게 CHO hprt 결손 세포(인간 과학 연구 자원 뱅크에서 입수, 등록 번호 JCRB0218)인 CHO(HPRT-)에 미소 핵 세포 융합법을 수행하였다. 2회 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 44 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC2)).
[B. 2] 약제내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
히그로마이신 (hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2이 CHO 세포에 도입되어 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
TRANS-L (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
m11 7R (상기 기재)
m11 4L (상기 기재)
m11 5L (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
hygR (696) : (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분 열변 후, 98℃ 10 초, 68℃ 7 분 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 44 클론 중 14 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 14 클론에서 임의로 선택 이후의 분석을 실시하였다.
Figure 112012061265489-pct00024
[B.2.2] two-color FISH 분석
상기에서 수득한 CHO(HPRT-; MAC2) 14 클론에서 무작위로 뽑은 9 클론에 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따른 방법으로 마우스 Cot-1 DNA와 5'HPRT -loxP-PGK hygro 카세트를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 9 클론 중 8 클론이 95%의 비율로 MAC2이 CHO 세포에 도입되는 것을 확인하였다(도 22).
Figure 112012061265489-pct00025
이상의 결과에서, 마우스 11 번 염색체 유래의 염색체 단편인 마우스 인공 염색체 MAC에 유전자 삽입 부위인 loxP 서열이 삽입된 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2이 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[C] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2 함유 CHO 세포에서 마우스 ES 세포로 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2 도입
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 CHO(HPRT-; MAC2) -13, 18을 세포 배양 접시에서 배양하고 컨플루언트(confluent) 된 시점에서 20% FBS, 0.1 μg/ml 콜세미드 (colcemid)을 첨가한 F12 배지로 교체하고, 48 시간 배양 후, 20% FBS, 0.1 μg/ml 콜세미드를 첨가한 F12 배지에서 배지 교환하고, 오버 나이트로 배양하고 마이크로셀(microcell)을 형성시켰다. 배양액을 제거하고, 미리 37℃로 보온한 사이토 칼 라신(cytochalasin) B (10 μg/ml, 시그마) 용액을 원심 용 플라스크에 채우고 34℃, 8000rpm, 1 시간 원심분리를 수행하였다. 미소 핵 세포("마이크로셀 (microcell)"라고도 함)를 무혈청 DMEM 배지에 현탁하고, 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 2000 rpm 10 분간 원심 분리하여 무혈청 DMEM 배지 5 ml에 현탁하였다. 마이크로셀을 5 ml의 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 2000 rpm 10 분간 원심분리를 수행하였다.
공여 세포에는 일본 클레어사로부터 입수한 C57B6 계통 마우스의 ES 세포인 B6-ES, 및 상기 ES 세포에 6TG 처리한 HPRT 결핍주인 B6(HPRT-) 및 TT2F 세포 HPRT 결핍주인 KO56(HPRT-)을 이용하였다. 배양에는 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium-high glucose : SIGMA), 10% FCS, LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor), 1 × 10-5M 2-ME(2-mercaptoethanol : SIGMA), L-글루타민(3.5g/ml : GIBCO), Sodium pyruvate 용액(3.5g/ml : GIBCO), MEM 비필수 아미노산(0.125mM : GIBCO)를 첨가하여 5% CO2, 37℃에서 배양을 하였다. 마우스 ES 세포를 PBS (-)로 세포 표면을 두 번 세척 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산시켜 DMEM 배지에 10% FBS를 첨가한 배양액에서 회수하고, 1500 rpm에서 원심 분리하여 상청을 제거하고, 무혈청 배양액 5 ml에 다시 현탁하고, 마이크로셀의 원심 분리 후 펠렛을 포함하는 무혈청 배지에 조용히 첨가하고, 1200 rpm에서 원심 분리를 수행하였다. 상청을 제거하고 PEG1000(Wako) 용액[5g의 PEG1000를 무혈청 DMEM 배지에 완전히 용해, 디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide)을 1ml 첨가하여 여과 멸균]을 0.5 ml하고 정확하게 1분 30초 동안 융합하였다. 13 ml의 무혈청 배양액(DMEM)을 조용히 첨가하여 1200 rpm에서 원심분리를 수행하였다. 상청을 제거하고 일반 마우스 ES 세포의 배양액을 첨가하고, 마이토마이신 처리한 G418 내성 마우스 태생 섬유아 세포를 피더 세포로 사용하여 직경 10 cm 세포 배양 접시 2 장에 파종하고 오버 나이트에서 배양하였다. 하이그로마이신(Hygromycin)을 250 μg/ml되도록 첨가하여 3 ~ 4 주 선택 배양하였다. 2회 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 28 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다(클론 명: B6-ES (MAC2) 및 B6 (HPRT-; MAC2) 및 KO56 (HPRT -; MAC2)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
히그로마이신(hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합 체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 마우스 인공 염색체 MAC2가 마우스 ES 세포에 도입할 수 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
TRANS L (전출)
m11 6R (전출)
m11 4L (전출)
hyg R (696) (전출)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃ 1 분 열변 후, 98℃ 10 초, 68℃ 10 분 30 사이클 반복수행하였다. PCR 결과, 28 클론 중 27 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 27 클론 중 무작위로 선택한 3 클론을 이후 분석을 수행하였다.
Figure 112012061265489-pct00026
[C.2.2] mono-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 mouse ES(MAC2)의 클론에 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 minor sattelite DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 3 클론 중 1 클론에서 80% 이상의 비율로 MAC2가 마우스 ES 세포에 1 카피로 도입되어 있고, KO56 세포의 정상 핵형인 내재 마우스 염색체의 갯수가 39 개임을 확인했다.
이상의 결과에서, 마우스 11 번 염색체 유래의 염색체 단편인 마우스 인공 염색체 MAC에 유전자 삽입 부위인 loxP 서열이 삽입된 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2가 마우스 ES 세포에 도입될 수 있다는 결론을 내렸다(도 23).
Figure 112012061265489-pct00027
[D] 실시예 8에 기재된 것과 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2를 보유하는 마우스 ES 세포를 이용하여 in vitro 안정성을 검증할 수 있다. 또한, 상기 ES 세포에서 키메라 마우스를 제작하고, MAC2가 자손 전달된 마우스 계통 TC(MAC2)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC(MAC2) 마우스 계통을 이용하여 체세포에 있어서 MAC2의 안정성을 검증할 수 있다.
[실시예 5] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3의 구축
마우스 인공 염색체 MAC에 DNA 삽입 서열로 PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 서열을 삽입한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3을 구축하였다(도 4). 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3의 마우스 ES 세포의 안정성을 검증하고, MAC3을 도입한 자손 전달 마우스를 제작하는 것으로, 개체 조직의 안정성을 검증하였다.
[A] 마우스 인공 염색체 MAC에 PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 서열 삽입
[A.1] PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 타겟팅 벡터의 제작
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 상기에서 제작한 VH21-12을 이용하였다. pVNLH에서 SalI과 AscI으로 자른 PGKneo-loxP-3'HPRT 카세트를 VH21-12 XhoI 사이트 및 AscI 사이트에 클로닝 하였다(벡터 명: pMAC3). 타겟팅 벡터, 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 나타내었다(도 24).
[A.2] 형질 전환 및 G418 내성 클론의 단리
닭 DT40 세포 배양은 10% 소태아혈청(GIBCO, 이하 FBS로 한다), 1% 닭 혈청 (GIBCO), 10-4M 2-mercaptoethanol(시그마)를 첨가한 RPMI1640 배지(GIBCO)에서 수행하였다. DT40(MAC) -1의 약 107 개의 세포를 무첨가 RPMI1640 배지로 한번 세척하고, 0.5 ml의 무첨가 RPMI1640 배지에 현탁하고, 제한 효소 NotI(TAKARA)로 선형화된 타겟팅 벡터 pMAC3을 25 μg 더한 다음, 전기천공법(electroporation)용의 큐벳트(cuvette)(바이오 래드)로 옮겨, 실온에서 10 분간 방치했다. 큐벳트를 진 펄스(Gene Pulser)(바이오 래드)로 설정하고, 550V, 25 μF 조건에서 전압을 가하였다. 실온에서 10 분간 정치한 후, 24 시간 배양하였다. G418(1.5 mg/ml)를 포함하는 배지로 교체하고, 96 웰 배양 접시 2 개로 분주하여 약 2 주간의 선택 배양하였다. 2 번의 형질 전환으로 얻은 총 14 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (MAC3)).
[A.3] 상동 재조합체 선별
[A.3.1] PCR 분석
G418 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 11 번 염색체에서 부위 특이적 재조합 일어나고 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 17L (상기 기재)
Puro-1 : 5'-GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACG-3 '(서열 번호 50)
kj neo (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 10 분 35 사이클 반복하였다. PCR 결과 17 클론 중 16 클론이 모든 프라이머 세트 양성이었기 때문에, 이 16 클론 중 무작위로 두 클론을 선택하여 이후의 분석을 실시하였다.
Figure 112012061265489-pct00028
[A.3.2] mono-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 DT40(MAC3) 2 클론에 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 수행한 결과, 모든 클론 염색체 전좌 등이 일어나지 않고 90% 이상의 비율로 독립적으로 보유되고 있는 것을 확인하였다.
Figure 112012061265489-pct00029
[A.3.3] two-color FISH 분석
상기에서 무작위로 선택한 DT40(MAC3) -160 및 187에 있어서, two-color FISH 분석을 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA 및 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 하고 FISH 분석을 실시한 결과, 마우스 인공 염색체 MAC3이 1 카피로 독립적으로 존재하는 것을 확인하였다(도 25).
이러한 결과는, DNA 삽입 서열로서 loxP 서열을 마우스 중심체 부근에 삽입한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3을 보유하는 DT40 세포 클론을 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[B] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3 함유 닭 DT40 세포로부터 MAC3의 CHO 세포에 도입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC3의 DNA 서열 삽입 부위인 loxP를 통해 안정적으로 목적 유전자 등(예를 들면, GFP 유전자 등)을 삽입하기 위해서 CHO 세포에 도입하였다.
[B.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40(MAC3) -160 세포 배양 접시에서 배양하고 컨플루언트(confluent) 된 시점에서 20% FBS, 1% 닭 혈청 10-4M 2-mercaptoethanol, 0.05 μg/ml 콜세미드(colcemid)를 첨가한 RPMI1640 배지로 교체하고, 12 시간 배양하여, 마이크로셀(microcell)을 형성시켰다. 배양액을 24 ml의 무혈청 DMEM 배지로 교체하고, 미리 100 μ/ml 폴리 L-라이신으로 코팅된 원심분리용 25 cm2 플라스크 12 개(코닝)에 2 ml 씩 분주하고, 37℃에서 30 분 배양하고, 세포를 플라스크 바닥에 부착시켰다. 상청을 제거하고, 미리 37℃로 보온한 사이토칼라신 (cytochalasin) B (10μg/ml, 시그마) 용액을 원심분리용 플라스크에 채우고 34℃, 8000 rpm, 1 시간으로 원심분리를 수행하였다. 마이크로셀을 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 1700 rpm 10 분간 원심 분리하여 무혈청 DMEM 배지 5 ml에 현탁했다.
공여세포는 CHO hprt 결손 세포(인간 과학 연구 자원 뱅크에서 입수, 등록 번호 JCRB0218)인 CHO (HPRT-)를 이용하였다. 정제한 미소 핵을 PHA-P(SIGMA)를 포함하는 무혈청 배양액 2 ml에 다시 현탁하고, 배양 상층액에서 10% FBS 첨가 F12 배지(invitrogen)를 제거한 CHO 세포에 조용히 접종하였다. 플레이트를 37℃, 15 분간 배양하였다. 상청을 제거하고 PEG1000(Wako) 용액[5 g의 PEG1000를 무혈청 DMEM 배지에 완전히 용해, 디멜틸설폭시드(Dimethyl sulfoxide)를 1 ml 첨가하여 여과 멸균]을 1 ml로 정확하게 1 분간 융합하였다. 무혈청 배양액(DMEM)을 4 ml로 4 회 세척하고, 일반 CHO 세포 배양액 5 ml를 더하여 오버 나이트에서 배양했다. PBS(-)에서 세포 표면을 두 번 세척 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산시켜, 직경 10 cm 세포 배양 접시 5 개에 접종하고, G418을 800 μg/ml 되도록 첨가하여 3~ 4 주 선택 배양하였다. 2회 미소 핵 세포융합에서 얻은 총 12 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다(클론 명: CHO(HPRT-; MAC3)).
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
G418 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3이 CHO 세포에 도입되어 있는지를 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
kj neo (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
m11 17L (상기 기재)
Puro-1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃ 10 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 7 클론 중 6 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 6 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00030
[B.2.2] mono-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO(HPRT-; MAC3) 6 클론에 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 3 클론에서 90% 이상의 비율로 CHO 세포에 MAC3가 도입되는 것을 확인하였다(도 26).
Figure 112012061265489-pct00031
이상의 결과에서, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3이 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[C] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3 함유 CHO 세포로부터 MAC3 마우스 ES 세포에 도입
마우스 ES 세포 및 마우스 개체 내에서의 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3의 안정성을 검증하기 위하여, 마우스 인공 염색체 MAC3을 마우스 ES 세포에 도입하고 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3을 함유하는 키메라 마우스 및 자손 전달 마우스를 제작하였다.
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 CHO(HPRT-; MAC3) -1, 6을 세포 배양 접시에서 배양하고, 컨플루언트(confluent) 된 시점에서 20% FBS, 0.1 μg/ml 콜세미드 (colcemid)을 첨가한 F12 배지로 교체하고, 48 시간 배양 후, 20% FBS, 0.1 μg/ml 콜세미드(colcemid)를 첨가한 F12 배지에서 배지 교환하고, 오버 나이트로 배양하고 마이크로셀(microcell)을 형성시켰다. 배양액을 제거하고, 미리 37℃로 보온한 사이토칼라신(cytochalasin) B (10 μg/ml, 시그마) 용액을 원심분리용 플라스크에 채우고 34℃, 8000 rpm, 1 시간 원심분리 하였다. 마이크로셀을 무혈청 DMEM 배지에 현탁하고 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 2000 rpm 10 분간 원심분리하고, 무혈청 DMEM 배지 5 ml에 현탁하였다. 마이크로셀을 5 ml의 무혈청 DMEM 배지에 현탁하고 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제했다. 정제 후 2000 rpm 10 분간 원심분리하였다.
공여세포는 일본 클레어사로부터 입수한 C57B6 계통 마우스 ES 세포에 6TG 처리한 HPRT 결핍주인 B6(HPRT-)를 이용하였다. 배양에는 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium-high glucose: SIGMA), 10% FCS, LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor), 1 × 10-5M 2-ME(2-mercaptoethanol : SIGMA), L-글루타민( 3.5 g/ml: GIBCO), Sodium pyruvate solution(3.5g/ml : GIBCO), MEM Nonessential amino acid (0.125mM : GIBCO)를 첨가하여 5% CO2, 37℃에서 배양을 하였다. 마우스 ES 세포를 PBS (-)로 세포 표면을 두 번 세척 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산시켜 DMEM 배지에 10% FBS를 첨가한 배양액으로 회수하여 1500 rpm에서 원심 분리하여 상청을 제거하고 무혈청 배양액 5 ml에 다시 현탁하고, 마이크로셀의 원심분리 후, 펠렛을 포함하는 무혈청 배지에 조용히 첨가하고, 1200 rpm에서 원심분리하였다. 상청을 제거하고 PEG1000(Wako) 용액[5g의 PEG1000를 무혈청 DMEM 배지에 완전히 용해하고, 디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide)을 1ml 첨가하여 여과 멸균]을 0.5 ml로 정확하게 1 분 30 초 동안 융합하였다. 13 ml의 무혈청 배양액 (DMEM)을 조용히 첨가하여 1200rpm에서 원심분리 하였다. 상청을 제거하고 일반 마우스 ES 세포의 배양액을 첨가하여 마이토마이신 처리한 G418 내성 마우스 태생 섬유아 세포를 피더 세포로 사용하여 직경 10 cm 세포 배양 접시 2 개에 파종하고 오버 나이트에서 배양하였다. G418을 250 μg/ml되도록 첨가하여 3 ~ 4 주 선택 배양하였다. 2회 미소 핵 세포융합에서 얻은 총 28 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: B6 (HPRT-; MAC3)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
G418 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 11 번 염색체에 부위 특이적으로 절단이 일어나고 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
kj neo (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
m11 17L (상기 기재)
Puro-1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃ 10 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 28 클론 중 27 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 27 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00032
[C.2.2] mono-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 B6(HPRT-; MAC3) 중 16 클론에 대하여 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 16 클론 중 5 클론이 95% 이상의 비율로 MAC3가 마우스 ES 세포에 도입되어 있는 것을 확인하였다.
이상의 결과에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3이 마우스 ES 세포에 도입할 수는 것으로 결론을 내렸다(도 27).
Figure 112012061265489-pct00033
[D] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3의 마우스 ES 세포에 있어서 안정성
상기 방법으로 수득한 마우스 ES 클론(예를들면, B6 (HPRT-; MAC3) -3, -s6 상기 [C]에서 취득)에 대하여, 0 ~ 100 PDL의 비선택 배양에서 장기 배양 후, FISH 분석에 의한 MAC1 보유 세포의 비율을 측정한 결과, 100 PDL에서도 95% 이상의 보유 비율을 나타내었다(도 28).
이상의 결과로, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3은 마우스 ES 세포(in vitro)에서 95% 이상의 비율로 매우 안정적으로 보유되는 것을 확인하였다.
[E] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3을 보유하는 키메라 마우스 제작
상기 방법으로 수득한 ES 세포 클론을 이용하여(진 타겟팅, 실험 의학, 1995)의 방법에 따라 키메라 마우스를 제작하였다. 숙주로는 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입)의 자웅 교배에 의해 얻을 수 상실배(Morula)를 사용하였다. 주입 배아를 대리 부모에 이식한 결과 태어나는 새끼 생쥐 머리 색깔에 따라, 키메라인지 여부와 ICR의 배아 세포에 ES 세포가 개체를 형성하는 세포에서의 기여율로 키메라 비율을 판정할 수 있다.
B6(HPRT; MAC3) 클론(예를들면, B6(HPRT; MAC3)-ES (MAC3)-s6 상기에서 취득)을 주입한 60 개의 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 8 마리의 키메라 마우스 (머리 색깔에 진한 갈색 부분은 인정)가 탄생했다. 8 마리 중 2 마리는 수컷으로 10% 키메라 마우스가 1 마리, 5% 키메라 마우스가 1 마리 태어났고, 6 마리는 암컷 10% 키메라 마우스가 4 마리, 5% 키메라 마우스가 2 마리 태어났다. 즉, 마우스 인공 염색체 MAC3을 보유하는 ES 세포주(B6 HPRT-/ - 주)는 키메라 형성 능력을 보유하고 있는, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있는 것으로 나타났다.
[F] 실시예 8 기재된 바와 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3을 보유하는 키메라 마우스와 야생형 마우스를 교배시켜 MAC3이 자손 전달된 마우스 계통 TC(MAC3)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC(MAC3) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 MAC3의 안정성을 검증할 수 있다.
[실시예 6] 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC의 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC3에 유용 단백질을 코딩하는 유전자의 예로는 형광 유전자인 EGFP를 Cre/loxP 시스템을 이용하여 삽입하고, 기능 단백질의 발현과 장기적인 안정성을 검증하였다(도 5).
[A] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3 벡터 함유 CHO 세포에 있어서, 특정 유전자(예를 들면 GFP)의 Cre/loxP 시스템에 의한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3에 삽입
마우스 인공 염색체 MAC에 DNA 삽입 서열로 PGKneo-loxP-3'HPRT 타입의 loxP 서열을 삽입한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3에서, loxP가 실행되어, 플라스미드 DNA가 부위 특이적으로 삽입할 수 있는지 여부를 확인하였다.
[A.1] EGFP 삽입 벡터의 제작
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V913(Lexicon genetics)을 이용하였다. 5'HPRT-loxP는 V820(Lexicon genetics)의 XbaI 사이트에 올리고 합성 loxP 서열을 클로닝하였다. 5'HPRT-loxP를 V907(Lexicon genetics)의 ClaI과 AscI에 클로닝하고 PGKhygro을 ClaI과 KpnI 사이트에 클로닝하였다(벡터 명: pX6.1). 또한, X6.1의 NotI 사이트 및 SalI 사이트에 NotI과 SalI으로 자른 HS4-CAG-EGFP-HS4(오사카, 오카베 박사와 NIH, Felsenfeld 박사로부터 입수)를 클로닝하고, HPRT 재구축계통의 GFP 삽입 컨스트럭트(construct)를 제조하였다(벡터 명: pX6.1 EGFP). Cre/loxP 시스템에 의한 HPRT 재구축계통의 GFP 삽입으로 인해 발생하는 염색체 부위 특이적 DNA 삽입은 도 29에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
유전자 도입은 리포펙션(lipofection) 법을 이용하여 실시하였고, 90% 컨플루언트(confluent) 상태로 된 6 웰 세포에 대해여, Cre 1μg와 GFP 삽입 벡터 2 μg을 시판(인비트로젠(invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양에서 2 주간 배양하면 내성 콜로니가 출현하고, 2 회 도입에서 얻은 총 22 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: CHO (GFP-MAC)).
[A.3] 약제 내성 클론의 선별
[A.3.1] 형광 현미경 관찰에 의한 GFP 삽입체의 확인
클로닝하여 22개의 콜로니를 형광 현미경으로 관찰한 결과, 모든 클론에서 GFP 양성 세포가 관찰되었고, 이의 양성률은 거의 100%였다.
[A.3.2] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 부위 특이적으로 GFP 유전자의 삽입이 일어나고 있는지 확인하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 10 분 가열 변성 후, 94℃, 30 초, 60℃, 30초, 72℃, 30초 35 사이클 반하였다. PCR 결과, 22 클론 모두가 양성이고, 이 22 클론을 이후 분석하였다.
Figure 112012061265489-pct00034
[A.3.3] two-color FISH 분석
상기의 결과에서 무작위로 뽑은 6 클론에서 two-color FISH 분석을 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA 및 X6.1EGFP를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 3 클론에서 50% 이상의 비율로 GFP-MAC이 1 카피 보유되고, 또한 X6.1EGFP 유래 신호가 나타나고, 네거티브 컨트롤인 EGFP를 부위 특이적 삽입하기 전에 MAC3 위에는 신호가 감지되지 않은 것으로부터, 부위 특이적으로 EGFP가 삽입된 것이 확인되었다(도 30).
Figure 112012061265489-pct00035
이상의 실험을 통해, 마우스 인공 염색체 MAC3에 GFP 유전자를 탑재하는 것에 의해, GFP 발현이 관찰되고, 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC을 보유하는 CHO 세포를 수득할 수 있었던 것을 확인할 수 있었다.
[B] 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC 함유 CHO 세포로부터 GFP-MAC의 마우스 ES 세포에 도입
[B.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 CHO(GFP-MAC) -4, 10, 12 세포 배양 접시에서 배양하고, 컨플루언트(confluent) 된 시점에서 20% FBS, 0.05 μg/ml 콜세미드 (colcemid)를 첨가한 F12 배지로 교체하고, 48 시간 배양 후, 20% FBS, 0.05 μg/ml 콜세미드를 첨가한 F12 배지에서 배지 교환하고, 오버 나이트로 배양하고 마이크로셀을 형성시켰다. 배양액을 제거하고, 미리 37℃로 보온한 사이토칼라신 (cytochalasin) B (10μg/ml, 시그마) 용액을 원심분리용 플라스크에 채우고 34℃, 8000 rpm, 1 시간 원심분리했다. 마이크로셀을 무혈청 DMEM 배지에 현탁하여 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 2000 rpm 10 분간 원심 분리하여 무혈청 DMEM 배지 5 ml에 현탁하였다.
마이크로셀을 5 ml의 무혈청 DMEM 배지에 현탁하고, 8 μm, 5 μm, 3 μm 필터에서 정제하였다. 정제 후 2000 rpm 10 분간 원심분리하였다.
공여세포는 일본 클레어사로부터 입수한 C57B6 계통 마우스의 ES 세포로부터 수립한 야생형 B6 세포 및, 야생형 TT2F 세포 마우스의 ES 세포를 이용하였다. 배양에는 DMEM(Dulbecco 's Modified Eagle 's Medium-high glucose: SIGMA), 10% FCS, LIF(Muerin Leukemia Inhibitory Factor), 1×10-5M2-ME (2-mercaptoethanol: SIGMA), L-글루타민(3.5 g/ml: GIBCO), Sodium pyruvate solution(3.5 g/ml: GIBCO), MEM Nonessential amino acid (0.125 mM: GIBCO)를 첨가하여 5% CO2, 37℃에서 배양을 하였다. 마우스 ES 세포를 PBS(-)로 세포 표면을 두 번 세척 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산시켜 DMEM 배지에 10% FBS를 첨가한 배양액으로 회수하여 1500 rpm에서 원심 분리하여 상청을 제거하고 무혈청 배양액 5 ml에 다시 현탁하고, 마이크로셀의 원심분리 후, 펠렛을 포함하는 무혈청 배지에 조용히 첨가하고, 1200rpm에서 원심분리를 수행하였다. 상청을 제거하고 PEG1000(Wako) 용액 [5g의 PEG1000를 무혈청 DMEM 배지에 완전히 용해하고, 디메틸 술폭시드(Dimethyl sulfoxide)을 1 ml 첨가하여 여과 멸균]을 0.5 ml하고 정확하게 1 분 30 초 동안 융합하여다. 13 ml의 무혈청 배양액(DMEM)을 조용히 첨가하여 1200 rpm에서 원심분리하였다. 상청을 제거하고 일반 마우스 ES 세포에 배양액을 첨가하고, 마이토마이신 처리한 G418 내성 마우스 태생 섬유아 세포를 피더 세포로서 사용하고, 직경 10 cm 세포 배양 접시 2 개에 파종하고 오버 나이트에서 배양하였다. G418을 250 μg/ml되도록 첨가하고, 3 ~ 4 주 선택 배양하였다. 2회 미소 핵 세포융합에서 얻은 총 36 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: TT2F(GFP-MAC) 및 B6-ES (GFP-MAC)).
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
G418 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 마우스 11 번 염색체에 부위 특이적으로 절단이 일어나고 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
TRANS L1 : (상기 기재)
TRANS R1 : (상기 기재)
m11 6R : (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq(TAKARA)를 이용하여 버퍼 및 dNTPs(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. TRANS L1/R1 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 1 분 35 사이클 반복하였다. TRANS L1/m11 6R 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 35 사이클 반복하였다. PCR 결과, 36 클론 중 34 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 중에서 무작위로 24 클론 시리즈를 선택하고 하기 분석을 수행하였다.
Figure 112012061265489-pct00036
[B.2.2] 퀴나쿠린(Quinacrine)· 훽스트(Hoechst) 이중 염색
상기 PCR 분석을 통해 양성으로 나타난 클론에 대해, 상기 방법처럼 퀴나쿠린(Quinacrine) 훽스트 (Hoechst) 이중 염색을 실시했다. 퀴나쿠린· 훽스트 이중 염색한 클론의 염색체 상을 형광 현미경으로 관찰한 결과, 24 클론 중 18 클론에서 100%의 비율로 마우스 인공 염색체 GFP-MAC를 보유하는 것을 확인하였다.
Figure 112012061265489-pct00037
이상의 결과에서, 마우스 인공 염색체 GFP-MAC을 도입한 마우스 ES 세포는 일반적으로 핵형으로 장기 배양 및 키메라 마우스 제작에 이용하는 것이 가능하다고 결론 지었다.
[B.2.3] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 마우스 ES(GFP-MAC)의 클론을 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 minor satellite DNA 및 pX6.1E를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 12 클론 중 6 클론이 95% 이상의 비율로 GFP-MAC에서 마우스 ES 세포로 도입되어 있는 것을 확인하였다.
Figure 112012061265489-pct00038
이상의 결과에서, 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC에서 마우스 ES 세포로 도입할 수 있었다고 결론 지었다.
[C] 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC의 마우스 ES 세포의 안정성
상기 방법으로 수득한 마우스 ES 클론(예를 들면, B6-ES (MAC3) -9 상기 [B]에서 수득)에 대해 0 ~ 100 PDL 비선택 배양에서 장기 배양 후의 FISH 분석에 의한 GFP-MAC3 보유 세포 비율을 측정한 결과 100 PDL에서도 95% 이상의 보유 비율이었다(도 31, 도 32). 또한, 콜로니 형광 현미경으로 관찰한 결과, 모든 클론에서 GFP 양성 세포가 관찰되어 그 양성률은 거의 100%였다.
Figure 112012061265489-pct00039
이상의 결과에서, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3에, Cre/loxP 시스템에 의해 20kb 이하의 외래 유전자(EGFP 유전자 등)를 부위 특이적으로 효율적으로 삽입할 수 있으며, 외래 유전자를 탑재한 MAC3은 마우스 ES 세포에서 매우 안정이고 MAC3에서 외래 유전자의 발현도 장기간 안정하다고 결론 지었다.
[D] 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC을 보유하는 키메라 마우스 제작
상기 [B]에서 수득한 ES 세포 클론을 이용하여(진 타겟팅, 실험 의학, 1995)의 방법에 따라 키메라 마우스를 제작하였다. 숙주는 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입)의 자웅 교배에 의해 얻을 수 상실배(Morula) 및 8 세포기 배아를 사용하였다. 주입 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 태어나는 새끼 생쥐 머리 색깔을 통하여 키메라인지 여부를 판정할 수 있다.
야생형 수컷 B6(GFP-MAC) 클론 및 야생형(GFP-MAC) TT2F 암컷 클론(예를 들면, B6-ES (GFP-MAC) 4 및 18, TT2F (GFP-MAC) -12 상기에서 수득)을 각각 주입 한 배아(야생형 수컷 B6(GFP-MAC) 클론 260개 및 야생형 암컷 TT2F(GFP-MAC) 클론 180 개)를 대리 부모에 이식한 결과, 키메라 마우스(머리 색깔에 진한 갈색 부분은 인정)가 탄생하였다. 수컷 야생형 B6(GFP-MAC) 클론 유래 키메라 마우스 42 마리 태어나, 그 중 20 마리는 수컷 마우스이며, GFP 양성 50% 키메라 마우스가 1 마리, 40% 키메라 마우스가 5 마리, 30% 키메라 마우스가 1 마리, 20% 키메라 마우스가 7 마리, 10% 키메라 마우스가 3마리, 5% 키메라 마우스가 3 마리 태어났다. 또한, 야생형 TT2F(GFP-MAC) 클론 유래 키메라 마우스는 14 마리 태어나, 그 중 1 마리는 흰색 부분이 거의 관찰할 수 없고, 키메라 비율 100% 하고 GFP 양성 개체였다.
이상에서 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC를 보유하는 ES 세포주(B6 및 TT2F)는 키메라 형성 능력을 가지고 있다. 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
[E] 마우스 인공 염색체 벡터 GFP-MAC을 보유하는 키메라 마우스로부터 마우스 인공 염색체의 자손 전달
상기 [D]에서 제작된 암컷 키메라 마우스(키메라 비율 100%)를 C57B6(흑색 일본 클레어 사로부터 구입) 수컷 마우스와 교배하여 키메라 마우스로부터 탄생한 4 마리의 새끼 마우스 중 3 마리가 ES 세포 유래의 GFP-MAC의 우성 유전 형질인, GFP의 형광이 관찰되었다. 또한, 3 마리 중 1 마리의 새끼 마우스에 대해서는 온몸에서 GFP의 형광이 관찰되었고, 마우스 개체에서도 마우스 인공 염색체가 안정 것으로 나타난 것을 확인하였다(도 33). GFP-MAC이 자손 전달된 마우스 계통을 TC (GFP-MAC)라고 부른다. 또한, 실시예 8에 기재된 바와 같이, 상기 TC(GFP-MAC) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 GFP-MAC의 안정성을 검증할 수 있다.
[실시예 7] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1의 안정성
[A.1] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1의 CHO 세포에서의 안정성
상기 방법으로 수득한 CHO 클론(예를들면, CHO(HPRT-; MAC1) -8, 22 상기 실시예 2에서 수득)에 대하여 0 ~ 25 PDL 비선택 배양에서 장기 배양 후의 FISH 분석에 의한 MAC1 보유 세포 비율을 측정한 결과, 25 PDL에서도 90% 이상의 보유비율이었다. 한편, Kazuki 등의 보고(Gene Therapy: PMID : 21085194,2010)에 포함된 21 번 염색체 유래의 GFP 탑재 HAC 벡터(21HAC2)를 보유하는 CHO 세포에서는, 25PDL에 있어서, 70% 이하 보유 비율이었다. 그 대표적인 결과를 도 34에 나타내었다.
[A.2] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1의 마우스 ES 세포에 있어서의 안정성
상기 방법으로 수득한 마우스 ES 클론(예를 들면, KO56(MAC1) -5 및 TT2F (MAC1) -23, 상기 실시예 2에서 수득)에 대해 0 ~ 75 PDL 비선택 배양에서 장기 배양 후의 FISH 분석에 의한 MAC1 보유 세포의 비율을 측정한 결과, 75 PDL에서도 90% 이상의 보유 비율이었다. 한편, Kazuki 등의 보고(Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에 포함된 21 번 염색체 유래의 GFP 탑재 HAC 벡터(21HAC2)를 보유하는 마우스 ES 세포에서 75PDL에 있어서는 70% 이하 보유비율이였다. 그 대표적인 결과를 도 35에 나타내었다.
[A.3] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1을 보유하는 키메라 마우스 제작
상기 실시예 2에서 수득한 ES 세포 클론을 이용하여 Tomizuka 등의 방법 (Nature Genet.16 : 133,1997)으로 키메라 마우스를 제작하였다. 숙주는 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입)의 자웅 교배에 의해 얻을 수 8 세포기 배아를 사용하였다. 주입 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 태어나는 새끼 생쥐 머리 색깔로 키메라인지 여부를 판정할 수 있다. MAC1 보유 ES 클론(예를들면, KO56MAC1-5 및 TT2FMAC1-4, 상기 실시예 2에서 수득)을 주입한 1620 개의 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 56 마리의 키메라 마우스(머리 색깔에 진한 갈색 부분 인정 수)가 탄생했다. 이 중 13 마리는 흰색 부분이 거의 관찰할 수 없는, 키메라 비율 100%의 개체였다. 즉, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1을 보유하는 ES 세포주(KO56 및 TT2F)는 키메라 형성 능력을 보유하고 있고, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
[A.4] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1을 보유하는 키메라 마우스로부터 MAC1 자손 전달
상기 [A.3]에서 제작된 암컷 키메라 마우스(키메라 비율 100%) 2 마리를 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입) 수컷 마우스와 교배했다. 키메라 마우스로부터 탄생한 18 마리의 새끼 마우스 가운데 13 마리가 ES 세포 유래의 우성 유전 형질을 보유하는 것을 나타내는 진한 갈색이었다. 즉 MAC1을 보유하는 ES 세포는 암컷 키메라 마우스에서 기능적인 난세포로 분화 것으로 나타났다. 또한, GFP 형광에 의해 MAC1의 보유를 검토한 결과, 13 마리 중 6 마리(46%)에서 GFP 양성이고, 키메라 마우스 자손에 있어서, MAC1 보유가 확인되었다. 즉, 멘델 유전 법칙 따라, MAC1 형질이 약 50%의 빈도로 나타난 것을 확인할 수 있어, 난자의 MAC1 보유 비율이 100%에 가까운 것으로 나타났다. MAC1가 자손 전달된 마우스 계통을 TC(MAC1)라고 명한다.
[A.5] TC(MAC1) 마우스 계통의 체세포에 있어서 MAC1의 안정성
[A.5.1] 실체 형광 현미경 관찰
상기에서 얻은 TC(MAC1) 마우스 중 수컷(5) 및 암컷(2)을 1 마리씩에 뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 소장, 근육, 고환(또는 난소)을 실체 형광 현미경 관찰하에서 관찰한 결과, 모든 조직에서 GFP 양성이 관찰되고, 그 양성률은 100%였다. 상기 암컷(5)의 대표적인 결과를 도 36에 나타내었다.
[A.5.2] 혈액계 세포의 FACS 분석
B 세포(CD19), T 세포((CD4, CD8) 거핵공(CD41)에 대한 특이적인 항체 (Becton, Dickinson and Company)를 이용하여, 골수 및 비장 세포에서 GFP 양성 비율을 검토한 결과, 모든 조직에서 양성률은 95% 이상이었다. 한편, Kazuki 등의 보고(Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에 포함된 21 번 염색체 유래의 GFP 탑재 HAC 벡터(21HAC2)를 보유하는 마우스는 모든 조직에서 양성률 15% 이하 나타났다. 이의 대표적인 결과를 도 37, 도 38에 나타내었다.
[A.5.3] 형광 인시추하이브리다이제이션(in situ hybridization)(FISH) 분석
또한, 상기와 같은 개체로부터 제작한 꼬리 섬유아 세포를 이용하고, Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 시각적으로 MAC1의 존재를 확인하고, 마우스 염색체와는 별도로 95% 이상의 세포에서 MAC1가 존재하고 있는 것이 확인되었다(도 39).
이상의 결과로, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1는 마우스 ES 세포(in vitro) 및 마우스 조직(in vivo)에서 90% 이상의 비율로 매우 안정적으로 보유되는 것을 확인하였다.
[실시예 8] 마우스 인공 염색체 벡터 CYP3A-MAC 보유 마우스의 제작과 안정성
[A] CHO 세포로부터 CYP3A-MAC의 마우스 A9 세포에 이입
CYP3A-MAC을 보유하는 마우스 ES을 제작하기 위해, 상기 실시예 3에서 수득한 CYP3A-MAC을 보유하는 CHO 세포(CHO (CYP3A-MAC, hChr7-△CYP3A) 22, 26, 34, 35 등)로부터 마우스 A9 세포에 마이크로셀(microcell) 형성능이 높은 마우스 A9 세포에 미소 핵 세포융합법에 의해 도입하였다. 8 번의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 25 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: A9 (CYP3A-MAC)). 그 결과, CYP3A-MAC 영역만을 검출하는 상기 프라이머를 이용한 PCR에서 양성인 클론은 6 클론 있었다. 또한, CYP3A-BAC(RP11757A13)(CHORI) 및 마우스 minor satellite DNA 프로브로 사용하여 FISH 분석(Tomizuka들, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되는 CYP3A -MAC의 존재가 6 클론 중 3 클론으로 확인되었다(도 40). 이상으로부터, CYP3A-MAC 보유 A9 세포를 3 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[B] A9 세포로부터 CYP3A-MAC의 마우스 ES 세포에 이입
CYP3A-MAC을 보유하는 키메라 마우스를 제작하기 위해, 상기 [A]에서 수득한 CYP3A-MAC을 보유하는 A9 세포로부터 마우스 ES 세포(야생형 TT2F)에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. Tomizuka 등(Nature Genet.16 : 133,1997) 방법에 따라 약 108개의 CYP3A-MAC을 보유하는 A9 세포(A9(CYP3A-MAC) 8,9 등)로부터 마이크로셀(microcell)을 정제하여 DMEM 5 ml에 현탁하였다. 약 107 개의 마우스 ES 세포 TT2F를 트립신 처리에 의해 분리하여 DMEM 3 회 세정 후 DMEM 5 ml에 현탁하고 원심분리한 후, 마이크로셀을 첨가하여 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하고, 상층 액을 완전히 제거하였다. 침전을 탭핑(tapping)하여 충분히 풀고, 1:1.4 PEG 용액 [5 g PEG1000(와코순약), 1 ml DMSO(시그마)를 DMEM 6 ml 용해] 0.5 ml를 넣고, 약 1 분 30 초 동안 충분히 교반하였다. 그 후, DMEM 10 ml를 천천히 첨가하고, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하고, 30 ml의 ES 배지에 현탁하고, 미리 피더 세포를 뿌린 직경 100 mm 샬레(코닝) 3 세트에 분주 배양하였다. 24 시간 후, 300 μg/ml의 G418을 포함하는 배지로 교환하고, 약 1 주일 동안 선택 배양하였다. 그 결과, 총 34 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다. A9(CYP3A-MAC) 8로부터 14 클론, A9 (CYP3A-MAC) 9로부터 7 클론을 CYP3A-MAC 영역만을 검출하는 사기 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이었다. 또한, 상기 중 20 클론에 대하여, CYP3A-BAC(RP11-757A13)(CHORI) 유래의 DNA를 이용하여 FISH 분석(Tomizuka 등, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브는 특이적으로 검출되며, 마우스 핵형이 정상적인 클론은 8 클론이었다(도 41). 이상으로부터, CYP3A-MAC 보유 TT2F 세포를 8 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[C] CYP3A-MAC의 마우스 ES 세포에 있어서 안정성
상기 [B]에서 수득한 마우스 ES 클론(예를들면, TT2F (CYP3A-MAC) 8-5, 8-22, 9-4, 9-7, 9-9 상기 [B]에서 수득)에 대해 0 ~ 100 PDL 비선택 배양에서 장기 배양 후의 FISH 분석에 의한 CYP3A-MAC 보유 세포의 비율을 측정한 결과, 100 PDL에서도 95% 이상의 보유 비율이었다(그림 42).
[D] CYP3A-MAC을 보유하는 키메라 마우스의 제작
상기 [B]에서 얻은 CYP3A-MAC을 보유하는 ES 세포 클론을 이용하여 Tomizuka 등의 방법(Nature Genet.16 : 133,1997)으로 키메라 마우스를 제작하였다. 숙주는 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입)의 자웅 교배에 의해 얻을 수 8 세포기 배아를 사용하였다. 주입 배아를 대리 부모에 이식한 결과 태어나는 새끼 생쥐 머리 색깔로 키메라인지 여부를 판정할 수 있다. MAC1을 보유하는 ES 클론(예를들면, TT2F (CYP3A-MAC) 8-5,8-16, 8-22, 9-4, 9-7, 9-9, 9-10 등 상기 [B]로 수득)을 주입 한 840 개의 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 28 마리의 키메라 마우스 (머리 색깔에 진한 갈색 부분은 인정)가 탄생했다. 이 중 5 마리는 흰색 부분이 거의 관찰할 수 없는 키메라 비율 100%의 개체였다. 즉, 마우스 인공 염색체 벡터 CYP3A-MAC을 보유하는 ES 세포주(TT2F)는 키메라 형성 능력을 보유하고 있고, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
[E] CYP3A-MAC을 보유하는 키메라 마우스로부터 CYP3A-MAC의 자손 전달
상기 [D]에서 제작된 암컷 키메라 마우스(키메라 비율 100%) 5 마리를 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입) 수컷 마우스와 교배했다. 키메라 마우스로부터 탄생한 60 마리의 새끼 마우스 중 50 마리가 ES 세포 유래의 우성 유전 형질을 보유하는 것을 나타내는 진한 갈색이었다. 즉 CYP3A-MAC을 보유하는 ES 세포는 암컷 키메라 마우스에서 기능적인 난세포로 분화된 것으로 나타났다. 또한, GFP 형광에 의해 CYP3A-MAC의 보유를 검토한 결과, 50 마리 중 29 마리(58%)에서 GFP 양성이고, 키메라 마우스 자손의 CYP3A-MAC의 보유가 확인되었다. 즉, 멘델 유전법칙 따라, CYP3A-MAC 형질이 약 50%의 빈도로 나타난 것을 확인하였고, 난자의 CYP3A-MAC의 보유 비율이 100%에 가까운 것을 확인하였다. CYP3A-MAC이 자손 전달된 마우스 계통을 TC(CYP3A-MAC)라고 부른다.
[F] TC(CYP3A-MAC) 마우스 계통의 체세포에서 CYP3A-MAC의 안정성
[F.1] 실체 형광 현미경 관찰
상기 방법으로 수득한 TC(CYP3A-MAC) 마우스 중 수컷(2) 1 마리, 암컷(14) 1 마리에 뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 소장, 근육, 고환을 실체 형광 현미경관찰하에서 관찰한 결과, 모든 조직에서 GFP 양성이 관찰되었고, 그 양성률은 100%였다. 상기 수컷(2)의 대표적인 결과를 도 43에 나타내었다.
[F.2] 혈액 계 세포의 FACS 분석
B 세포(CD19), T 세포(CD4, CD8), 거대공(CD41)에 대한 특이적인 항체 (Becton, Dickinson and Company)를 사용하여 골수의 GFP 양성 비율을 검토한 결과, 모든 조직에서 양성 비율은 94%였다. 한편, WO 2009/063722 (PCT/JP2008/068928)에 기재되어 있는, 14 번 염색체 유래의 HAC 벡터(CYP3A-HAC△) 보유 마우스는 모든 조직에서 양성률은 20% 이하였다. 그 대표적인 결과를 도 44에 나타내었다.
[F.3] 형광 인시츄 하이브리다이제이션 (in situ hybridization)(FISH) 분석
또한, 상기와 같은 개체나 조직에서 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 CYP3A-BAC(RP11-757A13) DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 수행한 바, 시각적으로 CYP3A-MAC의 존재를 확인하였고, 90-98%의 세포에서 CYP3A-MAC이 존재하고 있는 것이 확인되었다. 한편, WO 2009/063722(PCT/JP2008/068928)에 명시된 인간 14 번 염색체 유래의 HAC 벡터 (CYP3A-HAC△)를 보유하는 마우스는 모든 조직에서 양성률은 56-97%였다. 그 대표적인 결과를 도 45에 나타내었다.
[F.4] TC(CYP3A-MAC) 계통의 전달율
TC(CYP3A-MAC) 암컷 마우스 8 마리와 MCH(ICR)(흰색, 일본 클레어 사로부터 구입) 수컷 마우스 8 마리를 교배하여 전달율을 확인하였다. 81 마리의 새끼 마우스를 얻었고, 38 마리가 GFP 네거티브, 43 마리가 GFP 양성 개체였다(전달률은 53%). 즉, 전달율은 멘델 유전 법칙에 부합하고, CYP3A-MAC 형질이 약 50%의 빈도로 나타난 것을 확인할 수 있고, 난자에 있어서 CYP3A-MAC의 보유 비율이 100%에 가까운 것을 확인하였다.
[F.5] CYP3A-MAC이 2 개 보전된 TC(CYP3A-MAC) 호모 계통의 제작과 전달율
상기 방법으로 수득한 TC(CYP3A-MAC) 수컷 마우스와 TC(CYP3A-MAC) 암컷 마우스를 교배하고, CYP3A-MAC이 2 개 보전된 TC(CYP3A-MAC) 호모 계통의 수립을 시도했다. 18 마리의 새끼 마우스의 꼬리 섬유아 세포를 이용하여 Shinohara 등의 보고(Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 CYP3A-BAC(RP11757A13) DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 시각적으로 CYP3A-MAC의 존재를 확인하였다. 4 × 36의 계통에서는, 12 마리의 새끼 마우스 중 3 마리는 2 카피, 5 마리는 1 카피, 4 마리는 0 카피이었다. 24 × 37의 계통은 6 마리의 새끼 마우스 중 1 마리는 2 카피, 3 마리는 1 카피, 2 마리는 0 카피이었다. 총 18 마리를 얻을 수 있었고, CYP3A-MAC의 2 카피(4 마리), 1 카피(8 마리), 0 카피(6 마리)의 비율은 1:2:1.5이며, 멘델 유전 법칙에 거의 일치하고 있었다. 그 대표적인 결과를 도 46에 나타내었다.
이상의 결과, CYP3A-MAC은 마우스 ES 세포(in vitro)에서 95% 이상의 비율로 매우 안정적으로 장기간 보유되고, 마우스 조직(in vivo)에서 90% 이상의 비율로 매우 안정하고 호모 계통으로 보유되는 것을 확인하였다.
[G] TC(CYP3A-MAC) 마우스 계통에 있어서 조직 특이적인 CYP3A 유전자 클러스터의 유전자 발현
상기에서 TC(CYP3A-MAC) 마우스 중 수컷(2)과 암컷(14) 1 마리씩에 대해 뇌, 흉선, 심장, 폐, 간, 신장, 비장, 소장, 근육에서 총 RNA를 상용 프로토콜 (QIAGEN)에 따라 추출한 후, 상용 프로토콜(invitrogen)에 따라 cDNA을 합성하고, 이를 주형으로 PCR을 실시하여, 인간 CYP3A 유전자 클러스터 및 마우스 Cyp3a 유전자 클러스터의 발현을 검출했다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
인간 CYP3A 유전자 클러스터 발현 검출용 프라이머:
3A4-1L: 5'-gtatggaaaagtgtggggct-3'(서열 번호 51)
3A4-1R: 5'-atacttcaagaattgggatg-3'(서열 번호 52)
3A4-2L: 5'-ccaagctatgctcttcaccg-3'(서열 번호 53)
3A4-2R: 5'-tgaagaagtcctcctaagct-3'(서열 번호 54)
3A5-1L: 5'-ctctgtttccaaaagatacc-3'(서열 번호 55)
3A5-1R: 5'-tcaacatctttcttgcaagt-3'(서열 번호 56)
3A7-1L: 5'-agcttttaagatttaatcca-3'(서열 번호 57)
3A7-1R: 5'-gagctttgtgggtctcagag-3'(서열 번호 58)
3A7-2L: 5'-ctctcagaattcaaaagact-3'(서열 번호 59)
3A7-2R: 5'-agaagaagtcctccaaagcg-3'(서열 번호 60)
3A43-2L: 5'-tatgacacaactagcaccac-3'(서열 번호 61)
3A43-2R: 5'-agtgtctagtgttctgggat-3'(서열 번호 62)
마우스 Cyp3a 유전자 클러스터 발현 검출용 프라이머:
3a11-1L: 5'-tcaaacgcctctccttgctg-3'(서열 번호 63)
3a11-1R: 5'-gcttgcctttctttgccttc-3'(서열 번호 64)
3a11-2L: 5'-ggtaaagtacttgaggcaga-3'(서열 번호 65)
3a11-2R: 5'-agaaagggctttatgagaga-3'(서열 번호 66)
3a13-1L: 5'-agaaacatgaggcagggatt-3'(서열 번호 67)
3a13-1R: 5'-acaaggagacatttagtgca-3'(서열 번호 68)
3a13-2L: 5'-taccccagtatttgatgcac-3'(서열 번호 69)
3a13-2R: 5'-agataactgactgagccaca-3'(서열 번호 70)
컨트롤 유전자 발현 검출용 프라이머:
GAPDH-F: 5'-CCATCTTCCAGGAGCGAGA-3'(서열 번호 71)
GAPDH-R: 5'-TGTCATACCAGGAAATGAGC-3'(서열 번호 72)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 EX Taq(타카 라 주조)를 이용하여 버퍼 및 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 93℃ 5 분 열변 후, 93℃, 1 분, 56℃, 1 분, 72℃ 1 분 1 사이클로 35 사이클로 반복하였다.
그 결과 TC(CYP3A-MAC)를 보유하는 마우스에 있어서, CYP3A4는 간장과 소장에서만, CYP3A5은 간장과 소장과 폐에서만, CYP3A7은 간과 소장과 신장과 폐에서만, CYP3A43은 간과 소장과 신장에서만, Cyp3a11은 간장과 소장에서만, Cyp3a13은 간장과 소장에서만 발현을 검출할 수 있었다. 또한, 컨트롤의 GAPDH는 모든 조직에서 발현되었다. 그 암컷(14)의 대표적인 결과를 도 47에 나타내었다. 이처럼 인간으로 보여지도록 조직 특이적으로 발현이 인정되어, 사람형화 된 것을 확인하였다.
[H] TC(CYP3A-MAC) 마우스 계통의 시기 특이적인 CYP3A 유전자 클러스터의 유전자 발현
GFP 양성의 TC(CYP3A-MAC) 마우스의 수컷과 암컷의 태령 14.5 일, 태령 16.5 일, 태령 18.5 일, 생후 0 일, 4 주령, 6 주령, 12 주령, 24 주령의 간장에서 총 RNA를 상용 프로토콜(QIAGEN)에 따라 추출한 후, 상용 프로토콜(invitrogen)에 따라 cDNA을 합성하고, 이를 주형으로 PCR을 실시하여, 상기 인간 CYP3A 유전자 클러스터 발현 및 마우스 Cyp3a 유전자 클러스터 발현을 검출하는 프라이머를 이용하여 발현을 검출하였다.
그 결과, 성체발현의 인간 CYP3A4, 인간 CYP3A5, 마우스 cyp3a11, 마우스 Cyp3a13은 성체기에서 태아형의 CYP3A7는 태아에서 강하게 발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, 컨트롤의 GAPDH는 모든 태령, 주령에서 같은 정도의 발현량이 검출되었다. 그 대표적인 결과를 도 48에 나타낸다. 이처럼 인간으로 보여지는 것 같은 시기 특이적으로 발현이 인정되어, 사람형화 된 것을 확인하였다.
[실시예 9] TC(CYP3A-MAC)/△cyp 마우스 계통의 제작
[A] CYP3A-MAC을 보유하고, 내생 Cyp3a 유전자군의 두 대립 유전자(allele)가 함께 파괴된 마우스 계통의 구축
상기 실시예 8에서 제작된 TC(CYP3A-MAC)를, WO 2009/063722 (PCT/JP2008/068928)의 실시예 7에서 제작된 △cyp 계통에 다시 교배하여서 얻은 GFP 양성 마우스 개체에 대하여, 상기에서 기재한 PCR 방법을 사용하여 유전자형의 분석을 실시하였다. 교배하여 얻은, 새끼 쥐 51 마리의 꼬리를 일부 잘라내, 그 시료로부터 게놈 DNA를 조제하였다. 상기 얻어진 DNA에 대해 CYP3A-MAC 검출용 프라이머 및 WO 2009/063722(PCT/JP2008/068928)의 표 1에 개재된 프라이머를 이용한 PCR을 상기와 동일한 방법으로 수행하고, CYP3A-MAC의 보유 및 Cyp3a 유전자 클러스터 KO를 검토한 결과, 24 마리에 있어서, CYP3A-MAC을 보유하며, 내생 Cyp3a 유전자군의 한쪽 대립 유전자(allele)가 파괴된(헤터로 KO) 마우스 계통임이 확인되었다. 또한, 상기 헤터로에 Cyp3a 유전자군이 파괴되고, 또한 CYP3A-MAC을 보유하는 마우스와 △cyp 계통에 다시 교배하여 얻은 GFP 양성 마우스 38 마리 중의 꼬리를 일부 잘라내, 상기 시료로부터 게놈 DNA를 조제하고, 상기와 같은 PCR 법을 이용하여 유전자형 분석을 실시하였다. 그 결과 18 마리에 있어서, CYP3A-MAC을 보유하며 내생 Cyp3a 유전자군의 두 대립 유전자(allele)가 파괴된(호모 KO) 마우스 계통임을 확인하였다(이하, TC(CYP3A-MAC)/△cyp라고 적는다).
[B] TC(CYP3A-MAC)/△cyp 마우스 계통의 대사 분석
TC(CYP3A-MAC)/△cyp 마우스, △cyp 마우스 개체의 간장 마이크로좀(microsome)을 Omura 등(J.Biol.Chem., 239, 2370, 1964)에 따라서, CYP3A4에 의해 대사되는 것을 알고 있는 트리아졸람(Triazolam)(200μM)와 혼합하고, 그 대사 물인 알파-OH-트리아졸람(α-OH-triazolam) 및 4-OH-트리아졸람(4-OH-triazolam)을 측정할 수있다. WO 2009/063722(PCT/JP2008/068928)에 기재된 바와 같이, TC (CYP3A-MAC△)/△cyp 마우스에 있어서, 같은 계통의 마우스와 인간(HLM : human liver microsome)의 활성이 동일한 정도임을 확인할 수 있었다. 이상으로부터, TC (CYP3A-MAC)/△cyp 마우스 계통에 있어서, CYP3A-MAC에서 인간 CYP3A 유전자가 기능적이며 사람과 동등하다는 것을 확인할 수 있었다.
[C] 따라서, TC(CYP3A-MAC)/△cyp 마우스 계통 유래의 간장 마이크로좀 (microsome)은 의약품 개발에 있어서 제 1상 반응의 약효 · 독성을 조사하기 위한 시료로 이용할 수 있다. 또한, TC(CYP3A-MAC)/△cyp 마우스 계통은 인간의 약물 대사를 재현할 수 있기 때문에, 의약품 개발에 있어서, 제 1상 반응의 약효 · 독성을 조사하기 위한 생체내(in vivo) 시험을 위한 모델 마우스로 유용하게 사용될 수 있다.
[실시예 10] 마우스 인공 염색체 벡터 CYP3A-MAC 보유 랫트의 제작
[A] A9 세포로부터의 CYP3A-MAC의 랫트 ES 세포에 이입
CYP3A-MAC를 보유하는 키메라 랫트를 제작하기 위하여, 상기 실시예 8에서 수득한 CYP3A-MAC을 보유하는 A9 세포로부터, 자손 전달 가능한 랫트 ES 세포인 rESWIv3i-1 (Hirabayashi et al., Mol Reprod Dev 2010 Feb; 77 (2) : 94)에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. Tomizuka 등 (Nature Genet.16 : 133,1997) 방법에 따라 약 108 개의 CYP3A-MAC을 보유하는 A9 세포 (A9 (CYP3A-MAC) 8, 9 등)로부터 마이크로셀 (microcell)를 정제하여 DMEM 5ml에 현탁하였다. 약 107 개의 랫트 ES 세포 rESWIv3i-1을 트립신 처리에 의해 분리하고, DMEM 3 회 세정 후 DMEM 5 ml에 현탁하고 원심분리한 후, 마이크로셀을 첨가하고 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층 액을 완전히 제거하였다. 침전을 탭핑(tapping)에 의해 충분히 풀어, 1:1.4 PEG 용액[5g PEG1000 (와코 순 약), 1 ml DMSO (시그마)를 DMEM 6 ml 용해] 0.5 ml를 넣고, 약 1 분 30 초 동안 충분히 교반 하였다. 그 후, DMEM 10 ml를 천천히 더하고, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 30 ml의 ES 배지에 현탁하여 미리 피더 세포를 뿌린 직경 100 mm 샬레(코닝)에 3장에 분주한 후, 배양하였다. 24 시간 후, 300 μg/ml의 G418을 포함한 배지로 교환하고, 약 1 주일 선택 배양하였다. 그 결과 총 10 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다. A9 (CYP3A-MAC) 8로부터는, 2 클론, A9 (CYP3A-MAC) 8로부터는 3 클론이 CYP3A-MAC 영역만을 검출하는, 상기의 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이었다. 또한, 상기 5 클론에 대하여, CYP3A-BAC (RP11-757A13) (CHORI) 및 마우스 Cot-1 DNA를 이용한 FISH 분석 (Tomizuka 등, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되고, 또한 쥐핵형이 정상적인 클론은 3 클론인 것을 확인하였다(도 49). 이상으로부터, CYP3A-MAC을 보유하는 랫트 ES 세포가 3 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[B] 실시예 8에 기재된 바와 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 CYP3A-MAC을 보유하는 랫트 ES 세포를 이용하여 실험관내(in vitro)에서 안정성을 검증할 수 있다. 또한, 상기 ES 세포에서 키메라 렛트를 제작하고. 랫트가 자손 전달된 랫트 계통 rTC (CYP3A-MAC)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 rTC (CYP3A-MAC) 랫트 계통을 이용하여 체세포에 있어서, CYP3A-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, rTC (CYP3A-MAC) 랫트 계통 유래 간 마이크로좀 (microsome)은 의약품 개발에 있어서 제 1상 반응의 약효 · 독성을 조사하기 위한 시료로 이용할 수 있다. 또한, rTC (CYP3A-MAC) 랫트 계통은 사람의 약물 대사를 재현할 수 있기 때문에 의약품 개발에 있어서 제 1상 반응의 약효 · 독성을 조사하기 위한 생체내(in vivo) 시험의 모델 랫트로 유효하다.
[실시예 11] 마우스 인공 염색체 벡터 hChr21q-MAC 구축
다운 증후군(Down's syndrome) 모델 마우스를 제작하기 위한, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 인간 21 번 염색체 장완의 AP001657보다 원위 영역 33Mb를 포함한 DNA 서열을 Cre/loxP 시스템을 이용하여 전좌 클로닝하고, 상기 실시예 3과 마찬가지로, hChr21q-MAC를 구축하였다.
[A] hChr21-loxP 함유 DT40로부터 hChr21-loxP의 MAC1 함유 CHO 세포에 도입
CHO 세포 내에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 loxP 서열을 통해 인간 21 번 염색체 장완의 AP001657보다 원위 영역을 전좌에 삽입하기 위하여, loxP 서열을 AP001657에 삽입한 인간 21 번 염색체인 hChr21- loxP를 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 CHO 세포에 도입하였다.
[A.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 hChr21-loxP 함유 DT40 세포, DT40 (kk139) (특개 2007-295860)를 사용하여, 상기 같이 MAC1 함유 CHO hprt 결손 세포 (인간 과학 연구 자원 뱅크에서 수득, 등록 번호 JCRB0218)인, CHO (HPRT-; MAC1)에 미소 핵 세포 융합법을 실시하였다. 14 번의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 114 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC1, hChr21-loxP)).
[A.2] 약제 내성 클론의 선별
[A.2.1] PCR 분석
히그로마이신 (hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해서, 상기 114 클론 중 60 클론에 대해 하기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여, 인간 21 번 염색체 단편이 MAC1 함유 CHO 세포에 도입되어 있는지를 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 5L (상기 기재)
EGFP (F) L (상기 기재)
kj neo (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
# 21CEN <1> 2L : 5'-aaatgcatcaccattctcccagttaccc -3 '(서열 번호 73)
PGKr1 : 5'-ggagatgaggaagaggagaaca-3 '(서열 번호 74)
D21S265-L : 5'-gggtaagaaggtgcttaatgctc-3 '(서열 번호 75)
D21S265-R : 5'-tgaatatgggttctggatgtagtg-3 '(서열 번호 76)
D21S261-L : 5'-gagggggactgggacaagccctttgctggaagaga-3 '(서열 번호 77)
D21S261-R : 5'-acattaggaaaaatcaaaaggtccaattattaagg-3 '(서열 번호 78)
D21S268-L : 5'-CAACAGAGTGAGACAGGCTC-3 '(서열 번호 79)
D21S268-R : 5'-TTCCAGGAACCACTACACTG-3 '(서열 번호 80)
D21S266-L : 5'-ggcttggggacattgagtcatcacaatgtagatgt-3 '(서열 번호 81)
D21S266-R : 5'-gaagaaaggcaaatgaagacctgaacatgtaagtt-3 '(서열 번호 82)
D21S1259-L : 5'-GGGACTGTAATAAATATTCTGTTGG-3 '(서열 번호 83)
D21S1259-R : 5'-CACTGGCTCTCCTGACC-3 '(서열 번호 84)
CBR-L : 5'-gatcctcctgaatgcctg-3 '(서열 번호 85)
CBR-R : 5'-gtaaatgccctttggacc-3 '(서열 번호 86)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용 하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 60 클론 중 11 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 PCT 결과를 바탕으로 상기 11 클론을 이용하여 하기 분석을 수행하였다.
[A.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC1, hChr21-loxP)의 11 클론 중 6 클론에 대하여, Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로, 마우스 Cot- 1 DNA와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로 한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 1 클론에서 70% 비율로 MAC1 및 hChr21-loxP가 CHO 세포에 1 카피로 도입되고 있는 것을 확인하였다(도 50).
이상의 결과에서, hChr21-loxP가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[B] CHO (HPRT-; MAC1, hChr21-loxP) 클론의 인간 21 번 염색체 장완의 AP001657보다 원위 영역 33Mb의 MAC1 벡터에 부위 특이적 전좌
33Mb 크기의 DNA인 인간 21 번 염색체 장완의 AP001657보다 원위 영역을 마우스 개체에서 안정적으로 보유하기 위하여, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 전좌 삽입하였다(그림 51).
[B.1] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC1, hChr21-loxP) -37에 리포펙션 (lipofection) 법을 이용하여 유전자를 도입하고, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태로 된 6 웰(well) 세포에 대해, Cre 3μg를 시판 (인비트로젠(invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양에서 2 주간 배양하면, 내성 콜로니가 출현하고, 2 회 도입에서 얻은 총 2 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: CHO (hChr21q-MAC, hChr21-hChr21q)).
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
HAT 내성주 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 상호 전좌 클론을 선별하기 위하여, 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여, 인간 21 번 염색체 단편과 MAC1에서 염색체 상호 전좌가 발생하는지 확인하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
kj neo (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
D21S265-L (상기 기재)
D21S265-R (상기 기재)
D21S261-L (상기 기재)
D21S261-R (상기 기재)
D21S268-L (상기 기재)
D21S268-R (상기 기재)
D21S266-L (상기 기재)
D21S266-R (상기 기재)
D21S1259-L (상기 기재)
D21S1259-R (상기 기재)
CBR-L (상기 기재)
CBR-R (상기 기재)
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부 된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분, 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 2 클론 중 2 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 결과를 바탕으로, 이 2 클론에 대하여 이후 분석을 수행하였다.
[B.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (hChr21q-MAC, hChr21-hChr21q) 2 클론에 대하여, Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA와 인간 Cot -1 DNA를 프로브로 한, FISH 분석을 실시한 결과, 2 클론 중 2 클론이 90% 이상의 비율로 MAC1에 인간 21 번 염색체 유래의 신호가 관찰되는 것을 확인하였다(도 52).
이상의 결과로부터, 인간 21 번 염색체 장완의 AP001657보다 원위 영역 33Mb가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 상호 전좌에 의한 클로닝을 할 수 있었다고 결론 지었다.
[C] CHO 세포로부터 hChr21q-MAC의 마우스 ES 세포에 이입
hChr21q-MAC을 보유하는 키메라 마우스를 제작하기 위하여, 상기 [B]에서 수득한 hChr21q-MAC을 보유하는 CHO 세포로부터 마우스 ES 세포 (야생형 TT2F)에 미소 핵 세포 융합법을 이용하여 도입하였다. Tomizuka 등 (Nature Genet.16 : 133,1997) 방법에 따라 약 108개의 hChr21q-MAC을 보유하는 CHO 세포 (CHO (hChr21q-MAC, hChr21-hChr21q) 1, 2)로부터 마이크로셀 (microcell)를 정제하고, DMEM 5 ml에 현탁하였다. 약 107개의 마우스 ES 세포 TT2F를 트립신 처리에 의해 분리하여 DMEM에서 3 회 세정 후, DMEM 5 ml에 현탁하고, 원심분리를 수행한 후, 마이크로셀을 첨가한 후, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층 액을 완전히 제거하였다. 침전을 톱핑(tapping)에 의해, 충분히 풀어, 1:1.4 PEG 용액 [5g PEG1000 (와코 순약) 1 ml DMSO (시그마)를 DMEM 6ml 용해] 0.5 ml를 넣고 약 1 분 30 초 동안 충분히 교반하였다. 그 후, DMEM 10 ml를 천천히 함께 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하고, 30 ml의 ES 배지에 현탁하여, 미리 피더 세포(feeder cell)를 뿌린 직경 100 mm 샬레(코닝) 3개로 분주한 후, 배양하였다. 24 시간 후, 300 μg/ml의 G418을 포함하는 배지로 교환하고, 약 1 주일 동안 선택 배양하였다. 그 결과 총 24 개 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다. CHO (hChr21q-MAC, hChr21-hChr21q) 1로부터 2 클론, CHO (hChr21q-MAC, hChr21-hChr21q) 2로부터 6 클론이 hChr21q-MAC 영역만을 검출하는 앞의 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이였다. 또한, 상기 8 클론에 대하여, 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 minor satellite DNA를 이용하여 FISH 분석 (Tomizuka 등, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되고, 마우스 핵형이 정상적인 클론은 2 클론이었다 (도 53). 이상으로부터, hChr21q-MAC 보유 TT2F 세포가 2 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[D] hChr21q-MAC의 마우스 ES 세포에서의 안정성
상기 방법으로 수득한 마우스 ES 클론 (예를들면 TT2F (hChr21q-MAC) 22, 상기 [C]로 취득)에 대해 0 ~ 50 PDL의 비선택 배양하에서 장기 배양 후에 있어서, FISH 해석에 의한 hChr21q-MAC 보유 세포의 비율을 측정 결과, 50 PDL에서도 95% 이상의 보유 비율이었다(도 54).
[E] hChr21q-MAC를 보유하는 키메라 마우스의 제작
상기 [C]에서 얻은 hChr21q-MAC 보유 ES 세포 클론을 이용하여 Tomizuka 등의 방법 (Nature Genet.16 : 133,1997)으로 키메라 마우스를 제작하였다. 숙주은 MCH (ICR) (흰색, 일본 클레어 사로부터 구입)의 자웅 교배에 의해 얻을 수 있는 8 세포기 배아를 사용하였다. 주입 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 태어나는 새끼 생쥐 머리 색깔로 키메라인지 여부를 판정할 수 있다. MAC1 보유 ES 클론 (예 TT2F (hChr21q-MAC) 20, 22 등 위의 [C]로 취득)을 주입한 220개의 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 18 마리의 키메라 마우스 (머리 색깔에 진한 갈색 부분의 인정)가 탄생했다. 이 중 2 마리는 흰색 부분이 거의 관찰할 수 없는 키메라 비율 100%의 개체였다. 또한, 이중 1 마리는 GFP 양성 개체였다(도 55). 즉, 마우스 인공 염색체 벡터 hChr21q-MAC 보유 ES 세포주 (TT2F)는 키메라 형성 능력을 보유하고 있는, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있는 것으로 확인하였다.
[F] 실시예 8에 기재된 바와 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 hChr21q-MAC을 보유하는 키메라 마우스로부터, hChr21q-MAC이 자손 전달된 마우스 계통 TC (hChr21q-MAC)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC (hChr21q-MAC) 마우스 계통을 이용하여, 체세포에 있어서의 hChr21q-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, TC (hChr21q-MAC) 계통은 다운 증후군 모델 마우스로 사용할 수 있으며, 다운 증후군의 증상 발병 메커니즘 해명이나 증상 개선을 위한 치료제 개발에 이용할 수 있다.
[실시예 12] 마우스 인공 염색체 벡터 hChr21q22.12-MAC 구축
다운증후군(Down's syndrome)이 유발된 마우스를 제작하기 위하여, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 인간 21 번 염색체 장완의 AP00172보다 원위 영역을 포함하는 DNA 서열을 Cre / loxP 시스템을 이용하여 전좌 클로닝하고, 실시예 3과 동일한 방법으로, hChr21q22.12-MAC를 구축하였다.
[A] 인간 21 번 염색체의 AP001721에 loxP 서열의 부위 특이적 삽입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 loxP 서열을 통해서 전좌 삽입하기 위해 DT40 세포 내에서 인간 21 번 염색체 (hChr21)의 DSCR (다운 증후군 질환 원인 영역 클러스터)의 근위의 AP001721에 loxP 서열을 삽입하였다.
[A.1] 타겟팅 벡터 pCKloxPHyg의 제작
인간 21 번 염색체상의 AP001721의 매우 가까운 동시에 중심체(cetromere) 측 (약 50Kb 중심체 (cetromere) 쪽)에 위치하는, 다운증후군(Down's syndrome) 원인 유전자 영역 (DSCR)에 Cre 재조합 효소의 인식 서열 loxP를 삽입하기 위한 타겟팅 벡터 pCKloxPHyg을 하기와 같이 제작하였다. 먼저, AP001721 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
AML5'.L1; 5'-TAGAATTCGTAGGCTTGGAAGCAGTGAGAGAGAA-3'(서열 번호 87)
AML5'.R2; 5'-GAAGACTGGTAAATCTGGTGGCTGTC-3'(서열 번호 88)
AML5'.L4; 5'-ATTAGATCTCCTGCTGTTATCTCATGCACTCTCA-3'(서열 번호 89)
AML5'. R4; 5'-ATTAGATCTATGATGCCTGATACATGGTCTGTGA-3'(서열 번호 90)
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V901 (Lexicon genetics)을 이용하였다. PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 5 분 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제(proteinase) K (GIBCO) 처리 후, CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)로 PCR 단편 (2.9kb 및 2.0kb)을 젤 여과하였다. 그 후 제한 효소 EcoRI (닛뽄진) 및 BglII (닛뽄진)로 절단하여 CHROMASPIN-TE1000 (클론 텍)에서 젤 여과하였다. 다음에 MC1-TK 서열을 V830 (Lexicon genetics)에서 RsrII (NEB)로 잘라, V901 플라스미드의 제한 효소 HindIII 인식 부위에 클로닝 하였다 (V901T-1). 상기 PCR 단편 (2.9kb 및 2.0kb)를 V901T-1 플라스미드 EcoRI과 BglII 사이트에 클로닝 하였다 (V901T-1HR2). 그런 다음, Kazuki 등의 보고 (Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에 나열된 5'-HPRT-loxP-Hyg-TK 벡터로부터 5'-HPRT-loxP-Hyg을 KpnI과 AscI로 잘라, V901T-1HR2의 AscI과 KpnI 사이트에 클로닝하였다(pCKloxPHyg). 최종적인 loxP 삽입 컨스트럭트(construct)의 크기는 11.2kb이였다. 타겟팅 벡터 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)(도 56)에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 히그로마이신 (hygromycin) 내성 클론의 단리
상기에서 동일한 방법으로 제작한 타겟팅 벡터 pCKloxPHyg를 제한 효소 NotI (TAKARA)로 선형화한 후, 인간 21 번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포 (Kazuki et al. BBRC 2004, DT40 (21-2-3 ))에 형질 전환하고, 히그로마이신 B (1.5 mg/ml)가 포함된 배지로 교체하고, 96 웰 배양 플레이트 3 장에 분주하고, 약 2 주일 동안 선택 배양하였다. 4 번의 형질 전환으로 얻은 총 178 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (hChr21q22.12-loxP)).
[A.3] 상동 재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
히그로마이신 (hygromycin) 내성 클론으로부터 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System 사)을 사용하여 게놈 DNA를 추출한 후, 다음 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다.
하기, 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다.
AMLloxP-4L; 5'-AGAAAGGCAGGTGAGTGTGGAGGTAGA-3'(서열 번호 91)
AMLloxP-4R; 5'-GAAGTGGGCTCACAGGAATTTTCCAA-3'(서열 번호 92)
AMLloxP-8L; 5'-GGGCCTCTTTATTTGGCAGAATATCACC-3'(서열 번호 93)
AMLloxP-8R; 5'-TTACACTGAGATTCAGGGCACGATGA-3'(서열 번호 94)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 4 분 35 사이클 반복하였다. 178 클론을 스크리닝한 결과, 71 클론이 상동 재조합체로 동정되었다.
[A.3.2] 서던 블롯 분석
상기 PCR 분석에서 재조합을 확인한 후, 10 클론에 대해 다음과 같이 서던 블롯 분석을 실시하였다. 이 게놈 DNA를 제한 효소 EcoRI (TAKARA)로 처리하고, 0.8% 아가로스겔에 전기 영동하고 GeneScreen PlusTM 하이브리다이제이션 (hybridization) 트렌스퍼 멤브레인(NENTM Life Science Products, Inc.)에 알카리 블롯팅(alkali blotting )을 수행하였다. 이 필터에 대하여, AP001721안의 유전자 서열을 PCR에 의해 증폭한 SP7 프로브를 사용하여 서던 하이브리다이제이션 (Southern Southern hybridization)을 수행하여 상동 재조합 체를 동정하였다. SP7 프로브의 제작은 하기의 프라이머를 이용해 DT40 (21-2-3)의 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR을 실시하고, 그 PCR 산물을 주형으로서 랜덤 프라이밍(priming)에 의한 32P 표식 DNA 프로브를 제작 하였다(아마샤무 첨부된 프로토콜에 따라 수행).
SP7 프로브 제작용 뇌관 :
SP7L; 5'-CAGCTGGGAAACACTGAGCAAGATTATG-3'(서열 번호 95)
SP7R; 5'-CTGCTAGACTGAAAATGCGTTTCCTCTG-3'(서열 번호 96)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 EX Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 93℃, 5 분 열변 후, 93℃, 1 분, 54℃, 1 분, 72℃, 1 분, 1 사이클로 35 사이클을 수행하였다. 서던 하이브리다이제이션에의해, 비상동 재조합은 약 7.5 kb, 상동 재조합은 약 9.4 kb 밴드가 검출되는 것으로 예측되었다(도 56). 서던 하이브리다이제이션의 결과, 10 클론 중 모든 클론이 목적 상동 재조합체였다. 그 대표적인 결과를 도 57에 나타내었다.
[A.3.3] two-color FISH 분석
FISH 분석 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 클론 중 10 클론을 사람 cot-1 DNA 및 히그로마이신 (hygromycin)을 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 21 번 염색체의 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌 하지 않고, 21q22 부근에 히그로마이신 (hygromycin) 유래의 신호가 검출된 것으로부터, 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다(도 58). 이상의 결과로부터 인간 21 번 염색체 단편에 유전자 부위인 loxP 서열이 부위 특이적으로 삽입됐다고 결론 지었다.
[B] hChr21q22.12-loxP 함유 DT40로부터 hChr21q22.12-loxP의 MAC1 함유 CHO 세포에 도입
CHO 세포 내에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 loxP 서열을 통해서, 인간 21 번 염색체 장완의 AP001721보다 원위 영역을 전좌 삽입하기 위하여, loxP 서열을 AP001721에 삽입한 인간 21 번 염색체인 hChr21q22. 12-loxP를 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 CHO 세포에 도입하였다.
[B.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 hChr21q22.12-loxP 함유 DT40 세포, DT40 (hChr21q22.12-loxP) 47을 이용하여, 상기와 같이 MAC1 함유 CHO hprt 결손 세포 (인간 과학 연구 자원 뱅크에서 수득, 등록 번호 JCRB0218)인 CHO (HPRT-; MAC1)에 미소 핵 세포 융합 법을 실시하였다. 15 회 미소 핵 세포 융합으로 얻은 140 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC1, hChr21q22.12-loxP)).
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
히그로마이신 (hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해, 상기 140 클론 중 20 클론에 대해 다음 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하고, 인간 21 번 염색체 단편이 MAC1 함유 CHO 세포에 도입되어있는지를 확인하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 5L (상기 기재)
EGFP (F) L (상기 기재)
kj neo (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
D21S265-L : gggtaagaaggtgcttaatgctc (서열 번호 97)
D21S265-R : tgaatatgggttctggatgtagtg (서열 번호 98)
D21S261-L : gagggggactgggacaagccctttgctggaagaga (서열 번호 99)
D21S261-R : acattaggaaaaatcaaaaggtccaattattaagg (서열 번호 100)
D21S268-L : CAACAGAGTGAGACAGGCTC (서열 번호 101)
D21S268-R : TTCCAGGAACCACTACACTG (서열 번호 102)
D21S266-L : ggcttggggacattgagtcatcacaatgtagatgt (서열 번호 103)
D21S266-R : gaagaaaggcaaatgaagacctgaacatgtaagtt (서열 번호 104)
D21S1259-L : GGGACTGTAATAAATATTCTGTTGG (서열 번호 105)
D21S1259-R : CACTGGCTCTCCTGACC (서열 번호 106)
CBR-L : gatcctcctgaatgcctg (서열 번호 107)
CBR-R : gtaaatgccctttggacc (서열 번호 108)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분, 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 20 클론 중 13 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이후, 13 클론에서 이후 분석을 수행하였다.
[B.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC1, hChr21q22.12-loxP) 13 클론 중 6 클론에 대하여 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 2 클론의 75% 비율로 MAC1 및 hChr21q22.12-loxP가 CHO 세포에 1 카피로 되입되어 있는 것을 확인하였다 (도 59).
이상의 결과에서, hChr21q22.12-loxP가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1 함유 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[C] CHO (HPRT-; MAC1, hChr21q22.12-loxP) 클론의 인간 21 번 염색체 장완의 AP001721보다 원위 영역 12 Mb의 MAC1 벡터에 부위 특이적 전좌
12Mb 크기의 DNA인 인간 21 번 염색체 장완의 AP001721보다 원위 영역을 마우스 개체에서 안정적으로 보유하기 위하여, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 전좌 삽입하였다(도 60).
[C.1] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC1, hChr21q22.12-loxP) -12, 13을 리포펙션 (lipofection) 법을 이용하여 유전자 도입하고, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태로 된 6 웰의 세포에 대해 Cre 3 μg를 시판 (인비트로젠 (invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양하에서, 2 주 동안 배양하면 내성 콜로니가 출현하고, 2 회 도입에서 얻은 총 19 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: CHO (hChr21q22.12- MAC, hChr21-hChr21q22.12)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 상호 전좌 클론을 선별하기 위하여 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 인간 21 번 염색체 단편과 MAC1에서 염색체 상호 전좌가 발생하는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
kj neo (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
D21S265-L (상기 기재)
D21S265-R (상기 기재)
D21S261-L (상기 기재)
D21S261-R (상기 기재)
D21S268-L (상기 기재)
D21S268-R (상기 기재)
D21S266-L (상기 기재)
D21S266-R (상기 기재)
D21S1259-L (상기 기재)
D21S1259-R (상기 기재)
CBR-L (상기 기재)
CBR-R (전출)
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 19 클론 중 8 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 이 8 클론으로 이후 분석을 실시하였다.
[C.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (hChr21q22.12-MAC, hChr21-hChr21q22.12)의 8 클론에 대하여, Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한, 결과 8 클론 중 8 클론이로 85 % 이상 비율로 MAC1에 인간 21 번 염색체 유래의 신호가 관찰되는 것을 확인하였다(도 61).
이상의 결과로부터 인간 21 번 염색체 장완의 AP001721보다 원위 영역 12 Mb가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC1에 상호 전좌에 의한 클로닝 수 있었다고 결론 지었다.
[D] CHO 세포로부터의 hChr21q22.12-MAC 마우스 ES 세포에 이입
hChr21q22.12-MAC을 보유하는 키메라 마우스를 제작하기 위하여, 상기 [C]에서 수득한 hChr21q22.12-MAC을 보유하는 CHO 세포로부터 마우스 ES 세포 (야생형 TT2F)에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. Tomizuka 등 (Nature Genet.16: 133,1997) 방법에 따라 약 108개의 hChr21q-MAC을 보유하는 CHO 세포 (CHO (hChr21q22.12-MAC, hChr21-hChr21q22.12) 1, 12)에서 마이크로 셀 (microcell)를 정제하고, DMEM 5 ml에 현탁하였다. 약 107개의 마우스 ES 세포 TT2F를 트립신 처리에 의해 분리하고 DMEM 3 회 세정 후, DMEM 5 ml에 현탁하고 원심한 후, 마이크로셀을 첨가한 후, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층 액을 완전히 제거하였다. 침전을 톱핑(tapping)하여 충분히 풀고, 1:1.4 PEG 용액 [5g PEG1000 (와코 순 약) 1ml DMSO (시그마)를 DMEM 6 ml 용해] 0.5 ml를 넣고 약 1 분 30 초 동안 충분히 교반하였다. 그 후, DMEM 10 ml를 천천히 더하고, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 30 ml의 ES 배지에 현탁하고, 미리 피더 세포(feeder cell)를 뿌린 직경 100mm 샬레(코닝) 3 개로 분주 배양하였다. 24 시간 후, 300 μg/ml의 G418을 포함한 배지로 교환하고, 약 1 주일 선택 배양하였다. 그 결과, 총 13 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다. CHO (hChr21q22.12-MAC, hChr21-hChr21q22.12) 1로부터 1 클론, CHO (hChr21q22.12-MAC, hChr21-hChr21q22.12) 12로부터 1 클론이 hChr21q22.12-MAC 영역만을 검출하는 상기 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이었다. 또한, 상기 2 클론에 대한 인간 Cot-1 DNA 및 마우스 minor satellite DNA를 이용하여 FISH 분석 (Tomizuka들, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되고, 마우스 핵형이 정상적인 클론이 1 클론이었다 (도 62). 이상으로부터, hChr21q22.12-MAC 보유 TT2F 세포를 1 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[E] hChr21q22.12-MAC의 마우스 ES 세포에 있어서 안정성
상기에서 수득한 마우스 ES 클론 (예를들면, TT2F (hChr21q22.12-MAC) 8 상기 [D]로부터 취득)에 대하여, 0 ~ 50 PDL의 비선택 배양하에서 장기 배양 후의 FISH 해석에 의한 hChr21q22.12-MAC 보유 세포의 비율을 측정한 결과, 50 PDL에서도 95% 이상의 보유 비율이였다(도 63).
[F] hChr21q22.12-MAC을 보유하는 키메라 마우스 제작
상기 [D]에서 수득한 hChr21q22.12-MAC 보유 ES 세포 클론을 이용하여 Tomizuka 등의 방법 (Nature Genet.16 : 133,1997)에서 키메라 마우스를 제작하였다. 숙주은 MCH (ICR) (흰색, 일본 클레어 사로부터 구입)의 자웅 교배에 의해 얻을 수 있는 8 세포기 배아를 사용하였다. 주입 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 태어나는 새끼 생쥐 머리 색깔로 키메라인지 여부를 판정할 수 있다. hChr21q22.12-MAC 보유 ES 클론 (예 TT2F (hChr21q22.12-MAC) 8 위 [D]로 취득)을 주입하고 80 개의 배아를 대리 부모에 이식한 결과, 43 마리의 키메라 마우스 (머리 색깔에 진한 갈색 부분의 인정)가 탄생하였다. 이 중 3 마리는 흰색 부분이 거의 관찰할 수 없는 키메라 비율 100%의 개체였다. 즉, 마우스 인공 염색체 벡터 hChr21q22.12-MAC 보유 ES 세포주 (TT2F)는 키메라 형성 능력을 보유하고 있는, 즉 마우스 개체의 정상 조직으로 분화하는 능력을 보유하고 있는 것을 확인하였다.
[G] 실시예 8에 기재된 바와 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 hChr21q22.12-MAC을 보유하는 키메라 마우스로부터 hChr21q22.12-MAC이 자손 전달된 마우스 계통 TC (hChr21q22.12-MAC)을 제작할 수 있다. 또한, 상기의 TC (hChr21q22.12-MAC) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 hChr21q22.12-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, hChr21q22.12-MAC 계통은 다운 증후군 모델 마우스로 사용할 수 있으며, 다운 증후군의 증상 발병 메커니즘 해명이나 증상 개선을 위한 치료제 개발에 이용할 수 있다. 또한, TC (hChr21q-MAC) 마우스 계통과 TC (hChr21q22.12-MAC) 마우스 계통의 표현형을 비교하여 다운 증후군의 원인 유전자 영역을 분류할 수 있다.
[실시예 13] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2의 안정성
[A] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2의 CHO 세포에 있어서 안정성
상기 방법으로 수득한 CHO 클론 (예를들면, CHO (HPRT-; MAC2) -13,18 상기 실시예 4에서 취득)에 대해 0 ~ 25 PDL 비선택 배양하에서 장기 배양 후의 FISH 분석에 의한 MAC2 보유 세포 비율을 측정한 결과, 25 PDL에서도 90% 이상의 보유 비율이었다. 한편, Kazuki 등의 보고 (Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에 포함된 21 번 염색체 유래의 GFP 탑재 HAC 벡터 (21HAC2) 보유 CHO 세포에서 25 PDL에서는 70% 이하 보유 비율이였다. 그 대표적인 결과를 도 64에 나타내었다.
[실시예 14] 마우스 인공 염색체 벡터 FVIII-MAC 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC2 유용 단백질을 코딩하는 유전자의 예로는 혈우병 A의 원인 유전자인 여덟째 인자(FVIII)를 Cre/loxP 시스템을 이용하여 삽입 기능 단백질의 발현과 장기 안정성 검증하였다.
[A] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2 벡터 함유 CHO 세포에 있어서의 특정의 유용 단백질을 코딩하는 유전자 (예를들면 FVIII)의 Cre/loxP 시스템에 의한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2에 삽입
마우스 인공 염색체 MAC에 DNA 삽입 서열로 5'HPRT-loxP-PGKhyg 유형 loxP 서열을 삽입한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2에 있어서 loxP가 실행되어 환상 DNA가 부위 특이적으로 삽입할 수 있는지 여부를 확인하였다.
[A.1] FVIII 삽입 벡터의 제작
pCAGGS (오사카, 오카베 박사로부터 입수)의 프로모터와 poly A 영역을 SalI과 PstI 사이트에서 절단하고, pBluescript KS (-) (Stratagene) 멀티 클로닝 사이트를 개변한 pB3의 SalI과 PstI 사이트에 클로닝 하였다(pB-CAG). pKF17K 플라스미드중의 B 도메인 결손 FVIII cDNA (자치의과대학, 사카타 교수로부터 입수)를 XhoI과 SalI 사이트에서 절단하고, pB-CAG의 프로모터와 poly A 사이에 EcoRI 사이트에 클로닝 하였다 (pB- CAGF8). pB-CAGF8의 CAG-F8-pA 영역을 SalI과 AvrII 사이트에서 단리하고, pB3ins2에 상기 2개의 HS4 인슈레이터 (insulator) 서열에 끼어지게 SalI과 AvrII 사이트에 클로닝 하였다 (pB3-F8ins2). 그런 다음, pPAC4 (Children 's Hospital Oakland Research Institute (CHORI), BAC / PAC Resources)를 3'HPRT-loxP 서열을 포함하는 벡터에 도입하였다. pB3-F8ins2에 상기 AscI과 FseI 영역인 FVIII 발현 카세트 (HS4-CAG-F8-pA-HS4)를 pPAC4의 AscI과 FseI 사이트에 클로닝하고, HPRT 재구축계의 1 카피 FVIII 삽입 컨스트럭트(construct)했다(벡터 명: pPAC4 F8ins2 H3-9 (1 복사 FVIII-PAC)) (도 65). AvrII 사이트 및 NheI 사이트 컴패터블 코히시브 앤드(compatible cohesive end)의 특징을 이용하고, 1 카피 FVIII-PAC에 있어서의 AscI로부터 AvrII1 1 발현 카세트 영역을 벡터의 AscI에서 NheI 사이트에 다시 클로닝에 의해 2 발현 카세트를 가진 2 카피 FVIII -PAC을 수득하였다. 또한, 상기와 동일하게 삽입 카세트를 AscI과 AvrII, 벡터 쪽을 AscI과 NheI 사이트에서 다시 클로닝하여 2, 4, 8, 16 카피까지 FVIII 발현 카세트를 가진 PAC 벡터를 제작하였다 (도 66).
[A.2] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
유전자 도입 리포펙션(lipofection) 법을 이용하여, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태로 된 6 웰 세포에 대해 Cre 1 μg 및 1 카피 FVIII-PAC 벡터 10 μg을 시판 (인비트로젠(invitrogen))의 프로토콜에 따라, 상기 CHO (HPRT-; MAC2) -13 및 Kazuki 등의 보고 (Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에 기재된 CHO (HPRT-; 21HAC2)에 도입하였다(클론 명: CHO (FVIIIx1-MAC) 및 CHO (FVIII x1-HAC)). 또한 Cre 1 μg 및 16 카피 FVIII-PAC 벡터 10 μg을 시판 (인비트로젠 (invitrogen))의 프로토콜에 따라 상기 CHO (HPRT-; MAC2) -13에 도입하였다(클론 명: CHO (FVIIIx16-MAC)). HAT 선택 배양하에서 2 주 동안 배양하면 내성 콜로니가 출현하고, 4 회 도입에서 얻은 각각 CHO (FVIIIx1-MAC)는 46 클론, CHO (FVIIIx16-MAC)는 18 클론, CHO (FVIIIx1- HAC)에 대해서는 19 클론으로, 총 83 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다.
[A.3] 약제 내성 클론의 선별
[A.3.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하고, 부위 특이적으로 FVIII 유전자 삽입이 일어나고 있는지 확인했다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다.
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
FVIII F : 5'-ATACAACGCTTTCTCCCCAA-3'(서열 번호 109)
FVIII R : 5'-TCTTGAACTGAGGGACACTG-3'(서열 번호 110)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ex Taq (Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 10 분 가열 변성 후, 94℃, 30 초, 60℃, 30 초, 72℃, 1 분 35 사이클 반복하였다. PCR 결과 CHO (FVIIIx1-MAC) 유래에 대해서는 4 클론, CHO (FVIIIx1-HAC) 유래에 대해서는 17 클론, CHO (FVIIIx16-MAC) 유래에 대해서는 3 클론에서 양성이며, 이 24 클론을 이후 분석하였다.
[A.3.2] mono-color FISH 분석
상기 결과에서 7 클론에서 mono-color FISH 분석을 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA 또는 인간 cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, CHO (FVIIIx1-MAC) 유래에 대해서는 1 클론이 90% 이상의 비율로 FVIII-MAC을 보유하고, CHO (FVIIIx1 -HAC) 유래에 대해서는 2 클론이 90% 이상의 비율로 FVIII-HAC가 보유하며, CHO (FVIIIx16-MAC) 유래에 대해서는 1 클론이 90% 이상의 비율로 FVIII-HAC을 보유하는 것을 확인하였다.
[B] CHO 세포에 있어서의 FVIII 유전자의 유전자 발현 분석
상기 FVIIIx1-MAC을 보유하고 있는 CHO (FVIIIx1-MAC) 1-3 및 FVIIIx1-HAC를 보유하고 있는 CHO (FVIIIx1-HAC) 1-2 및 FVIIIx16-MAC을 보유하고 있는 CHO (FVIIIx16- MAC) 16-1, 16-2, 16-3를 이용하여 FVIII mRNA가 발현하고 있는지 여부를 검토하기 위해 위에서 언급한 방법에 따라 RNA를 추출하고, RNA를 주형으로 cDNA 합성하고, 하기 프라이머 (상기 기재)를 사용하여 PCR을 실시하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 10 분 가열 변성 후, 94℃, 30 초, 60℃, 30 초, 72℃, 1 분 25 사이클 반복하였다.
FVIII F : (상기 기재)
FVIII R : (상기 기재)
GAPDH F : (상기 기재)
GAPDH R : (상기 기재)
그 결과, CHO (FVIIIx1-MAC) 및 CHO (FVIIIx1-HAC)에서는 동등하게 발현하고, CHO (FVIIIx16-MAC)에서는 상기 CHO (FVIIIx1-MAC) 및 CHO (FVIIIx1-HAC)보다도 높은 발현되는 것을 확인하였다.
[C] CHO 세포에 있어서의 FVIII 유전자의 유전자 기능 분석
상기 FVIII mRNA의 발현이 확인된 CHO (FVIIIx1-MAC) 1-3 및 CHO (FVIIIx1-HAC) 1-2의 FVIII 단백질 발현의 기능 여부를 확인하기 위하여, Clotting assay (코스모 바이오)를 첨부된 프로토콜에 따라 수행하였다. 0PDL 및 비선택 배양 25 PDL까지 배양한 상기 세포를 6 웰 디쉬에 배양 100% 컨플루언트(confluent) 상태에서 새 배지로 교환하였다. 24 시간 후, 배양 상청을 회수하고, FVIII 활성에 의한 FVIII의 활성화 정도를 측정하였다. 그 결과 0PDL에서는 CHO (FVIIIx1-MAC) 1-3 및 CHO (FVIIIx1-HAC) 1-2 활성의 차이는 거의 보이지 않는 것을 확인하였다. 한편, CHO (FVIIIx1-MAC) 1-3에서는 25 PDL에서도 활성이 1.8 배 상승하고 있던 것에 반해, CHO (FVIIIx1-HAC) 1-2는 25 PDL에서는 활성이 1/6 배 감소하고 있는 것을 확인하였다(도 67). 또한, CHO (FVIIIx1-MAC) 1-3 비해 CHO (FVIIIx16-MAC) 16-1, 16-2, 16-3의 활성은 약 10 배로 상승하고, 매수 의존적으로 활성이 상승하는 것으로 확인되었다 (도 68).
이상의 실험을 통해 마우스 인공 염색체 MAC2 벡터에 FVIII 유전자를 탑재하는 것에 의해, FVIII 유전자의 기능적인 발현이 관찰되고, 더욱이, FVIII-MAC을 보유하는 CHO에서는 FVIII-HAC을 보유하는 CHO보다 장기간 안정적 및 기능적으로 발현을 보이는 것을 확인하였다. 또한, PAC 벡터에 의해, 200 kb 이내의 유용 단백질을 코딩하는 DNA가 삽입 가능하다.
[실시예 15] 복수 유전자의 도입이 가능한 마우스 인공 염색체 벡터 MI-MAC 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC2에 복수의 유전자를 탑재할 수 있는, 예를 들어, 5 개의 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위(ΦC31 attP, R4 attP, TP901-1 attP, Bxb1 attP, FRT)를 가진 multi-integrase platform을 Cre/loxP 시스템을 이용하여 삽입하고 복수 유전자의 도입·발현을 확인하였다.
[A.1] 복수 유전자 탑재 부위 (multi-integrase platform) 카세트의 제작
마우스 인공 염색체 벡터에 복수 유전자를 도입하는 복수 유전자 탑재 부위를 가진 카세트를 Multisite-Gateway kit (Invitrogen)을 이용하여 다음과 같이 제작하였다. 먼저, PGK-hyg (Clontech)를 템플릿으로서, 유전자 도입부위인 ΦC31 attP 사이트(site), R4 attP 사이트, TP901-1 attP 사이트, Bxb1 attP 사이트, FRT 사이트를 첫번째 PCR(이하의, 각 프라이머 쌍 F1-R1)에 의해 PGK 프로모터(promoter) 서열을 추가하였다. PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 kodplus (Toyobo)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 2 분 열변 후, 94℃, 15 초, 68℃, 30 초, 72℃, 90 초, 20 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제 (proteinase) K (GIBCO) 처리 후, CHROMASPIN-TE400(클론 테크)로 정제하였다.
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5r F1 :
5'-GAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCATTCTACCGGG TAGGGGAGGCGCTTTTCCC-3'(서열 번호 111)
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5r R1 :
5'-CAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGCACTACGGTCGAAAGGCCCGGAGATGAGGAAG AGGA-3'(서열 번호 112)
B5-PGK-R4 attP-B4 F1 :
5'-GGGGACAACTTTGTATACAAAAGTTGATATTCTACCGGGTAGGGGAGGCGC TTTTCCC-3'(서열 번호 113)
B5-PGK-R4 attP-B4 R1 :
5'-CACAAGCAGTACCACTGCTTCAAGTGGTATCGCTTTGGGGAACATGCGGTCGAAAGGCCCGGAGATGA
GGAAGAGGA-3'(서열 번호 114)
B4r-PGK-TP901 attP-B3r F1 :
5'-GGGGACAACTTTTCTATACAAAGTTGATATTCTACCGGGTAGGGG AGGCGCTTTTCCC-3'(서열 번호 115)
B4r-PGK-TP901 attP-B3r R1 :
5'-CTTAATTGAAATAAACGAAATAAAAACTCGCAATTAAGCGAGTTGGAAGGTCGAAAGGCCCGGAGA TGAGGAAGAGGA-3'(서열 번호 116)
B3-PGK-Bxb1 attP-B2 F1 :
5'-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGGTATTCTACCGGGTAGGGGAGG CGCTTTTCCC-3'(서열 번호 117)
B3-PGK-Bxb1 attP-B2 R1 :
5'-AGACCGCGGTGGTTGACCAGACAAACCACGAAGACACAGGTCATCACGGCCATAGGTCGAAAGGCCC GGAGATGAGGAAGAGGA-3'(서열 번호 118)
상기 방법으로 수득한 첫번째 PCR 단편을 템플릿에, Multisite-Gateway BP reaction 필요한 gateway attB 서열을 추가하고, 두번째 PCR (이하의 각 프라이머 쌍 F1-R2, ΦC31에만 F2-R2)를 실시했다. PCR 조건 등은 사이클을 25 사이클로 한 것 이외는 상기와 동일하다. 또한, primer F1 서열에 대해서도 상기의 기재된 것과 동일하다.
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5r F2 :
5'-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGAAGTTCCTAT ACTTTCTAGAGAATAGGAA-3'(서열 번호 119)
B1-FRT-PGK-ΦC31 attP-B5r R2 :
5'-GGGGACAACTTTTGTATACAAAGTTGTGACCCTACGCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGT TACCCCAGT-3'(서열 번호 120)
B5-PGK-R4 attP-B4 R2 :
5'-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGGGTGCACCCGCAGAGTGTACCCACAAGCAGTACCACTGC TTCAAGTGGTAT-3'(서열 번호 121)
B4r-PGK-TP901 attP-B3r R2 :
5'-GGGGACAACTTTATTATACAAAGTTGTTAAAAGGAGTTTTTTAGTTACCTTAATTGAAATAAACGAAA TAAAAACTCG-3'(서열 번호 122)
B3-PGK-Bxb1 attP-B2 R2 :
5'-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTATGGGTTTGTACCGTACACCACTGAGACCGCGGTGG TTGACCAGACAAACCACG-3'(서열 번호 123)
이러한 PCR 단편과 해당 gateway attP 서열을 가지는 공여벡터(donor vector)(Invitrogen : pDONR221 P1-P5r, pDONR221 P5-P4, pDONR221 P4r-P3r, pDONR221 P3-P2)를 혼합하여 BP clonase를 이용한 시험관내 재조합 반응 (BP reaction)에 의해, 도입 벡터(entry vector) (pENTR L1-FRT-PGK-ΦC31-R5, pENTR L5-PGK-R4-L4, pENTR R4-PGK-TP901-1-R3, pENTR L3-PGK-Bxb1-L2)를 제작하였다 (도 69). BP 반응(reaction)은 권장 조건에 따라 수행하였다.
그런 다음, 상기의 유전자도입 부위를 마우스 인공 염색체 벡터에 도입하기 위하여 필요한, 3'HPRT-loxP 서열을 포함하는 플라스미드를 다음과 같이 제작하였다. 상기 X3.1 템플릿은 다음과 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 조건은 상기 조건(25 사이클)과 동일하다.
PGK2362 : 5'-TGATTGTTCAGGAGGAGGAAGCCGGTGGCG-3'(서열 번호 124)
loxP4548 : 5'-AGAGCCTTCAACCCAGTCAGCTCCTTCGAA-3'(서열 번호 125)
상기 PCR 단편과 DEST 카셋트(Invitrogen : R1-ccdB-Cm-R2)를 블론트 라이게이션(blunt ligation)하고 pDEST했다. 그런 다음 pDEST와 상기에서 제작한 도입벡터(pENTR L1-FRT-PGK-ΦC31-R5, pENTR L5-PGK-R4-L4, pENTR R4-PGK-TP901-1-R3, pENTR L3-PGK-Bxb1 -L2)를 혼합하여 LR clonase를 이용한 시험관내 재조합 반응 (LR reaction)에 의해 복수 유전자 탑재 부위 (multi-integrase platform) 카세트를 제작하였다(도 70). LR 반응은 권장 조건에 따라 수행하였다.
[A.2] 복수 유전자 탑재 부위 (multi-integrase platform) 카세트의 마우스 인공 염색체 벡터에 탑재
복수 유전자 탑재 부위 카세트는 상기의 CHO (HPRT-; MAC2) 및 하기에 기재된 CHO (HPRT-; MAC4)에, 상기에서 설명한 바와 같이 Cre-loxP 재조합 후, HAT 내성 클론을 수득하는 것으로 마우스 인공 염색체 벡터 MAC2이나 MAC4에 삽입할 수 (MI-MAC이라고 부른다) (도 71).
[A.3] 유전자 카세트의 제작
복수 유전자 탑재 부위 (multi-integrase platform)에 외래 유전자를 도입하기 위한 카세트 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 먼저, 약제 선택을 위해 필요한 프로모터 불포함(Promoterless)의 네오마이신-저항 유전자(Neomycin-resistant gene)를 pIRES Neo2 (Clontech)를 템플릿에 다음의 프라이머를 이용하여 증폭하였다. PCR 조건은 상기의 조건(25 사이클)과 같다.
NeoF : 5'-AAAGATATCAACTCGAGATGGGATCGGCCATTGAACAAGATGGATTG-3'(서열 번호 126)
NeoR : 5'-TTTGCTAGCCCCCAGCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGCC-3'(서열 번호 127)
그런 다음, 제한 효소 EcoRV과 SmaI 사이트에서 절단한 SLR test (Toyobo)에, 상기 PCR 단편을 블론트(blunt) 클로닝하고 pNeo를 제작하였다. 하기 각각의 attP 사이트(site) 또는 FRT 사이트에 대한 재조합 서열 (ΦC31 attB, R4 attB, TP901-1 attB, Bxb1 attB, FRT)를 de novo 합성을 수행하였다(ΦC31, Bxb1, FRT : Integrated DNA technologies Inc., R4, TP901-1 : Invitrogen). pNeo 제한 효소 SalI로 절단하고, 상기의 합성 벡터로부터 제한 효소 SalI로 ΦC31 attB 또는 R4 attB를 포함하는 DNA 단편을 잘라, 라이게이션하였다 (pNeo-ΦC31 attB, pNeo-R4 attB). 마찬가지로 pNeo 제한 효소 ClaI로 절단하고, 위의 합성 벡터에서 제한 효소 ClaI로 TP901-1 attB 또는 FRT를 포함하는 DNA 단편을 잘라, 라이게이션한 pNeo-TP901-1 attB, pNeo-FRT와 pNeo을 제한 효소 NheI로 절단하고, 위의 합성 벡터로부터 제한 효소 NheI로 Bxb1 attB를 포함하는 DNA 단편을 잘라, 라이게이션한 pNeo-Bxb1 attB를 제작하였다. 이 벡터는 BamHI 사이트에 임의의 외래 유전자를 삽입할 수 있고, 그것을 복수 유전자 탑재 부위를 가진 마우스 인공 염색체에 탑재할 수 있는 카세트 벡터이다(도 72).
[A.4] 부위 특이적 재조합 효소 발현 벡터의 제작
각각 대응한 attB-attP간의 재조합을 일으키는 부위 특이적 재조합 효소 (ΦC31 integrase, R4 integrase, TP901-1 integrase, Bxb1 integrase) (GenBank accession numbers : ΦC31, CAA07153; R4, BAA07372; TP901-1, CAA59475 ; Bxb1, AAG59740)를 de novo 합성하였다 (ΦC31 : Codon device 이외: Invitrogen). 이 인터그라아제(integrase)는 포유류 세포에서 높은 발현을 할 수 코돈유시지(codon usage)를 포유류에 최적화하여 합성한 것이다. 이 합성한 벡터에서 제한 효소 KpnI-XbaI로 ΦC31 인터그라아제를 포함하는 DNA 단편을 자르고, 제한 효소 KpnI-XbaI으로 절단한 pVAX1 (Invitrogen)에 라이게이션한 pCMV-ΦC31 및, 제한 효소 NheI-XhoI로 R4 인터그라아제, 또는 TP901-1 인터그라아제, Bxb1 인터그라아제를 포함하는 DNA 단편을 자르고, 제한 효소 NheI-XhoI로 절단한 pVAX1 (Invitrogen)에 라이게이션한 pCMV-R4, pCMV-TP901-1, pCMV-Bxb1를 각각 제작하였다 (도 72).
[A.5] MI-MAC 벡터에의 유전자 도입
Cre 발현 벡터 대신 상기 각종 부위 특이적 재조합 효소 발현 벡터와, FVIII 삽입 벡터 대신 유전자 카세트를 도입하여 다중 (1 ~ 5 개)의 유전자를 마우스 인공 염색체 벡터 MI- MAC 벡터 위로 삽입할 수 있다. 또한, 복수 유전자 탑재 부위 (multi-integrase platform) 카세트를 마우스 인공 염색체 MAC 벡터에 복수 탑재하는 것도 가능하기 때문에 무제한으로 유전자를 삽입할 수 있다 (도 72).
[실시예 16] 마우스 인공 염색체 벡터 PXR-MAC의 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC3에 핵 수용체인 인간 PXR을 Cre/loxP 시스템을 이용하여 삽입하고 PXR-MAC를 구축하였다.
[A.1] 인간 PXR 삽입 벡터의 제작
인간 PXR 유전자 및 loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 BAC 벡터는 인간 PXR 유전자 길이를 포함하는 RP11-169N13 (CHORI)를 이용하였다. Yamada 등 (J Hum Genet .2008; 53 (5) :447-53)의 방법에 따라 상기 BAC 벡터의 카나마이신 내성 유전자 영역에 마우스 인공 염색체 벡터 MAC3을 삽입하기 위한 Amp-5'HPRT-loxP 서열 를 상동 재조합에 의해 삽입하였다(벡터 명: PXR-loxP).
Cre/loxP 시스템에 의한 HPRT 재구축계에 의한 인간 PXR 삽입에 의해 생기는 부위 특이적 DNA 삽입을 (도 73)과 같다.
[A.2] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
유전자 도입은 리포펙션 (lipofection) 법을 이용하여 실시하고, 90% 컨플루언트(confluent) 상태로 된 6 웰 세포에 대해 Cre 1 μg 및 PXR-loxP 벡터 2 μg을 시판 (인비트로젠(invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양하에서 2 주간 배양하면 내성 콜로니가 출현하고, 2 회 도입에서 얻은 총 11 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: CHO (PXR-MAC) ).
[A.3] 약제 내성 클론의 선별
[A.3.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 부위 특이적으로 PXR 유전자의 삽입이 일어나고 있는지 확인하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
hPXR1L : 5'-aaacagcaaggcaagcatcca-3 '(서열 번호 128)
hPXR1R : 5'-tgctttaatccagccctggtg-3 '(서열 번호 129)
hPXR2L : 5'-tgtttgctcaatcgtggtctcc-3 '(서열 번호 130)
hPXR2R : 5'-acaaaagccgaatgtggtgga-3 '(서열 번호 131)
hPXR3L : 5'-ccaagaggcccagaagcaaa-3 '(서열 번호 132)
hPXR3R : 5'-tccccacatacacggcagatt-3 '(서열 번호 133)
hPXR4L : 5'-acactgccaagagccgacaat-3 '(서열 번호 134)
hPXR4R : 5'-gcaaccttgcctctctgatggt-3 '(서열 번호 135)
hPXR5L : 5'-tcaaggtgtggaagggaccaa-3 '(서열 번호 136)
hPXR5R : 5'-acaaagcagctcggaagagga-3 '(서열 번호 137)
hPXR6L : 5'-gtttgttcctggggctggaat-3 '(서열 번호 138)
hPXR6R : 5'-caaggcaggcactttcataccc-3 '(서열 번호 139)
kj neo (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 10 분 가열 변성 후, 94℃, 30 초, 60℃, 30 초, 72℃, 30 초, 35 사이클 반복하였다. PCR 결과 11 클론 중 6 클론이 모든 프라이머 양성이며, 상기 6 클론을 이후 분석하였다.
[A.3.3] two-color FISH 분석
상기 방법의 결과에서 선택한 6 클론에서 two-color FISH 분석을 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA와 인간 PXR-BAC 유래의 DNA (RP11-169N13) (CHORI)를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 5 클론에서 60% 이상의 비율로 PXR-MAC이 보유되고, 또한 PXR-BAC 유래 신호가 나타나 네거티브 컨트롤인 PXR-BAC를 부위 특이적 삽입하기 전에 MAC3 위에는 신호가 감지되지 않으므로, 이로부터, 부위 특이적으로 인간 PXR 유전자 삽입되는 것이 확인되었다 (도 74).
이상의 실험을 통해 마우스 인공 염색체 MAC3에 인간 PXR 유전자를 탑재하여 마우스 인공 염색체 벡터 PXR-MAC을 보유하는 CHO 세포를 얻은 것을 확인할 수 있었다.
[B] 마우스 인공 염색체 벡터 PXR-MAC 함유 CHO 세포로부터 마우스 ES 세포로 마우스 인공 염색체 벡터 PXR-MAC의 도입
PXR-MAC을 보유하는 키메라 마우스를 제작하기 위하여, 상기 [A]에서 얻은 PXR-MAC을 보유하는 CHO 세포로부터 마우스 ES 세포 (야생형 TT2F)에 미소 핵 세포 융합법을 이용하여 도입하였다. Tomizuka 등 (Nature Genet.16 : 133,1997) 방법에 따라 약 108개의 PXR-MAC을 보유하는 CHO 세포 (CHO (PXR-MAC) 7,9,10 등)로부터 마이크로셀 (microcell)를 정제하고 DMEM 5 ml에 현탁하였다. 약 107개의 마우스 ES 세포 TT2F를 트립신 처리에 의해 분리하여 DMEM 3 회 세정 후 DMEM 5 ml에 현탁하고 원심분리한 후, 마이크로셀을 첨가하고 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층 액을 완전히 제거하였다. 침전을 톱핑(tapping)하여 충분히 풀고, 1:1.4 PEG 용액 [5 g PEG1000 (와코 순 약), 1 ml DMSO (시그마)를 DMEM 6ml 용해] 0.5 ml를 넣고 약 1 분 30 초 동안 충분히 교반 하였다. 그런 다음, DMEM 10 ml를 천천히 첨가한 후, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하고, 30 ml의 ES 배지에 현탁하여 미리 피더 세포(feeder cell)를 뿌린 직경 100mm 샬레 (코닝) 3 개로 분주 배양하였다. 24 시간 후, 300 μg/ml의 G418을 포함한 배지로 교환하고 약 1 주일 선택 배양하였다. 그 결과, 총 34 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다. CHO (PXR-MAC) 7로부터는 2 클론, CHO (PXR-MAC) 9로부터는 2 클론, CHO (PXR-MAC) 10으로부터는 12 클론이 PXR-MAC 영역만을 검출하는 전출 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이었다. 또한, 상기 16 클론에 대하여, 인간 PXR-BAC 유래의 DNA (RP11-169N13) (CHORI)를 사용하여 FISH 분석 (Tomizuka들, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검색된 클론은 16 클론 중 4 클론이었다. 이상으로부터, PXR-MAC 보유 TT2F 세포가 4 클론 얻은 결론을 내렸다 (도 75).
[C] 실시예 8에 기재된 바와 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 PXR-MAC을 보유하는 마우스 ES 세포로부터 키메라 마우스를 제작하고, PXR-MAC가 자손 전달된 마우스 계통 TC (PXR-MAC)을 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC (PXR-MAC) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 PXR-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, TC (PXR-MAC) 마우스 계통은 인간의 약물에 의한 CYP 유전자 발현 유도를 재현할 수 있다. 또한, 상기 TC (CYP3A-MAC) 마우스 계통과의 교배에 의해 TC (CYP3A-MAC / PXR-MAC) 계통을 제작할 수 있고, 의약품 개발에 있어서 약효·독성을 조사하기 위한 생체내(in vivo) 시험을 위한 모델 마우스로 이용할 수 있다.
[실시예 17] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4의 구축
마우스 인공 염색체 MAC에 DNA 삽입 서열로 GFP-5'HPRT-loxP-PGKhyg 타입의 loxP 서열을 삽입한 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4를 구축하였다. 5'HPRT-loxP-PGKhyg 타입 loxP 서열은 Kazuki 등의 보고 (Gene Therapy : PMID : 21085194,2010)에 기재된 21 번 염색체 유래의 GFP 탑재 HAC 벡터 (21HAC2)에 삽입하고, HAC 와 MAC의 유전자 발현을 같은 벡터에서 비교할 수 있다. 또한, 21HAC2에 삽입을 위한 유전자 도입 벡터를 벡터 제작 단계를 거치지 않고 그대로 이용 가능하다.
[A] 마우스 인공 염색체 MAC에 GFP-5'HPRT-loxP-hyg 타입 loxP 서열 삽입
[A.1] GFP-5'HPRT-loxP-hyg 타입 loxP 타겟팅 벡터 작성
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 상기에서 제작한 pMAC2를 이용했다. NotI과 SalI으로 자른 HS4-CAG-EGFP-HS4 (오사카, 오카베 박사와 NIH, Felsenfeld 박사로부터 입수)을 평활화하고, 상기 pMAC2을 XhoI 절단 및 평활화한 후 클로닝 하였다 (벡터 명: pMAC4). 타겟팅 벡터 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 도 76에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
위에서와 마찬가지로 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pMAC4을 제한 효소 NotI (TAKARA)로 선형화된 후, 상기에서 제작한 클론 DT40 (MAC)에 형질 전환하고, 히그로마이신(hygromycin) (1.5 mg/ml)을 포함한 배지로 교체하고, 96 웰 배양 플레이트 2 장에 분주하여 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 한 번의 형질 전환으로 얻은 총 36 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다 (클론 명: DT40 (MAC4)).
[A.3] 상동재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
히그로마이신 (hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 마우스 염색체 벡터 MAC에서 부위 특이적 재조합이 일어나는지 확인하였다. 그 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : 5'-AGATCTCGGCTAGAGGTACCCTAGAAGATC-3 '(서열 번호 140)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 35 사이클 반복하였다. PCR 결과, 36 클론 중 5 클론이 모든 프라이머 세트 양성이었기 때문에, 이 5 클론을 이후 분석하였다.
[A.3.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 DT40 (MAC4) 5 클론에 있어서, two-color FISH 분석을 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 마우스 cot-1 DNA 및 GFP-5'HPRT-loxP-hyg 카세트를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 네거티브 컨트롤의 타겟팅하기 전에 마우스 인공 염색체 벡터 MAC에서는 프로브 유래의 신호가 감지되지 않은 반면, DT40 (MAC4) 5 클론은 65% 이상의 비율로 프로브 유래의 신호가 감지되었으므로, 상기 5 클론에서 부위 특이적 재조합이 일어나는 것을 시각적으로 확인하였다(도 77). 이러한 결과에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4을 보유하는 DT40 세포 클론을 얻을 수 있는 결론을 내렸다.
[B] 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 닭 DT40 세포로부터 MAC4의 CHO 세포에 도입
[B.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40 (MAC4)-B1-5 및 B1-74 및 B2-3과 B2-4를 사용하여, 상기와 같이 CHO hprt 결손 세포 (인간 과학 연구 자원 뱅크에서 수득, 등록 번호 JCRB0218) 인 CHO (HPRT-)에 미소 핵 세포 융합법을 실시하였다. 4 회 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 23 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC4)).
[B.2] 약제 내성 클론의 선별
[B.2.1] PCR 분석
히그로마이신 (hygromycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4이 CHO 세포에 도입되어 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 23 클론 중 7 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 7 클론을 사용하여 이후 분석을 수행하였다.
[B.2.2] mono-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC4) 7 클론에 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 7 클론 중 4 클론이 95% 이상의 비율로 CHO 세포에 MAC4가 도입되는 것을 확인하였다 (도 78).
이상의 결과에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4이 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[C] 실시예 8에 기재된 것과 같이, 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4를 보유하는 마우스 ES 세포를 제작하고, ES 세포를 사용하여 실험관내(in vitro) 안정성을 검증할 수있다. 또한, 상기 ES 세포로부터 키메라 마우스를 제작하고, MAC4가 자손 전달된 마우스 계통 TC (MAC4)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC (MAC4) 마우스 계통을 이용하여 체세포에 있어서, MAC4의 안정성을 검증할 수 있다.
[실시예 18] 마우스 인공 염색체 벡터 UGT2-MAC의 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 인간 약물 대사 효소 유전자 군인 UGT2 클러스터를 Cre/loxP 시스템을 이용하여 전좌 클로닝하고, 실시예 3과 동일한 방법으로 UGT2-MAC를 구축하였다. 또한, UGT2-MAC의 마우스 ES 세포에서의 안정성을 검증하였다.
[A] 인간 4 번 염색체상의 AC125239의 부위 특이적 절단
인간 4 번 염색체의 UGT2 유전자 클러스터에서 원위쪽 유전자를 제거하기 위하여, 부위 특이적 염색체 제거하려고 텔로미어 (Telomere)을 절단하였다.
[A.1] 타겟팅 벡터 pTELpuro-UGT2의 제작
인간 4 염색체의 UGT2 유전자 자리의 매우 가까운 텔로미어 (Telomere) 측 (약 150 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AC125239 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하기 위한, 타겟팅 벡터 pTELpuro-UGT2은 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AC125239 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
UGT2tel4L; 5'-ttctggcaagccttgaagggacaatact-3 '(서열 번호 141)
UGT2tel4R; 5'-gcctattttgcctcataacccactgctc-3 '(서열 번호 142)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp9600를, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 8 분, 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제 (proteinase) K (GIBCO) 처리 후 CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)에서 젤 여과하였다. 그 후 제한 효소 PstI (닛뽄진) 및 BglII (닛뽄진)로 절단하고, CHROMASPIN-TE 1000 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 상기 PCR 단편을 플라스미드 pTELpuro (Kuroiwa들, Nature Biotech., 20:88,2002)의 PstI 및 BamHI 부위에 클로닝 하였다. AC125239 게놈 시퀀스의 방향은 중심체 (cetromere) → 텔로미어 (Telomere)이므로, 클로닝된 AC125239 게놈 단편이 사람 텔로미어 (Telomere) 서열과 같은 방향의 목표 타겟팅 벡터 pTELpuro-UGT2했다. 최종 장완 근위 부위 특이적 절단용 컨스트럭트(construct)의 크기는 11.9 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 도 79에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
Kazuki et al. BBRC 2004에 기재된 방법으로, 인간 4 번 염색체를 보유하는 A9 (KM64-4) (Kugoh et al. DNA research 1999)에서 사람 4 번 염색체를 보유하는 닭 DT40 세포를 제작하였다 (클론 명: DT40 (hChr4)). 그런, 다음 상기와 동일하게 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pTELpuro-UGT2을 제한 효소 PstI (닛뽄진)로 선형화한 후, 상기에서 제작한 클론 DT40 (hChr4) 1로 형질 전환하고, 퓨로마이신 (Puromycin) (0.3 ug/ml)을 포함하는 배지로 교체하고 96 웰 배양 접시 10 장에 분주하여 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 4 번의 형질 전환으로 얻은 총 96 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (hChr4-tel)).
[A.3] 상동 재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
퓨로마이신 (Puromycin) 내성주는 게놈 DNA를 주형으로서 재조합체를 선별하기 위하여 일차 스크리닝으로 절단 부위부터 텔로미어 (Telomere)쪽에 위치를 이하의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 부위 특이적 절단이 일어나고 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
CSN1S1-1L; 5'-tttctcctctcaaggaaaacca-3 '(서열 번호 143)
CSN1S1-1R; 5'-gccctccatatggcaagaca-3 '(서열 번호 144)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 95℃, 10 분 가열 변성 후, 95℃, 20 초, 55℃, 30 초, 72℃ 30 초, 30 사이클 반복하였다. 그럼 다음, 상기 프라이머로 검출되지 않은 두 클론에 대하여 하기의 프라이머를 이용하여 부위 특이적 상동 재조합이 일어나고 있는지 PCR로 확인하였다. 서열은 다음과 같다.
UGT2tel4L; (상기 기재)
SK23 : 5'-ggccgctctagaactagtggatc -3 '(서열 번호 145)
UGT2A1-1L : 5'-tcttctgcatcaagccacatca-3 '(서열 번호 146)
UGT2A1-1R : 5'-agccaatgactaccttccattg-3 '(서열 번호 147)
UGT2A1-2L : 5'-atcagggagccaccgtagga-3 '(서열 번호 148)
UGT2A1-2R : 5'-gcaggcaagttatgccgtga-3 '(서열 번호 149)
UGT2A3-1L : 5'-tgcgcccaaacacatggata-3 '(서열 번호 150)
UGT2A3-1R : 5'-tggcagaaatgtaggccatga-3 '(서열 번호 151)
UGT2B4-1L : 5'-aggctggaagctgggaaacc-3 '(서열 번호 152)
UGT2B4-1R : 5'-cctgcatgaaatggatccaaag-3 '(서열 번호 153)
UGT2B7-1L : 5'-ccagcaagaaagattgtgatgc-3 '(서열 번호 154)
UGT2B7-1R : 5'-ttctaaccatgaactgggtggt-3 '(서열 번호 155)
UGT2B11-1L : 5'-gggtttctgctggcctgtgt-3 '(서열 번호 156)
UGT2B11-1R : 5'-tctggttttccagcttcaaatg-3 '(서열 번호 157)
UGT2B15-1L : 5'-ggtctccttggcatgcacct-3 '(서열 번호 158)
UGT2B15-1R : 5'-tgcaatgcttcttttccagttg-3 '(서열 번호 159)
UGT2B15-2L : 5'-cagcatggagggttttaaatgg-3 '(서열 번호 160)
UGT2B15-2R : 5'-atgttggcgtgctgcatcc-3 '(서열 번호 161)
UGT2B28-1L : 5'-catttgaagctggaaaaccaga-3 '(서열 번호 162)
UGT2B28-1R : 5'-cctgggtggtaaatctctgaaa-3 '(서열 번호 163)
상기 프라이머는 PCR은 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 8 분, 35 사이클 반복하였다. 부위 특이적 재조합이 일어난 2 클론에서만 약 8 kb의 밴드가 검출되었다. 네거티브 컨트롤의 DT40, DT40 (hChr4) 1은 밴드가 발견되지 않았다.
[A.3.2] two-color FISH 분석
FISH 분석은 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 클론 중 2 클론을 사람 cot-1 DNA 및 퓨로마이신 (Puromycin) DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 4 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌 하지 않고, 인간 4 번 염색체 단편 말단에 퓨로마이신 (Puromycin) 유래의 신호가 감지하여 원하는 부위에서 절단되어 있던 것으로부터 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인하였다 (도 80) .
이상의 결과에서, 클론 DT40 (hChr4-tel) 35과 73에 있어서, UGT2 유전자 클러스터 영역보다 텔로미어 (Telomere) 측의 AC125239로부터 원위에 있어서 전달할 수 있었다고 결론지었다.
[B] 인간 4 염색체의 AC074378에 loxP 서열의 부위 특이적 삽입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 loxP 서열을 통해 전좌 삽입하기 위하여, DT40 세포 내에서 hChr4-tel의 UGT2 유전자 클러스터 근위의 AC074378에 loxP 서열을 삽입하였다.
[B.1] 타겟팅 벡터 pUGT2loxPneo의 제작
인간 4 번 염색체 UGT2 유전자 자리의 매우 가깝고, 중심체 (cetromere) 측 (약 300 Kb 중심체 (cetromere) 쪽)에 위치하고 AC074378 영역에 Cre 재조합 효소의 인식 서열 loxP를 삽입하는 타겟팅 벡터 pUGT2loxPneo를 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AC074378 게놈 영역을 다음의 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭했다.
UGT2loxP3L : 5'-ggaacaatcccaatcaaaacctcagtgc-3 '(서열 번호 164)
UGT2loxP4R : 5'-cgaggattcaagccacatccctaactct-3 '(서열 번호 165)
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V907 (Lexicon genetics)을 이용하였다. PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 7 분, 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로 테이나제 (proteinase) K (GIBCO) 처리 후 CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)에서 젤 여과하였다. 그 후, 제한 효소 KpnI (닛뽄진) 및 EcoRI (닛뽄진) 및 BglII (닛뽄진)으로 절단하여 CHROMASPIN-TE1000 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 상기 PCR 단편 (2.7 kb 및 2.6 kb)를 V907 플라스미드의 KpnI 또는 EcoRI과 BglII 사이트에 클로닝 하였다 (벡터 명: V907-UGT2HR2). 그런 다음, loxP-FRT-pGKneo-FRT-loxP 카세트인 pNT1.1 (오사카 대학 유전 정보 실험 센터에서 입수)로부터 FRT-pGKneo-FRT를 EcoRI과 BamHI로 자르고, 상기의 X3.1의 BglII 사이트에 클로닝 하였다 (벡터 명: X3.1-FRT-pGKneo-FRT). 그런 다음, V907-UGT2HR2을 제한 효소 EcoRI으로 절단하고 상기 X3.1-FRT-pGKneo-FRT로부터, 제한 효소 EcoRI로 loxP를 포함하는 DNA 단편을 자르고, 라이게이션하였다. loxP 서열 방향이 클로닝한 AC074378 게놈 단편과 같은 방향 타겟팅 벡터 pUGT2loxPneo했다. 최종 loxP 삽입 컨스트럭트(construct)의 크기는 11.1kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 도 81에 나타내었다.
[B.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
상기 방법과 동일하게, 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pUGT2loxPneo을 제한 효소 NotI (TAKARA)로 선형화한 후, 인간 4 번 염색체를 보유하는 닭 DT40 세포 (클론 DT40 (hChr4-tel) 35로 형질 전환하고, 네오마이신(neomycin) (1.5 mg/ml)이 포함된 배지로 교체하고, 96 웰 배양 플레이트 3 장에 분주하여, 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 2 회 형질 전환에서 얻은 총 12 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (hChr4-tel-loxP)).
[B.3] 상동 재조합 체의 선별
[B.3.1] PCR 분석
네오마이신(neomycin) 내성 클론에서 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System 사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출한 후, 다음 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다.
이하의 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다. UGT2loxP3L (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
UGT2loxP4R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 4 분, 35 사이클 반복하였다. 12 클론을 스크리닝한 결과, 5 클론이 상동 재조합체로 동정되었다.
[B.3.2] two-color FISH 분석
FISH 분석 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 클론 중 4 클론을 사람 cot-1 DNA 및 네오 마이신 (neomycin) DNA를 프로브한 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 4 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌 하지 않고, 4q13 근처에 네오 마이신 (neomycin) 유래의 신호가 감지된 것으로부터 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다 (도 82). 이상의 결과로부터 인간 4 번 염색체상의 AC074378에 유전자 도입부위인 loxP 서열이 부위 특이적으로 삽입됐다고 결론 지었다.
[C] hChr4-loxP-tel 함유 DT40로부터 hChr4-loxP-tel의 MAC4 함유 CHO 세포에 도입.
CHO 세포 내에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 loxP 서열을 통해서, 인간 UGT2 유전자 클러스터 영역을 전좌 삽입하기 위하여, hChr4-loxP-tel을 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 CHO 세포에 도입하였다.
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40 (hChr4-loxP-tel) 5 및 10을 사용하여 상기와 동일하게 MAC4 함유 CHO hprt 결손 세포 (인간 과학 연구 자원 뱅크에서 수득, 등록 번호 JCRB0218)인, CHO (HPRT- ; MAC4)에 미소 핵 세포 융합법을 실시하였다. 3회의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 22 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC4, hChr4-loxP-tel)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
네오마이신 (neomycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 사람 4 번 염색체 단편이 MAC4 함유 CHO 세포에 도입되고 있는지를 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
UGT2tel4L; (상기 기재)
SK23 (상기 기재)
UGT2A1-1L (상기 기재)
UGT2A1-1R (상기 기재)
UGT2A1-2L (상기 기재)
UGT2A1-2R (상기 기재)
UGT2A3-1L (상기 기재)
UGT2A3-1R (상기 기재)
UGT2B4-1L (상기 기재)
UGT2B4-1R (상기 기재)
UGT2B7-1L (상기 기재)
UGT2B7-1R (상기 기재)
UGT2B11-1L (상기 기재)
UGT2B11-1R (상기 기재)
UGT2B15-1L (상기 기재)
UGT2B15-1R (상기 기재)
UGT2B15-2L (상기 기재)
UGT2B15-2R (상기 기재)
UGT2B28-1L (상기 기재)
UGT2B28-1R (상기 기재)
UGT2loxP3L (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
UGT2loxP4R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 22 클론 중 5 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 5 클론을 이후 분석하였다.
[C.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC4, hChr4-loxP-tel) 5 클론을 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA 와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 1 클론에서 90% 이상의 MAC1 및 hChr4-loxP-tel가 CHO 세포에 1 카피 또는 2 카피 도입되는 것을 확인하였다(도 83).
이상의 결과에서, hChr4-loxP-tel이 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[D] CHO (HPRT-; MAC4, hChr4-loxP-tel) 클론에 있어서, 인간 UGT2 유전자 클러스터 영역 주변 (AC074378-인간 UGT2 유전자 클러스터 - AC125239) 2 Mb의 MAC4 벡터에 부위 특이 전좌 2 Mb 크기의 DNA인 인간 UGT2 유전자 클러스터를 마우스 개체에서 안정적으로 보유하기 위해 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 전좌 삽입하였다 (도 84).
[D.1] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
상기 방법으로 수득한 CHO (HPRT-; MAC4, hChr4-loxP-tel) 8을 리포펙션 (lipofection) 법을 이용하여 유전자 도입하고, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태로 된 6 웰 세포 대하여 Cre 3 μg를 시판 (인비트로젠 (invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양하에서 2 주 동안 배양하면 내성 콜로니가 출현하고, 2 회 도입에서 얻은 총 6 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: CHO (UGT2-MAC, hChr4-△UGT2)).
[D.2] 약제 내성 클론의 선별
[D.2.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 상호 전좌 클론을 선별하기 위하여, 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 사람 4 번 염색체 단편과 MAC4에서 염색체 상호 전좌가 발생하는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
UGT2tel4L; (상기 기재)
SK23 (상기 기재)
UGT2A1-1L (상기 기재)
UGT2A1-1R (상기 기재)
UGT2A1-2L (상기 기재)
UGT2A1-2R (상기 기재)
UGT2A3-1L (상기 기재)
UGT2A3-1R (상기 기재)
UGT2B4-1L (상기 기재)
UGT2B4-1R (상기 기재)
UGT2B7-1L (상기 기재)
UGT2B7-1R (상기 기재)
UGT2B11-1L (상기 기재)
UGT2B11-1R (상기 기재)
UGT2B15-1L (상기 기재)
UGT2B15-1R (상기 기재)
UGT2B15-2L (상기 기재)
UGT2B15-2R (상기 기재)
UGT2B28-1L (상기 기재)
UGT2B28-1R (상기 기재)
UGT2loxP3L (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
UGT2loxP4R (상기 기재)
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 6 클론 중 모든 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 6 클론을 이후 분석하였다.
[D.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로 수득한 CHO (UGT2-MAC, hChr4-△UGT2) 6 클론에 대하여, Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 UGT2-BAC (RP11-643N16) (CHORI) DNA 및 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 2 클론이 50% 이상의 비율로 MAC4에 인간 UGT2 유래에 의한 신호가 관찰되는 것을 확인했다(도 85).
이상의 결과로부터, 인간 4 번 염색체 단편의 UGT2 클러스터 2 Mb가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 상호 전좌에 의한 클로닝될 수 있었다고 결론 지었다.
[E] CHO 세포로부터 UGT2-MAC의 마우스 A9 세포에 이입
UGT2-MAC을 보유하는 마우스 ES을 제작하기 위하여, 상기 [D]에서 수득한 UGT2-MAC을 보유하는 CHO 세포 (CHO (UGT2-MAC, hChr4-△UGT2) 4,5)로부터 마우스 A9 세포에 마이크로셀 (microcell) 형성능이 높은 마우스 A9 세포에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. 4 번의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 16 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다(클론 명: A9 (UGT2-MAC)). 그 결과 UGT2-MAC 영역만을 검출하는 상기 프라이머를 이용한 PCR에서 양성인 클론이 5 클론 있었다. 또한, UGT2-BAC (RP11-643N16) (CHORI) 및 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 사용하여 FISH 분석 (Tomizuka들, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되는 UGT2-MAC의 존재가 5 클론 중 모든 클론으로 확인되었다 (도 86). 이상으로부터, UGT2-MAC를 보유하는 A9 세포를 5 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[F] A9 세포에서 UGT2-MAC 마우스 ES 세포에 이입
UGT2-MAC을 보유하는 키메라 마우스를 제작하기 위하여, 상기 [E]에서 얻은 UGT2-MAC를 보유하는 A9 세포로부터 마우스 ES 세포 (야생형 TT2F)에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. Tomizuka 등 (Nature Genet.16 : 133,1997) 방법에 따라 약 108개의 UGT2-MAC을 보유하는 A9 세포(A9 (UGT2-MAC) 13,15 등)로부터 마이크로셀 (microcell)을 정제하고 DMEM 5 ml에 현탁하였다. 약 107개의 마우스 ES 세포 TT2F를 트립신 처리에 의해 분리하여 DMEM 3 회 세정 후 DMEM 5 ml에 현탁하고 원심분리한 후, 마이크로셀을 첨가하여 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 상층 액을 완전히 제거하였다. 침전을 톱핑(tapping)하여 충분히 풀어, 1:1.4 PEG 용액 [5g PEG1000 (와코 순 약) 1ml DMSO (시그마)를 DMEM 6ml 용해] 0.5 ml를 넣고 약 1 분 30 초 동안 충분히 교반 하였다. 그 후, DMEM 10 ml를 천천히 첨가하고, 1250 rpm에서 10 분간 원심 분리하여 30 ml의 ES 배지에 현탁하여 미리 피더 세포(feeder cell)를 뿌린 직경 100mm 샬레 (코닝) 3 개로 분주 배양하였다. 24 시간 후, 300 μg/ml의 G418을 포함한 배지로 교환하고, 약 1 주 동안 선택 배양하였다. 그 결과, 총 25 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다. A9 (UGT2-MAC) 13으로부터 5 클론, A9 (UGT2-MAC) 15로부터 4 클론이 UGT2-MAC 영역만을 검출하는 상기 프라이머를 이용한 PCR에서 양성이었다. 또한, 상기 중 9 클론에 대해 UGT2-BAC (RP11-643N16) (CHORI) 및 마우스 minor satellite DNA를 이용하여 FISH 분석 (Tomizuka들, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되어 있고, 마우스 핵형이 정상적인 클론은 7 클론이었다(도 87). 이상으로부터, UGT2-MAC 보유 TT2F 세포가 7 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[G] UGT2-MAC의 마우스 ES 세포에 있어서 안정성
상기 방법으로 수득한 마우스 ES 클론 (예 TT2F (UGT2-MAC) 9, 10, 19 상기 [F]에서 수득)에 대해 0 ~ 50 PDL 비선택 배양에서 장기 배양 후의 FISH 분석에 의한 UGT2-MAC 보유 세포의 비율을 측정한 결과, 50 PDL에서도 95% 이상의 보유 비율이었다(도 88).
[H] 실시예 8에 기재된 바와 같이 마우스 인공 염색체 벡터 UGT2-MAC을 보유하는 마우스 ES 세포로부터 키메라 마우스를 제작하고, UGT2-MAC이 자손 전달된 마우스 계통 TC (UGT2-MAC)을 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC (UGT2-MAC) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 UGT2-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, TC (UGT2-MAC) 마우스 계통은 인간의 약물 대사를 재현할 수 있기 때문에 의약품 개발의 제 2 상 반응의 약효·독성을 조사하기 위한 생체내(in vivo) 시험을 위한 모델 마우스로 유용하게 이용될 수 있다.
[실시예 19] 마우스 인공 염색체 벡터 CYP2C-MAC 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 인간 약물 대사 효소 유전자 군인 CYP2C 클러스터를 Cre/loxP 시스템을 이용하여 전좌 클로닝하고, 실시예 3과 동일하게 하여 CYP2C-MAC를 구축하였다.
[A] 인간 10 번 염색체 AL157834에 있어서의 부위 특이적 절단
인간 10 번 염색체의 CYP2C 유전자 클러스터에서 원위쪽 유전자를 제거하기 위해 부위 특이적 염색체 제거인 텔로미어 (Telomere)를 절단한다.
[A.1] 타겟팅 벡터 pTELpuro-CYP2C 제작
인간 10 염색체 CYP2C 유전자 자리의 매우 가까운 텔로미어 (Telomere) 측 (약 150 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AL157834 영역에 인간 텔로미어 (Telomere) 서열을 삽입하는 타겟팅 벡터 pTELpuro-CYP2C는 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AL157834 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
2Ctel2L; 5'-GCTATGAGACACAGGGCAGCTGAAAGTC-3 '(서열 번호 166)
2Ctel2R; 5'-TTGTGAACCACCATGCCTAGCTGAAAGT-3 '(서열 번호 167)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp9600를, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 8 분, 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제 (proteinase) K (GIBCO) 처리 후 CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)에서 젤 여과하였다. 그 후 제한 효소 BamHI (닛뽄진) 및 BglII (닛뽄진)로 절단하고, CHROMASPIN-TE 1000 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 상기 PCR 단편을 플라스미드 pTELpuro (Kuroiwa들, Nature Biotech., 20:88,2002)의 BamHI 부위에 클로닝 하였다. AL157834 게놈 시퀀스의 방향은 중심체 (cetromere) → 텔로미어 (Telomere)이므로, 클로닝된 AL157834 게놈 단편이 사람 텔로미어 (Telomere) 서열과 같은 방향으로 목표 타겟팅 벡터 pTELpuro-CYP2C했다. 최종 장완 근위 부위 특이적 절단용 컨스트럭트(construct)의 크기는 11.6 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 도 89에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
Kazuki et al. BBRC 2004 기재된 방법으로, 인간 10 번 염색체를 보유하는 A9 (KM32-2) 및 A9 (KM26-3) (Kugoh et al. DNA research 1999)에서 인간 10 번 염색체를 보유하는 닭 DT40 세포를 제작하였다 (클론 명: DT40 (hChr10)). 그런 다음, 상기에서와 마찬가지로 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pTELpuro-CYP2C를 제한 효소 PstI (닛뽄진)로 선형화된 후에, 상기에서 제작한 클론 DT40 (hChr10) 1, 42에 형질 전환하고, 퓨로마이신 (Puromycin)(0.3 ug/ml)를 포함한 배지로 교체하고 96 웰 배양 접시 10 장에 분주하여 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 4 번의 형질 전환으로 얻은 총 96 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다 (클론 명: DT40 (hChr10-tel)).
[A.3] 상동 재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
퓨로마이신(Puromycin) 내성주는 게놈 DNA를 주형으로서 재조합체를 선별하기 위하여 일차 스크리닝으로서 절단 부위로부터 텔로미어 (Telomere)쪽에 위치를 다음 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 부위 특이적 절단이 일어난 있는지 확인했다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
h10yi_1F; 5'-ACGGGGCTCCTACTCTTGTC-3 '(서열 번호 168)
h10yi_1R; 5'-GCTTCCACCTGCATCTCAC-3 '(서열 번호 169)
h10yi_2F; 5'-CAATGCCTTATGCATGTTGTG-3 '(서열 번호 170)
h10yi_2R; 5'-TCCACAGCATACTGCTGACC-3 '(서열 번호 171)
h10yi_3F; 5'-AAGGAAGGTGACCGCCTACT-3 '(서열 번호 172)
h10yi_3R; 5'-CATCCGAGGACATCTTTGGT-3 '(서열 번호 173)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 95℃, 10 분 가열 변성 후, 95℃, 20 초, 55℃, 30 초, 72℃ 30 초, 30 사이클 반복하였다. 그럼 다음, 상기 프라이머로 검출되지 않은 3 클론에 대하여, 다음의 프라이머를 이용하여 부위 특이적 상동 재조합이 일어나고 있는지 PCR에서 확인하였다. 서열은 하기와 같다.
2Ctel4L; 5'-ATCTGCAGGGAAGGGATCCAGTTTCAGCTTCCTAC -3 '(서열 번호 174)
SK23 (상기 기재)
CYP2C8-1F : 5'-ACATGTCAAAGAGACACACA-3 '(서열 번호 175)
CYP2C8-1R : 5'-TAGCATATTTCCAATAATAGGA-3 '(서열 번호 176)
CYP2C9-1F : 5'-AGAAGGCTTCAATGGATTCTC-3 '(서열 번호 177)
CYP2C9-1R : 5'-TGTCCTTAATACCTATCTGTAGG-3 '(서열 번호 178)
CYP2C18-1F : 5'-ACAGCTGGATCCATTGAAGG-3 '(서열 번호 179)
CYP2C19-1F : 5'-ACACACACTTAATTAGCATGGA-3 '(서열 번호 180)
CYP2C19-1R : 5'-TTGGTTAAGGATTTGCTGACA-3 '(서열 번호 181)
상기 프라이머를 사용한 PCR은 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 8 분, 35 사이클 반복하였다. 부위 특이적 재조합이 일어난 2 클론에서만 약 8 kb의 밴드가 검출되었다. 네거티브 컨트롤의 DT40, DT40 (hChr10) 1, 42에서는 밴드가 발견되지 않았다.
[B.3.2] two-color FISH 분석
FISH 분석은 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 3 클론을 사람 cot-1 DNA 및 퓨로마이신 (Puromycin) DNA를 프로브하고 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 10 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 인간 10 번 염색체 단편 말단에 퓨로마이신 유래의 신호가 감지되어 원하는 부위에서 절단되어 있던 것으로부터 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다 (도 90).
이상의 결과에서 클론 DT40 (hChr10-tel) 5과 98과 101에서 CYP2C 유전자 클러스터 영역으로부터 텔로미어 (Telomere) 측의 AL157834로부터 원위에서 절단할 수 있다고 결론 지었다.
[B] 인간 10 번 염색체의 AL138759에 loxP 서열의 부위 특이적 삽입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 loxP 서열을 통하여 전좌 삽입하기 위해 DT40 세포 내에서 hChr10-tel의 CYP2C 유전자 클러스터 근위의 AL138759에 loxP 서열을 삽입하였다.
[B.1] 타겟팅 벡터 pCYP2CloxPneo 제작
인간 10 번 염색체 CYP2C 유전자 자리의 매우 가깝고 중심체 (cetromere) 측 (약 300 Kb 중심체 쪽)에 위치하는 AL138759 영역에 Cre 재조합 효소의 인식 서열 loxP를 삽입하는 타겟팅 벡터 pCYP2CloxPneo을 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AL138759 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
hloxP-SacII-EcoRI-F : 5'-TCCCCGCGGATCTGCTCCATACTCTGTACC-3 '(서열 번호 182)
hloxP-1R : 5'-CATTCAAGGGGTTCTGGGTCTGTAAACT-3 '(서열 번호 183)
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V907 (Lexicon genetics)을 이용하였다. PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 7 분 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제 (proteinase) K (GIBCO) 처리 후 CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 그 후 제한 효소 SacII (닛뽄진) 및 EcoRI (닛뽄진) 및 BamHI (닛뽄진)로 절단하여 CHROMASPIN-TE1000 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 상기 PCR 단편 (1.5kb 및 3.0kb)를 V907 플라스미드의 SacII와 EcoRI 또는 EcoRI과 BamHI 사이트에 클로닝 하였다 (벡터 명: V907-CYP2CHR2). 그런 다음, V907-CYP2CHR2를 제한 효소 EcoRI으로 절단하고, 상기 X3.1-FRT-pGKneo-FRT로부터, 제한 효소 EcoRI로 loxP를 포함하는 DNA 단편을 잘라, 라이게이션하였다. loxP 서열 방향이 클로닝한 AL138759 게놈 단편과 같은 방향으로 타겟팅 벡터 pCYP2CloxPneo했다. 최종 loxP 삽입 컨스트럭트(construct)의 크기는 10.3 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 도 91에 나타내었다.
[B.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
상기와 동일한 방법으로 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pCYP2CloxPneo을 제한 효소 NotI (TAKARA)로 선형화한 후, 인간 10 번 염색체를 보유하는 닭 DT40 세포 (클론 DT40 (hChr10-tel) 1-98에 형질전환 한 후, 네오마이신(neomycin)(1.5 mg/ml)이 포함된 배지로 교체하고 96 웰 배양 플레이트 3 장에 분주하여 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 2 회 형질 전환에서 얻은 총 15 개의 저항 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (hChr10-tel-loxP)).
[B.3] 상동 재조합체의 선별
[B.3.1] PCR 분석
네오마이신(neomycin) 내성 클론으로부터 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System 사)를 사용하여 게놈 DNA를 추출하여 다음 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 분류하였다.
하기, 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 분류하였다.
hloxP-SacII-EcoRI-F (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
hloxP-1R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 4 분, 35 사이클로 반복하였다. 15 클론을 스크리닝한 결과, 1 클론이 상동 재조합체로 동정되었다.
[B.3.2] two-color FISH 분석
FISH 분석은 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 클론 중 1 클론을 사람 cot-1 DNA 및 네오 마이신(neomycin)를 프로브로하고 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 10 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 10q24 부근에 네오 마이신 유래의 신호가 감지되었으므로, 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터 인간 10 번 염색체상의 AL138759에 유전자 도입부위인 loxP 서열이 부위 특이적으로 삽입됐다고 결론 지었다.
[C] hChr10-loxP-tel 함유 DT40로부터 hChr10-loxP-tel의 MAC4 함유 CHO 세포에 도입.
CHO 세포 내에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 loxP 서열을 통해 인간 CYP2C 유전자 클러스터 영역을 전좌 삽입하기 위해, hChr10-loxP-tel을 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 CHO 세포에 도입하였다.
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40 (hChr10-loxP-tel) 7을 사용하여, 위와 같이 MAC4 함유 CHO hprt 결손 세포 (인간 과학 연구 자원 뱅크에서 입수, 등록 번호 JCRB0218), CHO (HPRT-; MAC4)에 미소 핵 세포 융합법을 실시하였다. 3의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 8 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC4, hChr10-loxP-tel)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
네오마이신(neomycin) 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 인간 10 번 염색체 단편이 MAC4 함유 CHO 세포에 도입되고 있는지를 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
2Ctel4L (상기 기재)
SK23 (상기 기재)
CYP2C8-1F (상기 기재)
CYP2C8-1R (상기 기재)
CYP2C9-1F (상기 기재)
CYP2C9-1R (상기 기재)
CYP2C18-1F (상기 기재)
CYP2C19-1F (상기 기재)
CYP2C19-1R (상기 기재)
hloxP-SacII-EcoRI-F (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
hloxP-1R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 8 클론 중 모든 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 8 클론을 이후 분석하였다.
[C.2.2] two-color FISH 분석
상기에서 수득한 CHO (HPRT-; MAC4, hChr10-loxP-tel) 8 클론에 대하여, Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA 와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 2 클론에서 90% 이상의 비율로 MAC1 및 hChr10-loxP-tel가 CHO 세포에 1 카피 또는 2 카피 도입된 것을 확인하였다 (도 92).
이상의 결과에서 hChr10-loxP-tel이 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[D] CHO (HPRT-; MAC4, hChr10-loxP-tel) 클론에 있어서의 인간 CYP2C 유전자 클러스터 영역 주변 (AL138759-인간 CYP2C 유전자 클러스터 - AL157834) 380 kb의 MAC4 벡터에 부위 특이적 전좌
380 kb 크기의 DNA인 인간 CYP2C 유전자 클러스터를 마우스 개체에서 안정적으로 보유하기 위해 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 전좌 삽입하였다 (그림 93).
[D.1] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
상기에서 수득한 CHO (HPRT-; MAC4, hChr10-loxP-tel) 1과 5를 리포펙션 (lipofection) 법을 이용하여 유전자 도입하고, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태로 된 6 웰 세포에 대해 Cre 3μg를 시판 (인비트로젠(invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양하에서 2 주 동안 배양하면 내성 콜로니가 출현하고, 2 회 도입에서 얻은 총 11 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다 (클론 이름 : CHO (CYP2C-MAC, hChr10-△CYP2C)).
[D.2] 약제 내성 클론의 선별
[D.2.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 상호 전좌 클론을 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하여 인간 10 번 염색체 단편과 MAC4에서 염색체 상호 전좌가 발생하는지 확인하였다. 상기 프라이머의 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
2Ctel4L (상기 기재)
SK23 (상기 기재)
CYP2C8-1F (상기 기재)
CYP2C8-1R (상기 기재)
CYP2C9-1F (상기 기재)
CYP2C9-1R (상기 기재)
CYP2C18-1F (상기 기재)
CYP2C19-1F (상기 기재)
CYP2C19-1R (상기 기재)
hloxP-SacII-EcoRI-F (상기 기재)
PGKr1 (상기 기재)
hloxP-1R (상기 기재)
TRANS L1 (전출)
TRANS R1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 11 클론 중 9 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 9 클론을 이후 분석하였다.
[D.2.2] two-color FISH 분석
위에서 얻은 CHO (CYP2C-MAC, hChr10-ΔCYP2C) 9 클론에 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 CYP2C-BAC (RP11-466J14) (CHORI) DNA 및 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 9 클론 중 3 클론 50% 이상의 비율로 MAC4에 인간 CYP2C 유래에 의한 신호가 관찰되는 것을 확인했다 (그림 94).
이상의 결과로부터 인간 10 번 염색체 단편의 CYP2C 클러스터 380kb가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 상호 전좌에 의한 클로닝 수 있었다고 결론 지었다.
[E] CHO 세포에서 CYP2C-MAC 마우스 A9 세포에 이입
CYP2C-MAC를 보유하는 마우스 ES세포를 제작하기 위하여, 상기 [D]에서 수득한 CYP2C-MAC을 보유하는 CHO 세포 (CHO (CYP2C-MAC, hChr10-△CYP2C) 2,8,10)로부터 마우스 A9 세포에 마이크로셀 (microcell) 형성능이 높은 마우스 A9 세포에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. 4 번의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 4 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다 (클론 명: A9 (CYP2C-MAC)). 그 결과 CYP2C-MAC 영역만을 검출하는 상기 프라이머를 이용한 PCR에서 양성인 클론은 4 클론 있었다. 또한, CYP2C-BAC (RP11-466J14) (CHORI) 및 마우스 minor satellite DNA를 프로브로 사용하여 FISH 분석 (Tomizuka 등, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되는 CYP2C-MAC의 존재가 4 클론 중 2 클론으로 확인되었다. 이상으로부터, CYP2C-MAC을 보유하는 A9 세포가 2 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[F] 실시예 8에 기재된 바와 같이 마우스 인공 염색체 벡터 CYP2C-MAC를 보유하는 마우스 ES 세포를 조작하고 ES 세포를 사용하여 실험관내(in vitro) 안정성을 검증할 수 있다. 또한, 상기 ES 세포에서 키메라 마우스를 제작하고, CYP2C-MAC이 자손 전달된 마우스 계통 TC (CYP2C-MAC)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC (CYP2C-MAC) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 CYP2C-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, TC (CYP2C-MAC) 마우스 계통 유래 간 마이크로좀 (microsome)은 의약품 개발에 있어서 제1상 반응의 약효·독성을 조사하기 위한 시료로 이용할 수 있다. 또한, TC (CYP2C-MAC) 마우스 계통은 인간의 약물 대사를 재현할 수 있기 때문에 의약품 개발에 있어서 제1상 반응의 약효·독성을 조사하기 위한 생체내(in vivo) 시험을 위한 모델 마우스로 유용하게 이용될 수 있다.
[실시예 20] 마우스 인공 염색체 벡터 MDR1-MAC의 구축
마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 인간 약물 대사 효소 유전자 군인 MDR1 유전자를 Cre/loxP 시스템을 이용하여 전좌 클로닝하고, 실시예 3과 동일하게 하여 MDR1-MAC를 구축하였다.
[A] 인간 7 번 염색체의 AC005045에 loxP 서열의 부위 특이적 삽입
마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 loxP 서열을 통해서, 전좌 삽입하기 위해 DT40 세포 내에서 인간 7 번 염색체 (hChr7)의 MDR1 유전자의 근위의 AC005045에 loxP 서열을 삽입하였다.
[A.1] 타겟팅 벡터 pMDR1loxPbs의 제작
인간 7 번 염색체상의 MDR1 유전자 자리의 매우 가깝고, 중심체 (cetromere) 측 (약 50 Kb 중심체 쪽)에 위치하는 AC005045 영역에 Cre 재조합 효소의 인식 서열 loxP를 삽입하는 타겟팅 벡터 pMDR1loxPbs을 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AC005045 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
MDR1loxP2L : 5'-gccaagtgtagctggagaatgattcgtg -3 '(서열 번호 184)
MDR1loxP1R : 5'-acaaggcacttcaggataccaagcttcc -3 '(서열 번호 185)
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V901 (Lexicon genetics)을 이용하였다. PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 7 분 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이 나제 (proteinase) K (GIBCO) 처리 후 CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 그 후 제한 효소 BglII (닛뽄진)로 절단하여 CHROMASPIN-TE1000 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 상기 PCR 단편 (2.5kb 및 5.3kb)를 V901 플라스미드 BglII과 BamHI 사이트에 클로닝 하였다 (벡터 명: V901-MDR1HR2). 그런 다음, V901-MDR1HR2를 제한 효소 AscI (NEB) 및 KpnI로 절단하고, 카세트 벡터 Bs-loxP-3'HPRT (Hoshiya들, Mol Ther .2009; 17 (2) :309-17)에서 제한 효소 AscI 및 KpnI에서 loxP를 포함하는 DNA 단편을 잘라, 라이게이션하였다. loxP 서열 방향이 클로닝한 AC005045 게놈 단편과 같은 방향으로 타겟팅 벡터 pMDR1loxPbs했다. 최종 loxP 삽입 컨스트럭트(construct)의 크기는 13.0 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열과 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 도 95에 나타내었다.
[A.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
상기와 동일한 방법으로 상기 방법으로 제작한 타겟팅 벡터 pMDR1loxPbs를 제한 효소 NotI (TAKARA)로 선형화한 후, WO01/011951에 명시된 방법으로 제작된 인간 7 번 염색체를 보유하는 닭 DT40 세포 (클론 DT40 - # 7)에 형질 전환하고, 블라스티시딘 (Blasticidin) S (15μg/ml)을 포함한 배지로 교체하고 96 웰 배양 플레이트 3 장에 분주하여 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 2 번의 형질 전환으로 얻은 총 9 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다(클론 명: DT40 (hChr7M-loxP)).
[A.3] 상동 재조합체의 선별
[A.3.1] PCR 분석
블라스티시딘 (Blasticidin) S 내성 클론으로부터 Puregene DNA Isolation Kit (Gentra System 사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하여 다음 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 확인하였다.
하기 두 쌍의 프라이머를 이용한 PCR에 의해 상동 재조합체를 동정하였다.
MDR1loxP2L (상기 기재)
BsdR : 5'-gctcaagatgcccctgttct-3 '(서열 번호 186)
hprt332F : 5'-aaagatggtcaaggtcgcaa-3 '(서열 번호 187)
MDR1loxP1R (전출)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp 9600, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 이용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 4 분 35 사이클 반복하였다. 9 클론을 스크리닝한 결과, 3 클론이 상동 재조합체로 동정되었다.
[A.3.3] two-color FISH 분석
FISH 분석은 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 3 클론을 사람 cot-1 DNA 및 블라스티시딘 (Blasticidin) DNA를 프로브하고 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 7 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 7q21 근처에 네오 마이신 (neomycin) 유래의 신호가 감지되었음으로 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다. 이상의 결과로부터, 인간 7 번 염색체상 AC005045에 유전자 도입부위인 loxP 서열이 부위 특이적으로 삽입됐다고 결론 지었다.
[B] 인간 7 번 염색체 AC003083의 부위 특이적 절단
인간 7 번 염색체의 MDR1 유전자 말초 측의 유전자를 제거하기 위해 부위 특이적 염색체 삭제인 텔로미어를 절단하였다.
[B.1] 타겟팅 벡터 pTELpuro-MDR1의 제작
인간 7 염색체 MDR1 유전자 자리의 매우 가까운 텔로미어 쪽 (약 50 Kb 텔로미어 쪽)에 위치하고 AC003083 영역에 인간 텔로미어 서열을 삽입하는 타겟팅 벡터 pTELpuro-MDR1을 다음과 같이 제작하였다. 먼저, AC003083 게놈 영역을 다음 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하였다.
MDR1tel5L; 5'-ctattctaaaaagctgccttggcccaca-3 '(서열 번호 188)
MDR1tel5R; 5'-tgtagcccagttcctaatgggacacaga-3 '(서열 번호 189)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 Gene Amp9600를, Taq 중합 효소는 LATaq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 8 분 35 사이클 반복하였다. PCR 산물을 프로테이나제 (proteinase) K (기부코) 처리 후 CHROMASPIN-TE400 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 그 후 제한 효소 EcoRI (닛뽄진) 및 PstI (닛뽄진)로 절단하고, CHROMASPIN-TE 1000 (클론 텍)에서 젤 여과했다. 상기 PCR 단편을 플라스미드 pTELpuro (Kuroiwa들, Nature Biotech., 20:88,2002)의 EcoRI 및 PstI 부위에 클로닝 하였다. AC003083 게놈 시퀀스의 방향은 센토로메아 → 텔로미어 때문에 복제된 AC003083 게놈 단편이 인간 텔로미어 서열과 같은 방향으로 목표 타겟팅 벡터 pTELpuro-MDR1했다. 최종 장완 근위 부위 특이적 절단용 컨스트럭트(construct)의 크기는 13.1 kb이다. 타겟팅 벡터 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자 (allele)를 (도 96)에 나타내었다.
[B.2] 형질 전환 및 약제 내성 클론의 단리
상기의 방법과 동일하게 상기에서 제작한 타겟팅 벡터 pTELpuro-MDR1를 제한 효소 EcoRI (닛뽄진)로 선형화된 후에, 상기에서 제작한 클론 DT40 (hChr7M-loxP) 8, 9에 형질 전환하고 퓨로마이신 (Puromycin)(0.3 ug/ml)를 포함한 배지로 교체하고, 96 웰 배양 접시 10 장에 분주하여 약 2 주 동안 선택 배양하였다. 4 번의 형질 전환으로 얻은 총 96 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다 (클론 명: DT40 (hChr7M-loxP-tel)).
[B.3] 상동 재조합 체의 선별
[B.3.1] PCR 분석
퓨로마이신 (Puromycin) 내성주는 게놈 DNA를 주형으로서 재조합체를 선별하기 위하여 일차 스크리닝으로서 절단 부위로부터 텔로미어 (Telomere)쪽에 위치를 다음 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 부위 특이적 절단이 일어난 있는지 확인하였다. 하기 프라이머 서열은 다음과 같다.
CYP3A4 R (상기 기재)
CYP3A4 F (상기 기재)
CYP3A5 R (상기 기재)
CYP3A5 F (상기 기재)
CYP3A7 R (상기 기재)
CYP3A7 F (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 Ampli Taq Gold (Applied Biosystems)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 95℃, 10 분 가열 변성 후, 95℃, 20 초, 55℃, 30 초, 72℃, 30 초, 30 사이클 반복하였다.
그런 다음, 상기 프라이머에 검출되지 않은 3 클론에 대해 다음의 프라이머를 이용하여 부위 특이적 상동 재조합이 일어나고 있는지 PCR에서 확인하였다. 서열은 아래와 같다.
MDR1tel5L; 5'-ATCTGCAGGGAAGGGATCCAGTTTCAGCTTCCTAC -3 '(서열 번호 190)
SK23 (상기 기재)
MDR1-1L : 5'-ctcctaggagtactcacttc -3 '(서열 번호 191)
MDR1-1R : 5'-aacagaaacatggcttggcg-3 '(서열 번호 192)
MDR1-2L : 5'-cgccaagccatgtttctgttt-3 '(서열 번호 193)
MDR1-2R : 5'-aaggaaatgctttctgccttg-3 '(서열 번호 194)
MDR1-3L : 5'-gtgcaacggaagccagaaca-3 '(서열 번호 195)
MDR1-3R : 5'-agcggcctctgcttctttga-3 '(서열 번호 196)
MDR1-4L : 5'-ctgattggctgggcaggaac-3 '(서열 번호 197)
MDR1-4R : 5'-cttggaacggccaccaagac-3 '(서열 번호 198)
MDR1-5L : 5'-ggtgctggttgctgcttaca-3 '(서열 번호 199)
MDR1-5R : 5'-cccaacatcgtgcacatcaa-3 '(서열 번호 200)
MDR1-6L : 5'-gtcagtgttgatggacagga-3 '(서열 번호 201)
MDR1-6R : 5'-gcattggcttccttgacagc-3 '(서열 번호 202)
MDR1-7L : 5'-ggttccaggcttgctgtaat-3 '(서열 번호 203)
MDR1-7R : 5'-tctttcagtgcttgtccaga-3 '(서열 번호 204)
MDR1-8L : 5'-ggcaaagaaataaagcgactg-3 '(서열 번호 205)
MDR1-8R : 5'-cctcctttgctgccctcaca-3 '(서열 번호 206)
MDR1-9L : 5'-tcttgtccaaactgcctgtga-3 '(서열 번호 207)
MDR1-9R : 5'-tgcaagaatcagcaggatcaa-3 '(서열 번호 208)
상기 프라이머에 의한 PCR은 LATaq (타카 라 주조)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 20 초, 68℃, 8 분, 35 사이클 반복하였다. 부위 특이적 재조합이 일어난 3 클론에서만 약 8 kb의 밴드가 검출되었다. 네거티브 컨트롤의 DT40, DT40 (hChr7M-loxP) 8, 9에서는 밴드가 발견되지 않았다.
[B.3.2] two-color FISH 분석
FISH 분석은 마쓰바라 등(FISH 실험 프로토콜 수윤사(秀潤社), 1994)에 따라 수행하였다. 상기에서 재조합을 확인한 3 클론을 사람 cot-1 DNA 및 퓨로마이신 (Puromycin) DNA를 프로브하고 FISH 분석을 실시한 결과, 인간 7 번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 인간 7 번 염색체 단편 말단에 퓨로마이신 유래의 신호가 감지하여 원하는 부위에서 절단되어 있던 것으로부터 부위 특이적 재조합이 일어난 것이 확인되었다 (도 97).
이상의 결과에서, 클론 DT40 (hChr7M-loxP-tel) 10, 12 및 70에 있어서, MDR1 유전자 영역에서 텔로미어 (Telomere) 측의 AC003083으로부터 원위에 있어서 절단할 수 있다고 결론 지었다.
[C] hChr7M-loxP-tel 함유 DT40로부터 hChr7M-loxP-tel의 MAC4 함유 CHO 세포에 도입.
CHO 세포 내에서 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 loxP 서열을 통해, 인간 MDR1 유전자 영역을 전좌 삽입하기 위해 hChr7M-loxP-tel을 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 CHO 세포에 도입하였다.
[C.1] 미소 핵 세포 융합과 약제 내성 클론의 단리
수용자(recipient) 세포인 DT40 (hChr7M-loxP-tel) 10과 70을 사용하여, 상기와 같이 MAC4 함유 CHO hprt 결손 세포 (인간 과학 연구 자원 뱅크에서 수득, 등록 번호 JCRB0218)인, CHO (HPRT- ; MAC4)에 미소 핵 세포 융합법을 실시하였다. 4 회 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 15 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 수행하였다(클론 명: CHO (HPRT-; MAC4, hChr7M-loxP-tel)).
[C.2] 약제 내성 클론의 선별
[C.2.1] PCR 분석
블라스티시딘 (Blasticidin) S 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 재조합체를 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 사람 7 번 염색체 단편이 MAC4 함유 CHO 세포에 도입 있는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
MDR1loxP2L (상기 기재)
BsdR : 5'-gctcaagatgcccctgttct-3 '(서열 번호 209)
hprt332F : 5'-aaagatggtcaaggtcgcaa-3 '(서열 번호 210)
MDR1loxP1R (상기 기재)
MDR1tel5L (상기 기재)
SK23 (상기 기재)
MDR1-1L (상기 기재)
MDR1-1R (상기 기재)
MDR1-2L (상기 기재)
MDR1-2R (상기 기재)
MDR1-3L (상기 기재)
MDR1-3R (상기 기재)
MDR1-4L (상기 기재)
MDR1-4R (상기 기재)
MDR1-5L (상기 기재)
MDR1-5R (상기 기재)
MDR1-6L (상기 기재)
MDR1-6R (상기 기재)
MDR1-7L (상기 기재)
MDR1-7R (상기 기재)
MDR1-8L (상기 기재)
MDR1-8R (상기 기재)
MDR1-9L (상기 기재)
MDR1-9R (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 15 클론 중 6 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 6 클론을 이후 분석하였다.
[C.2.2] two-color FISH 분석
상기로부터 수득한 CHO (HPRT-; MAC4, hChr7M-loxP-tel)의 6 클론에 대하여, Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 마우스 Cot-1 DNA 와 인간 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 2 클론에 있어서, 80% 이상의 비율로 MAC1 및 hChr7M-loxP-tel가 CHO 세포에 1 카피 또는 2 카피 도입되었는지 확인하였다 (도 98).
이상의 결과에서 hChr7M-loxP-tel이 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4 함유 CHO 세포에 도입될 수 있었다고 결론 지었다.
[D] CHO (HPRT-; MAC4, hChr7M-loxP-tel) 클론에 있어서 인간 MDR1 유전자 영역 주변 (AC005045-인간 MDR1 유전자 - AC003083) 210 kb의 MAC4 벡터에 부위 특이 전좌
210kb 크기의 DNA인 인간 MDR1 유전자를 마우스 개체에서 안정적으로 보유하기 위해 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 전좌 삽입하였다(도 99).
[D.1] 형질 전환 및 HAT 내성 클론의 단리
상기 방법으로 얻은 CHO (HPRT-; MAC4, hChr7M-loxP-tel) 7과 15를 리포펙션 (lipofection) 법을 이용하여 유전자 도입하고, 90% 컨플루언트 (confluent) 상태로 된 6 웰 세포에 대해 Cre 3 μg를 시판(인비트로젠 (invitrogen))의 프로토콜에 따라 도입하였다. HAT 선택 배양하에서 2 주간 배양하면 내성 콜로니가 출현하고 2 회 도입에서 얻은 총 10 개의 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석을 실시하였다 (클론 명: CHO (MDR1-MAC, hChr7-ΔMDR1)).
[D.2] 약제 내성 클론의 선별
[D.2.1] PCR 분석
HAT 내성주는 게놈 DNA를 추출하여 주형으로서 상호 전좌 클론을 선별하기 위해 다음의 프라이머를 이용하여 PCR을 실시하여 사람 7 번 염색체 조각과 MAC4에서 염색체에 상호 전좌가 발생하는지 확인하였다. 상기 프라이머 서열은 다음과 같다.
m11 4L : (상기 기재)
V907-NotI-R : (상기 기재)
hygF (244) : (상기 기재)
m11 6R (상기 기재)
MDR1loxP2L (전출)
BsdR : 5'-gctcaagatgcccctgttct-3 '(서열 번호 211)
hprt332F : 5'-aaagatggtcaaggtcgcaa-3 '(서열 번호 212)
MDR1loxP1R (상기 기재)
MDR1tel5L (상기 기재)
SK23 (상기 기재)
MDR1-1L (상기 기재)
MDR1-1R (상기 기재)
MDR1-2L (상기 기재)
MDR1-2R (상기 기재)
MDR1-3L (상기 기재)
MDR1-3R (상기 기재)
MDR1-4L (상기 기재)
MDR1-4R (상기 기재)
MDR1-5L (상기 기재)
MDR1-5R (상기 기재)
MDR1-6L (상기 기재)
MDR1-6R (상기 기재)
MDR1-7L (상기 기재)
MDR1-7R (상기 기재)
MDR1-8L (상기 기재)
MDR1-8R (상기 기재)
MDR1-9L (상기 기재)
MDR1-9R (상기 기재)
TRANS L1 (상기 기재)
TRANS R1 (상기 기재)
PCR은 Thermal cycler로서 Perkin-Elmer 사의 GeneAmp9600를, Taq 중합 효소는 LA Taq (TAKARA)를 이용하고, 버퍼 및 dNTPs (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)는 첨부 된 것을 권장 조건에 따라 사용하였다. 온도 사이클 조건은 94℃, 1 분 열변 후, 98℃, 10 초, 68℃, 7 분, 30 사이클 반복하였다. PCR 결과, 10 클론 중 6 클론이 모든 프라이머 세트에서 양성이며, 상기 6 클론을 이후 분석하였다.
[D.2.2] two-color FISH 분석
상기 방법으로부터 수득한 CHO (MDR1-MAC, hChr7-△MDR1) 6 클론에 대하여 Shinohara 등의 보고 (Human Molecular Genetics, 10 : 1163-1175,2001)에 기록된 방법으로 MDR1-BAC (RP11-784L5) (CHORI) DNA 및 마우스 Cot-1 DNA를 프로브로한 FISH 분석을 실시한 결과, 6 클론 중 3 클론에 있어서, 60% 이상의 비율로 MAC4에 인간 MDR1 유래에 의한 신호가 관찰되는 것을 확인하였다(도 100).
이상의 결과로부터, 인간 7 번 염색체 단편의 MDR1 유전자 210 kb가 마우스 인공 염색체 벡터 MAC4에 상호 전좌에 의한 클로닝될 수 있었다고 결론 지었다.
[E] CHO 세포로부터 MDR1-MAC의 마우스 A9 세포에 이입
MDR1-MAC을 보유하는 마우스 ES세포를 제작하기 위하여, 상기 [D]에서 얻은 MDR1-MAC을 보유하는 CHO 세포 (CHO (MDR1-MAC, hChr7-△MDR1) 1,2,4)로부터 마우스 A9 세포에 마이크로셀 (microcell) 형성능이 높은 마우스 A9 세포에 미소 핵 세포 융합법에 의해 도입하였다. 4 번의 미소 핵 세포 융합에서 얻은 총 7 개의 내성 콜로니를 분리 증식시켜, 이후 분석하였다(클론 명: A9 (MDR1-MAC)). 그 결과, MDR1-MAC 영역만을 검출하는 앞의 프라이머를 이용한 PCR에서 양성인 클론은 5 클론 있었다. 또한, MDR1-BAC (RP11-784L5) (CHORI) 및 마우스 minor satellite DNA 프로브를 사용하여 FISH 분석 (Tomizuka들, Nature Genet.16 : 133,1997)를 실시한 결과, 상기 프로브에 의해 특이적으로 검출되는 MDR1-MAC의 존재가 5 클론 중 3 클론으로 확인되었다. 이상으로부터, MDR1-MAC을 보유하는 A9 세포가 3 클론 얻을 수 있었다고 결론 지었다.
[F] 실시예 8에 기재된 바와 같이 마우스 인공 염색체 벡터 MDR1-MAC을 보유하는 마우스 ES 세포를 조작하고 ES 세포를 사용하여 실험관내(in vitro) 안정성을 검증할 수 있다. 또한, 상기 ES 세포에서 키메라 마우스를 제작하고, MDR1-MAC이 자손 전달된 마우스 계통 TC (MDR1-MAC)를 제작할 수 있다. 또한, 상기 TC (MDR1-MAC) 마우스 계통을 이용하여 체세포의 MDR1-MAC의 안정성을 검증할 수 있다. 또한, TC (MDR1-MAC) 마우스 계통은 인간의 약물 수송 등을 재현할 수 있다. 또한, 위의 TC (CYP3A-MAC) 마우스 계통과의 교배하여 TC (CYP3A-MAC / MDR1-MAC) 계통을 제작할 수 있기 때문에 의약품 개발에 있어서 약효·독성을 조사하기 위한 생체내(in vivo) 시험을 위한 모델 마우스로 이용할 수 있다.
본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터는 WO 2009 / 063722에서 설명하는 인간 인공 염색체와 같은 유용성을 가지지만, 또한 설치류 세포 또는 설치류 개체에서 보유 비율을 향상시켜 상기 세포 내에서 안정적으로 보유되며, 목적 유전자 (군)를 장기간 안정하게 보유할 수 있으며, 또한 마우스와 같은 설치류의 개체 사이 및 조직 사이에서 도입 유전자 양에 편차가 없기 때문에 개체 간 또는 조직 간의 도입 유전자의 보다 정확한 해석을 가능하게 한다. 본 발명의 마우스 인공 염색체 벡터 예를 들어, 외래 유전자의 수용체 세포에 도입, iPS 세포의 수립 및 재생 의료에 이용, 외래 유전자를 발현하는 세포와 유용한 비인간 동물의 제작, 단백질의 제조 유전자 기능 분석 등 다양한 용도와 목적을 위해 유용하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입한다.
독립 행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11128 20090514
<110> National University Corporation Tottori University Chromocenter Inc. <120> Mouse Artificial Sequence chromosome vector <130> 12FPI-06-10 <150> JP 2010-1425 <151> 2010-01-06 <160> 212 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 catgtgggag cggcaattc 19 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ttgagtggaa tgagttcttc aatcg 25 <210> 3 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cgaggatccc acattggtag tcttttcact gccatca 37 <210> 4 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cgaggatccc cacttaactt ttccaggctt acggaga 37 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgacagagag cttcctcctg cctctgta 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ctaaagaccc tcatgctcct gtgtggaa 28 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gttcaacctg 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<210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 179 acagctggat ccattgaagg 20 <210> 180 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 180 acacacactt aattagcatg ga 22 <210> 181 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 181 ttggttaagg atttgctgac a 21 <210> 182 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 182 tccccgcgga tctgctccat actctgtacc 30 <210> 183 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 183 cattcaaggg gttctgggtc tgtaaact 28 <210> 184 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 184 gccaagtgta gctggagaat gattcgtg 28 <210> 185 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 185 acaaggcact tcaggatacc aagcttcc 28 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 186 gctcaagatg cccctgttct 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 187 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Claims (45)

  1. 마우스 11번 염색체 유래의 천연형 센트로미어(Centromere), 센트로미어 근방의 마우스 11번 염색체 장완의 AL671968, BX572640, CR954170 또는 AL713875 부위부터 장완원위를 제거한 마우스 11번 염색체 유래의 장완 단편, 및 텔로미어(telomere) 서열을 포함하고, 설치류의 세포 및 조직에 있어서 90% 이상의 보유율을 가지는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 기탁세포주 DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)에 포함된 마우스 인공염색체를 기본구조로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
  5. 삭제
  6. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 설치류는 마우스, 래트 또는 햄스터인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  7. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 1개 이상의 DNA 서열 삽입 부위를 추가적으로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
  8. 제 7항에 있어서, DNA 서열 삽입 부위는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위인 것을 특징으로 하는 마우스 인공 염색체 벡터.
  9. 제 7항에 있어서, DNA 서열 삽입 부위는 loxP 서열, FRT 서열, ΦC31 attB 및 ΦC31 attP 서열, R4 attB 및 R4 attP 서열, TP9011 attB 및 TP9011 attP서열, 또는 Bxb1 attB 및 Bxb1 attP 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  10. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 리포터 유전자, 선택 마커 유전자 또는 둘 모두를 추가적으로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
  11. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 외래 DNA 서열을 추가적으로 포함하는 마우스 인공염색체 벡터.
  12. 제 11항에 있어서, 외래 DNA 서열의 사이즈가 200kb이상인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  13. 제 11항에 있어서, 외래 DNA 서열이 인간 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  14. 제 11항에 있어서, 외래 DNA 서열이, 약물대사 관련 유전자의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  15. 제 14항에 있어서, 약물대사 관련 유전자는 제1상 반응 또는 제2상 반응에 영향을 미치는 효소를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  16. 제 15항에 있어서, 제1상 반응에 영향을 미치는 효소는, CYP1A, CYP1B, CYP2A, CYP2B, CYP2C, CYP2D, CYP2E, CYP2J, CYP3A, CYP4A, CYP4B, 및 이의 서브 패밀리 CYP 및 CES로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  17. 제 15항에 있어서, 제2상 반응에 영향을 미치는 효소는, UGT1 및 UGT2로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  18. 제 14항에 있어서, 약물대사 관련 유전자는 트렌스포터(Transporter)를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  19. 제 18항에 있어서, 트랜스 포터를 코딩하는 유전자는 MDR1, MDR2, MRP2, OAT, OATP, OCT 및 BCRP로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유전자를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  20. 제 14항에 있어서, 약물대사 관련 유전자는 핵내 수용체를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  21. 제 20항에 있어서, 핵내 수용체를 코딩하는 유전자는 PXR, AhR, CAR 및 PPARα로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 유전자를 코딩하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  22. 제 11항에 있어서, 외래 DNA 서열은 인간 염색체의 장완 또는 단완의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  23. 제 11항에 있어서, 외래 DNA 서열은 제1상 반응에 영향을 미치는 효소를 코딩하는 유전자, 제2상에 관계되는 효소를 코딩하는 유전자, 트랜스포터를 코딩하는 유전자 및 핵내 수용체를 코딩하는 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2개 이상의 유전자 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  24. 제 22항에 있어서, 인간 염색체는 질병 유전자의 원인 영역을 포함하는 인간 염색체의 장완 또는 단완의 DNA 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  25. 제 11항에 있어서, 외래DNA 서열이, 사이트카인류, 호르몬류, 성장인자류, 영양인자류, 조혈인자류, 혈액응고·용해인자류, 면역글로불린류, G 단백질결합수용체류 및 효소류로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드류를 코딩하는 유전자 또는 DNA의 서열, 또는 종양, 근위축증, 혈우병, 신경퇴행성 질환, 자기면역질환, 알레르기성 질환, 및 유전성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택되는 질환에 관련되는 치료용 유전자 또는 DNA의 서열인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  26. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 세포는 간세포, 장세포, 신장세포, 비장세포, 폐세포, 심장세포, 골격근세포, 뇌세포, 골수세포, 림프구세포, 거대핵세포, 정자 또는 난자인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  27. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 조직은 간장, 장, 신장, 비장, 폐, 심장, 골격 근육, 뇌, 골수, 고환 또는 난소 유래의 조직인 것을 특징으로 하는 마우스 인공염색체 벡터.
  28. 제 1항 또는 제 4항에 기재된 마우스 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포.
  29. 제 28항에 있어서, 세포는 체세포, 비인간 생식 계열세포, 줄기세포 및 전구 세포로부터 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포.
  30. 제 29항에 있어서, 줄기세포는 배아줄기(ES)세포 또는 인공 다능줄기(iPS)세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  31. 제 28항에 있어서, 세포는 초대배양 세포, 계대 세포 또는 주화세포인 것을 특징으로 하는 세포.
  32. 제 28항에 있어서, 세포는 인간 항체 생산이 가능한 것을 특징으로 하는 세포.
  33. 질환치료용 외래 DNA 서열을 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 제 28항의 세포를 포함하는 종양, 근위축증, 혈우병, 신경퇴행성 질환, 자기면역질환 또는 알레르기성 질환 치료용 의약 조성물.
  34. 제 1항 또는 제 4항에 있어서, 마우스 인공염색체 벡터를 보유하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  35. 제 34항에 있어서, 비인간 동물은 질환 모델 동물인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  36. 제 34항에 있어서, 비인간 동물은 외래 인간 약물 대사 관련 유전자를 발현하는 동물인 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  37. 제 34항에 있어서, 비인간 동물은 인간 항체를 생산하는 것을 특징으로 하는 비인간 동물.
  38. 제 34항에 있어서, 마우스 인공염색체 벡터에 포함되는 외래 DNA에 대응하는 내재 유전자가 파괴되고 또는 내재 유전자의 발현이 저하되고 있는 비인간 동물.
  39. 외래 DNA 서열을 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 제 28항의 세포를 배양하여 생산된 상기 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 회수하는 것을 포함하는 단백질의 생산 방법.
  40. 인간 항체 유전자를 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 제 37항의 비인간 동물을 이용해서 인간 항체를 생산하고, 상기 인간 항체를 회수하는 것을 포함하는 인간 항체의 제조 방법.
  41. 질환 모델 동물인 제 35항의 비인간 동물에게 후보약제를 투여하고, 상기 약제의 치료 효과를 평가하는 것을 포함하는, 상기 질환을 치료하는데도 유효한 물질을 스크리닝하는 방법.
  42. 인간 약물 대사 관련 유전자를 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 제 36항의 비인간 동물 또는 상기 동물 유래의 세포, 기관 또는 조직에, 약물 또는 식품을 투여하고, 상기 약물 또는 식품의 약리작용 또는 대사 또는 독성을 측정하는 것을 포함하는, 약물 또는 식품의 약리작용 또는 대사 또는 독성의 시험 방법.
  43. 인간 약물 대사 관련 유전자를 포함하는 마우스 인공염색체 벡터를 가지는 제 36항의 비인간 동물로부터 얻을 수 있었던 마이크로좀(microsome) 또는 마이크로좀 S9 분획을, 배양 세포 또는 세균과, 약물 또는 식품과 함께 배양하고, 약물 또는 식품이 상기 세포 또는 세균에게 끼치는 영향을 측정하는 것을 포함하는, 약물 또는 식품의 독성의 시험 방법.
  44. 제 1항 또는 제 4항의 마우스 인공 염색체 벡터를 사용하고, 200 kb이상의 큰 사이즈의 외래 DNA를 설치류 세포 또는 설치류 개체 내에서 90% 이상의 보유비율로 안정하게 보유시키는 것을 포함하는, 세포 또는 개체 내에서의 큰 사이즈 DNA의 안정화 방법.
  45. 기탁 세포주 DT40 B6bT-1(FERM BP-11128)에 포함된 마우스 인공염색체 벡터.
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