KR20090036581A - 인간 인공 염색체（ｈａｃ） 벡터 및 인간 인공 염색체（ｈａｃ） 벡터를 갖는 인간 세포 의약 - Google Patents

인간 인공 염색체（ｈａｃ） 벡터 및 인간 인공 염색체（ｈａｃ） 벡터를 갖는 인간 세포 의약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 염색체 유래의 센트로미어 및 서브텔로미어 서열과 텔로미어 서열을 보유하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터, 이 HAC 벡터를 포함하는 인간 세포 의약 또는 인간 세포, 이 HAC 벡터 및 인간 세포의 제조 방법, 및 이 HAC 벡터에 의한 치료용 단백질 제조 방법에 관한 것이다.
Figure P1020097002553
텔로미어, 서브텔로미어, 센트로미어, 인간 인공 염색체 벡터, 인간 세포 의약, 인간 세포, 치료용 단백질, 장완원위, 단완원위, 외래 DNA

Description

인간 인공 염색체（ＨＡＣ） 벡터 및 인간 인공 염색체（ＨＡＣ） 벡터를 갖는 인간 세포 의약{HUMAN ARTIFICIAL CHROMOSOME (HAC) VECTOR, AND HUMAN CELL PHARMACEUTICAL COMPRISING HUMAN ARTIFICIAL CHROMOSOME (HAC) VECTOR}
본 발명은 인간 염색체 유래의 센트로미어(centromere), 서브텔로미어(subtelomere) 서열 및 텔로미어(telomere) 서열을 포함하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터를 제공한다. 본 발명은 또한 상기 HAC 벡터를 포함하는 인간 세포 의약 또는 인간 세포를 제공한다. 이러한 인간 세포(의약품)는 유전자 치료 및 재생 의약품으로서 유용하다. 또한 본 발명은 상기 HAC 벡터를 포함하는 인간 세포의 제조 방법, 상기 HAC 벡터 및 그 제조 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 HAC 벡터를 이용한 치료용 단백질의 제조 방법을 제공한다.
HAC 벡터
포유 동물 세포로의 유전자 도입에서 범용되는 플라스미드, 코스미드, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC), 바이러스 벡터 등의 종래 벡터는, 에피솜의 경우에는 도입 유전자의 발현이 일과성이라는 문제가 있다. 그러나, 이러한 종래 벡터는 유전자가 숙주 세포의 염색체에 조립되는(integrated) 경우에는, 숙주 염색체의 유전자가 파괴되고, 도입 유전자의 카피수가 제어되지 않고, 도입 유전자 가 불활성화되고, 조립된 숙주 염색체 상의 제어 서열의 영향을 받는다는 등의 다수의 문제가 있다.
이들을 해결하는 한 방법으로서, 본 발명자의 연구 그룹은 인간 21번 염색체를 출발 재료로 하여, 구조가 분명하고 불필요한 유전자를 제거하고, 외래 DNA를 간편하게 도입 가능한 신규의 HAC(21HAC) 벡터계를 구축하였다(특허 문헌 1 및 비특허 문헌 1). 이 문헌들에서, 본 발명자들은 21HAC 벡터가 인간을 포함하는 포유 동물 세포를 숙주로 하여 자율 복제 및 분배가 가능하고 21HAC 벡터가 안정적으로 보유되며, 숙주 염색체를 파괴하지 않고 일정 카피수의 유전자가 도입 가능한 것을 입증하였다. 또한, 생체외(ex vivo) 호르몬 대체 유전자 치료를 위한 모델로서 치료용 유전자 인간 에리트로포이에틴(hEPO)을 도입한 21HAC 벡터를 인간 정상 초대 배양 섬유아세포에 도입할 수 있는 것, EPO를 장기간 지속 발현할 수 있는 것, 그 발현량은 CHO 세포에서의 약 1/1000로 발현 억제를 받는 것, HAC 도입 정상 초대 배양 섬유아세포를 단일 콜로니로부터 최대 3.8×107 세포까지 증폭할 수 있는 것, 비선택 조건 하에서 6 또는 9대 계대 후 65.5 내지 90.9％의 유전자가 보유되는 것을 입증하였다(특허 문헌 1 및 비특허 문헌 2).
비비 원숭이에서의 생체외 EPO 대체 유전자 치료 모델의 경우, 레트로바이러스 벡터로 hEPO 유전자 도입한 비비 원숭이 초대 배양 MSCs(0.81 내지 6.6×106 세포/kg)의 캡슐 피하 이식에 의해 혈중 EPO 농도 상승 및 빈혈 회복이 보고되었다(비특허 문헌 3). 그러나, 유전자 치료를 위해서는 세포 당 발현량의 추가적인 향 상이 요구된다. 또한 인간 정상 초대 배양 섬유아세포의 분열 한계를 고려하면 세포 분열 횟수를 적게 하는 것이 바람직하다. 생체내(in vivo) 효과를 발휘할 수 있는 상태의 치료용 HAC 도입 세포를 효율적으로 증폭시키기 위해서는, 벡터 안정성이 개선되고 향상되어야 한다.
상기 문제를 해결하는 수단의 예는, 벡터의 기본 골격이 되는 인간 염색체로서 안정성이 높은 인간 염색체를 이용하여 기능적인 텔로미어를 갖는 HAC 벡터를 구축하는 것이다.
외래 유전자의 발현은 삽입된 부위 주변의 크로마틴 구조나 제어 서열의 유무에 의해 영향을 받는 것이 알려져 있다. 또한 염색체를 안정적으로 유지하기 위해서는 기능적인 충분한 길이의 텔로미어가 필요한 것이 알려져 있다 (비특허 문헌 4). HAC 상에서, 크로마틴 구조나 제어 서열의 영향 배제를 위해 인슐레이터를 이용한 사례가 있지만 (비특허 문헌 23), 크로마틴 구조나 제어 서열의 영향 배제의 검증은 이루어지지 않았고, 상기 인슐레이터는 텔로미어 서열을 조작할만한 것이 아니다. 또한, HAC 상에서 텔로메라제 등에 의한 텔로미어 서열의 부가·텔로미어 길이의 회복 등, 텔로미어 서열 조작에 의한 HAC 벡터 안정성 향상의 검토는 이루어지지 않않다.
상동 재조합 효율의 향상
외래 유전자를 도입할 때, 유전자 도입 세포의 선별을 위해 약제 내성 유전자의 도입이 범용된다. 많은 경우, 약제 내성 유전자는 목적으로 하는 외래 유전자와 병렬하여 동일 벡터 상에 배치된다. 유전자 발현 유닛이 복수 병렬되면, 이 들이 서로 간섭하여 외래 유전자의 발현량이 저감되는 것이 알려져 있다. 종래, 고발현/생산 세포의 구축에서, 발현량 향상을 위해, 예를 들면 약제 내성 유전자를 엑손으로서 분단 배치하여 스플라이싱을 거쳐서 발현시킴으로써 약제 내성능을 저하시킴으로써, 도입 외래 유전자를 고발현하는 세포의 선별이 행해져 왔다(비특허 문헌 22) 그러나, 약제 내성 유전자의 제거에 의해 외래 유전자의 발현이 현저히 향상되었다는 보고는 없다.
또한, 약제 내성 유전자 제거에 대해서는, 항체경쇄 κ에 유전자좌에 외래 유전자를 노킹할 때, 하류에 존재하는 약제 내성 유전자 제거에 의해 상동 재조합 효율이 향상되는 것이 마우스 ES 세포에서 알려져 있는데(특허 문헌 2), 이는 외래 유전자 발현을 향상시키기 위한 것이 아니다.
인간 염색체의 안정성과 유전자 발현
마우스 ES 세포에 관한 실험의 결과로, 도입한 염색체 단편이 클수록 그것을 보유하는 세포의 키메라 개체 중에서의 기여율이 낮아지는 것이 알려져 있다. 본 발명자들의 연구 그룹은, 마우스 배아 줄기 세포에 항체 유전자를 포함하는 인간 14번, 2번, 22번 염색체 단편을 도입하여, 키메라 개체가 제조할 수 있는 것, 도입된 항체 유전자가 개체 속에서 기능 발현하는 것, 인간 염색체 단편이 키메라 개체로 안정적으로 보유되는 것, 생식 계열을 거쳐서 차세대 전달 가능한 것을 나타내었다(비특허 문헌 5 및 6). 인간 항체 중쇄 유전자를 보유하는 마우스를 제조할 목적으로 단리된 인간 14번 염색체 유래의 자연 발생 단편 SC20 및 이것에 항체 경쇄 유전자를 포함하는 인간 22번 염색체 영역을 클로닝한 HAC에 대해서, 마우스에 서의 안정성과 생식 계열 전달을 확인하였다(비특허 문헌 7). 또한 본 발명자들은 상기 SC20 유래 HAC는 체세포핵 이식에 의해 새로 만들어 낸 클론 소 개체로 안정적으로 보유되는 것, 도입된 항체 유전자가 개체 속에서 기능 발현하는 것을 입증하였다(비특허 문헌 8). 한편, 상기한 인간 14번 염색체 유래의 자연 발생 단편 및 HAC에 대해서, 인간 정상 초대 배양 세포 및 인간 세포주에서의 안정성 및 발현의 검토는 아직 이루어지지 않았다. 또한, 인간 21번 염색체를 제외한 그 밖의 인간 염색체 유래의 자연 발생 단편 및 HAC에 대해서도, 인간 정상 초대 배양 세포 및 인간 세포주에서의 발현/안정성의 검토는 아직 충분히 이루어지지 않았다. 인간 X 염색체 유래의 미니 염색체가 인간 세포주에서 보유된 보고가 있지만(비특허 문헌 9), 이 미니 염색체에서는 계대 후에 현저한 다카피화가 발견되므로, 일정한 카피수를 유지하는 것은 여전히 어렵다.
텔로미어에 의한 발현 및 안정성의 제어
텔로미어는 염색체 말단에 위치하는 반복 서열이며, 효모로부터 인간을 포함하는 포유 동물 세포까지 넓은 생물종으로 보존되어 있다. 인간 정상 세포의 경우, (TTAGGG)의 반복이 15 내지 0.4 kb의 길이에 이른다. 텔로미어는 세포 분열의 진행과 함께 단축되어, 텔로미어 길이의 감소에 수반하여 이상 염색체(즉, 융합·탈락·분단·이수화(異數化) 등)의 출현 또는 증가가 관찰된다. 따라서, 텔로미어는 염색체의 보호·안정 유지에 필요한 것으로 생각되고 있다(비특허 문헌 10 및 11). 따라서, 충분한 길이의 기능적인 텔로미어 구조를 갖는 것에 의해 염색체의 안정성이 향상된다고 생각된다.
텔로미어 길이는, 텔로메라제의 강제 발현에 의해, 또는 텔로미어 결합 단백질(POT·TRF2)의 결실에 의해 인위적으로 신장될 수 있다(비특허 문헌 12 및 13). 이들 기술에 의해 인간 정상 초대 배양 세포 및 인간 세포주에서 분열횟수의 증가·수명 연장은 실증되었지만, 염색체 안정성을 회복 및 향상시킬 수 있을지에 대해서는 여전히 분명하지 않다. 또한, 불사화 세포에서, 발증 후에 내재성의 텔로메라제 활성이 상승하여 단축된 텔로미어가 일정한 길이로 신장 및 유지되면 이상 염색체의 출현 빈도는 증감하지 않고 유지된 예가 있다(비특허 문헌 14). 그러나, 이 경우에 염색체 안정성의 회복 및 향상은 달성하지 못하였다.
서브텔로미어는 염색체 말단의 텔로미어(TTAGGG)n 반복 서열의 센트로미어측에 인접하여 위치하고, 분절/중복 도메인이나 (TTAGGG)n형의 반복 서열을 갖는, 약 300 내지 500 kb에 걸치는 염색체 영역을 가리킨다. 분절/중복 도메인 구조가 갖는 높은 상동성 때문에, 동일 염색체 상의 서브텔로미어 내 또는 서로 다른 염색체 상의 서브텔로미어 사이에서 고빈도로 전위나 재조합이 발생되기 쉬운 것이 알려져 있다(비특허 문헌 15 내지 17). 인간 14번 염색체 장완의 서브텔로미어 길이는, 분절/중복 영역으로서 499 kb가 동정되고, 또한 (TTAGGG)n의 텔로미어 서열과 상기 서브텔로미어 영역과의 사이에 20 kb 이하의 미동정 서열의 존재가 시사되어 있다(비특허 문헌 18). 서브텔로미어의 기능은, 높은 상동성을 이용한 재조합 촉진에 의한 텔로메라제 비존재 하에서의 텔로미어 회복 및 유지, 서브텔로미어의 가소성에 의한 새로운 환경에의 적응, 질환을 야기하는 전위 및 결실의 유도 등이 시사되어 있지만, 그 상세는 아직 분명하지 않다.
텔로미어와 유전자 발현의 관계 또는 텔로미어 및 서브텔로미어와 유전자 발현의 관계에 대해서는, 텔로미어 서열의 랜덤 삽입에 의해 염색체 말단이 텔로미어 서열로 치환된 염색체를 갖는 세포에서, 텔로미어 근위에서의 외래 도입 유전자 발현이 헤테로크로마틴화에 의한 사일렌싱(즉, 텔로미어 포지션 효과(Telomere position effect); TPE)를 받는 것이 관찰된다(비특허 문헌 19). TPE에 대해서는, 텔로미어 신장과 사일렌싱이 상관성이 있다는 보고가 있다(비특허 문헌 20). 그러나, 내재성의 텔로미어 영역 유전자 발현에 대해서는, 계대 전후의 인간 신생아 포피 섬유아세포에서 유전자 발현 패턴과 텔로미어 길이 감소 및 텔로미어 끝으로부터의 거리는 상관성이 없었다(비특허 문헌 21). 따라서, 텔로미어와 유전자 발현의 관계에 대한 논의는 아직 결론이 나지 않았다.
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<발명의 개시>
본 발명은 세포 내에서 안정적으로 보유되고 외래 유전자를 고발현 가능한 인간 인공 염색체(HAC) 벡터 및 그 제조 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 유전자 치료 및 재생 의료에 유용한 인간 세포 의약 및 그의 제조 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 치료용 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서 인간 염색체에 존재하는 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열에 주목하여, 인공 염색체 말단에 텔로미어 서열 및/또는 서브텔로미어 서열을 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 구축을 시도하였다.
그 일례로서, 인간 14번 염색체의 장완으로부터 인간 14번 염색체의 센트로미어 영역, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열의 일부를 남기고 기지의 유전자의 대부분을 결실시키고, 장완근위에 loxP 서열을 부위 특이적으로 삽입하여, 개질된 인간 염색체(14HAC) 벡터를 제조하였다(도 1). 이 14HAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포를 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양하면, 14HAC 벡터는 거의 탈락하지 않고 일정 카피수로 보유되는 것, 이러한 계대 배양은 14HAC 벡터의 안정성을 종래의 21HAC 벡터(WO2994/031385호)보다 현저히 향상시키는 것을 확인하였다(도 13). 또한 Cre/loxP 시스템에 의해 적혈구 증식 인자인 인간 에리트로포이에틴(hEPO) 유전자를 도입한 14HAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포로는, 종래의 21HAC 벡터와 비교하여 2.5배의 hEPO의 발현 향상을 확인하였다. 또한 이 hEPO 유전자를 도입한 14HAC 벡터를 보유하는 인간 정상 초대 배양 섬유아세포에서는 종래의 21HAC 벡터에 의한 것보다 11.7배 높은 현저한 hEPO 발현 향상을 확인하였다(도 21).
상기한 작용 효과가 무엇에 기인하는 가를 조사하는 것을 목적으로 하여, 텔로미어 서열과 인간 14번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열의 일부를 갖는 HAC 벡터의 발현 효율을 비교한 결과, 상기 HAC 벡터는 텔로미어 서열만을 장완 결실 말단에 갖는 경우와 비교하여, 인간 정상 섬유아세포에서 약 4배의 hEPO 발현 향상을 실현하였다. 이 HAC 벡터들은 그 구조에 있어 장완 결실 말단의 서브텔로미어 서열 외에는 기본 골격의 염색체, 외래 유전자(hEPO) 도입 위치가 동일하다. 따라서 상기한 현저한 발현 상승은 서브텔로미어 서열이 결실된 장완 말단에 포함되도록 인간 14번 염색체를 개질한 것에 의해 발생되었다고 생각된다.
인간 인공 염색체 벡터에서의 서브텔로미어 서열의 존재는, 외래 유전자 또는 외래 DNA의 발현 상승뿐만 아니라, 형질 도입된 세포 내에서의 상기 벡터가 안정적인 보유, 자손 전달율의 향상 등에도 양성의 영향을 주는 것을 알았다. 이러한 작용 효과는, 인간 14번 인공 염색체 벡터뿐만 아니라 인간 21번 염색체로부터 마찬가지로 제조한 인간 인공 염색체(HAC) 벡터라도 관찰되었다. 따라서, 상기한 작용 효과는 인간 14번 또는 21번 염색체 이외의 임의의 인간 염색체로부터 마찬가지로 제조된 HAC 벡터로서도 인간 14번 또는 21번 염색체 유래의 HAC 벡터와 마찬가지의 작용 효과를 발휘하는 것을 의미한다.
이러한 발견으로부터, 본 발명자들은 인간 염색체에 기초하여 구축한 HAC 벡터에 의해 상기 목적을 달성할 수 있는 것을 발견하였다. 이를 통해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하기 위해서, 인간 정상 세포 또는 인간 세포주에서 도입 유전자를 고발현하고 안정적으로 보유되는 염색체 벡터를 구축하는 것을 문제로 하여 예의 연구를 행하였다. 외래 유전자를 도입할 때, 유전자 발현 유닛이 복수 병렬되면 서로 간섭하여 전사 방향 하류에 위치하는 유닛의 발현이 감소하는 것이 알려져 있다(Proudfoot NJ 등, Nature, 제332권, p.562-565, 1986년, Kadesch T 등, Mol Cell Bio1, 제6권, p.2593-2601, 1986년). 상기한 hEPO 도입 21HAC 벡터(WO2994/031385호)는 hEPO 유전자 발현 유닛의 하류에 인접하여 neo 내성 유전자 발현 유닛이 존재한다. hEPO 유전자 발현을 향상시키는 방법으로서, HAC 벡터 상에서 hEPO 유전자 발현 유닛의 하류에 인접하는 neo 내성 유전자 발현 유닛을 제거할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 인간 염색체의 장완으로부터 기지의 유전자의 대부분을 결실시킨 개질된 염색체를 제조한다. 이 개질된 염색체 상의 장완근위에 loxP 서열 및 FRT 서열과 hCMV 프로모터를 부위 특이적으로 삽입한다. 이 개질된 염색체를 보유하는 CHO 잡종 세포에서 Cre/loxP 시스템에 의해 hEPO 유전자를 외래 유전자로서 개질된 염색체에 도입한다. FLPe/FRT 시스템에 의해 neo 내성 유전자 발현 유닛을 제거한다. 또한 생성물을 hEPO 도입 개질된 염색체를 보유하는 인간 정상 초대 배양 섬유아세포에 도입한다. 그 결과, 본 발명의 14HAC 벡터의 경우, 종래의 21HAC 벡터와 비교하고 평균 18.5배의 hEPO 발현 향상을 확인하였다(도 21). 이러한 발견으로부터, 본 발명자들은 내성 유전자 발현 유닛을 결실시킨 HAC 벡터에 의해 상기 목적을 달성할 수 있는 것을 발견하였다. 또한 이를 통해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
구체적으로, 본 발명의 개요는 이하와 같다.
본 발명은 제1 양태에서, 장완원위 및/또는 단완원위가 결실된 인간 염색체 단편이며, 인간 염색체 유래의 센트로미어와, 상기 결실된 장완 및/또는 단완의 원심 말단 부위에 부가되거나 또는 결합된 텔로미어 서열 및/또는 서브텔로미어 서열(바람직하게는 인간 염색체 유래의 서브텔로미어 서열)을 포함하는 인간 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체 벡터를 제공한다.
본 발명은 일 실시 형태에서, 장완원위 및/또는 단완원위가 결실된 인간 염색체 단편이며, (i) 인간 14번 염색체 유래의 센트로미어, (ii) 텔로미어 서열, 및 (iii) 서브텔로미어 서열을 포함하는 인간 14번 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한, 다른 실시 형태에서, 장완원위 및/또는 단완원위가 결실된 인간 염색체 단편이며, (i) 인간 21번 염색체 유래의 센트로미어, (ii) 텔로미어 서열, 및 (iii) 서브텔로미어 서열을 포함하는 인간 21번 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터를 제공한다.
본 명세서의 전체를 통해서, 본 발명에 따른 HAC 벡터는 천연에 존재하는 인간 염색체 단편 또는 자연 발생한 인간 염색체 단편을 항상 포함하지는 않는다. 그러한 단편이 상기 특징을 갖고 또한 인위적으로 단리된 경우에 본 발명에 포함되는 것으로 한다.
다른 실시 형태에서, 상기 HAC 벡터는 (iv) 특정한 부위에 삽입된 외래 DNA(또는 외래 유전자 또는 외래 핵산)을 포함할 수도 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 인간 염색체 단편의 크기는, 통상 약 1 Mb 이상, 예를 들면 약 1 Mb 이상 약 19 Mb 이하이고, 바람직하게는 약 18 Mb 이하이고, 더욱 바람직하게는 약 17 Mb 이하이다. 그러나, 이 크기는 상기한 범위에 특별히 한정되지 않는 것으로 하고, 인간 염색체의 종류, 인간 염색체로부터 장완원위 또는 단완원위를 결실시킨 후에 염색체 단편에 남는 장완근위의 길이, 또는 단완근위 또는 단완의 길이 등에 의해서 영향 받는다.
본 발명의 실시 형태에 따르면, 인간 염색체 단편은 인간 염색체의 장완원위가 결실되어 있고 또한 장완근위 및 단완을 포함할 수 있다. 다르게는, 인간 염색체의 단완원위가 결실되어 있고 또한 단완근위를 포함할 수 있다. 다르게는, 인간 염색체의 장완원위 및 단완원위가 함께 결실되어 있고 또한 장완근위 및 단완근위를 포함할 수 있다.
인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위는, 표적으로 하는 절단 영역의 염기 서열, 예를 들면 미국 National Center for Biotechnology information(NCBI)의 온라인 게놈 데이터베이스 Human Genome Resources, (http: //vnuv.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)의 염기 서열을 기초로 하여 표적 서열(타겟팅 벡터)을 설계하고, 그것을 이용하여 절단·결실시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시 형태에 따르면, 인간 염색체 단편의 장완원위는 인간 염색체 장완의 q11 영역 내 또는 q11 영역 내지 q12 영역 내에서 결실된다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 인간 염색체 단편의 단완원위는 인간 염색체 단완의 p11 영역 내 또는 p11 영역부터 p12 영역 내에서 결실된다.
예를 들면, 상기 인간 14번 염색체의 장완원위는, 예를 들면 14q 영역 내, 바람직하게는 14q11 영역 내에서 결실되고, 보다 바람직하게는 AL391156에서 또는 AL391156보다 근위인 위치에서, 구체적으로는 AL391156 내지 CR383659의 사이에서 결실되고, 더욱 바람직하게는 AL512310 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL929601 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL589182 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL589743 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL929602 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL512624 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 CR383657 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 CR383659에서 결실된다.
상기 인간 14번 염색체의 단완원위는, 예를 들면 14p 영역 내에서 결실되고, 바람직하게는 14p11 영역부터 14p12 영역 내에서 결실되고, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역부터 14p11.2 영역 내에서 결실되고, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역 내에서 결실되고, 더욱 바람직하게는 RNR2, PABPCP2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에서 결실된다.
또 다른 예로서, 인간 21번 염색체의 장완원위는 예를 들면, 21q 영역 내, 바람직하게는 21q11 영역 내, 보다 바람직하게는 21q11.1 영역부터 21q11.2 영역 내에서 결실된다. 결실 위치는, 예를 들면, 21q11.1의 NT_011512보다 근위, 바람직하게는 NT_011512 함유 영역 내 중 AL16202보다 근위, 보다 바람직하게는 AL16202 함유 영역 내의 AP001657 또는 AP001657보다 근위이다.
또한, 상기 인간 21번 염색체의 단완원위는 예를 들면 21p 영역 내에서 결실되고, 바람직하게는 21p11.1 영역부터 21p11.2 영역 내에서 결실되고, 더욱 바람직하게는 21p11.1 영역 내에서 결실되고, 더욱 바람직하게는 AL163201의 위치에서 결실된다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 텔로미어 서열은 TTAGGG 등의 반복 서열을 갖는 염기 서열이다. 이 서열은 인공적으로 합성된 서열 및 인간을 포함하는 포유 동물의 염색체 장완 또는 단완 유래의 것 등을 들 수 있지만, 특별히 한정되는 것은 아니다. 텔로미어 서열은 바람직하게는 인간 염색체 유래의 텔로미어 서열이고, 보다 바람직하게는 서브텔로미어 서열과 동일 염색체에서 유래되는 것이다.
본 발명의 또 다른 실시 형태에 따르면, 상기 텔로미어 서열의 길이는, 약 0.4 내지 50 kb이고, 바람직하게는 약 0.4 내지 25 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 0.4 내지 15 kb이다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 서브텔로미어 서열은 인간 염색체의 장완 또는 단완 유래의 서브텔로미어 서열이고, 임의의 인간 염색체 유래의, 예를 들면 인간 14번 염색체 또는 인간 21번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열이다. 구체적인 실시 형태에서, 상기 인간 염색체 단편은, 인간 염색체로부터 장완원위가 결실된 부위에 상기 인간 염색체와 동일하거나 상이한, 바람직하게는 동일한, 인간 염색체의 장완 유래의 서브텔로미어 서열을 포함한다.
또다른 본 발명의 다른 실시 형태에서, 상기 서브텔로미어 서열의 길이는 약 1 내지 500 kb이고, 바람직하게는 약 1 내지 300 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 40 kb, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 60 kb 이고 더욱 바람직하게는 약 25 내지 40 kb이다.
바람직한 실시 형태에서, 인간 14번 또는 21번 염색체 단편은 상기한 바와 같이 결실된 장완원위의 부위에 각각 인간 14번 또는 21번 염색체의 장완 유래의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 포함한다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 인간 14번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열 및 텔로미어 서열은 인간 14번 염색체의 14q32 영역 내의 부위부터 14q-tel 영역까지의 서열이다. 바람직하게는, 인간 14번 염색체의 14q32.33 영역부터 14q-tel 영역까지의 서열이고, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체의 AB019439, AB019438, AB019437 중 어느 하나의 마커로부터 14q-tel 영역까지의 서열이고, 특히 바람직하게는, 인간 14번 염색체의 AB019437로부터 14q-tel 영역까지의 서열이다.
또 다른 실시 형태에 따르면, 인간 21번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열 및 텔로미어 서열은, 인간 21번 염색체의 21q22.3 영역부터 21q-tel 영역 내의 텔로미어 말단까지의 서열 및 텔로미어 서열이다. 서브텔로미어 서열은 바람직하게는 인간 21번 염색체의 21q-tel 영역 내의 임의의 부위부터 텔로미어 말단까지의 서열이고, 더욱 바람직하게는 21q-tel 영역 내의 NT_011515로부터 텔로미어 말단까지의 서열이다.
추가 실시 형태에 따르면, 본 발명에 따른 인간 인공 염색체 벡터는 상기 인간 염색체 단편이 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 인간 염색체 단편의 장완근위 및/또는 단완근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입된다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 염색체의 장완 또는 단완의 결실 부위(또는 결실 위치)보다도 센트로미어측(즉, 「근위」)에 삽입된다.
예를 들면 인간 14번 염색체의 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 14q 영역 내에서, 바람직하게는 인간 14번 염색체의 장완근위의 14q11 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에서, 더욱 바람직하게는 AL391156 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL512310 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL929601 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL589182 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL589743 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL929602 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL512624 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 CR383657 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 CR383659에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입된다. 다른 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 14번 염색체의 단완에, 예를 들면 14p 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체의 단완근위의 14p11 영역부터 14p12 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체의 단완근위의 14p11 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입된다.
예를 들면 인간 21번 염색체의 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 21q 영역 내에서, 바람직하게는 인간 21번 염색체의 장완근위의 21q11.1 영역부터 21q11.2 영역 내에서의 결실 위치보다 근위에서, 예를 들면, 21q11.1의 NT_011512 영역에서의, 바람직하게는 NT_011512 함유 영역 내 중 AL16202 영역에서의, 보다 바람직하게는 AL16202 함유 영역 내의 AP001657의 결실 위치이거나 또는 AP001657에서의 결실 위치보다 근위에 삽입된다. 또한 다른 실시 형태에서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 21번 염색체의 단완에, 예를 들면 21p 영역 내에서, 바람직하게는 21p11.1 영역부터 21p11.2 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 인간 21번 염색체의 단완근위의 21p11.1 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 AL163201의 위치에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입된다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다. 다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열이다.
본 발명의 다른 실시 형태에서, 본 발명에 따른 인간 인공 염색체 벡터는 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 포함하는 인간 염색체 단편을 포함한다. 예를 들면, 상기 인간 염색체의 장완근위 및/또는 단완근위에 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입되어 있다. 이것에 의해 1 종류의 부위 특이적 재조합 효소/인식 부위를 외래 유전자의 도입에 사용하여, 별도의 종류의 부위 특이적 재조합 효소/인식 부위가 불필요하게 되는 약제 내성 유전자 발현 유닛의 제거 등에 사용하는 것이 가능해진다.
이 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 복수의 인식 부위는 상기와 같이 인간 염색체의 장완 또는 단완의 결실 부위보다 센트로미어측(즉, 근위)에 삽입된다.
예를 들면 인간 14번 염색체의 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 상기와 마찬가지이다. 즉, 14q 영역 내에서, 바람직하게는 인간 14번 염색체의 장완근위의 14q11 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에서, 더욱 바람직하게는 AL391156 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL512310 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL929601 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL589182 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL589743 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL929602 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL512624 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 CR383657 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 CR383659에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입된다. 또한 다른 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 인간 14번 염색체의 단완에, 예를 들면 14p 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체의 단완근위의 14p11 영역부터 14p12 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체의 단완근위의 14p11 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입된다.
예를 들면 인간 21번 염색체의 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 21q 영역 내에서, 바람직하게는 인간 21번 염색체의 장완근위의 21q11.1 영역부터 21q11.2 영역 내에서의 결실 위치보다 근위에서, 예를 들면, 21q11.1의 NT_011512 영역에서의, 바람직하게는 NT_011512 함유 영역 내 중 AL16202 영역에서의, 보다 바람직하게는 AL16202 함유 영역 내의 AP001657의 결실 위치이거나 또는 AP001657에서의 결실 위치보다 근위에 삽입된다. 또한 다른 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 21번 염색체의 단완에, 예를 들면 21p 영역 내에서, 바람직하게는 21p11.1 영역부터 21p11.2 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 인간 21번 염색체의 단완근위의 21p11.1 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 AL16320l의 위치에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입된다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소 및/또는 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열 및/또는 FRT 서열이다.
제2 양태에서, 본 발명은 상기 인간 인공 염색체(HAC) 벡터를 보유하는 세포를 제공한다. 예를 들어 이러한 세포로는, 포유 동물 세포, 바람직하게는 인간 세포(예를 들면 배아 및 체세포 줄기 세포, 체세포, 정상 체세포, 상피 세포, 신경 세포, 섬유아세포, 양성 또는 악성 종양 세포, 내피 세포, 진피 세포, 기저 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 간질 세포, 골수 세포, 혈구 세포, 지방 세포, 골세포, 연골 세포, 유모 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 양막 세포, 시각 세포, 청각 세포, 후각 세포), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 3T3 세포, BHK 세포, 293 세포, A9 세포 등을 사용할 수 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조 방법을 제공한다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계; 및
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계.
텔로미어 서열과 서브텔로미어 서열을 1개의 서열로 하여 제조한 때에는, 단계 (c) 및 단계 (d)을 1개의 단계로 하여 상기 서열을 상기 결실된 장완 및/또는 단완의 부위에 부가할 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 단계 (a)에서는 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포로서 상동 재조합 효율이 높은 것을 이용한다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 상동 재조합 효율이 높은 세포는 닭 DT40 세포 유래의 것이다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 단계 (b)에서는 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실은, 부위 특이적 재조합 효소를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 부위 특이적 재조합 효소를 이용하여, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 텔로미어 서열 및/또는 서브텔로미어 서열과의 치환에 의해 결실시킬 수 있다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 장완원위를 14q 영역, 바람직하게는 14q11 영역부터 14q12 영역에서 결실시키고, 단완원위를 14p12 영역 내에서 결실시킨다. 또한 더욱 바람직한 실시 형태에서는, 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 장완원위를 AL391156에서 또는 AL391156보다 근위인 위치에서, 구체적으로는 AL391156 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL512310 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL929601 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL589182 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL589743 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL929602 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 AL512624 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 CR383657 내지 CR383659의 사이에서, 더욱 바람직하게는 CR383659 내지 CR383659의 사이에서 결실시킨다. 다른 실시 형태에서, 인간 14번 염색체의 단완원위를 예를 들면 14p 영역 내에서 결실시키고, 바람직하게는 14p11 영역부터 14p12 영역 내에서 결실시키고, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역부터 14p11.2 영역 내에서 결실시키고, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역 내에서 결실시키고, 더욱 바람직하게는 RNR2, PABPCP2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 위치에서 결실시킨다.
다른 실시 형태에 따르면, 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 장완원위를 21q 영역, 바람직하게는 21q11.1 영역에서 21q11.2 영역 내에서 결실시키고, 단완원위를 21p11.1 영역부터 21q11.2 영역 내에서 결실시킨다. 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 장완원위를, 예를 들면, 21q11.1의 NT_011512를 포함하는 영역 내, 바람직하게는 NT_011512 함유 영역 내 중 AL16202를 포함하는 영역 내, 보다 바람직하게는 AL16202 함유 영역 내의 AP001657에서 또는 AP001657보다 근위에서 결실시킨다. 또한, 상기 인간 21번 염색체의 단완원위를, 예를 들면 21p 영역 내에서, 바람직하게는 21p11.1 영역부터 21p11.2 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 21p11.1 영역 내에서, 더욱 바람직하게는 AL163201의 위치에서 결실시킨다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 단계 (b) 및 (c)에서는 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실을 텔로미어 서열과의 치환에 의해 결실시키고, 인간 염색체 단편에 텔로미어 서열을 부가할 수 있다. 다른 실시 형태에 따르면, 단계 (b) 및 (c)에서는 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실을 텔로미어 서열 및 인간 염색체 유래의 서브텔로미어 서열과의 치환에 의해 결실시키고, 인간 염색체 단편에 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가할 수 있다. 상기 인간 염색체 유래의 서브텔로미어 서열은 인간 염색체, 이에 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 인간 14번 염색체 및 인간 21번 염색체에서 유래된 것이 바람직하다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 단계 (b) 및 (c)에서는 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위에서 2개 부위 이상을 절단함으로써, 상기 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키고, 또한 결실된 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가할 수 있다.
다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 단계 (b) 내지 (d)에서는 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위에서 2개 부위 이상을 절단함으로써 상기 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키고, 또한 결실된 장완 및/또는 단완의 부위에 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편 유래의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가한다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열은, 인간 14번 염색체의 14q32 영역 내의 부위부터 14q-tel 영역까지의 서열이다. 더욱 바람직하게는, 인간 14번 염색체의 14q32.33 영역부터 14q-tel 영역까지의 서열이다.
다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 인간 21번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열 및 텔로미어 서열은 인간 21번 염색체의 21q22.3 영역부터 21q-tel 영역 내의 텔로미어 말단까지의 서열 및 텔로미어 서열이다. 서브텔로미어 서열은, 바람직하게는, 인간 21번 염색체의 21q-tel 영역 내의 임의의 부위부터 텔로미어 말단까지의 서열이고, 더욱 바람직하게는 21q-tel 영역 내의 NT_011515부터 텔로미어 말단까지의 서열이다.
구체적인 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 시스템, 예를 들면 Cre-loxP 시스템 또는 FLPe-FRT 시스템의 이용에 의해 기본 골격이 되는 출발 재료인 인간 염색체 유래의 천연 텔로미어 서열 및/또는 서브텔로미어 서열을 남기도록, 장완원위 및/또는 단완원위의 결실을 행한다. 예를 들면, 단계 (b) 내지 (d)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완 q11 영역 내 또는 q11-q12 영역 내에서 장완원위를 결실시키고, 결실된 장완에 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가한다. 인간 14번 염색체의 경우, 예를 들면 14q32 영역 내의 부위부터 14q-tel 영역까지의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가한다. 인간 21번 염색체의 경우, 예를 들면 21q22.3 영역 내의 부위부터 21q-tel 영역까지의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가한다.
상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위의 결실은, 예를 들면, 장완원위 및 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하고, 부위 특이적 재조합에 의해 이들 2개의 인식 부위 사이를 결실시켜 행한다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 장완원위의 14q32 영역보다 원위에 또한 장완근위의 14q11 영역보다 근위에, 더욱 바람직하게는 장완원위의 AB019437보다 원위에 또한 장완근위의 AL391156보다 근위에 삽입된다. 다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 장완원위의 21q22 영역보다 원위에 또한 장완근위의 21q11 영역보다 근위에, 더욱 바람직하게는 장완원위의 21q22.3보다 원위에, 예를 들면 NT_011515의 위치에, 또한 장완근위의 21q11.2보다 근위에, 예를 들면 NT_011512보다 원위에, 바람직하게는 AL16202보다 원위에, 예를 들면 NT_011515의 위치에, 보다 바람직하게는 AP001657의 위치에 또는 AP001657보다 원위에 각각 삽입된다.
다른 바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다. 더욱 바람직한 실시 형태에서는, 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열이다.
또한, 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 단완원위의 결실은, 예를 들면, 단완원위 및 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하고, 부위 특이적 재조합에 의해 이들 2개의 인식 부위 사이를 결실시켜 행한다. 바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 단완원위의 예를 들면 단완 p 영역 내보다 원위에, 바람직하게는 p11 영역 내 또는 p11 영역부터 p12 영역 내보다 원위에, 더욱 바람직하게는 p11 영역 내보다 원위에, 또한 단완근위의 p11 영역 내 또는 p11 영역부터 p12 영역 내보다 근위에 삽입된다.
예를 들면, 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 단완원위의 예를 들면 14p 영역 내보다 원위에, 바람직하게는 14p11 영역부터 14p12 영역 내보다 원위에, 더욱 바람직하게는 14p11 영역 내보다 원위에, 또한 단완근위의 14p11 영역부터 14p12 영역 내보다 근위에, 바람직하게는 14p11 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역부터 14p11.2 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 RNR2, PABPCP2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 위치보다 근위에 삽입된다. 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 경우, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 21번 염색체의 단완의 예를 들면 21p 영역 내보다 원위에, 바람직하게는 21p11.1 영역부터 21p11.2 영역 내보다 원위에, 더욱 바람직하게는 21p11 영역 내보다 원위에, 또한 단완근위의 21p11 영역부터 21p12 영역 내보다 근위에, 바람직하게는 21p11 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 21p11.1 영역부터 21p11.2 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 21p11.1 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 AL163201의 위치보다 근위에 삽입된다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다. 더욱 바람직한 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열이다.
다른 실시 형태에 따르면, 본 발명에 따른 HAC 벡터의 제조 방법은, (e) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 단계 (e)에서는 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다. 다른 실시 형태에 따르면, 단계 (e)에서는 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열이다.
또 다른 실시 형태에서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 예를 들면 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 AL391156에서의 상기 결실 위치 또는 AL391156보다 근위의 위치에, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 단완근위의 14p12 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위의 위치에 삽입할 수 있다.
부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 예를 들면 14q 영역 내에서, 바람직하게는 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 장완근위의 14q11 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에서, 더욱 바람직하게는 AL391156, 더욱 바람직하게는 AL512310, 더욱 바람직하게는 AL929601, 더욱 바람직하게는 AL589182, 더욱 바람직하게는 AL589743, 더욱 바람직하게는 AL929602, 더욱 바람직하게는 AL512624, 더욱 바람직하게는 CR383657, 더욱 바람직하게는 CR383659 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입할 수 있다. 상기 인식 부위는 또한 예를 들면 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 단완근위의 14p 영역 내, 더욱 바람직하게는 인간 14번 염색체의 단완근위의 14p12 영역 내, 더욱 바람직하게는 14p11 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위에 삽입할 수 있다.
다른 실시 형태에 따르면, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 예를 들면 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 AP001657에서의 상기 결실 위치 또는 AP001657보다 근위의 위치에, 더욱 바람직하게는 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 단완근위의 21p11-p12 영역 내에서의 결실 위치보다 근위의 위치에 삽입할 수 있다.
또한 제4 양태에서, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 얻어지는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터를 제공한다.
또한, 제5 양태에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 제조 방법을 제공한다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계; 및
(f) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계.
제6 양태에서 본 발명은 또한 이하의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 제조 방법을 제공한다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열 또는 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(e) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 이용한 것과는 다른 종류의 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편 상의 약제 내성 유전자를 제거하는 단계.
바람직한 실시 형태에서, 인간 염색체는 인간 14번 염색체 및 인간 21번 염색체이다.
일 실시 형태에서, 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소와 그 인식 부위는, Cre 효소와 loxP 서열, 및 FLPe 효소와 FRET 서열이다. 또한 일 실시 형태에서, 약제 내성 유전자는 네오마이신 내성 유전자이다.
상기한 제5 및 제6 양태에 따르면, 외래 DNA의 삽입 위치, 즉 부위 특이적 재조합 효소의 삽입 위치는 상술한 부위 특이적 재조합 효소의 삽입 위치와 동일하다. 예를 들면, 인간 14번 염색체에 대해서는, 장완근위 14q11보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AL391156(GenBank 등록 번호)에서의 상기 결실 위치보다 근위일 수 있다. 또한 인간 14번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 14p12 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위일 수 있다. 그러나, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다. 인간 21번 염색체에 대해서는, 예를 들어, 장완근위의 21q11.2보다 근위, 바람직하게는 21q11.1보다 근위, 보다 바람직하게는 AL16202보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AP001657(GenBank 등록 번호)의 결실 위치일 수 있다. 또한 AP001657에서의 결실 위치보다 근위, 또는 인간 21번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 21p11.2 영역 내에서의 결실 위치보다 근위일 수 있다. 그러나, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다.
바람직한 실시 형태에 따르면, 외래 DNA의 삽입 위치는, 상기 인간 염색체 단편단의 텔로미어 서열로부터 약 1 내지 500 kb이고, 바람직하게는 약 1 내지 300 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 40 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 40 kb이다.
제7 양태에서, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 얻어지는 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터를 제공한다.
제8 양태에서, 본 발명은 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터를 보유하는 세포를 제공한다. 예를 들어, 이러한 세포로는, 포유 동물 세포, 바람직하게는 인간 세포(예를 들면 배아 및 체세포 줄기 세포, 체세포, 정상 체세포, 상피 세포, 신경 세포, 섬유아세포, 양성 또는 악성 종양 세포, 내피 세포, 진피 세포, 기저 세포, 심근 세포, 골격근 세포, 간질 세포, 골수 세포, 혈구 세포, 지방 세포, 골세포, 연골 세포, 유모 세포, 간장 세포, 췌장 세포, 신장 세포, 양막 세포, 시각 세포, 청각 세포, 후각 세포), 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 3T3 세포, BHK 세포, 293 세포, A9 세포 등을 사용할 수 있다.
제9 양태에서, 본 발명은 상기 HAC 벡터 또는 외래 DNA를 포함하는 HAC 벡터를 보유하는 세포를 포함하는 의약 조성물을 제공한다. 이러한 경우, 외래 DNA는, 이하의 것에 한정되지 않지만, 예를 들면 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 폰 빌브랜드 인자(vWF), 디스트로핀, 도파민 합성 효소, 인슐린, 인슐린형 증식 인자(IGF), 인슐린형 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로메라제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 면역 글로블린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나아제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린 뉴클레오티드 포스포릴라아제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M, Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈, 트랜스포밍 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt), 알 스폰딘(R-spondin), 모노클로날 항체, 올리고클로날 항체, 및 폴리클로날 항체 등을 코딩하는 유전자를 들 수 있다.
제10 양태에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는, 외래 DNA를 수용 세포에 도입하는 방법을 제공한다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(f) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(i) 융합한 수용 세포에서 외래 DNA의 도입을 확인하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 상기 수용 세포는 동물 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포이다. 또한, 상기 수용 세포는 다분화능을 갖는 세포, 예를 들면 배아 줄기 세포(ES 세포), 및 간질계 줄기 세포 및 조직 줄기/전구 세포 등일 수도 있다.
제11 양태에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는, 외래 DNA를 발현하는 세포의 제조 방법을 제공한다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(1) 부위 특이적 재조합 효소의 발현 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(i) 융합한 수용 세포에서 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 상기 수용 세포는 동물 세포, 바람직하게는 포유 동물 세포이다. 또한, 상기 수용 세포는 다분화능을 갖는 세포, 예를 들면 배아 줄기 세포(ES 세포), 및 간질계 줄기 세포 및 조직 줄기/전구 세포 등일 수도 있다.
제12 양태에서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는 단백질의 제조 방법을 제공한다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(f) 부위 특이적 재조합 효소의 발현 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 단백질을 코딩하는 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계;
(i) 융합한 수용 세포를 배지 속에서 배양하는 단계; 및
(j) 얻어지는 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계.
본 발명의 일 실시 형태에 따르면, 상기 단백질로는, 예를 들면, 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 제8 인자, 제9 인자, 폰 빌브랜드 인자(vWF), 디스트로핀, 도파민 합성 효소, 인슐린, 인슐린형 증식 인자(IGF), 인슐린형 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로메라제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 면역 글로블린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나아제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린 뉴클레오티드 포스포릴라아제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M, Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈, 트랜스포밍 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt), 알 스폰딘(R-spondin), 모노클로날 항체, 올리고클로날 항체, 및 폴리클로날 항체 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 용어의 정의는 이하와 같다.
본 명세서 중, 「인간 인공 염색체 벡터」 또는 「HAC 벡터」란, 인간 염색체에 기초하여 제조된 인공 염색체를 가리킨다.
또한 본 명세서 중, 「인간 염색체」란, 인간 세포 유래의 천연의 DNA와 단백질의 복합체를 가리킨다. 정상적인 인간 염색체는 23종(수컷은 24종)(즉, 상염색체인 1번 염색체부터 22번 염색체, 및 성염색체인 X 염색체 및 Y 염색체) 46개 존재하고, 각각 약 50 내지 300 Mb의 길이의 DNA를 포함하는 것이 알려져 있다. 또한 「인간 염색체 단편」이란, 독립 염색체로서 안정적으로 복제 및 분배가 가능한 염색체의 부분 단편을 가리키고, 단편의 크기는 통상 1 Mb 이상이지만, 그 이하인 경우도 있다.
본 명세서 중, 염색체에 대해서「장완」 및 「단완」이란, 염색체 상의 센트로미어 양측의 팔(arm)을 가리키고, 그 길이에 따라서 장완(q) 및 단완(p)이라 칭해진다. 또한 인간 염색체에 대해서 「장완원위」 및 「장완근위」란, 장완 상의 센트로미어로부터 먼 위치(즉 텔로미어측)에 있는 영역(원위) 및 센트로미어에 근접하는 영역(근위)를 의미한다. 구체적으로는, 인간 14번 염색체의 경우에는 장완원위는 AL359218보다 텔로미어측, 장완근위는 AL391156보다 센트로미어측이고, 인간 21번 염색체의 경우에는 장완원위는 21q22.2보다 텔로미어측이고, 장완근위는 21q11.2이다. 또한 「단완원위」 및 「단완근위」란, 단완 상의 센트로미어로부터 먼 위치에 있는 영역(원위) 및 센트로미어에 근접하는 영역(근위)를 의미한다. 예를 들면, 인간 14번 염색체의 경우에는 리보솜 RNA 영역에서 경계가 있다.
본 명세서 중, 「부위 특이적 재조합 효소」 및 「부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위」란, 어떤 효소가 특정한 인식 부위를 인식하여 특이적으로 그 인식 부위에서 DNA의 재조합을 일으키는 현상에 대해서 이용되는 용어이고, 각각 그 부위 특이적으로 재조합을 일으키는 효소 및 이 효소에 의해 인식되는 부위를 가리킨다.
본 명세서 중, 「텔로미어 서열」이란, TTAGGG의 반복 서열(TTAGGG)n을 갖는 서열을 가리킨다. 텔로미어 서열의 길이는, 약 0.4 내지 50 kb이고, 바람직하게는 약 0.4 내지 25 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 0.4 내지 15 kb이다. 상기 텔로미어 서열은 화학적으로 합성되거나 또는 인공적으로 생성된 것이거나, 염색체에서 유래되는 것일 수도 있다.
본 명세서 중, 「서브텔로미어 서열」이란, 진핵 세포 중의 염색체 말단의 텔로미어(TTACGG)n의 반복 서열의 센트로미어측에 인접하여 위치하고, 분절/중복 도메인이나(TTAGGG)n형의 반복 서열을 갖고, 약 300 내지 500 kb에 걸치는 염색체 영역을 가리킨다. 서브텔로미어 서열은, 임의의 염색체에서 유래되는 서브텔로미어 서열의 전체 또는 일부일 수도 있고, 또는 임의의 염색체에서 유래되는 복수의 서브텔로미어 서열이 결합된 것일 수도 있고, 또는 임의의 염색체에서 유래되는 서브텔로미어 서열에 다른 서열이 부가된 것일 수도 있다. 본 발명에서는, 예를 들면 부위 특이적 재조합을 이용한 텔로미어 말단절단(truncation)이나 전좌에 의한 텔로미어 서열 또는 서브텔로미어 서열의 부가를 행할 수 있다.
본 명세서 중, 「외래 DNA」란, 대상으로 하는 세포에서 외부로부터 도입되는 DNA를 가리키고, 물질 생산, 질환 치료 및 기능 개질 또는 기능 분석 등을 위해 발현시키는 것이 요구되는 유전자 및 그 밖의 기능 서열(예를 들면 프로모터 서열) 등을 코딩하는 DNA를 의미하고, 동종 또는 이종 모두 가능하다.
본 명세서 중, 「세포」란, 생물 개체 또는 조직에서 유래되는 세포를 가리킨다. 예를 들면, 체세포, 정상 체세포, 생식 세포, 체세포 줄기 세포, 종양 세포, 불사화 세포주, 배아 줄기 세포(ES 세포), 배아 생식 세포(EG 세포), 배아 종양 세포(EC 세포), 정자 유래 줄기 세포(GS 세포) 등을 의미하고, 동종 또는 이종 중의 어느 것이어도 되고, 인간 유래의 상기 세포(즉, 인간 세포)일 수도 있다.
본 명세서 중, 「공여 세포」 및 「수용 세포」란, 인간 인공 염색체 벡터를 도입 또는 도입하는 경우에, 최초에 상기 벡터를 보유하는 세포(즉, 공여 세포)와, 공여 세포로부터 상기 벡터가 도입되는 세포(즉, 수용 세포)를 가리킨다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2006-188392호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 인간 14번 염색체 유래의 HAC 벡터의 구조의 개요를 도시한다. 도면 중, 「14A」는 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실되고, 텔로미어 서열이 부가된 HAC 벡터의 개요를 나타내고, 「14N」은 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실되고, 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체 유래의 약 25 kb의 서브텔로미어 서열을 함유하는 HAC 벡터의 개요를 나타내고, 「14gN」은 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실되고, 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체 유래의 약 60 Kb의 서브텔로미어 서열을 함유하는 HAC 벡터의 개요를 나타낸다.
도 2는 텔로미어 말단절단용 벡터 pTELpuro-t1의 구조를 도시한다. 도면 중, tel은 텔로미어측을, cen은 센트로미어측을 나타낸다. 또한 puro는 푸로마이신 유전자를 나타내고, Tel 서열은 텔로미어 서열을 나타내고, 서열 중 검은 화살표는 반복 서열을 나타낸다.
도 3은 인간 염색체 14q에의 pTELpuro-t1 벡터 도입에 대한 PCR 해석 결과를 도시한다.
도 4는 인간 염색체 14q에의 pTELpuro-t1 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 5는 인간 염색체 14q에의 pTELpuro-t1 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던(Southern) 해석 결과를 도시한다.
도 6은 인간 염색체 14q에의 pTELpuro-t1 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. (A) 인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포. (B) 장완 결실된 인간 14번 염색체 단편을 보유하는 DT40 잡종 세포.
도 7은 loxP 및 3'neo 서열 삽입용 t1pSF1 벡터의 구조를 도시한다. 도면 중, Ori는 복제 개시점, Apr은 암피실린 내성 유전자, Sv40pA는 SV40 폴리 A를 각각 나타낸다.
도 8은 14AΔqHAC에의 t1pSF1 벡터 도입에 대한 PCR 해석 결과를 도시한다.
도 9는 14AΔqHAC에의 t1pSF1 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 10은 14AΔqHAC에의 t1pSF1 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 11은 14AΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 12는 14AΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 12의 A는 FISH상을 도시하고, 도 12의 B는 14AΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 13은 14ΔqHAC 벡터(14AΔqHAC, 14NΔqHAC(G), 14gNΔqHAC(g)), 및 21ΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 비선택 조건 하에서의 장기 안정성 해석 결과를 도시한다.
도 14는 hEPO 유전자 도입에 의해 생기는 14HAC 벡터의 대립 유전자를 도시한다. 도면 중, hEPO는 인간 에리트로포이에틴유전자, CMV는 사이토메갈로바이러스 프로모터를 나타낸다.
도 15는 hEPO 유전자 도입 14AΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 16은 hEPO-14AΔqHAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포에서의 hEPO 유전자 발현을 도시한다.
도 17은 hEPO-14AΔqHAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 17의 A는 FISH상을 도시하고, 도 17의 B는 hEPO-14AΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 18은 hEPO-14AΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 발현/안정성 해석 결과를 도시한다.
도 19는 hEPO-14A/N/gNΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 서던 해석 결과를 도시한다. (A)는 hEPO-14AΔqHAC를 나타내고, (B)는 hEPO-14NΔqHAC를 나타내고, (C)는 hEPO-14gNΔqHAC를 나타낸다.
도 20은 hEPO-14AΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포: FISH 해석 결과를 도시한다. 도 20의 A는 FISH상을 도시하고, 도 20의 B는 hEPO-14AΔqHtAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 21은 hEPO-14A/N/gNΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에서의 hEPO 유전자 발현을 도시한다.
도 22는 인간 14번 염색체 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxpPGK-14qtel의 구조를 도시한다.
도 23은 인간 염색체 14q에의 ploxpPGK-14qtel 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 24는 인간 염색체 14q에의 ploxpPGK-14qtel 벡터 도입에 대한 PCR 해석 결과를 도시한다.
도 25는 인간 염색체 14q에의 ploxpPGK-14qtel 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 26은 인간 14번 염색체 장완근위 센트로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxPHYGOR/n1의 구조를 도시한다.
도 27은 인간 염색체 14q에의 ploxPHYGOR/n1 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 28은 인간 염색체 14q에의 ploxPHYGOR/n1 벡터 도입에 대한 PCR 해석 결과를 도시한다.
도 29는 인간 염색체 14q에의 ploxPHYGOR/n1 및 ploxpPGK-14qtel 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 30은 Cre-loxP 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 염색체 14q 원위 결실로 생기는 염색체 대립 유전자(도 30의 A: G/n1; 도 30의 B: g/n1)를 나타낸다.
도 31은 14NΔqHAC 보유 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 32는 14NΔqHAC 보유 DT40 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 32의 A는 G94n56 세포, 도 32의 B는 G94n56Δp25 세포에서의 FISH상을 도시한다.
도 33은 loxP 및 3'neo 서열 삽입용 pSF1(G+n1) 벡터의 구조를 도시한다.
도 34는 14NΔqHAC에의 pSF1(G+n1) 또는 GnpSF1-FRT 벡터 도입(A), 및 14gNΔqHAC에의 pSF1(g+n1) 또는 gnpSF1-FRT 벡터 도입(B)에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 35는 14NΔqHAC에의 pSF1(G+n1) 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 36은 14NΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 37은 14NΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 37의 A는 FISH상을 도시하고, 도 37의 B는 14NΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 38은 hEPO 유전자 도입 14NΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 39는 hEPO-14AΔqHAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 39의 A는 FISH상을 도시하고, 도 39의 B는 hEPO-14AΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 40은 hEPO-14NΔqHAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포에서의 hEPO 유전자 발현을 도시한다.
도 41은 hEPO-14NΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 발현/안정성 해석 결과를 도시한다.
도 42는 hEPO-14NΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 42의 A는 FISH상을 도시하고, 도 42의 B는 hEPO-14NΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 43은 hEPO-14ΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포에서의 장기간 hEPO 유전자 발현을 도시한다.
도 44는 인간 14번 염색체 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxpPGK-14qtel-2의 구조를 도시한다.
도 45는 인간 염색체 14q에의 ploxpPGK-14qtel-2 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 46은 인간 염색체 14q에의 ploxpPGK-14qtel-2 벡터 도입에 대한 PCR 해석 결과를 도시한다.
도 47은 인간 염색체 14q에의 ploxpPGK-14qtel-2 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 48은 인간 염색체 14q에의 ploxPHYGOR/n1 및 ploxpPGK-14qtel-2 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 49는 14gAΔqHAC 보유 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 50은 14gNΔqHAC 보유 DT40 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 50의 A는 FISH상을 도시하고, 도 50의 B는 14gNΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 51은 loxP 및 3'neo 서열 삽입용 pSF1(g+n1) 벡터의 구조를 도시한다.
도 52는 14gNΔqHAC에의 pSF1(g+n1) 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 53은 14gNΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 54는 14gNΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 54의 A는 FISH상을 도시하고, 도 54의 B는 14gNΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 55는 hEPO 유전자 도입 14gNΔqHAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 56은 hEPO-14gNΔqHAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 56의 A는 FISH상을 도시하고, 도 56의 B는 hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 57은 hEPO-14gNΔqHAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포에서의 hEPO 유전자 전자 발현을 도시한다.
도 58은 hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 발현/안정성 해석 결과를 도시한다.
도 59는 hEPO-14gNΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 59의 A는 FISH상을 도시하고, 도 59의 B는 hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 60은 FLP-FRT에 의한 neo 내성 유전자 유닛의 제거의 개요를 도시한다.
도 61은 14AΔqHAC에의 t1pSF1-FRT 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 62는 14AΔqHAC에의 t1pSF1-FRT 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 63은 14AΔqF-HAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 64는 14AΔqF-HAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다.
도 65는 hEPO 유전자 도입에 의해 생기는 14AΔqF-HAC 벡터의 대립 유전자를 도시한다.
도 66은 hEPO 유전자 도입 14AΔqF-HAC 벡터 도입 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 67은 hEPO-14AΔqF-HAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 67의 A는 FISH상을 도시하고, 도 67의 B는 hEPO-14AΔqF-HAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 68은 neo 내성 유전자 유닛의 제거에 의해 생기는 14AΔqF-HAC 벡터 상의 대립 유전자를 도시한다.
도 69는 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 70은 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터 보유 CHO 잡종 세포의 FISH 해석 결과를 도시한다. 도 70의 A는 FISH상을 도시하고, 도 70의 B는 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터의 핵형을 도시한다.
도 71은 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터 보유 인간 정상 섬유아세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 72의 A 및 B는 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터 보유 인간 정상 섬유아세포의 FISH 해석 결과를 도시한다.
도 73은 FRT 서열 도입용 벡터 GnpSF1-FRT의 구조를 도시한다.
도 74는 14NΔqHAC에의 GnpSF1-FRT 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다.
도 75는 FRT 서열 도입용 벡터 gnpSF1-FRT의 구조를 도시한다.
도 76은 14gNΔqHAC에의 gnpSF1-FRT 벡터 도입 DT40 잡종 세포의 서던 해석 결과를 도시한다. ·
도 77은 21HAC 벡터의 구축을 도시한다. 상측의 도면은 텔로미어 말단절단에 의한 21AΔqHAC의 제조 절차를 도시하고, 또한 하측의 도면은 Cre-loxP에 의한 결실을 이용한 21NΔqHAC의 제조 절차를 도시한다.
도 78은 인간 21번 염색체 상의 장완 AP001657에서 loxP 서열을 삽입하는 방법의 개략을 도시한다.
도 79는 인간 21번 염색체 상의 장완 AP001657에서 부위 특이적 절단을 행하는 방법의 개략을 도시한다.
도 80은 loxP 및 3'neo 및 FRT 서열 삽입용 pSF1(FRT)-C 벡터를 도시한다.
도 81은 21AΔqHAC에의 pSF1(FRT)-C 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다. 도면 중, 5'HPRT은 5'히폭산틴구아닌포스포리보실트랜스페라제를 나타내고, Hyg는 하이그로마이신 유전자를 나타내고, Tk는 티미딘 키나아제 유전자를 나타낸다. FRT는 FLP 리콤비나아제 타겟을 나타내고, BS는 블라스티사이딘 내성 유전자를 나타내고, Apr은 암피실린 내성 유전자를 나타낸다.
도 82는 FLP-FRT에 의한 neo 내성 유전자 유닛의 제거를 도시한다.
도 83은 인간 21번 염색체 상의 장완 NT_011515에서 loxP 서열을 삽입하는 방법의 개략을 도시한다.
도 84는 Cre 벡터 도입에 의해 생기는 장완이 결실된 인간 21번 염색체 상의 대립 유전자를 도시한다.
도 85는 loxP 및 3'neo 및 FRT 서열 삽입용 pSF1(FRT)-D 벡터를 도시한다.
도 86은 21NΔqHAC에의 pSF1(FRT)-D 벡터 도입에 의해 생기는 대립 유전자를 도시한다.
도 87은 EPO의 생체내 약효의 경시 변화를 도시하는 그래프이다. 도 87의 A는 적혈구(RBC)수를 도시하고, 도 87의 B는 헤모글로빈(HGB)수를 도시하고, 도 87의 C는 헤마토크릿(HCT)치를 도시한다. 또한, 도면 중, 마름모형은 CMV(사이토메갈로바이러스 프로모터 지배 하에 hEPO 유전자를 도입한 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 클론 t7S38-8E5)의 평균(N=3; 28주: N=2; 32주 이후: N=1), 사각형은 대조군(sham operation)의 평균(N=3; 20주, 28주 및 44주 N=2)을 각각 나타낸다.
도 88은 EGFP-14HAC 벡터의 PCR 해석 결과를 개략적으로 도시한다. 도 88의 A는 인간 14번 염색체 벡터에 EGFP(고감도 녹색 형광 단백질; enhanced green fluorescent protein) 유전자를 도입하여 얻어진 EGFP-14HAC 벡터의 구조를 도시한다. 도 88의 B는 14AΔq-HAC 벡터 및 의 14NΔq-HAC 벡터의 센트로미어측 및 텔로미어측에서의 인간 마커의 유무를 도시한다.
도 89는 pLN1IRESEGFP을 CHO 잡종 세포주에 도입(+)했을 때, 또는 비도입(-)했을 때의, 서던 블롯 해석에 의한 단편 크기와 벡터 상의 위치와의 관계를 도시한다.
도 90은 EGFP-14AΔq-HAC 벡터 또는 EGFP-14NΔq-HAC 벡터를 보유하는 다양 한 ES 클론으로부터 제조된 키메라 마우스에서의, HAC의 보유를 PCR로 판정한 결과를 도시한다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 인간 인공 염색체 벡터(이하, 「본 HAC 벡터」라고도 함)에 관한 것으로, 상기 HAC 벡터는 인간 염색체에 기초하여 제조되고, 장완원위 및/또는 단완원위가 결실되고, 또한 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 포함하는, 특히 서브텔로미어 서열을 포함하는, 인간 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.
본 발명에서, 인간 염색체의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 인간 1번 염색체부터 22번 염색체, X 염색체 및 Y 염색체로 이루어지는 군에서 선택된다. 또한, 본 발명에서, 인간 염색체 중의 다형 등의 변이는 허용의 범위 내이다. 후술한 실시예에서는, 인간 14번 염색체 및 인간 21번 염색체를 예시하고, 이들 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편으로부터의 인간 인공 염색체 벡터의 제조를 설명한다. 이하에 기재되는 방법, 수단 등은, 그 밖의 인간 염색체에도 마찬가지로 적용하여 본 발명의 인간 인공 염색체 벡터를 제조하는 것을 가능하게 한다.
이하, 본 HAC 벡터의 제조, 벡터에의 외래 DNA의 삽입, 및 본 HAC 벡터의 용도에 대해서 기재한다.
1. 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조
본 HAC 벡터는 상술한 바와 같이인간 염색체에 기초하여 제조한다. 본 HAC 벡터의 제조에는, 이하의 (a) 내지 (d)의 단계가 포함된다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계; 및
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계.
또한, 본 HAC 벡터의 제조는, 이하의 단계 (e):
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계를 포함할 수도 있다.
여기서, 상기 단계 (b), (c) 및 (d)의 순서, 및 상기 단계 (b), (c), (d) 및 (e)의 순서는 특별히 한정되는 것은 아니다.
단계 (a): 인간 염색체를 보유하는 세포의 제조
본 HAC 벡터의 제조에서는, 인간 염색체(예를 들면 인간 14번 염색체 및 인간 21번 염색체를 포함하는 모든 인간 상염색체) 또는 그 단편을 보유하는 세포를 제조한다. 인간 염색체 또는 그 단편만을 보유하고, 또한 그 후의 조작을 위해 상동 재조합율이 높은 세포가 바람직하다. 따라서 본 발명에서는 우선 이들 조건을 만족시키는 세포를 제조한다.
인간 염색체를 보유하는 세포는, 예를 들면, 인간 단일 염색체를 보유하는 공지된 마우스 A9 잡종 세포 라이브러리로부터 인간 염색체를 보유하는 클론을 선택하고, 그 염색체를 상동 재조합율이 높은 세포에 도입함으로써 제조할 수 있다. 마우스 A9 잡종 세포 라이브러리는, 약제 내성 유전자로 표지된 인간 단일 염색체를 보유하는 것이고, 예를 들면, WO00/10383호, Tanabe, H. 등(Chromosome Res., 8: 319-334, 2000) 등에 기재되어 있다. 예를 들면 인간 14번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포는, Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)에 JCRB2214(세포명 A9(Hygro14))로서 등록되어 있고, 그 상세한 정보·배양법 등도 입수 가능하다.
상술한 바와 같이 입수한 마우스 A9 잡종 세포에 보유되는 인간 염색체를 상동 재조합율이 높은 세포에 도입한다. 여기서「상동 재조합율이 높은 세포」란, 그 세포에서 상동 재조합하여 조작을 행했을 때에, 상동 재조합이 빈도가 높은 세포를 가리키고, 그와 같은 세포로는, 예를 들면, 닭 DT40 세포(Dieken 등, Nature Genetics, 12: 174-182, 1996), 마우스 ES 세포(아이자와 신이찌, 바이오메뉴얼 시리즈 8, 진타겟팅, 요도샤, 1995), 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 조작의 간편성 등 면에서, 본 발명에서는 닭 DT40 세포를 이용하는 것이 바람직하다.
염색체의 도입은 당 기술분야에서 공지된 염색체 도입법에 따라서 행할 수 있다. 예를 들면, 원하는 염색체를 1개만 도입하는 방법으로서, Koi 등(Jpn. J. Cancer Res., 80: 413-418, 1973)에 기재되어 있는 마이크로셀 매개 유전자 전이법을 들 수 있다. 이 방법은, 어느 종류의 세포에서 방추체 형성을 저해하는 약제에 의해 유도되는 마이크로셀을 분리하고, 이것을 수용 세포와 융합함으로써, 소수의 염색체를 도입한다고 하는 것이다. 이 마이크로셀법을 이용하여 인간 염색체를 도입하는 구체적인 조작 수순에 대해서는, 예를 들면 WO97/07671호 및 WO00/10383호를 참조하길 바란다. 이상과 같이 하여 인간 염색체를 보유하는 세포를 제조할 수 있다.
다르게는, 전장의 인간 염색체가 아니고, 부분 단편화한 염색체, 예를 들면 인간 14번 염색체의 부분 단편(SC20)을 보유하는 세포를 사용하는 것도 가능하다(SC20; 토미즈까 등, P.N.A.S., 97: 722-727, 2000년). SC20은 인간 14번 염색체의 장완원위 및 장완근위의 많은 부분을 결실하고 있는 것이 보고되어 있다(Tomizuka 등, P.N.A.S., 97: 722-727, 2000년; Kuroiwa 등, Nature Biotech. (USA), 제18권, p.1086-1090, 2000년). 구체적으로는, SC20은 인간 14번 염색체 장완의 텔로미어 서열로부터 AL137229(GenBank 등록 번호)를 포함하는 영역, 및 이것보다 더 센트로미어측의 AL121612(GenBank 등록 번호)부터 AL157858(GenBank 등록 번호)의 텔로미어측부터 24-26 kb까지를 포함하는 영역을 보유하고 있다. 또한, AL137229(GenBank 등록 번호)와 AL121612(GenBank 등록 번호) 사이의 영역, 및 AL157858(GenBank 등록 번호)의 텔로미어측 24-26 kb로부터 센트로미어 사이의 영역을 결실하고 있다. 한편, SC20에서 인간 14번 염색체의 단완 영역은 보유되어 있다. SC20의 문제점은, 14번 염색체 14q32 영역의 유전자를 복수 포함하고 있다는 점인데, 본 명세서에 기재된 방법으로 SC20를 축소화함으로써, 여러가지 세포종에서 안정적으로 유지되고, 또한 여분의 유전자를 포함하지 않는 HAC 벡터를 얻을 수 있다. 또한, SC20 염색체 단편을 보유하는 닭 DT-40세포(SC20)는, 독립 행정 법인 산업 기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반지 1 쮸오 다이 6)에 2001년 5월 9일자로 국제 기탁되어, 수탁 번호 FERMBP-7583가 주어져 있다.
단계 (b): 인간 염색체의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실
단계 (c): 텔로미어 서열의 부가
단계 (d): 서브텔로미어, 서열의 부가
HAC 벡터의 제조에서는, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포에서, 해당 염색체 또는 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시킨다. 염색체의 결실은, 당 기술분야에서 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면 부위 특이적 재조합 효소계를 이용하여 행할 수 있다. 또한 본 HAC 벡터의 제조에서는 염색체 또는 염색체 단편의 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열의 부가 및 서브텔로미어 서열을 부가하지만, 이것도 예를 들면 부위 특이적 재조합 효소계를 이용하여 행할 수 있다. 부위 특이적 재조합 효소계의 사용은, 당 기술분야에서 주지이고, 예를 들면 후술하는 단계 (e)의 항에 예시되는 부위 특이적 재조합 효소와 그 인식 부위를 사용할 수 있다. 예를 들면 바람직한 실시 형태에서는, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열이다. 다른 바람직한 실시 형태에서는, 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열이다.
단계 (b) 내지 (d)의 순서는 특별히 한정되는 것이 아니다. 예를 들면 장완 원위 및/또는 단완원위를 결실시킨 후, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가할 수 있다. 다르게는, 텔로미어 서열과의 치환에 의해서 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시킨 후, 서브텔로미어 서열을 삽입할 수 있다. 또한, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열과의 치환에 의해서 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시킬 수도 있다. 이들 단계의 순서는, 목적으로 하는 본 HAC 벡터가 최종적으로 얻어지는 것이면, 임의의 순서로 또한 임의로 반복하여 실시할 수 있다.
장완원위 및/또는 단완원위의 결실은, 그 결과 얻어지는 인간 염색체 단편의 크기가, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 포함해서, 통상 약 1 Mb 이상, 예를 들면 약 1 Mb 이상 약 19 Mb 이하가 되도록, 바람직하게는 약 18 Mb 이하, 더욱 바람직하게는 약 17 Mb 이하가 되도록 행한다.
인간 염색체 단편의 장완 및/또는 단완의 부위에 부가되는 텔로미어 서열은 TTAGGG 등의 반복 서열을 갖는 염기 서열로 이루어지는 것이면 어느 것이어도 된다. 텔로미어 서열은, 예를 들면, TTAGGG의 반복 서열에 기초하여 화학적으로 합성할 수도 있고, 또는 임의의 염색체(예를 들면 인간 염색체)로부터 공지된 방법을 이용하여 제조하는 것도 가능하다. 부가되는 텔로미어 서열의 길이는, 약 0.4 내지 50 kb이고, 바람직하게는 약 0.4 내지 25 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 0.4 내지 15 kb이다.
또한 인간 염색체 단편의 장완 및/또는 단완의 부위에 부가되는 서브텔로미어 서열은, 포유 동물 염색체 유래의 서브텔로미어 서열, 바람직하게는 인간 염색체 유래의 서브텔로미어 서열, 보다 바람직하게는 인간 상염색체 유래의 서브텔로 미어 서열, 예를 들면 인간 14번 염색체 또는 인간 21번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열이다. 인간 염색체 유래의 서브텔로미어 서열을 이용하는 경우, 임의의 염색체의 장완 및/또는 단완 유래의 서브텔로미어 서열을 사용할 수 있다. 인간 염색체 상의 서브텔로미어에 대해서는, Linardopoulou EV 등, Nature, 제437권, p.94-100, 2005년, Riethman H 등, Chromosome Res., 제13권, p.505-515, 2005년, Mefford H. C. 등, Nat Rev Genet., 제3권, p.91-102, 2002년 등의 문헌에, 그 상세한 구조, 길이 등이 기재되어 있다. 당업자는 이들 문헌의 기재에 기초하여 바람직한 서브텔로미어 서열을 선택하여 설계할 수 있다.
부가되는 서브텔로미어 서열의 길이는, 약 1 내지 500 kb이고, 바람직하게는 약 1 내지 300 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 40 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 40 kb이다. 또한 사용하는 서브텔로미어 서열은, 임의의 인간 염색체에 존재하는 서브텔로미어 영역의 전체일 수도 있고, 그 일부일 수도 있다. 본 HAC 벡터에서는, 세포 내에서의 안정성 등을 고려하여 서브텔로미어 서열은 약 5 내지 60 kb의 일부를 이용하는 것이 바람직하다. 서브텔로미어 서열은, 임의의 인간 염색체로부터 공지된 방법, 예를 들면 부위 특이적 재조합 효소계의 이용과 같은 방법을 이용하여 입수할 수 있다. 바람직하게는, 인간 염색체 단편은 인간 염색체의 장완원위가 결실된 부위에 부가 또는 결합된 상기 인간 염색체와 동일하거나 상이한 (바람직하게는 동일한) 인간 염색체의 장완 유래의 서브텔로미어 서열을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서는, 인간 14번 염색체 단편은 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실된 부위에 부가 또는 결합된, 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체의 장완 유래의 서브텔로미어 서열을 포함한다. 인간 14번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열은, 예를 들면 인간 14번 염색체의 14q32 영역보다 원위의 부분(즉 14q-tel 영역까지의 부분)이다. 구체적으로는, 인간 14번 염색체의 14q32.33 영역, 혹은 인간 14번 염색체의 AB019439부터 AB019437 사이, AB019438부터 AB019437 사이, 바람직하게는 AB019437에서의 위치보다 원위의 부분의 서브텔로미어 서열이다.
다른 바람직한 실시 형태에서는, 인간 21번 염색체 단편은 인간 21번 염색체의 장완원위가 결실된 부위에 부가 또는 결합된, 텔로미어 서열 및 인간 21번 염색체의 장완 유래의 서브텔로미어 서열을 포함한다. 인간 21번 염색체 유래의 서브텔로미어 서열은, 예를 들면 인간 21번 염색체의 21q22.3 영역보다 원위의 부분, 예를 들면 21q-tel 영역 내의 NT_011515부터 텔로미어 말단까지의 서열이다. 또한, 텔로미어 말단이란 염색체로부터 이어지는 텔로미어의 끝의 부분을 말하며, 염색체의 말단(염색체 말단)과 동일 의미이다. 텔로미어 서열은 텔로미어 말단을 당연히 포함한다.
예를 들면, 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실은, WO00/10383호에 기재되어 있는 텔로미어 서열과의 치환(텔로미어 말단절단)에 의해 행할 수 있다. 또한 동일하게 하여, 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실은, 텔로미어 서열과의 치환에 의해서 행할 수 있다. 보다 구체적으로, 단계 (b) 및 (c)에서 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위 및/또 는 단완원위를 텔로미어 서열과 치환함으로써, 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가한다. 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키기 위한 구체적인 절차는, 예를 들면, 인간 염색체를 보유하는 세포에서, 텔로미어 서열을 보유하는 타겟팅 벡터를 구축하고, 상동 재조합에 의해 염색체 상의 원하는 위치에 텔로미어 서열의 삽입된 클론을 취득한 후, 텔로미어 말단절단에 의한 결실 변이체를 얻는 것이다(Itzhaki 등, Nature Genet., 제2권, p283-p287, 1992년, 및 Brown 등, P.N.A.S., 제93권, p7125-7130, 1996년 참조). 여기서 염색체의 원하는 위치란 결실 대상의 장완원위 또는 단완원위의 절단 위치이고, 이 위치에 텔로미어 서열이 상동 재조합에 의해 치환 및 삽입되고, 장완원위 또는 단완원위가 결실된다(텔로미어 말단절단). 원하는 위치는 타겟팅 벡터를 구축할 때에 표적서열의 설계에 의해 적절하게 설정할 수 있다.
예를 들면 인간 14번 무손상 염색체의 장완 서열을 결실시키는 경우를 참조하여 들어 설명한다.
인간 14번 염색체의 장완 14q 영역 내, 바람직하게는 14q11 영역 내, 더욱 바람직하게는 AL391156으로부터 CR383659(GenBank 등록 번호)의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계하고, 그 표적 서열보다 텔로미어측에서 텔로미어 말단절단이 발생하도록 한다. 따라서, 표적 서열을 설정한 영역에서 장완원위를 절단, 결실시킬 수 있다. 표적 서열의 설계는 인간 14번 염색체의 장완이 AL391156에서 또는 AL391156보다 근위인 위치에서 결실되도록 한다. 구체적으로, 표적 서열의 설계는 AL391156 내지 CR383659의 사이, 보다 바람직하게는 AL512310 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL929601 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL589182 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL589743 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL929602 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 AL512624 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 CR383657 내지 CR383659의 사이, 더욱 바람직하게는 CR383659의 염기 서열에 기초하여 행해진다. 또한 예를 들면 단완원위를 결실시키는 경우에는, 인간 14번 염색체 상의 예를 들면 14p 영역 내, 바람직하게는 14p11 영역부터 14p12 영역 내, 바람직하게는 14p11 영역 내, 더욱 바람직하게는 RNR2, 더욱 바람직하게는 PABPCP2(미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 게놈 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI))의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계할 수 있다. 인간 14번 염색체의 서열 정보는, 센트로미어 영역을 제외하는 장완 전체에 대해서 염기 서열이 상기한 데이터베이스 상에 공개되어 있다(또한, 도 1 참조). 표적 서열의 설계는 상술한 영역에 한정되지 않고, 당업자이면 원하는 HAC 벡터를 제조하도록 적절하게 설계하는 것이 가능하다.
예를 들면, 인간 14번 염색체의 장완 서열을 SC20보다 센트로미어측에 결실시키는 경우, AL157858의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계하고, 그 표적 서열보다 텔로미어측에서 텔로미어 말단절단이 발생하도록 한다. 따라서, 표적 서열을 설정한 영역에서 장완원위를 절단 또는 결실시킬 수 있다. 예를 들면, 단완원위를 결실시키는 경우, 인간 14번 염색체 상의 14p 영역 내, 바람직하게는 14p11 영역부터 14p12 영역 내, 더욱 바람직하게는 14p11 영역 내, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역부터 14p11.2 영역 내, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역 내, 보다 더욱 바람직하게는 RNR2, 더욱 바람직하게는 PABPCP2(미국 National Centerfor Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 게놈 데이터베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI))의 염기 서열에 기초하여 표적 서열을 설계할 수 있다. 표적 서열의 설계는 상술한 영역에 한정되지 않고, 당업자라면 원하는 HAC 벡터를 제조하도록 적절하게 설계하는 것이 가능하다.
별도의 방법으로서, 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실은, 예를 들면 Zheng B. 등, Mol Cell Biol., 제20권, p648-p655, 2000년에 기재되어 있는 바에 따를 수 있다. 즉, 2개 부위의 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위 사이를 결실시켜, 상기 장완원위 및/또는 단완원위의 결실이 기본 골격이 되는 출발 재료의 인간 염색체 또는 그 단편 유래의 서브텔로미어 서열을 남기고, 텔로미어 서열을 부가하도록 행하는 것이 바람직하다. 더욱 구체적으로, 단계 (b) 및 (c)에서는, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위에서 2개 부위 이상을 절단 및 결실시킴으로써, 상기 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키고, 또한 결실된 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가할 수 있다. 또한, 단계 (b) 내지 (d)에서 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위 및/또는 단완원위 상의 2개 부위 이상을 절단 및 결실시킴으로써, 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시킴과 함께, 결실된 장완 및/또는 단완 의 부위에 텔로미어 서열 또는 텔로미어 서열 및 해당 인간 염색체 유래의 서브텔로미어 서열을 부가한다.
장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키기 위한 구체적인 절차는, 예를 들면, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포에서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 보유하는 타겟팅 벡터를 구축하고, 상동 재조합에 의해 염색체 상의 원하는 위치에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위의 삽입된 클론을 취득한 후, 부위 특이적 재조합 효소에 의한 재조합 반응에 의해 결실 변이체를 얻는 것이다. 여기서 염색체의 원하는 위치란, 결실 대상의 장완원위 및 장완근위 또는 단완원위 및 단완근위의 절단 위치이고, 이 위치에 부위 특이적 서열이 상동 재조합에 의해 치환 및 삽입되고, 장완원위 또는 단완원위가 결실된다. 원하는 위치는, 타겟팅 벡터를 구축할 때에 표적 서열의 설계에 의해 적절하게 설정할 수 있다.
예를 들면, 상기 인간 염색체 또는 그 단편의 장완원위의 결실은, 장완원위 및 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하고, 부위 특이적 재조합에 의해 이들 2개의 인식 부위 사이를 결실시켜 행한다. 또한 본 발명의 다른 실시 형태에서는, 상기 장완원위 및/또는 단완원위의 결실이 기본 골격이 되는 출발 재료의 염색체 유래의 텔로미어 서열 또는 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 남기도록 행해진다. 예를 들면, 상기 인간 14번 염색체의 장완원위의 결실은, 장완원위 및 근위에 적어도 2개의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하고, 부위 특이적 재조합에 의해 2개의 인식 부위 사이를 결실시켜 행한다. 바람직한 실시 형태에서는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 인간 14번 염색체의 장 완원위의 14q32 영역보다 원위에 및 장완근위의 14q11 영역보다 근위에, 더욱 바람직하게는, 인간 14번 염색체의 장완원위의 AB019437보다 원위에 및 장완근위의 AL391156보다 근위에 삽입된다.
예를 들면, 상기 인간 14번 염색체의 단완원위의 결실은, 단완원위 및 근위에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하고, 부위 특이적 재조합에 의해 이들 2개의 인식 부위 사이를 결실시켜 행한다. 바람직한 실시 형태에서는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는 인간 14번 염색체의 단완원위의 예를 들면 14p 영역 내보다 원위에, 바람직하게는 14p12 영역 내보다 원위에, 더욱 바람직하게는 14p11 영역 내보다 원위에 삽입되고, 또한 단완근위의 14p12 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 14p11 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 14p11.2 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 14p11.1 영역 내보다 근위에, 더욱 바람직하게는 RNR2, PABPCP2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 위치보다 근위에 삽입되어 있다.
또한, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위는, 예를 들면 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 AP001657에서의 결실 위치 또는 AP001657보다 근위의 위치에, 더욱 바람직하게는 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 단완근위의 21p11-p12 영역 내에서의 결실 위치보다 근위의 위치에 삽입할 수 있다.
상술한 바와 같이 하여, 텔로미어 서열 또는 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 남기도록 하여 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시킨 인간 염색체 단편을 형성시켜, 그것을 보유하는 세포가 얻어진다. 이와 같이 텔로미어 서열 또는 텔로 미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 인간 염색체 단편 말단에 배치함으로써, 세포에서의 발현 및/또는 안정성을 달성할 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 하여, 장완원위 및/또는 단완원위가 결실된 인간 염색체 단편을 형성시켜, 그것을 보유하는 세포가 얻어진다. 이러한 염색체의 크기의 축소화에 의해, 세포에서 안정성을 달성할 수 있다. 또한, 본 HAC 벡터를 보유하는 세포, 및 후술하는 본 HAC 벡터가 도입되는 세포의 기능·증식 등에 악영향을 주지 않도록, 악영향을 줄것으로 추정되는 염색체 영역을 제거할 수 있다.
단계 (e): 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위의 삽입
본 HAC 벡터의 제조에서는, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입한다. 단계 (e)는 상기 단계 (b),(c) 및 (d)의 전, 이들 단계의 중간 또는 이들 단계의 후의 언제 행하여도 되고, 이들 순서는 특별히 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에서 장완원위 및/또는 장완원위를 결실시키고, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가한 후에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입할 수 있다. 다르게는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입한 후에 장완원위 및/또는 장완원위를 결실시키고, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가할 수도 있다. 또한, 장완원위 및/또는 장완원위를 결실시킨 후에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하고, 그 후 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가할 수도 있다.
당 기술분야에서는, 어떤 효소가 특정한 인식 부위를 인식하여 특이적으로 그 인식 부위로 DNA의 재조합을 일으키는 현상이 알려져 있다. 본 발명에서는 그 와 같은 효소 및 인식 부위의 계를 이용하지만, 그 종류는 하기의 예에 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 그와 같은 계로는, Cre/loxP 시스템이 알려져 있다(예를 들면, Sauer, B. 등, P.N.A.S., 85: 5166-5170, 1988 참조). Cre는 박테리오파지 P1 유래의 38 KD의 단백질이고, 리콤비나아제의 Int(인테그라아제) 족에 속하는 것이다. 이 효소는, 약 34 bp의 인식 부위 loxP 서열을 인식하여, 이 부위에서 특이적으로 DNA의 재조합을 일으킨다. 또한 이 loxP 서열의 방향성에 의해서 2개의 loxP 서열 사이 DNA의 결실 또는 전좌가 생기는 것이 알려져 있다. 또한 그 밖의 특이적인 서열을 인식하여 재조합 반응을 일으키는 계로는, 출아 효모 유래의 리콤비나아제 FLP(Broach 등, Cell, 21: 501-508, 1980), 파지 phiC31 유래의 인테그라아제(Thorpe 등, P.N, A.S., 95: 5505-5510, 1998) 등이 있다. 포유 동물 세포에서도 이들 효소에 의한 DNA 재조합 반응이 일어나는 것이 보고되어 있다(Koch 등, Gene, 249: 135-144, 2000; Thyagarajan 등, Mol. Cell. Biol., 21: 3926-3934, 2000).
인간 염색체에 상기 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하기 위해서는, 공지된 유전자 재조합 방법, 예를 들면 상동 재조합법을 이용할 수 있다. 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위의 삽입 위치는, 당업자이면 필수가 아닌 유전자의 위치 등을 고려하고 적절하게 설정할 수 있다. 예를 들면, 인간 염색체의 장완근위 또는 단완근위의 임의의 위치에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입한다. 이러한 삽입 위치로는, 예를 들면, 인간 14번 염색체에 대해서는 장완근위 14q11보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AL391156(GenBank 등록 번호) 에서의 상기 결실 위치보다 근위, 또는 인간 14번 염색체의 단완근위의 14p12 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위 등을 들 수 있지만, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 21번 염색체에 대해서는, 장완근위의 21q11.2보다 근위, 바람직하게는 21q11.1보다 근위, 바람직하게는 AL16202보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AP001657(GenBank 등록 번호)에서의 결실 위치 또는 AP001657보다 근위, 또는 인간 21번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 21p11.2, 영역 내에서의 결실 위치보다 근위 등을 들 수 있지만, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다.
또한, 후술하는 외래 DNA의 삽입 위치로서, 예를 들면 상기 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위를 사용할 수 있다. 따라서, 이러한 삽입 위치로는, 예를 들면, 인간 14번 염색체에 대해서는 장완근위 14q11보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AL391156(GenBank 등록 번호)에서의 상기 결실 위치보다 근위, 또는 인간 14번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 14p12 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위 등을 들 수 있지만, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다. 인간 21번 염색체에 대해서는, 장완근위의 21q11.2보다 근위, 바람직하게는 21q11.1보다 근위, 바람직하게는 AL16202보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AP001657(GenBank 등록 번호)에서의 결실 위치 또는 AP001657보다 근위, 또는 인간 21번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 21p11.2 영역 내에서의 결실 위치보다 근위 등을 들 수 있지만, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다.
그 후, 후술하는 외래 DNA의 도입 방법에 따라서 리포터 유전자를 도입하고, 그 발현을 확인할 수 있다. 따라서, 인간 염색체 상에 인식 부위의 위치를 확인함으로써 인간 염색체에 도입된 인식 부위의 적부를 조사할 수 있다.
상기 예시한 인식 부위 중 1 종류를 1개 또는 복수개 삽입할 수 있다. 다르게는, 다른 계의 인식 부위를 복수개 삽입할 수도 있다. 후술하는 바와 같이, 본 HAC 벡터는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 갖는다. 따라서, 외래 DNA를 부위 특이적으로 도입이 가능하고, 또한 인식 부위의 설정에 의해 외래 DNA의 도입 위치를 결정할 수 있다. 이 때문에 외래 DNA의 도입 위치가 일정해져서 포지션 효과(position effect)를 회피할 수 있다. 또한 외래 DNA의 도입 조작도 간편해진다. 또한 다른 계의 인식 부위를 복수 삽입함으로써, 복수의 외래 DNA를 순차 삽입하는 것도 가능하다. 또한, 복수종의 부위 특이적 효소의 인식 부위를 조합하여 이용함으로써, 1종의 부위 특이적 효소의 인식 부위를 이용하여 외래 DNA를 도입한 후, 벡터 상에 존재하는 약제 내성 유전자 등의 불필요한 유전자를 별도의 종류의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 이용하여 결실/제거할 수 있다.
상술한 바와 같이 인간 염색체를 개질하여 제조한 본 HAC 벡터에는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위 외에, 프로모터, 약제 내성 유전자 등의 벡터구축에 있어 일반적으로 삽입되는 서열 또는 성분이 삽입되어 있을 수도 있다. 또한 인슐레이터(예를 들면 일본 특허 공개 제2006-948494호 참조), 세포 골격 접착 영역(Matrix attachment region: MAR), 인간 또는 그 밖의 생물종의 게놈 영역 등, 유전자 발현 제어 및/또는 세포 기능 제어 및/또는 조직 기능 제어 및/또는 개체 발생 제어 및/또는 생체 기능 통제에 관한 서열 또는 성분이 삽입되어 있을 수도 있다. 또한 텔로메라제 등의 세포 수명을 조절하는 유전자 및/또는 티미딘 키나아제 등의 자살 유전자 및/또는 유전자 발현 제어나 세포 기능 제어나 조직 기능 제어나 개체 발생 제어나 생체 기능 통제 등에 관한 유전자가 삽입되어 있을 수도 있다. 그와 같은 서열 및/또는 성분 및/또는 유전자는, 전술한 바와 같이 상동 재조합법을 이용하여 본 HAC 벡터의 원하는 위치에 삽입할 수 있다.
또한 본 발명자들은, 상술한 바와 같이 제조한 본 HAC 벡터를 보유하는 세포를, 선택 약제를 포함하지 않는 배지에 장기간에 걸쳐서 계대 배양하고, 경시적으로 HAC 벡터의 유지율을 FISH법에 의해 검정하였다. 그 결과, 본 HAC 벡터는 숙주 세포(예를 들면 CHO 세포)에서 안정적으로 보유되고, 그 안정성은 종래의 21HAC 벡터를 현저히 상회하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 계대 배양에서, 그 HAC 벡터의 탈락이 적을 뿐만 아니라, 도입한 HAC 벡터의 카피수가 과도하게 증감하지 않고 안정적으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다.
놀랍게도, 본 HAC 벡터를 이용함으로써, 텔로미어 서열의 근방에 외래 DNA를 삽입한 경우에도, 종래 보고되어 있던 텔로미어 포지션 효과(TPE)에 의한 외래 유전자 발현 억제 사상을 받지 않고, 상기 외래 DNA를 고발현할 수 있다. 여기서 근방이란, 텔로미어 말단으로부터 센트로미어측을 향해서 약 1 내지 500 kb의 영역을 말하며, 바람직하게는 약 1 내지 300 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 1 내지 100 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 5 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 5 내지 40 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 60 kb이고, 더욱 바람직하게는 약 25 내지 40 kb이다.
2. HAC 벡터에의 외래 DNA의 도입(단계 (f))
상기 HAC 벡터의 제조에서, 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 외래 DNA를 삽입하는 단계 (f)를 행함으로써, 본 HAC 벡터에 외래 DNA를 도입할 수 있다. 이 단계 (f)는 상술한 단계 (e)의 후에 행하는 것이지만, 단계 (b),(c) 및 (d)와의 순서는 특별히 한정되지 않으며, 단계 (b),(c) 및 (d)의 전, 이들 단계의 중간 또는 이들 단계의 후에 행할 수 있다. 따라서, 단계 (b) 내지 (f)의 순서는 명세서에 기재하는 순서에 한정되지 않음에 유의해야 한다.
외래 DNA란, 대상으로 하는 세포에서 외부로부터 도입되는 DNA를 가리키고, 유전자 및 그 밖의 기능 서열 등을 코딩하는 DNA이다. 본 발명에서 도입 대상이 되는 외래 DNA로는, 물질 생산, 질환 치료 및 기능 개질 또는 기능 분석 등을 위해 발현시키는 것이 요구되는 유전자 및 그 밖의 기능 서열 등을 코딩하는 DNA이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 그 밖의 기능 서열이란, 유전자가 발현하기 위해서 기능하는 서열을 가리키고, 예를 들면, 프로모터, 인핸서, 신호 서열 등을 들 수 있다.
외래 DNA의 도입은 부위 특이적 재조합 효소의 계를 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, Cre 효소의 인식 부위인 loxP 서열과 외래 DNA를 보유하는 타겟팅 벡터를 구축한다. 계속해서 본 HAC 벡터(인간 14번 염색체 단편)를 보유하는 세포에서, Cre 효소를 세포 내에서 발현시킴으로써, loxP 서열과 텔로미어 서열에 사이에 끼여 있는 영역과, 상기 타겟팅 벡터와의 부위 특이적 재조합에 의해, 외래 DNA를 본 HAC 벡터 상에 삽입시킬 수 있다(쿠로이와 등, Nature Biotech., 18: 1086- 1090, 2000).
본 HAC 벡터에는, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위(loxP 서열)을 보유하는 환상 DNA를 삽입할 수 있다. 이 때문에 대장균을 숙주로 한 플라스미드, BAC, PAC나, 효모를 숙주로 한 환상 YAC 등 기존의 벡터에 의해 클론화된 DNA를 삽입할 수 있다. 벡터는 인간 염색체에 기초하여 제조되기 때문에, HAC 벡터에 도입 가능한 외래 DNA의 크기의 상한은 100 kb까지 확장된다. 종래 발현 실험에 이용되어 온 플라스미드 벡터에 조립된 cDNA뿐 아니라, 유전자의 발현 제어 영역을 포함하는 게놈 DNA도 도입 가능하다.
상술한 바와 같이, 외래 DNA의 삽입 위치는 예를 들면 상기 부위 특이적 재조합 효소 인식 부위를 사용할 수 있다. 이러한 삽입 위치로는, 예를 들면, 인간 14번 염색체에 대해서는 장완근위 14q11보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AL391156(GenBank 등록 번호)에서의 상기 결실 위치보다 근위, 또는 인간 14번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 14p12 영역 내에서의 상기 결실 위치보다 근위 등을 들 수 있지만, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 인간 21번 염색체에 대해서는, 장완근위의 21q11.2보다 근위, 바람직하게는 21q11.1보다 근위, 바람직하게는 AL16202보다 근위, 더욱 바람직하게는 장완근위의 AP001657(GenBank 등록 번호)에서의 결실 위치 또는 AP001657보다 근위, 또는 인간 21번 염색체의 단완 상, 바람직하게는 단완근위의 21p11.2 영역 내에서의 결실 위치보다 근위 등을 들 수 있지만, 이 위치에 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 복수의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 이용함으로써 본 HAC 벡터로부터 불필요하게 된 약제 내성 유전자 발현 유닛이나 DNA 성분 등을 제거할 수 있다. 예를 들면, 상기 Cre-loxP 시스템에 의해 도입한 외래 유전자 발현 유닛 하류에 존재하는 Neo 내성 유전자 유닛을 제거하는 경우, 상기 외래 DNA를 보유하는 타겟팅 벡터 상의 외래 유전자 발현 유닛의 하류, 및 본 HAC 벡터 상의 Neo 내성 유전자 유닛 하류에 loxP와는 다른 종류의 인식 부위(FRT 서열)을 도입한 구조물을 구축한다. 상기에 따라서 외래 DNA를 도입한 본 HAC 벡터를 보유하는 세포에서, FLPe 효소를 세포 내에서 발현시킴으로써 FRT 서열에 사이에 끼여 있는 Neo 내성 유전자 유닛 영역을 부위 특이적 재조합에 의해 추출하여 제거할 수 있다(예를 들면 도 60 참조).
상기와 같은 약제 내성 유전자의 제거는, 인간 14번 및 21번 염색체에 한정되지 않고, 임의의 인간 염색체에 기초하는 인간 인공 염색체 벡터의 제조에서 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이하의 단계를 포함하는 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터의 제조 방법에 관한 것이다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열 또는 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(e) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계; 및
(f) 단계 (e)에서 이용한 것과는 다른 종류의 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편 상의 약제 내성 유전자를 제거하는 단계.
상기 방법에 따라서 제조된 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체 벡터는 약제 내성 유전자가 제거되어 있고, 그 결과, 외래 DNA를 고발현할 수가 있다(예를 들면 인간 14번 염색체 벡터에 관한 도 21 참조).
종래의 cDNA 강제 발현 벡터를 이용한 유전자 도입법에서는, 과잉 발현에 의한 세포 독성이나 증식 억제 등의 부작용이 생겨, 도입 유전자를 항상적으로 발현하는 세포주가 얻어지지 않는 예가 많다. 이 문제점을 극복하여 생리적인 발현 패턴을 유지하면서 발현을 인공적으로 제어하기 위해서는, 테트라사이클린 등을 이용한 유전자 발현 유도계의 적용이 바람직하다. 도입 가능한 인서트 크기가 크고, 일정한 카피수가 안정적으로 보유된다는 본 HAC 벡터의 특징은 이러한 목적으로 적합하다.
조직 특이적/생리적인 유전자 발현은, 유전자를 코딩하는 게놈 영역에서의 전사, 전사 산물의 편집, 핵 밖으로의 수송, 번역의 각 단계에서 제어를 받는다. 하나의 유전자에 대하여 복수의 프로모터가 있고 전사 개시점이 서로 다른, 또는 스플라이싱에 변동이 생김으로써, 조직 특이적인 이소형이 발현하는 것이 알려져 있다. 클론화 cDNA는 하나의 유전자에서 유래하는 복수의 전사 산물 변이체의 하 나에 지나지 않는다. 생리적인 유전자 발현을 재현하기 위해서는, 게놈 DNA로서 제어 서열을 포함한 유전자 영역을 도입하는 것이 바람직하다. 본 HAC 벡터의 이용은 이러한 목적에 적합한 것이다.
인간 게놈 프로젝트로에 따르면, 게놈 DNA는 BAC 클론으로서 단리되고, 그의 염기 서열이 결정되었다. 이 때문에 공개되어 있는 데이터베이스(GenBank 등)에서 염기 서열은 BAC 단위로도 등록되어 있다. 유전자 기능 해석의 한 수단의 예로서 트랜스제닉 마우스의 제조가 있다. HAC 벡터 플랫폼으로 BAC를 삽입함으로써, 항상 삽입 부위가 동일한 조건으로 유전자의 발현을 해석하는 것이 가능해진다. 많은 BAC 벡터는 loxP 서열을 보유하고 있기 때문에, 본 HAC 벡터에의 삽입을 음성 선별하는 계를 이용하면, 염기 서열 기지의 BAC를 본 HAC 벡터에 카세트 형식으로 간편하게 삽입할 수 있다고 생각된다.
상술한 이외에도, 본 HAC 벡터에의 외래 DNA의 도입 방법 및 도입의 이점이 있고, 이하에 그 몇 가지를 예시한다.
(1) 상호 전좌에 의한 염색체 부분 단편의 도입
부위 특이적 재조합(예를 들면 Cre 효소에 의한 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합)은, 선상 염색체와 환상 인서트(외래 DNA)의 경우에는 삽입 반응이 발생하지만, 선상 염색체끼리에서는 상호 전좌의 반응이 일어난다. 이것을 이용하면 환상 인서트에 클로닝할 수 없는 Mb 단위 이상의 염색체 단편을 본 HAC 벡터에 도입할 수가 있다(Kuroiwa 등, Gene Ther. 9: 708-712, 2002).
(2) 삽입체 선별법
본 명세서의 실시예에 기재하는 방법에서, HAC 벡터에의 외래 DNA의 삽입은 약제 내성 유전자의 재구성을 지표로 한 양성 선별을 이용하고 있다(재조합체의 양성 선별에 대해서는, WO00/10383호 참조). 이 대신에, 티미딘 키나아제/간시클로비르계 등의 음성 선별에 의해, 인서트 삽입체(외래 DNA가 삽입된 것)을 얻는 것도 가능하다. 이 경우, 삽입하는 환상 DNA에는 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위만이 포함되어 있으면 된다. 게놈 프로젝트로 이용된 BAC 라이브러리는 loxP 서열을 포함하고 있기 때문에, 이와 같은 음성 선별의 계가 확립될 수 있으면 서열이 공지된 게놈 클론을 본 HAC 벡터에 용이하게 삽입하는 것이 가능해진다.
(3) 복수 인서트의 삽입
본 발명에서 바람직하게 이용되는 loxP 서열은, P1 파지에서 유래되는 야생형의 서열이고, Cre 효소에 의한 HAC 벡터 상의 loxP 서열에의 환상 인서트의 삽입 반응은 가역적이다. 본 명세서에 기재하는 실시예에서는, Cre 효소를 일과성으로 발현시키고, 약제 내성의 획득을 지표로 부위 특이적인 재조합체를 선별함으로써 구성적인 삽입체가 얻어졌다. 환상 인서트가 삽입되면, HAC 벡터 상에 2개의 loxP 서열이 남는다. 이 때문에 재차 Cre 효소를 발현시키면 역반응(환상 인서트의 추출)이 일어날 가능성도 있고, 이차적으로 인서트를 삽입하는 등의 추가적인 HAC 벡터의 개질은 곤란해진다. 한편, 염기 치환을 행한 변이 loxP 서열의 조합에 따라서는, 반응 방향 및 반응의 특이성을 한정할 수 있다는 보고가 있다(Hoess 등, Nucleic Acids Res., 14: 2287-2300, 1986; Araki 등, Nucleic Acids Res., 25: 868-872, 1997; Lee 등, Gene, 216: 55-65, 1998). 이러한 변이 loxP 서열을 이용 함으로써, 상술한 역 반응을 일으키지 않고, 복수의 환상 인서트를 순차 삽입하는 계도 구축 가능하다.
(4) 카피수 의존적 발현 제어
α글로빈 유전자 트랜스제닉 마우스를 이용하여 숙주 염색체 상에 랜덤하게 삽입된 유전자의 카피수와 mRNA 발현량의 관계를 해석한 보고(Sharpe 등, Proc Natl Acad Sci USA, 90: 11262, 1993)에서는, 발현량과 도입 유전자 카피수와의 사이에 상관은 인정되지 않는다. 이것은, 트랜스제닉 동물 계통에 따라 도입 유전자의 발현량이 크게 다르고, 또한 도입한 유전자의 카피수에 비례하지 않는 발현이 발생하는 포지션 효과라고 불리는 현상에 의한 것이라고 생각되고, 트랜스제닉 동물에서의 유전자 도입에서는 빈번히 발생하는 현상이다. 또한, 도입 유전자의 포지션 효과를 배제하여 비교하기 위해서 외래 DNA의 삽입 위치를 미리 숙주 염색체 상에 도입한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위(예를 들면 loxP 사이트)에 확정하여 부위 특이적 재조합 반응(예를 들면 Cre-loxP계)에 의해 플라스미드 벡터로부터 목적으로 하는 DNA 유닛을 도입하는 트랜스제닉 마우스의 보고(Garrick 등, Nature Genet., 18: 56-59, 1998)가 있다. 그러나, 여기서도 카피수 의존적 발현 제어는 실현되어 있지 않다.
한편, 티로시나아제 게놈 영역을 도입한 YAC를 이용하여 제조한 트랜스제닉 마우스에서, 도입한 게놈 영역의 카피수 의존적인 티로시나아제 발현이 보였지만(Schedl 등, Nature, 362: 258-261, 1993), 생리적 발현 제어 영역을 포함하는 게놈을 이용하는 점에서 포지션 효과의 영향을 받지 않는다고 생각된다. 따라서, 본 발명과 같은 생리적 제어 영역을 포함하지 않는 인공적인 유전자 발현 유닛만을 다카피화하여 발현시키는 것이 아니다. 에피솜 벡터는 숙주 염색체와 독립적으로 존재한다. 외래 DNA 삽입 위치가 결정되어 있지만, 에피솜 벡터는 세포 내에서의 벡터 자신의 카피수를 엄격하게 제어하지는 못한다(Morlino 등, ppl Ehviron Microbiol., 65: 4808-4013, 1999; Cooper 등, Proc Natl Acad Sci USA., 94: 6450-6455, 1997).
본 발명에서는, 동일 및/또는 이종의 목적 유전자의 발현 유닛을 다카피 연결하여 병렬 배치하고, HAC 벡터 상의 결정된 위치(예를 들면 loxP 사이트)에 도입한다. 따라서, 숙주 염색체에 변이를 제공하지 않고 카피수 의존적 발현 제어를 행할 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 의해, 외래 DNA로서 다카피의 목적 유전자를 원하는 세포에 도입하고, 상기 세포에서 상기 목적 유전자를 카피수 의존적으로 발현시키는 것이 가능하다. 또한, 상기 방법에 의해 상기 세포를 이용하여 새로 만들어 낸 트랜스제닉 동물에서는, 포지션 효과를 받지 않고 종래 곤란하였던 카피수 의존적인 목적 유전자의 발현을 달성하는 것이 가능해진다.
3. HAC 벡터의 세포로의 도입
본 HAC 벡터 또는 외래 DNA를 포함하는 본 HAC 벡터를 보유하는 세포로부터, 이들 벡터를 다른 세포로 도입할 수 있다. 이러한 세포는, 특별히 한정되는 것이 아니지만, 동물 세포(포유 동물 세포) 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 손상되지 않은 인간 염색체를 도입 가능한 것이 알려져 있는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세 포를 이용하는 것이 바람직하다(WO00/10383호 참조). CHO 세포는, 마이크로셀을 효율적으로 형성하는 것이 알려지고 있고(예를 들면, Koi 등, SCIENCE 260: 361-364, 1993), 이에 따라 본 HAC 벡터를 CHO 세포로부터 또 다른 세포(CHO 세포 이외의 세포)에 도입하는 것도 가능하다. 또한, 본 발명에서는, 본 HAC 벡터를 다분화능을 갖는 세포에 도입하는 것도 가능하다. 「다분화능을 갖는 세포」란, 소정의 조작에 의해 특정한 세포 또는 조직으로 분화 가능한 세포를 의미한다. 예를 들면, 숙주 배아에의 주입 또는 집합간 형성 등의 조작을 행함으로써, 키메라 동물의 2종 이상의 세포 또는 조직으로 분화 가능한 세포, 구체적으로는, 배아 줄기 세포(ES 세포), 배아 생식 세포(EG 세포), 배아 종양 세포(EC 세포), 정자 유래 줄기 세포(GS 세포) 등이 포함된다. 또한, 예를 들면, 증식 인자(예: 트랜스포밍 증식 인자; TGF) 등을 첨가한 유도 배지에서의 배양에 의해, 골세포, 연골 세포 또는 지방 세포로 분화 가능한 세포, 구체적으로는, 체세포 줄기 세포(예: 간엽계 줄기 세포) 등이 포함된다.
본 명세서 중에서 사용되는 「배아 줄기 세포」란, ES 세포라고도 칭해지고, 미분화성(전능성)을 유지한 채로 증식 가능한 것을 특징으로 하는 초기 배아 유래의 배양 세포를 의미한다. 구체적으로, 배아 줄기 세포는 동물 초기 배아 중의 배판포의 내부에 존재하는 미분화 줄기 세포인 내부 세포 덩어리의 세포를 배양하고, 미분화 상태를 유지한 채로 계속 증식하도록 수립된 세포주이다. 또한 「배아 생식 세포」란, EG 세포라고도 칭해지며, 상기 배아 줄기 세포와 거의 동등한 능력을 갖는 것을 특징으로 하는 원시 생식 세포 유래의 배양 세포를 의미한다. 배아 생 식 세포는, 수정 후 수일 내지 수주간, 예를 들면 마우스의 경우에는 약 8.5일 경과한 배아로부터 얻은 원시 생식 세포를 배양하고, 미분화 상태를 유지한 채로 계속 증식하도록 수립된 세포주이다.
또한, 인간을 대상으로 한 유전자/세포 치료나 조직 재생 치료에서 재료가 되는 세포는, 암화 등을 피하기 위한 안전성 측면에서, 불사화 세포가 아니라 정상 세포를 이용하는 것이 바람직하다고 되어 있다. 본 발명에서는 인간 염색체 유래 HAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포(HFL)로의 도입이 가능한 것이 나타났다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, 섬유아세포 이외의 인간 정상 체세포에의 인간 14번 염색체 유래 단편 또는 인간 염색체 유래 HAC 벡터의 도입이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에 따라서 제조된 인간 염색체 유래 HAC 벡터이면, 인간 염색체에 제한되지 않고, 인간 정상 체세포에 도입하는 것이 가능하다. ·
HAC 벡터의 세포에의 도입은, 마이크로셀 매개 유전자 전이법을 이용하여 행할 수 있다. 마이크로셀 매개 유전자 전이법은 상기 「1. 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조」의 항에 기재된 바와 같게 행할 수 있다.
또한, HAC 벡터의 세포에의 도입은, 체세포핵 이식법을 이용하여 행할 수 있다. 체세포핵 이식법은, Kuroiwa Y 등 Natute Biotech, 제20권, p889-894, 2002년에 기재된 바와 같이 행할 수 있다.
또한, 본 HAC 벡터의 세포에의 도입에 대해서, 최초에 준비한 인간 염색체 또는 염색체 단편을 보유하는 세포로부터, 인간 염색체에의 개질을 행하는 단계의 전, 단계의 중간, 또는 단계의 후 중의 어느 단계에서도 인간 염색체(HAC 벡터)를 다른 세포에 도입하는 것이 가능하다.
4. HAC 벡터의 용도
본 발명의 목적은 벡터라는 기본툴과 그 이용 기술을 제공하는 것이다. 본 발명은 학술 연구로부터 산업에 이르는 매우 폭넓은 영역에 파급 효과를 가져올 것이 기대된다. 본 HAC 벡터 (i)숙주 염색체에 삽입되지 않고 독립적으로 유지되고(숙주 유전자의 변이이나 암화의 걱정이 없음), (ii) 일정한 카피수로 장기간 안정적으로 보유되고(과잉 발현, 발현소실의 걱정이 없음), (iii) 도입 가능한 DNA의 길이의 제한이 없는(정상적인 발현 제어를 보증하는 DNA 성분을 포함하는 유전자나 복수 유전자를 동시에 도입 가능함) 것을 특징으로 한다. 이러한 특징은, 종래의 벡터로 불가능하였던 많은 것을 가능하게 한다고 생각된다. 본 HAC 벡터의 용도로는, 한정하는 것은 아니지만 주요한 것을 예로 들면, (i) 동물 배양 세포에서의 유전자 기능 해석용 벡터, (ii) 인간 질환 유전자 치료용 벡터, (iii) 인간 장기 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ES 세포)에의 유전자 도입용 벡터, (iv) 유전자 도입 동물 제조용 벡터(예: 인간 질환 모델 동물 제조, KO 동물과 조합한 특정 유전자의 인간화) 등이 생각된다. 이하에, 본 HAC 벡터의 용도의 일례로서, (1) 외래 bNA의 수용 세포에의 도입, (2) 외래 DNA를 발현하는 세포의 제조, (3) 단백질의 제조, (4) 유전자 기능 해석용 벡터, (5) 줄기 세포에의 유전자 도입용 벡터, (6) 배양 피더 제조용 벡터, (7) 인간 질환 치료용 벡터, 및 (8) 유전자 도입 동물 제조용 벡터를 설명한다.
(1) 외래 DNA의 수용 세포로의 도입
본 HAC 벡터는 세포 속에서 외래 DNA를 삽입하거나, 외래 DNA가 삽입된 HAC 벡터를 다른 세포에 도입하거나 할 수 있기 때문에, 외래 DNA를 원하는 수용 세포에 도입할 수 있다. 외래 DNA의 수용 세포로의 도입은, 예를 들면 이하의 단계가 포함된다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(f) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(i) 융합한 수용 세포에서 외래 DNA의 도입을 확인하는 단계.
단계 (a) 내지 (f)는 상술한 바와 같이 행할 수 있고, 단계를 행하는 순서는 이것에 한정되지 않는다.
단계 (g) 및 (h)에서는, 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터, 마이크로셀 매개 유전자 전이법을 이용하여 수용 세포에 해당 염색체 또는 그 단편을 도입한다. 도입 대상이 되는 인간 염색체 또는 그 단편은, 단계 (b) 내지 (f)에서의 염색체 또는 그 단편의 개질 전, 개질 단계의 도중, 또는 개질 후의 것으로 할 수 있다. 따라서, 예를 들면 단계 (f)에서 인간 염색체 또는 그 단편에 외래 DNA를 삽입하기 전에, 인간 염색체 또는 그 단편을 보유하는 공여 세포로부터, 마이크로셀 매개 유전자 전이법을 이용하여 수용 세포에 해당 염색체 또는 그 단편을 도입할 수도 있다. 그 후, 단계 (f)의 외래 DNA의 삽입 조작을 수용 세포에서 행하고, 외래 DNA가 삽입된 인간 염색체 또는 그 단편을 수용 세포에 보유시키는 것도 가능하다. 이들 단계는 다른 순서로 행하는 것도 가능하고, 단계 (f) 내지 (h)의 순서는 상기 순서에 한정되지 않는다.
마이크로셀 매개 유전자 전이법은, 상기 「1. 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조」의 항에 기재된 것과 같이 행할 수 있다. 여기서 이용하는 수용 세포는, 특별히 한정되는 것이 아니지만, 동물 세포, 특히 포유 동물 세포(예를 들면 마우스 세포, 인간 세포 등)이 바람직하다. 또한, 상술한 바와 같은 다분화능을 갖는 세포, 예를 들면 배아 줄기 세포(ES 세포), 및 간질계 줄기 세포 및 조직 줄기/전구 세포 등을 수용 세포로서 이용하는 것도 가능하다.
이어서, 단계 (i)에서는, 수용 세포에 외래 DNA가 도입(도입)되어 있는지 여부를 확인한다. 이 확인은, 당 기술분야에서 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, 외래 DNA의 제한 효소 부위에 대응하는 프로브를 이용한 서던 블롯 해 석 등에 의해, 외래 DNA의 도입을 확인할 수 있다.
본 HAC 벡터를 이용함으로써, 큰 크기의 외래 DNA를 세포에 도입하여, 안정적으로 보유시키는 것이 가능해진다.
(2) 외래 DNA를 발현하는 세포의 제조
본 HAC 벡터는, 상술한 바와 같이, 세포 속에서 외래 DNA를 삽입하거나, 외래 DNA가 삽입된 HAC 벡터를 다른 세포에 도입하거나 할 수 있기 때문에, 외래 DNA를 발현하는 세포를 제조할 수도 있다. 외래 DNA를 발현하는 세포의 제조에는, 예를 들면 이하의 단계가 포함된다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(f) 부위 특이적 재조합 효소의 발현 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계; 및
(i) 융합한 수용 세포에서 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택하는 단계.
단계 (a) 내지 (h)는, 상술한 바와 같이 행할 수 있고, 단계를 행하는 순서는 이것에 한정되지 않는다.
단계 (i)에서는, 수용 세포에서 외래 DNA의 발현을 확인하여, 외래 DNA를 발현하는 세포를 선택한다. 외래 DNA의 발현의 확인은, 당 기술분야에서 공지된 방법에 의해 행할 수 있고, 예를 들면, 외래 DNA에 대응하는 프로브를 이용한 노던 블롯법 등을 들 수 있다. 또는, 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질을, 상기 단백질에 대한 항체, 상기 단백질의 활성을 검출할 수 있는 수단을 이용하여 검출함으로써 외래 DNA의 발현을 확인하는 것도 가능하다.
본 HAC 벡터를 이용함으로써, 큰 크기의 외래 DNA를 발현하는 세포를 제조하는 것이 가능해진다.
(3) 단백질의 제조
본 HAC 벡터를 이용함으로써, 상술한 바와 같이, 외래 DNA를 세포에 도입하는 것이나, 외래 DNA를 발현하는 세포를 제조할 수가 있기 때문에, 해당 외래 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 제조할 수 있다. 단백질의 제조에는, 예를 들면 이하의 단계가 포함된다:
(a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
(b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
(c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
(e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
(f) 부위 특이적 재조합 효소의 발현 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 단백질을 코딩하는 외래 DNA를 삽입하는 단계;
(g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
(h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계;
(i) 융합한 수용 세포를 배지 속에서 배양하는 단계; 및
(j) 얻어지는 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계.
단계 (a) 내지 (h)는 상술한 바와 같이 행할 수 있고, 단계를 행하는 순서는 이것에 한정되지 않는다.
단계 (i)에서는, 단계 (h)에서 융합한 수용 세포를 배지 속에서 배양한다. 수용 세포를 배양하기 위한 배지는, 탄소원, 질소원, 무기염류 등을 함유하고, 상기 수용 세포의 배양을 효율적으로 행할 수 있는 배지이면, 천연 배지, 합성 배지 중의 어느 것을 이용하여도 되고, 당업자이면 적절한 배지를 선택하고, 또한 필요에 따라 적절하게 수정을 가하여 배지를 제조할 수 있다. 또한, 진탕 배양 또는 통기 교반 배양 등의 호기적 조건, 온도, pH, 배양 기간 등도 적절하게 설정한다.
배양 후, 단계 (j)에 기재한 바와 같이, 얻어지는 배양물로부터 단백질을 채취한다. 「배양물」이란, 배양상청 외, 배양 세포 또는 세포의 파쇄물의 모두를 의미하는 것이다. 배양 종료 후, 상기 배양물로부터 단백질을 채취하기 위해서는, 통상의 단백질 정제 수단 등을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들면, 세포 내에 생산된 경우에는, 통상법에 의해 세포를 초음파 단편화, 분쇄, 가압 단편화 등에 의해 단백질을 추출한다. 필요에 따라서 프로테아제 저해제를 첨가한다. 또한, 배양상청에 생산된 경우에는, 배양액 그 자체를 이용할 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심 분리 등을 행하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 프로타민 처리 등에 의해 핵산을 제거한다.
이어서, 이것에 황산암모늄, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고, 침전물을 채취하여, 조단백질 용액을 얻는다. 상기 단백질 용액을 각종 크로마토그래피, 전기 영동 등을 걸쳐서 정제 효소 샘플을 얻는다. 예를 들면, 세파덱스, 울트라겔 또는 바이오겔 등을 이용하는 겔여과, 이온 교환체 크로마토그래피, 폴리아크릴아미드겔 등을 이용하는 전기 영동법, 친화성 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 등을 이용하는 분획법을 적절하게 선택하고, 또는 이들을 조합함으로써, 정제된 목적으로 하는 단백질을 얻을 수 있다. 그러나, 상기 배양법, 정제법은 일례로서, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서, 제조 대상이 되는 단백질은 제조가 요구되는 단백질이면 특별히 한정되지 않는다. 일례로는, 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 폰 빌브랜드 인자(vWF), 디스트로핀, 도파민 합성 효소, 인슐린, 인 슐린형 증식 인자(IGF), 인슐린형 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로메라제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 면역 글로블린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나아제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린 뉴클레오티드 포스포릴라아제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M, Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VEGF), 안지오포이에틴, 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈, 트랜스포밍 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt), 알 스폰딘(R-spondin), 모노클로날 항체, 올리고클로날 항체, 및 폴리클로날 항체 등을 들 수 있다. 이러한 제조 대상의 단백질을 코딩하는 유전자(즉, 외래 DNA)는, 예를 들면 공공의 유전자 데이터베이스 등을 이용하여 그 서열 정보를 입수할 수 있다.
(4) 유전자 기능 해석용 벡터
본 HAC 벡터에 삽입된 외래 DNA는 세포 속에서 카피수 의존적이고 또한 안정적으로 발현된다. 따라서, 본 HAC 벡터는 유전자 기능을 해석하기 위해서 이용할 수 있다.
표적 유전자를 코딩하는 염기 서열의 일부에 상보적인 서열로 이루어지는 이중쇄 RNA(double-stranded RNA; dsRNA)를 발현시킴으로써 표적 유전자의 발현을 억 제하는 방법, 즉, RNA 간섭이 알려져 있다(예를 들면, 단쇄 간섭 RNA(siRNA)에 관해서는, Elbashir 등, Nature, 411: 494-498, 2001; McCaffrey 등, Nature, 418: 38-39, 2002를 참조. 또한, Shinagawa, T. 등, Genes & Development, 17: 1340-1345, 2003도 참조). dsRNA를 코딩하는 DNA를 유전자 발현 유도계와 함께 HAC 벡터 상에 도입함으로써, 표적 유전자의 조건적 기능 억제가 가능하다. 유전자 발현 유도계 대신에 게놈 영역을 이용함으로써 조직 특이적/생리적인 부위에서의 기능 억제가 가능하다. 또한, 게놈 중에 존재하는 마이크로 RNA(miRNA)의 기능 해석을 행하는 것도 가능하다.
목적 분자에 의한 효과를 해석하는 경우에, 그 목적 분자의 용량 의존성을 지표로 하여 해석하는 방법이 있다. 이 방법에서는, 본 발명에 따라서 목적 분자를 코딩하는 유전자의 발현 유닛의 카피수를 바꾸어 HAC 벡터 상에 도입하여 세포 등(조직 및 개체도 포함함)에 도입함으로써, 상기 세포 등에서의 카피수 의존적 발현 제어에 기초하여 용량 의존성 해석을 행하는 것이 가능하다. 또한, 유전자 발현 제어를 위해 발현 유도계나 게놈 영역을 이용함으로써 조건적 또는 조직 특이적/생리적인 기능 해석이 가능하다.
(5) 줄기 세포로 유전자를 도입하기 위한 벡터
본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터는 배아 줄기(ES) 세포 또는 간엽계 줄기 세포(mesenchimal stem cell; MSC)로의 유전자 도입용 벡터로서 이용할 수 있다. 상기 HAC 벡터는 ES 세포 또는 MSC에서 장기간 안정적으로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터 도입 ES 세포로부터 분화 유 도된 조직 또는 세포에서도 HAC 벡터가 안정적으로 보유된다고 생각된다.
최근, 다양한 조직의 줄기 세포 및 골수 유래의 다능성 세포가 동정되었다(요코타 등, 실험 의학(증간), 19권 15호, 2001년, 요도샤, 오까노 등, 실험 의학(증간), 21권 8호, 2003년, 요도샤, Li 등, Nature Med., online:31 August 2003, doi:10.1038/nm925). 본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터는, 조직 줄기/전구 세포, 예를 들면 골수, 혈액, 신경, 근육, 간장, 췌장, 피부, 내이 등에서 유래되는 다능성 줄기/전구 세포에의 유전자 도입용 벡터로서 이용 가능하다.
ES세포, MSC, 및 조직 줄기/전구 세포의 인간 임상 응용을 고려하는 경우, 치료처치에 필요한 양의 세포를 증폭하여, 원하는 분화 상태로 제공하는 것이 요구된다. 종래에는, 다분화능을 보유한 채로 줄기 세포만을 대량으로 증폭하는 것은 용이하지 않아, 달성해야 할 문제로 남아 있었다(히노 등, 실험 의학, 19권 15호 증간: 10, 2001, 요도샤). 예를 들면, 조혈 줄기 세포나 신경 줄기 세포를 생체 조직으로부터 채취하여 배양하면, 줄기 세포뿐만 아니라 줄기 세포로부터 분화한 전구 세포나 성숙 세포도 동시에 증폭된다. 따라서, 이러한 세포는 임상 용도에는 바람직하지 않다(오까노 히데유끼, 실험 의학, 19권 15호 증간: 80-90, 2001, 요도샤).
본 발명에서는, 다분화능 보유에 관한 인자, 예를 들면 마우스 ES 세포로는, 활성화형 Stat3, Oct-3/4, Nanog 등의 전사 인자(Niwa 등, Genes Dev., 12:2048-2060, 1998; Matsuda 등, EMBO J., 18:4261-4269, 1999; Niwa 등, Nature Genet., 24:372-376, 2000; Mitsui 등, Cell, 113:631-642, 2003; Chambers 등, Cell, 113:643-655, 2003)을 코딩하는 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제조하여 줄기 세포에 도입한다. 이로써, HAC 벡터는 숙주 염색체를 변이시키지 않고 다분화능을 보유하여 용이하게 줄기 세포를 증폭시키기 위해서 이용하는 것이 가능하다.
줄기 세포의 분화 제어에서는, 관여하는 분자의 발현량의 조절이 중요한 요소로 되어 있다. 예를 들면, 마우스 ES 세포에서의 상기 Oct-3/4에 의한 분화 제어에서 그 발현량이 생리적 발현 레벨을 100％로 한 경우에는 미분화 상태를 유지한다. 그러나, 발현 레벨이 50％ 이하인 경우에는 줄기 세포가 영양외배엽으로 분화한다. 발현 레벨이 150％ 이상이면 줄기 세포가 원시내배엽으로 분화한다(Niwa 등, Nature Genet., 24: 372-376, 2000). 이러한 발현 레벨의 변화에 의해 분화를 제어하는 경우에는, 본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터에 유전자 발현 ON/OFF 유도계(예를 들면 테트라사이클린에 의한 발현 유도계)를 도입함으로써, 엄격한 발현량의 조절이 가능해진다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터에 유전자 발현 ON/OFF 유도계(예를 들면 테트라사이클린에 의한 발현 유도계)와 복수의 분화 유도 인자를 조합하여 도입함으로써, 다분화능 보유 상태와 분화 유도 상태를 전환하는 것이 가능하다.
줄기 세포에 의한 조직 재생을 행하는 경우, 이식 세포 또는 공여체 유래의 재생 조직은, 장기간(바람직하게는 전체 생존 기간)에 걸쳐서 수용 개체의 일부가되어 기능한다. 그 때문에 암화 등의 생리적 제어의 일탈을 공여 세포에 유발하는 원인(예를 들면 유전자 변이)을 제공하는 조작은 최대한 피하는 것이 바람직하다. 본 HAC 벡터는, 숙주 염색체와 독립적으로 존재할 수 있기 때문에, 유전자 도입을 숙주 염색체에 변이를 제공하지 않고서 행할 수 있다. 또한 본 명세서 중 실시예에 설명하는 바와 같이, 인간 세포 속에서 안정적으로 존재할 수 있기 때문에, 장기간에 걸쳐서 안정적으로 목적 분자를 발현할 수 있다.
본 발명의 방법에 따라서, 분화시킨 조직으로 생리적으로 발현하는 유전자의 게놈 영역 또는 조직 특이적 발현 제어 영역을 포함하는 게놈 서열 하에서 목적으로 하는 유전자를 융합한 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제조하고, 상기 HAC 벡터를 도입한 줄기 세포를 이용한다. 따라서, 재생한 조직에서 생리적/조직 특이적으로 목적 분자를 발현하는 것이 가능하다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 HAC 벡터를 보유하는 줄기 세포를 분화 유도한 후, 도입 유전자의 발현이 필요없다면 HAC 벡터는 불필요가 되는 경우가 있다. 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 분화 유도 후에 HAC 벡터 탈락 클론을 예를 들면 선택 배양에서의 약제 내성을 지표로 하여 선별함으로써 불필요해진 HAC 벡터를 배제하는 것이 가능하다.
(6) 배양 지지 피더 세포 제조용 벡터
세포 배양법으로서, 배양기 저면에 부착성 세포를 깔아 채운 배양 지지 피더 세포 상에 목적으로 하는 세포를 접종하여 공배양하는 방법이 알려져 있다(일본 생화학회 편, 신생 화학 실험 강좌 14 발생 분화 노화, 1992년, 동경 화학 동인). 예를 들면 조혈 전구 세포를 증식시키는 경우에는, SCF, Flt3L, TPO, IL-6 및 sIL-6R 등의 필요한 인자를 각각 예를 들면 재조합체 단백질로서 준비하고, 이러한 단 백질을 배양액에 첨가하여 배양한다(Ueda 등, J Clin Invest., 105: 1013-1021, 2000). 종래법에 의해 배양 첨가물의 유전자를 배양 지지 피더 세포에 도입하는 것이 가능하다. 그러나, 숙주 염색체에의 랜덤 삽입에 의한 변이/포지션 효과, 발현 불활화, 다카피 발현 유닛 병렬에 의한 하류 유전자 발현의 저감 등에 의해, 모든 인자에 대해서 희망의 발현량을 제어하여 공급하는 것은 어려운 것으로 생각된다. 본 발명의 방법에 의해 이들 필요 인자를 코딩하는 DNA 전부(또는 일부)를 도입한 HAC 벡터를 제조하고, 배양 지지 피더 세포에 도입한다. 이로써, 재조합체 단백질 등을 나중에 첨가하지 않고 단순한 공배양만으로 간편하게 필요한 인자를 전부 보급하는 것이 가능하다. 또한, 유전자 발현 유도계를 이용함으로써 이들 인자의 조건적인 발현 제어가 가능하다.
(7) 인간 질환 치료용 벡터
인간 질환 치료용의 벡터는 바이러스성 및 비바이러스성 벡터가 종래부터 다양하게 연구되고 있는데, 면역 반응의 야기, 도입 DNA 크기의 한계, 숙주 염색체 삽입 변이, 저도입 효율, 저발현 효율, 발현량 제어 곤란(가네다 야스후미, 임상 면역, 39권: 551-558, 2003년, 과학평론사, 오자와 케이야 편, 유전자 치료, 1997년, 요도샤) 등의 다양한 문제가 지적되어 있다. 모든 벡터에 공통되는 문제로서, 「바람직한 발현량을, 바람직한 타이밍에 제어할 것」이 요구되고 있다.
HAC 벡터를 이용한 유전자 세포 치료의 전략의 예로서, (i) 1차적으로 결실되어 있는 효소나 단백질의 보충, (ii) 2차적으로 감소되어 있는 대사 산물을 보충하는 증상 요법, (iii) 세포에 신기능을 부가하여 세포의 생존을 높이는 방법(예를 들면 개질 세포를 이용하는 조직 재생에서, HAC 벡터는 게놈을 도입함으로써 생리적/조직 특이적 유전자 발현 제어를 행하는 것이 가능함. 이에 따라 과잉 발현 또는 발현 부족에 의한 기능 장해 등의 부작용을 회피할 수 있음), (iv) 기능획득(gain of function)의 형태로 진행하는 변성 질환의 장해를 저지하는 방법(예를 들면 파킨슨병에서의 GDNF 보충 치료) 등을 들 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 HAC 벡터는 인간 질환 치료용 벡터로서 사용하는 것이 가능하고, 치료용의 외래 DNA를 도입한 HAC 벡터를 세포에 도입한 후, 그 세포를 환자에게 투여하기 위한 의약 조성물로서 제조하는 것, 및 본 HAC 벡터를 이용한 유전자 치료가 가능하다. 또한, 이러한 인간 질환 치료용 벡터는 질환의 치료뿐만 아니라 질환의 예방에도 사용하는 것이 가능하다.
적용 범위를 특별히 한정하는 것은 아니지만, 이하에 인간 질환 치료용 벡터로서의 적용예를 기술한다.
(A) 텔로메라제의 이용
유전자 세포 치료나 조직 재생 치료에서 재료가 되는 세포는, 그 안전성 관점에서 불사화 세포가 아니라 정상 세포를 이용하는 것이 바람직하다. 그러나 정상 체세포는 일정 횟수 분열하면 증식/분열이 멈추고 결국에는 사멸, 즉 노화하는 것이 알려져 있다(이데 도시노리, 실험 의학, 16권 18호 증간: 18-24, 1998, 요도샤). 치료 효과를 장기간 지속시키기 위해서, 치료용 세포는 일정 기간, 바람직하게는 환자의 생애를 통해서 유지되는 것이 필수이다. 염색체 말단에 존재하는 반복 서열 텔로미어의 회복 효소인 텔로메라제는, 정상 세포 내에서 과잉 발현시킴으 로써 세포 노화 시에 나타나는 텔로미어 단축을 억제하여, 세포의 수명을 연장할 수 있는 것이 알려져 있다(Bodnar 등, Science, 279: 349-352, 1998). 또한 텔로메라제는 세포 내에서 과잉 발현시키더라도 불사화 또는 암화를 유도하지 않는 것이 기술되어 있다(신까이 요이찌, 실험 의학, 16권 18호 증간: 25-30, 1998, 요도샤, Jiang 등, Nature Gent., 21: 111-114, 1999). 그렇기 때문에, 본 발명의 방법에 의해 인간 텔로메라제(hTERT)를 코딩하는 유전자를 HAC 벡터 상에 도입하여 표적이 되는 세포에 도입함으로써, HAC 도입 세포의 수명을 연장하여, 불사화 또는 암화시키지 않고 치료 효과를 장기간 지속시키는 것이 가능하다. 또한, 유전자 발현 제어를 발현 유도계나 게놈 영역을 이용함으로써, 조건적 또는 조직 특이적/생리적인 텔로메라제 발현이 가능하다.
(B) 자기 항체 생성의 억제
재조합체 단백질 제제를 개발하는 경우, 투여시의 자기 항체(활성 중화 항체)의 생성이 문제된다(Li 등, Blood, 98: 3241-3248, 2001). 환자에게의 투여 방법은 특별히 한정되지 않는다. 본 발명의 방법에 의해 제조한 목적 단백질을 코딩하는 게놈을 도입한 HAC 벡터를, 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 정상인간 세포에 도입한 후, 이것을 환자에게 이식한다. 상기 환자에서 HAC 벡터로부터 목적 단백질을 생리적/조직 특이적으로 발현 및 공급함으로써, 환자에서의 자기 항체 생성의 억제가 가능하다.
또한, 조직 특이적 마이크로RNA(miRNA) 표적 부위를 도입 유전자에 부가하는 등에 의해(Brown B.D. 등, Nature Medicine, 제12권, p585-591, 2006년), 특정한 조직/세포에서 도입 유전자를 소실시키는 것이 가능하고, 도입 유전자에 대한 자기 항체 생성의 억제, 면역 응답 회피가 가능하다.
(C) 면역 유전자/세포 요법에서의 유전자 도입용 벡터
재발 백혈병에 대한 치료법으로서, 이식 편대 백혈병 반응에 의해 이식 림프구가 종양 특이적 세포 상해성 T 세포로서 백혈병 세포를 공격하는 것을 응용한 공여 림프구 주입 요법(Kolb 등, blood, 76: 2462-2465, 1990)이 알려져 있다. 상기 요법의 부작용으로서 이식 세포가 수용 조직을 공격하여 장해를 제공하는 이식 편대 숙주병이 알려져 있는데, 이것에 대한 하나의 대처법으로서 공여 림프구에의 레트로바이러스에 의한 약제 유도성의 자살 유전자 도입 및 약제 투여에 의한 공여 림프구의 제거가 행해지고 있다(오노데라 등, 게놈 의학, 3권: 45, 2003, 메디칼 리뷰사). 이러한 경우, 불리하게도 공여 림프구의 염색체에 변이가 발생할 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터는 숙주 염색체에 변이를 제공하지 않는 면역 유전자/세포 요법에서의 유전자 도입용 벡터로서 이용하는 것이 가능하다. 또한, 항종양 활성 촉진을 목적으로 한 치료, 예를 들면 림프종에서의 CD40 리간드에 의한 면역 활성화 요법(가토 등, 게놈 의학, 3권: 53, 2003, 메디칼 리뷰사)나 유전자 기재 백신접종 등에서의 유전자 도입용 벡터로서도 이용하는 것이 가능하다.
(D) 모노클로날 완전 인간 항체의 보충
최근 인간 항체 생산 마우스를 이용한 완전 인간 모노클로날 항체 의약품의 개발이 시도되고 있다(이사다 등, 바이오벤처, 2권: 44, 2002, 요도샤, Mori 등, Cell Death and Differentiation, in press, 2003, Proceedings of American Association for Cancer Research, Volume 44, 2nd Edition, July 2003, p1285, #6422). 그러나, 이것을 만성 질환에 적용하는 경우에는 정기적인 TPO 투여를 위해 병원에의 통원이 필요하게 되어 환자의 QOL의 장해가 될 것이 예측된다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 많은 비용이 들어, 그 결과로서 고액의 의료비 부담이 생기는 것도 문제가 된다.
본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터 상에, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 단리한 목적 항체를 코딩하는 게놈 영역을 도입하고, 예를 들면 환자 조혈 줄기 세포나 B 세포에 상기 HAC 벡터를 도입한 후, 이를 환자에게 재이식한다. 이로써, 완전 인간 항체를 생리적 발현 제어에 의해 보충 및 공급하는 것이 가능하다. 또한 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 감소시켜 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(E) 단일 유전성 질환에서의 결핍 보충
(E-1) 혈우병
혈우병 A는 혈액 응고 제8 인자의 변이, 혈우병 B는 혈액 응고 제9 인자의 변이가 원인이 되어 발생하는, 반성 열성 유전성 출혈 질환이다. 치료법으로서 제8 또는 제9 인자 농축 제제 투여에 의한 보충 요법이 유효하다. 그러나, 출혈후 투여에서는 위독한 합병증이 생기는 것, 농축 제제에의 병원체 혼입의 가능성, 반복 투여에 의한 자기 항체(활성 중화 항체)의 발생, 항상 출혈에의 대처 준비에 의 한 환자 QOL의 저하, 고액의 의료비 및 그 외의 문제들로 인하여, 유전자 치료법에 의한 해결이 기대되고 있다. 종래 벡터에 의한 임상 유전자 치료 연구가 행해지고 있는데, 충분한 발현을 장기간 지속할 수 없어 유의미한 치료 효과를 얻는 것에 이르지 않았다. 레트로바이러스 및 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터를 직접 투여하는 임상 연구에서 피험자의 정액 내에 벡터 유전자가 검출되고 생식 세포에의 유전자 도입의 위험성이 지적되었다(모찌즈끼 등, 게놈 의학, 3권: 25, 2003, 메디컬 리뷰사). 제8 인자를 코딩하는 유전자는 전체 길이 게놈으로 약 1.5 Mb, cDNA로 약 7 kb에 걸친다. 비바이러스 벡터나 아데노바이러스 벡터로는, 전장 cDNA의 도입은 가능하지만 발현량의 저하가, 또한 AAV 벡터로는, 도입 DNA 크기가 약 4.9 kb 이하로 한정되기 때문에 전체 길이 유전자를 도입할 수 없는 것이 문제로 되어있다.
본 발명의 방법에 의해 혈액 응고 제8 인자 또는 제9 인자를 코딩하는 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제조하는 것이 가능하다. 그리고, 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 상기 HAC 벡터를 예를 들면 인간 세포에 도입한 후, 환자에의 이식에 의해 보충하는 것이 가능하다. 또한, 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 상기 혈액 응고 제8 인자 또는 제9 인자의 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 예를 들면 인간 세포에 도입한 후, 상기 세포의 환자에의 이식에 의해, 생리적/조직 특이적 발현에 의해 상기 인자를 보충하는 것이 가능하다.
(E-2) X-SCID(X 연쇄 중증 복합 면역부전증)
중증 복합 면역부전증(SCID)은 액성 및 세포성 면역이 선천적으로 장해를 받는 질환이다. SCID의 약 반수가 X 연쇄의 X-SCID이고, 그 원인은 인터루킨 2 족의 수용체가 공유하는 공통 γ쇄의 변이인 것이 알려져 있다. 치료법으로서, 조혈 줄기 세포 이식이 행해지고 있지만, 액성 면역의 회복이 불충분하고 면역 글로블린의 정기적 투여가 필요하다. 따라서 조혈 줄기 세포에 공통 γ쇄를 도입하여 이식하는 유전자 세포 치료법에 의한 해결이 기대되고 있다. 1999년부터 레트로바이러스에 의해 공통 γ쇄를 도입한 조혈 줄기 세포 이식의 임상 연구가 행하여지고 있었는데, 최근 프랑스에서 이식 세포의 백혈병화가 복수예 보고되었다(Hacein-Bey-Abina 등, N Engl J Med., 348: 255-256, 2003; Marshall 등, Science, 299: 320, 2003). 어느 경우에도 유전자 도입 세포 염색체 중의 원암 유전자의 하나인 LMO2 유전자 영역에 벡터 서열 삽입 변이가 나타나며, LMO2 활성화와 종양화와의 관련이 의심되고 있다(구메 등, 게놈 의학, 3권: 9, 2003, 메디컬 리뷰사).
본 발명의 방법에 의해 공통 γ쇄를 코딩하는 DNA를 도입한 HAC 벡터를 제조하는 것이 가능하다. 또한, 상기 HAC 벡터를 유전자 도입용 벡터에 이용함으로써 숙주 염색체에의 벡터 서열 삽입 변이의 위험을 회피하는 것이 가능하다. 환자에게의 투여 방법은 특별히 한정되지 않는다. 상기 HAC 벡터를 인간 세포(예를 들면 인간 골수 유래 정상 조혈 줄기 세포)에 도입하고 환자에게 이식함으로써, 생리적/조직 특이적 발현에 의한 공통 γ쇄의 결실 기능 상보를 행하는 것이 가능하다.
(E-3) 듀센(Duchenne)형 근 디스트로피; DMD
듀센형 근 디스트로피는, 디스트로핀 유전자의 변이에 의한 디스트로핀의 기 능 결손이 원인인, X 연쇄 열성 단일 유전자성 질환의 하나이다(Hoffman 등, Cell, 51: 919-928, 1987). DMD의 치료는, 디스트로핀이 세포 골격 단백질이기 때문에 직접 투여에 의한 보충은 불가능하고, 유전자 치료법이 기대되고 있다.
디스트로핀 유전자는 전체 길이 게놈으로 약 2.3 Mb, cDNA로 14 kb에 걸쳐 있다. 비바이러스 벡터나 아데노바이러스 벡터로는, 전장 cDNA의 도입은 가능하지만 발현량의 저하가 문제이다(Liu 등, Mol. Ther., 4:45, 200 1; DelloRusso 등, Proc Natl Acad Sci USA, 99: 12979-12984, 2002). 또한 AAV 벡터로는, 도입 DNA 크기가 약 4.9 kb 이하로 한정되기 때문에 전체 길이 유전자를 도입할 수 없고, 또한 골격근에의 유전자 도입 실험에서 면역 반응이 야기되고 도입 유전자 산물의 발현 저하가 나타나는 등의 문제가 존재한다(Yuasa 등, Gene Therapy, 9: 1576-1588, 2002).
편재적인 발현을 유도하는 CMV 프로모터 제어 하에서 디스트로핀 미니 유전자를 도입한 AAV 벡터에 의한 골격근에의 유전자 도입 실험에서는, 면역 반응이 야기되고 도입 유전자 산물의 발현 저하가 관찰되었다. 그러나, 프로모터로서 골격근 특이적인 MCK 프로모터를 사용함으로써 상기 면역 응답이 개선되었다(Yuasa 등, Gene Ther., 9: 1576-1588, 2002). 이로부터, 디스트로핀의 발현에는 생리적/조직 특이적 발현이 필요한 것이 시사된다.
본 발명의 방법에 의해 디스트로핀를 코딩하는 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 제조하는 것이 가능하다. 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 상기 HAC 벡터를 인간 세포(특별히 한정하는 것은 아니지만 예를 들면 자가 인간 정상 근아세포)에 도입하여 환자에게 이식함으로써 생리적/조직 특이적 발현에 의한 디스트로핀 보충을 행하는 것이 가능하다.
(E-4) 적용 대상 질환을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 이하에 나타내는 단일성 유전자 질환을 치료할 수 있다; α-1 안티트립신 결손증, 낭포성 섬유증(CFTR), 만성육아종증, 가족성 고콜레스테롤증, 판코니 빈혈, 고셔병, 헌터 증후군, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결손증, 푸린 뉴클레오티드 포스포릴라아제 결손증, ADA-SCID, 백혈구 접착 결손증, Canavan병, 뇌량위축, 파브리병, 근위축성측색경화증, 리소좀병, 폰 빌브랜드병 또는 탈라세미아. 본 발명의 방법에 의해 원인 유전자를 도입한 HAC 벡터를 제조하고, 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 인간 세포에 도입하여 환자에게 이식한다. 이로써, 결손 분자의 보충 및 상보를 행하는 것이 가능하다. 질환 원인 유전자 정보에 대해서는, 미국 National Center for Biotechnology Information(NCBI)의 온라인 문헌 데이터베이스 PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed) 또는 OMIMTM-Online Mendelian Inheritance in ManTM (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)가 참조된다.
(F) 기타 질환
(F-1) 트롬보포이에틴(TP0)은 혈소판 생산 제어 및 조혈 줄기/전구 세포의 증식을 담당하는 인자이고, 예를 들면 재생 불량성 빈혈 등의 혈액 질환, 화학 요 법 후의 조혈 회복 등에의 적용이 기대되고 있다. 그러나, TPO 재조합체 단백질 투여 시의 활성 중화 항체 생성이 의약품 개발의 장해가 되고 있다(Li 등, Blood, 98: 3241-3248, 2001). 따라서, TPO를 만성 질환에 적용하는 경우에는 정기적인 TPO 투여를 위해 병원에의 통원이 필요하게 되어 환자의 QOL의 장해가 될 것이 예측된다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 많은 비용이 들어, 그 결과로서 고액의 의료비 부담이 생기는 것도 문제가 되고 있다.
본 발명의 방법에 의해 TPO 게놈을 도입한 HAC 벡터를 제조하고, 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 세포에 도입하여, 생리적/조직 특이적으로 TPO를 발현 및 공급함으로써, 자기 항체 생성을 억제하는 것이 가능하다. 이를 통해 정기적인 통원 치료 횟수를 감소시켜, 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(F-2) 에리트로포이에틴(EPO)은 적혈구 증식 인자로서, 예를 들면 당뇨병이나 신장 질환에서의 신장 빈혈 등의 치료약으로서 시판되고 있다. 만성 질환(예를 들면 당뇨병에 의한 신장 빈혈 등)에서는 정기적인 EPO 투여를 위해 병원에의 통원이 필요하여 환자의 QOL의 장해가 된다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 많은 비용이 들어, 그 결과로서 고액의 의료비 부담이 생기는 것도 문제가 되고 있다. 본 발명의 실시예 14에 설명한 바와 같이, EPO cDNA 도입한 HAC 벡터를 인간 정상 섬유아세포에 도입하고 환자에게 이식함으로써, 상기 환자에서 EPO를 발현 및 공급하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명의 방법에 의해, EPO 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 제조하고, 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 인 간 세포, 예를 들면 생산 조직의 세포에 도입한다. 따라서, 생리적/조직 특이적으로 EPO를 발현 및 공급하는 것이 가능하다. 또한 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 감소시켜, 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(F-3) 파킨슨병
파킨슨병은 중뇌 흑질 치밀부 도파민 합성 세포의 진행성의 변성 탈락에 의해 운동 기능이 장해를 받는 신경 질환이다. 치료법의 하나로서, 결손한 도파민 보충을 목적으로 한 L-DOPA 투여법이 있지만, 중등 이상의 증상에서는 약효가 감소하는 것이나 부작용에 의한 환자의 QOL 제한·투여량 감소 등의 문제가 존재한다. 이러한 문제는 도파민 농도가 선상체 내에서 일정하지 않은 것 및 투여한 L-DOPA가 선상체 이외에서 작용하는 것에 기인하기 때문에, 선상체에서의 일정한 도파민의 생리적 발현이 요구된다(다케다 등, 메디컬 사이언스 다이제스트, 29권: 20, 2003년, 뉴 사이언스사). 현재, 도파민 합성에 관한 효소 3 종류를 각각 도입한 AAV 벡터에 의한 유전자 치료 연구가 이루어지고 있다. 그러나, 생성된 벡터들은 모두 생리적 발현 제어를 행하는데 까지는 이르지 않았다. 도파민 합성 세포의 변성 탈락 억제를 목적으로 한 치료법에 GDNF(grial-cell derived neuronal factor) 투여가 있지만, 피각 아래에 카테터 유치에 의한 지속 투여로 효과가 나타난(Gill 등, Nature Med., 9: 589-595, 2003) 한편으로 감염의 위험성이나 환자의 QOL 제한 등이 문제로 되어있다. AAV 벡터에 의한 유전자 치료 연구에 의해 동물 모델로 효과가 나타났지만(Wang 등, Gene Ther., 9: 381-389, 2002), 생리적 발현 제어까지는 이르지 않았다.
본 발명의 방법에 의해 도파민 합성에 관한 효소군 또는 GDNF 게놈 영역을 도입한 HAC 벡터를 제조하는 것이 가능하다. 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 상기 HAC 벡터를 인간 세포(예를 들면 인간 정상 신경 줄기/전구 세포)에 도입하고 환자에게 이식함으로써, 생리적/조직 특이적 발현에 의한 도입 유전자 산물의 보충이 가능하다.
(F-4) 당뇨병
인슐린 의존형 당뇨병은 재조합체 단백질 제제 투여에 의한 치료가 행하여지고 있다. 만성 질환 환자는 정기적인 투여를 위해 병원에의 통원이 필요하여, 이는 환자의 QOL의 장해가 된다. 또한, 재조합체 단백질 제제의 제조에는 많은 비용이 들어, 그 결과로서 고액의 의료비 부담이 생기는 것도 문제가 되고 있다. 인슐린의 혈중 농도는 최적 범위가 좁기 때문에, 너무 많거나 너무 적어도 부작용이 생겨, 때로는 생명의 위험에 이르는 경우가 있다. 또한, 유전자 치료의 연구가 이루어지고 있지만, 체내에서의 인슐린 농도의 조절이 문제로 남아있다(모리야 등, 단백질 핵산 효소, 40권: 2764, 1995, 공립 출판).
본 발명의 방법에 의해 인슐린 게놈을 도입한 HAC 벡터가 제조된다. 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, HAC 벡터가 인간 세포, 예를 들면 생산 조직의 세포에 도입되어, 상기 게놈을 생리적/조직 특이적으로 발현 및 공급하는 것이 가능하다. 또한 상기에 의해 정기적인 통원 치료 횟수를 감소시켜 환자의 QOL을 향상시키는 것이 가능하다.
(F-5) 적용 대상 질환은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면 뇌종양, 말초 동맥 질환(예를 들어, 허혈), 만성 류마티스성 관절염, 동맥 재협착, 주관절 터널 증후군, 관동맥 질환, 알츠하이머병, 궤양, 골반 골절, 신장 질환, 악성 종양 등이 다음과 같은 방식으로 치료될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라서, 질환 치유에 필요하다고 생각되는 물질을 코딩하는 유전자를 도입한 HAC 벡터를 제조한다. 환자에게의 투여 방법을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 인간 세포에 도입하여 환자에게 이식하는 등에 의해서, 결손 분자의 보충 및 상보를 행하는 것이 가능하다.
(8) 유전자 도입 동물 제작용 벡터 및 HAC 벡터를 갖는 비인간 동물
본 발명의 방법에 의해 제조한 HAC 벡터는 유전자 도입 동물 제조용 벡터로서 이용 가능하다. 예를 들면, 상기 비특허 문헌 5, 6 또는 7의 방법에 따라서, 외래 유전자를 포함하는 본 HAC 벡터로서 마우스 배아 줄기 세포에 도입하여 키메라 개체의 제조가 가능하다. 또한 도입한 외래 유전자를 개체 속에서 기능 발현시키는 것, 및 상기 외래 유전자를 포함하는 본 HAC 벡터를 키메라 개체에서 안정적으로 보유시키고 생식 계열을 거쳐서 차세대 전달시키는 것이 가능하다. 또한, 또한 외래 유전자를 포함하는 본 HAC 벡터는, Kuroiwa 등(2002년; 상기함)의 방법에 따라서, 체세포핵 이식에 의해 클론된 소 개체를 제조하고, 개체 속에서 안정적으로 보유시켜 도입된 외래 유전자를 개체 속에서 기능 발현시키는 것이 가능하다. 또한, 본원 발명의 HAC를 보유하는 동물을 공지된 방법(예를 들면, 본 출원인 등에 의한 출원인, 국제 공개 WO97/07671, WO03/041495 및 WO03/097812에 기재된, 배아 줄기 세포를 사용하는 방법, 핵 이식법 등)에 의해서 제조할 수도 있다. 동물종으 로는 특별히 한정은 없지만, 바람직하게는 포유 동물, 특히 바람직하게는 소, 염소, 돼지, 양, 개, 래트, 마우스, 원숭이 등을 들 수 있다.
본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 하기 실시예 1 내지 5에서는, 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실되고, 장완원위에 텔로미어 서열이 부가되고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입된 HAC 벡터(이하, 「텔로미어형 14HAC」 또는 「14AΔqHAC」 등이라고 함)를 제조하였다. 이들의 안정성 및 도입된 외래 유전자의 발현을 확인하였다.
하기 실시예 6 내지 11에서는, 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실되고, 장완원위에 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체에서 유래되는 약 25 Kb의 서브텔로미어 서열이 부가되고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입된 HAC 벡터(이하, 「텔로미어·단서브텔로미어형 HAC」 또는 「14NΔqHAC」 등이라고 함)를 제조하였다. 이들의 안정성 및 도입된 외래 유전자의 발현을 확인하였다.
하기 실시예 12 내지 17에서는, 인간 14번 염색체의 장완원위가 결실되고, 장완원위에 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체에서 유래되는 약 60 Kb의 서브텔로미어 서열이 부가되고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입된 HAC 벡터(이하, 「텔로미어·장서브텔로미어형 HAC」 또는 「14gNΔqHAC」 등이라고 함)를 제조하였다. 이들의 안정성 및 도입된 외래 유전자의 발현을 확인하였다.
하기 실시예 18 내지 22에서는, 상기한 3종의 HAC 벡터에서 Neo 내성 유전자 유닛의 제거를 행하였다.
하기 실시예 23 내지 25에서는, 인간 21번 염색체의 장완원위가 결실되고, 장완원위에 텔로미어 서열이 부가되고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입된 HAC 벡터(이하, 「텔로미어형 21HAC」 또는 「21AΔqHAC」 등이라고 함)를 제조하였다. 이들의 안정성 및 도입된 외래 유전자의 발현을 확인하였다.
하기 실시예 26 내지 30에서는, 인간 21번 염색체의 장완원위가 결실되고, 장완원위에 텔로미어 서열 및 인간 21번 염색체에서 유래되는 약 8 Kb의 서브텔로미어 서열이 부가되고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 삽입된 HAC 벡터(이하, 「텔로미어·서브텔로미어형 HAC」 또는 「21NΔqHAC」 등이라고 함)를 제조하였다.
실시예 1
인간 14번 연색체 장완원위의 결실에 의한 텔로미어형 14 HAC (14AΔ qHAC ) 벡터의 제조
(1) 텔로미어 말단절단에 의한 인간 14번 염색체 장완 결실
(1-1) 텔로미어 말단절단용 벡터 pTELpuro-t1의 구축
인간 14번 염색체의 장완원위를 결실시키기 위한 텔로미어 말단절단 벡터(타겟팅 벡터)는 pTELpuro(Kuroiwa 등, Nature Biotech. (USA), 제18권, p.1086-1090, 2000년)을 이용하였다. GenBank 데이터베이스로부터 얻어진 인간 14번 염색체 장완원위의 염기 서열(등록 번호 AL391156)로부터, 텔로미어 말단절단 벡터 삽입의 표적 서열을 설계하였다. 표적 서열을 PCR 증폭하기 위한, 제한 효소 인식 서열을 부가한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
7791F Nhel: 5'-AGCTAGCTCAACTGGCTCCTGATTTCTCTC (서열 번호 1)
10680R(XhoI): 5'-ATCTTCCTCGAGTCACCAAACTTG (서열 번호 2)
10657F(XhoI): 5'-CAAGTTTGGTGACTCGAGGAAGAT (서열 번호 3)
14620R BamHI: 5'-GGGATCCTTTCAAGTGGAAGAGTGAGGTCC (서열 번호 4)
인간 14번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(A9c11-14chr, Shinohara 등, Hum Mol Genet, 10: 1163-1175, 2001년)을 배양하고, 세포로부터 Puregene DNA Isolation kit(Gentra System사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기한 프라이머를 이용하여 재조합의 표적 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 주형으로서 약 0.1 μg의 게놈 DNA를 사용하여, Innis 등(PCR 실험 메뉴얼, HBJ 출판국, 1991)에 따라서, GeneAmp970O 주기 가열기(Applied Biosy stems사)를 사용하여 PCR을 행하였다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 10분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 10분을 25 주기, 신장 72℃ 10분으로 행하였다. 7791FNhe1/10680R(XhoI)에 의한 2.9 kb의 증폭 산물을 제한 효소 NheI 및 XhoI로, 10657F(XhoI)/14620RbamHI에 의한 3.9 kb의 증폭 산물을 제한 효소 XhoI 및 BamHI(로슈)로 소화시키고, 돌출 말단을 갖는 DNA 단편을 각각 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 정제하였다. 이것을 pTELpuro 플라스미드의 XbaI-BamHI 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 pTELpuro-t1 구조물의 크기는 약 12.8 kb이다. 텔로미어 말단절단 벡터, 표적 서 열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 2 및 도 3에 도시하였다.
(1-2) 인간 14번 염색체 보유 DT40 세포에의 텔로미어 말단절단 벡터 도입
인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포는 동염색체를 보유하는 상기 A9c11-14chr 세포를 염색체 공여 세포로 하여 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의해 제조하였다. 염색체 수용 세포인 DT40은 Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)에 등록 번호 JCRB2221로서 등록되어 있고, 입수 가능하다. 이하에 제조법의 개략을 기재한다.
처음에 약 1×108개의 A9c11-14chr 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 25 cm2 원심용 플라스크(눈크(Nunc)) 12개에 세포 밀도가 80％ 포화될 때까지 배양한 A9c11-14chr 세포를 콜세미드(0.075 ㎍/ml, 데메콜신, 와코 쥰야꾸)를 포함하는 배양액(20％ 우태아혈청; FBS, 0.8 mg/ml G418, DMEM) 속에서 48시간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 이하의 실시예에서, 닛스이 제약 제조의 DMEM을 이용하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(34℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/ml, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 34℃, 8000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)를 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 DMEM 6 ml에 재현탁하였다. DT40 세포는, 10％ FBS, 1％ CS(송아지 혈청), 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에서 배양한 후, DMEM으로 2회 세정하고, 1×107개의 세포를 DMEM 5 ml에 재현탁하였다. 마이크로셀 현탁액을 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하고, 이것에 DT40 세포 현탁액을 중층한 후, 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 폴리에틸렌글리콜(PEG) 1:1.4 용액(Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년)에서 90초간 융합 처리하였다. 융합 세포를 60 ㎖의 10％ FBS, 1％ 닭 혈청(ChS), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(ME)을 포함하는 RPMI1640 배양액(인비트로겐(Invitrogen))에 현탁하고, 96웰 플레이트(well plate)의 6매에 접종하고 24시간 배양한 후, 1 mg/㎖의 G418을 포함하는 배지에서 약 2주간 선택 배양하였다. 2회의 마이크로셀 융합 실험으로부터 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하였다. PCR 해석에 의해 인간 14번 염색체 상에 존재하는 영역 NEK2P,: LOC122727, AL390798, AL121820, AL157858, AL137190, AL137229, IGHMC, IGHV3, 및 AB019437의 존재를 확인하고, 추가로 인간 특이적 프로브 Cot1(기브코 BRL)를 이용한 형광 계내(in situ) 혼성화(FISH) 해석에 의해 1카피의 인간 14번 염색체를 보유하는 클론 DT40(-14)1-2 및 DT40(-14)2-4을 확인하여 얻었다.
pTELpuro-t1 구조물을 제한 효소 SrfI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포에 도입하였다. 1×107개의 DT40(-14)1-2 또는 DT40(-14)2-4 세포를 0.5 ㎖의 RPMI 배지에 현탁하고, 30 μg DNA 존재 하에서 실온에서 10분간 정치한 후, 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 25 μF의 컨덴서에 550 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 실온에서 10분간 정치한 후, 전기 천공한 세포를 10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에 현탁하고, 96웰 플레이트(팔콘) 20매에 접종하였다. 24시간 후에 종농도 0.3 ㎍/ml가 되도록 푸로마이신(Puromycin dihydrochloride, 시그마)을 첨가하고, 2 내지 3주간 후에는 내성 콜로니가 출현하였다. DT40(-14)1-2에서는, 2회의 형질감염으로부터 합계 276의 약제 내성 콜로니를, 또한 DT40(-14)2-4에서는 4회의 형질감염으로부터 합계 294의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
푸로마이신 내성주 게놈 DNA를 주형으로 하여 인간 14번 염색체 상에 존재하는 유전자 및 STS 마커 D14S272 및 이하의 6 유전자 또는 게놈 영역의 존재를 PCR 법에 의해 확인하였다. STS 마커의 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열은 미국 National Center for Biotechnology Information의 온라인 데이터베이스 UniSTS(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists)에서 열람 가능하다. 상기한 STS 마커의 등록 번호는 UniSTS:45129이다. 그 외에 GenBank 데이터베이스로부터 입수한 염기 서열을 바탕으로 설계한 유전자 또는 게놈 영역 프라이머 올리고뉴클레오티드의 위치를 도 3(도면 중, 프라이머를 화살표로 나타냄)에, 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00001
또한, STS 마커 D14S282의 프라이머는 공지된 것을 사용하였다.
약 0.1 μg의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기 6종의 유전자 또는 게놈 영역과 D14S272 마커의 합계 7종에 대해서 PCR 증폭(Innis 등, 상기)을 행하였다. Ex Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 5분의 후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 56℃ 30초, 연장 72℃ 30초를 35 주기 행하였다. 텔로미어 말단절단에 의해 장완원위가 결실된 경우 NEK2P, LOC122727, 및 70-5를 보유하고, AL39 5409-AL395811, AL397258-397656, D14S272마커, 및 IGHV3을 보유하지 않을 것이 예상된다. AL397258-397656의 유무로 1차 스크리닝한 후, 나머지 마커 해석을 행하였다. 푸로마이신 내성 570주 중 6주(DT40(-14)1-2 유래 5클론, DT40(-14)2-4 유래 1클론)에서 예상되는 증폭 결과가 얻어졌다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 표적 서열내에 프로브를 설정하였다(도 4). 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제했다:
Figure 112009007627410-PCT00002
1차 스크리닝으로 얻은 6주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 SphI(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protdcols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 32p에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 대표적인 결과를 도 5에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는 상동 재조합체로 10.4 kb, 야생형(비재조합체)으로 11.1 kb이고, 후보 6주부터 합계 6주의 상동 재조합체를 확인하였다.
(1-5) 형광 계내 혼성화(FISH) 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠) 및 FITC 표지한 PGK-puro 단편(pTELpuro 벡터로부터 추출하여 제조)을 프로브로 이용하여 행하였다. 그 결과, 관찰한 분열상의 대부분에서 단축한 인간 14번 염색체 및 Cot1로 염색한 단축한 인간 14번 염 색체 장완단에 2개의 FITC 신호이 검출되었다. 대표적인 FISH상을 도 6의 A 및 B에 도시하였다. 도 6의 A에서 백색 화살표는 텔로미어 말단절단를 행하기 전의 전장의 인간 14번 염색체를, 도 6의 B에서 백색 화살표는 장완원위를 결실시킨 인간 14번 염색체 단편을 나타내고 있다. 숙주인 DT40 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 인간 14번 염색체가 단축된 것을 확인하였다.
이로부터, 얻어진 푸로마이신 내성의 6주(12t97, 12t134, 12t159, 12t201, 12t225, 및 24t8)가 인간 14번 염색체를 장완 결실에 의해 단축한, 텔로미어 서열을 말단에 갖는 인공 염색체(14AΔqHAC)를 보유하는 것을 확인하였다.
(2) 14AΔqHAC 장완근위에의 클로닝 부위의 도입
(2-1) loxP 및 3'neo 서열 삽입용 t1pSF1 벡터의 구축
실시예 (1-1)에서 제조한 인간 인공 염색체(HAC)에 loxP 및 3'neo 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 pSF1(라이프텍)를 이용하였다. loxP 및 3'neo 삽입 부위인 인간 14번 염색체 장완근위의 염기 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 얻었다(등록 번호 AL391156). 상동 재조합의 2개의 표적 서열 증폭에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00003
인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 표적 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 약 5 kb의 DNA 단편 제한 효소 SalI(로슈)로, 약 2 kb의 DNA 단편을 FseI 및 PacI(로슈)로 소화시키고, 돌출 말단을 갖는 DNA 단편을 각각 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 정제하였다. 이들을 pSF1③ 플라스미드의 SalI 내지 FseI-PacI 사이트에 클로닝하였다. pSF1③ 벡터는, pSF1플라스미드의 XhoI 사이트에, 상동 재조합체의 선별에 이용하는 블라스티사이딘 내성 유전자를 pCMV/Bsd(인비트로젠)로부터 제한 효소 XhoI(로슈) 및 SalI(로슈) 소화에 의해 약 1.3 kb의 단편으로서 추출하여 3'neo 서열과 역의 전사방향으로 도입하고, 또한 상기 블라스티사이딘 내성 유전자 도입 pSF1 구조물을 ApaI(로슈) 소화한 후 평활 말단화한 부위에 SNESPF 링커(SalI-NheI-EcoRV-SrfI-PacI-FseI)를 도입하여 구축하였다. 이하에 SNESPF 링커의 DNA 서열을 나타낸다.
Figure 112009007627410-PCT00004
최종적인 구조물의 크기는 약 13.4 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 7 내지 9에 도시하였다. 또한, 이와 같이 하여 얻어진 구조물을 t1pSF1 벡터라고 한다.
(2-2) 14AΔqHAC 보유 DT40 세포에의 t1pSF1 벡터 도입
t1pSF1 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 14AΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포에 도입하였다. 1×107개의 12t97 또는 12t134 세포를 0.5 ㎖의 RPMI 배지에 현탁하고, 30 μg DNA 존재 하에서 실온에서 10분간 정치한 후, 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 2,5 μF의 컨덴서에 550 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 실온에서 10분간 정치한 후, 전기 천공한 세포를, 10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에 현탁하고, 96웰 플레이트(팔콘) 20매에 접종하였다. 24시간 후에 종농도 8 ㎍/ml가 되도록 블라스티사이딘(Blasticidin S Hydrochloride, 후나코시)을 첨가하고, 2 내지 3주간 후에는 내성 콜로니가 출현하였다. 12t97에서는, 2회의 형질감염으로부터 합계 56의 약제 내성 콜로니를, 또한 12t134으로는 1회의 형질감염으로부터 합계 43개의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(2-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 7 중, 각각 SalI-SalI 서열 및 PacI-FseI 서열로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 두고 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 8 중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00005
LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 이하와 같이 행하였다. 5'게놈 해석; 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 10분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 10분을 25 주기, 신장 72℃ 10분. 3'게놈 해석; 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 6분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 30 주기, 신장 72℃ 10분. PCR 반응액에는 MgSO4(종농도 0.5 mM)로 첨가하였다.
얻어진 블라스티사이딘 내성 DT40 세포 99주 중 12주가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 5 kb 및 3'게놈 약 2 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(2-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 표적 서열의 외측에 N5'(i) 및 N3'(ii)의 2종의 프로브를 설정하였다(도 9). 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제하였다.
Figure 112009007627410-PCT00006
1차 스크리닝으로 얻은 12주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 StuI(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행 하였다. 32P에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 대표적인 결과를 도 10에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석 및 3'게놈측 해석 모두 상동 재조합체로 24.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보 12주로부터 합계 7주의 상동 재조합체를 확인하였다.
이상의 (2-1) 내지 (2-4)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위(loxP 서열)이 삽입된 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 7주(12t97S1, 12t97S38, 12t134S1, 12t134S2, 12t134S3, 12t134S5, 및 12t159S1)를 얻었다.
(3) CHO 세포에의 14AΔqHAC 벡터 도입
(3-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 14AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 1의 (2)에서 얻어진, 장완원위를 결실시켜 클로닝 부위(loxP 서열)이 삽입된 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포(12t97S1, 12t97S38, 및 12t134S2)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주CHO-K1(등록 번호 JCRB9018)를 이용하였다.
처음에 약 109개의 DT40 잡종 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 세포 밀도가 60 내지 70％ 포화될 때까지 배양한 DT40 잡종 세포를 콜세미드(0.05 ㎍/ml, 인비트로젠)를 포함하는 배양액(10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, RPMI1640) 속에서 13 내지 18시간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 원심 분리에 의해 세포를 회수하고 무혈청 DMEM에 재현탁하고, 미리 폴리 L-리신으로 코팅한 25 cm2 원심용 플라스크(눈크) 12개에 접종하였다. 37℃ 1시간 정치하여 세포가 부착된 후 배양액을 제거하고, 미리 보온(37℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/ml, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 원심 용기에 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8,000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)을 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과 정제한 후, 5 ㎖의 DMEM에 현탁하였다. 마이크로셀 현탁액을 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하고, 이것에 DMEM으로 2회 세정한 후 5 ㎖의 DMEM에 현탁한 약 107개의 CHO-K1 세포를 중층한 후, 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 45％ 폴리에틸렌글리콜 1500(PEG1500, 로슈) 10％ DMSO(시그마)를 포함하는 DMEM 용액으로 120초간 융합 처리하였다. 120 ㎖의 10％ FBS를 포함하는 F12 배지(인비트로젠)에 현탁하고, 48웰 플레이트(팔콘) 5매에 접종하고, 24 내지 36시간 후에 블라스티사이딘(8 ㎍/ml)를 포함하는 선택 배지(10％ FBS, F12)로 배양하였다. 약 2주간의 선택 배양의 후, 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 6회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 28주(12t97S1 유래 9주, 12t97S38 유래 10주, 12t134S2 유래 9주)의 블라스티사이딘 내성 CHO주를 얻었다.
(3-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 방법은, 상기 실시예 1의 (2-3)에 따라서 행하였다. 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO 세포 22주 중 20주가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 영역 약 5 kb 및 3'게놈 영역 약 2 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(3-3) 서던 블롯 해석
도입한 14AΔqHAC 벡터의 구조를 확인하기 위해서 서던 블롯 해석을 실시예 1의 (2-4)와 동일하게 행하였다. 대표적인 결과를 도 11에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석 및 3'게놈측 해석 모두 상동 재조합체로 24.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보 20주로부터 합계 19주(12t97S1 유래 6주, 12t97S38 유래 8주, 12t134S2 유래 5주)의 상동 재조합체를 확인하였다.
(3-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성 CHO주 중 17주에 대해서 해석한 결과, 합계 8주(12t97S1 유래 1주; -1, 12t97S38 유래 4주; -3, -6, -8, -9, 12t134S2 유래 3주; -3, -5, -6)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 14AΔqHAC 벡터가 검출되었다. 대표적인 FISH상 및 14AΔqHAC 벡터의 핵형을 각각 도 12의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (3-1) 내지 (3-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주 8주가 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 것을 확인하였다.
실시예 2
14AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
14AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 1에 기재한 CHO 세포주 3주(12t97S38-6, -8, -9, 이후 12t7S를 약칭하여 t7S38-6, -8, -9로 표기함)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 8 ㎍/ml를 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하고 FISH용 염색체 표본을 제조하였다.
(2) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등 (FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)을 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 그 결과를 표 1 및 도 13에 도시하였다.
표 1: 14AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성
Figure 112009007627410-PCT00007
도 13에서, 「21ΔqHAC」는 인간 21번 염색체 유래의 HAC 벡터(WO2004/031385호 공보)를, 「14AΔqHAC」은 실시예 1 및 2에서 제조한 HAC 벡터를, 「14NΔqHAC(G)」는 실시예 6 및 7에서 제조한 HAC 벡터를, 「14gNΔqHAC(g)」는 실시예 12 및 13에서 제조한 HAC 벡터의 결과를 도시한다.
14AΔqHAC 벡터는 CHO 세포에서 장기 계대 배양 후에도 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 또는 2개의 신호이 검출되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험에 의해, 14AΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되어 있는 것이 입증되었다.
실시예 3
hEPO-14AΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 hEPO 유전자 발현 해석
(1) hEPO-14AΔqHAC 벡터의 구축
(1-1) 14AΔqHAC 벡터에의 hEPO 유전자의 도입
실시예 1에서 구축한 14AΔqHAC 벡터에 hEPO 유전자 발현 유닛을 삽입한다. 구체적으로는, loxP 서열을 포함하는 hEPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다. 개략을 도 14에 도시하였다.
실시예 1에서 제조한 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포(t7S1-1, t7S38-6, t7S38-8)를 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8 ㎖의 행크스(Hank's) 평형염 용액(HBSS)에 현탁하였다. loxP 서열을 포함하는 hEPO 발현 플라스미드 pLN1-EPO(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년) 10 ㎍과 Cre 효소 발현 벡터 pBS185(라이프텍) 10 μg의 존재 하에서 진 펄서 II(바이오라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 500 μF의 컨덴서에 450 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 전기 천공한 세포를 10％ FBS 첨가한 F12 배지(인비트로겐)를 포함하는 48웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘) 5매에 접종하였다. 2일 후에 0.8 g/㎖의 G418(제네티신(GENETICIN), 인비트로젠)을 포함하는 배지와 치환하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 113개(t7S1-1 유래 6개, t7S38-16 유래 70개, t7S38-8 유래 37개)의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-2) PCR 해석
hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 14AΔqHAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 pLN1-EPO 벡터 상 및 14AΔqHAC 벡터 상에 설계한 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해서 행하였다. 또한 삽입된 hEPO 유전자를 플라스미드 벡터 pBS226 상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인하여 선별하였다. 프라이머 서열 및 PCR는 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gend Therapy; 12: 85과 856, 2005년)에 따랐다. 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7 kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포로부터 합계 65주(t7S1-1 유래 6주, t7S38-6 유래 37주, t7S38-8 유래 22주)에서 예상되는 증폭을 확인하였다. 이에 따라, 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 65주가 loxP 서열에의 hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것이 입증되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-14AΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은 Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 15에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다(도 15). 상기 (1-2)에서 얻은 G418 내성 후보 CHO 잡종 세포 64주로부터 합계 33주(t7S1-1 유래 4주, t7S38-6 유래 13주, t7S38-8 유래 16주)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(2) 14AΔqHAC 벡터에 삽입된 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현을 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 실시예 3의 (1-3)에서 단리한 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 33주를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류(confluence)에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ml로 치환하여 2일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ml로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 16에 도시하였다.
이로부터, 상기 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 33주 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다. 또한, 그 발현량은 장완 결실형 EPO-21ΔqHAC을 상회하는 것을 나타내었다.
(3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-3)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 14주에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 9주(t7S1-1 유래 3주; E4, E5, E6, t7S38-6 유래 3주; E25, E30, E34, t7S38-8 유래 3주; E5, E7, E21)에서 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 검출하였다. 대표적인 FISH상과 hEPO-14AΔqHAC 벡터의 핵형을 각각 도 17의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (1)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 9주는, hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포인 것이 입증되었다.
실시예 4
hEPO-14AΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-14AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하 및 선택 조건 하(대조군)에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 3에서 얻은 CHO 잡종 세포 3주(t7S38-6E25, t7S38-6E34, t7S38-8E5)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 8 ㎍/㎖를 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％. 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하고, hEPO 유전자의 발현 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다. 상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 3주에 대해서, 실시예 3의 (2)의 방법에 따라서 행하였다. 그 결과, 상기 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 3주 전부에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 18에 도시하였다. 도 18에 도시하는 클론 6E25, 6E34 및 8E5는 각각 t7S38-6E25, t7S38-6E34 및 t7S38-8E5를 나타낸다.
(3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 3주에 대해서 그 결과를 표 2 및 도 18에 나타내었다.
표 2: hEPO-14AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성
Figure 112009007627410-PCT00008
14AΔqHAC 벡터는 CHO 세포에서 장기 계대 배양 후에도 안정적으로 보유되었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호를 검출하였다.
이상의 (1) 내지 (3)의 실험에 의해, hEPO-14AΔqHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 CHO 세포에서, 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 세포당의 카피수가 유지되는 것, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 입증되었다.
실시예 5
hEPO-14AΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 hEPO 유전자 발현
(1) hEPO-14AΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 제조
(1-1) 미소핵 융합법에 의한 hEPO-14AΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에의 도입
염색체 공여 세포로서, 실시예 3에서 얻어진 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포주 중, 미소핵 형성능이 높은 클론(t7S38-6E25, t7S38-6E34 및 t7S38-8E5)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로는, 인간 정상 섬유아세포 HFL-1(이화학 연구소(RIKEN BioResource Center) 세포 재료 개발실로부터 입수, 등록 번호 RCBO521)를 이용하였다. 처음에 약 107개의 t7S38-6E25 또는 t7S38-8E5 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 즉, 25 cm2 원심용 플라스크(눈크) 24개에 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 t7S38-6E25 또는 t7S38-8E5 세포를 콜세미드(0.1 ㎍/ml, 인비트로젠)를 포함하는 배양액(20％ FBS, 0.8 mg/ml G418, F12) 속에서 3 일간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(37℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/㎖,시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 원심 용기에 원심용 플라스크를 삽입하여, 34℃, 8,000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)을 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 50 ㎍/㎖의 피토헴아글루티닌 P(Difco)를 포함하는 DMEM 2 ml에 재현탁하였다. HFL-1 세포를 90％ 포화의 상태까지 배양한 25 ㎠ 배양용 플라스크(팔콘) 2개에 정제한 미소핵 세포를 첨가하고 37℃ 에서 15분간 정치한 후, 45％ 폴리에틸렌글리콜 1500(PEG1500, 로슈) 10％ DMSO(시그마)를 포함하는 DMEM 용액으로 1분간에 걸쳐서 융합하였다. 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지로써 24시간 배양한 후, 트립신 처리에 의해 세포를 분산하고, 콜라겐 I 코팅 처리한 48웰 조직 배양용 플라스틱 플레이트(팔콘) 2매에 접종하였다. 1일 후에 블라스티사이딘(3 ㎍/ml)를 포함하는 선택 배지(20％ FBS, DMEM)로 대체하였다. 약 4주간의 선택 배양을 행하였다. 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 28회(t7S38-6E25; 13회, t7S38-6E34; 2회, t7S38-8E5; 13회)의 미소핵 세포 융합으로부터 138개(t7S38-6E25 유래; 56개, t7S38-6E34 유래; 26개, t7S38-8E5; 56개)의 약제 내성 콜로니를 얻었다. 상기 콜로니 중, 염색체 공여 세포로서 t7S38-6E25 세포를 이용하여 득이다 세포를 t25H 세포와, 세포를 이용하여 얻은 세포를 t5H 세포라고 이하 칭한다.
(1-2) PCR 해석
hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는지 여부를 실시예 3의 (1-2)의 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2를 이용하여, 인간 염색체를 STS 마커 D2S1334의 프라이머를 이용하여 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따라서 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 또한, 염색체 공여 CHO 세포의 혼입의 유무를 CHO furin 유전자 특이적 프라이머 furin3'subF 및 furinEx6-28R을 이용하여 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 설계한 프라이머 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00009
반응 조건은 94℃ 5분의 후, 변성 94℃ 20초, 어닐링/신장 68℃ 3분간을 32 주기 행하였다. hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포로 염색체 공여 CHO 세포의 혼입이 없는 경우에, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp의 증폭, D2S1334 프라이머에 의해 약 0.6 kbp의 증폭, furin3'subF 및 furinEx6-28R에 의한 증폭없음이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)로 얻어 블라스티사이딘 내성주 138주로부터 합계 7주(t5H3, 4, 26, 27, 28, 29, t25H2)에서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이로부터, 상기한 블라스티사이딘 내성주 6주가 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-14AΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 상기한 블라스티사이딘 내성주 중 5주(t5H3,7, 26, 27, 28)에 대해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 19의 A에 나타내는 D 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5,5 kb이다. 그 결과, 상기 (1-2)에서 얻은 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성주 5주 전부에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 14번 및 22번 염색체 특이적 α 부수 DNA 프로브(Q-Biogene, 후나코시)를 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성주 중 3주(t5H3, 26, 28)에 대해서 해석한 결과, 3주(t5H3, 26, 28)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에 있어서, 숙주 세포 유래의 1쌍의 인간 14번 및 22번 염색체 센트로미어 영역의 4개 부위와 1카피의 14AΔqHAC 벡터 유래의 1개 부위에 신호이 검출되었다. 그 결과를 도 20의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성주 3주는 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(2) hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포에서의 hEPO 유전자 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 단리한 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성 HFL-1 세포 4주에 대해서, 각각 약 105 세포를 블라스티사이딘(3 ㎍/ml)을 포함하는 선택 배지(20％ FBS, DMEM) 1 ml를 넣은 콜라겐 I 코팅한 24웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지로 대체하여 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 그 결과를 도 21의「14A-HAC」의 항목에 나타내었다.
이로부터, 상기 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 3주 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 6
인간 14번 염색체 장완원위의 결실에 의한 14 HAC (14NΔ qHAC ) 벡터의 구축
HAC 벡터가 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체 말단의 짧은 서브텔로미어 서열(약 5 kb)을 함유하도록, 장완원위 및 근위에 loxP 서열을 상동 재조합에 의해 삽입하고, Cre에 의한 부위 특이적 재조합 반응에 의해 2개 부위의 loxP 서열 사이의 영역을 추출하고 결실시켜 장완원위 결실 인공 염색체(14NΔqHAC) 벡터를 구축한다.
(1) 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 14번 염색체 장완 결실
(1-1) 인간 14번 염색체 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxpPGK-14qtel의 구축
loxP 서열 삽입용 벡터(타겟팅 벡터)에는, ploxPupBSD(WO00/10383호)의 KpnI 사이트에 KpnI*(사이트를 변형시키는 서열)-SrfI-PacI-PmlI-KpnI 링커를 삽입한 ploxPupBSD-PGK를 이용하였다. 상기 KpnI*-SrfI-PacI-PmlI-KpnI 링커의 염기 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00010
GenBank 데이터베이스로부터 얻은 인간 14번 염색체 장완원위의 염기 서열(등록 번호 AB019437)로부터, ploxpPGK-14qtel 벡터 삽입의 2개 부위의 표적 서열을 설계하였다. 이 Tel측 표적 서열(합계 약 9.5 kb)은, 이하에 나타낸 바와 같이 A9/#14게놈을 주형으로 하여 4단편으로 나누고 PCR 증폭한 후 pUC18 상에 클로닝하여, 제한 효소 소화에 의해 5' 및 3'측 표적 서열 단편을 추출하여 제조하였다.
단편(i); 0 kb-2.9 kb(5' 끝에 SalI 사이트를 부가, 3' 끝에는 BamHI 사이트가 내재함)는, LA-PCR로 증폭한 후, 제한 효소 SalI 및 BamHI로 소화하여 pUC18의 SalI-BamUI 사이트에 도입하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00011
단편(ii); 2.3 kb-5.4 kb(5' 끝에 BamHI 사이트가, 3' 끝에 AccI 사이트가 내재함)는, LA-PCR로 증폭한 후, 제한 효소 BamHI 및 AccI로 소화시키고, pBluescript의 BamHI-AccI 사이트에 도입하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00012
단편(iii); 4.5 kb-6.7 kb(5' 끝에 AccI 사이트가, 3' 끝에 KpnI 사이트가 내재함)는, LA-PCR로 증폭한 후, 제한 효소 AccI 및 KpnI로 소화하여 상기 단편(ii)을 포함하는 pBluescript의 AccI-KpnI 사이트에 도입하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00013
단편(iv); 6.3 kb-9.5 kb(5' 끝에 KpnI 사이트가 내재하고, 3' 끝에 EcoRI 사이트를 부가)는, LA-PCR로 증폭한 후, 제한 효소 KpnI 및 EcoRI로 소화하여 상기 단편(i)을 포함하는 pUC18 의 KpnI-EcoRI에 도입하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00014
상기한 단편(ii) 및 (iii)을 포함하는 pBluescript를 제한 효소 BamHI 및 KpnI로 소화시키고, 상기한 단편(i) 및 (iv)을 포함하는 pUC18 의 BamHI-KpnI 사이트에 도입하고, Tel측 표적 서열(합계 약 9.5 kb)을 클로닝하였다. PCR은 실시예 1의 (1-1)의 방법에 따라서, 인간 14번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(A9c11-14chr)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 이용하여, LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 94℃ 30초, 어닐링 60℃ 30초, 신장 72℃ 3분을 30 주기, 신장 70℃ 10분으로 행하였다.
5' 영역(tel측) 4.4 kb는 상기 Tel측 표적 서열(합계 약 9.5 kb)을 포함하는 pUC18을 제한 효소 SphI 소화에 의해 선상화시키고, KpnI-SphI 링커 부가 후, 제한 효소 KpnI 및 ApdI로 소화시키고, 정제하여 상기 ploxPupBSD-PGK 벡터의 KpnI-ApaI 사이트에 클로닝하였다. KpnI-SphI 링커의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00015
또한, 3' 영역(cen측) 4.0 kb는, Tel측 표적 서열(합계 약 9.5 kb)을 포함하는 pUC18로부터 제한 효소 EcoRI 소화하여 pBluescript의 EcoRI 사이트에 서브클로닝한 후, 제한 효소 HindIII로 소화 후 평활 말단화하고, 추가로 제한 효소 BamHI로 소화하고 정제하여, 상기 5' 영역(tel측) 4.4 kb를 포함하는 ploxPupBSD-PGK 벡터의 NheI-EcoRV 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 ploxpPGKkb 구조물의 크기는 약 15.7 kb이다. ploxpPGK-14qtel 벡터를 도 22에, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 23에 도시하였다.
(1-2) 인간 14번 염색체 보유 DT40 세포에의 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxpPGK-14qtel 벡터 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, ploxpPGK-14qtel 구조물을 제한 효소 SrfI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포 DT40(#14)2-4에 도입하였다. 블라스티사이딘(종농도 8 ug/ml)로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다. 2회의 형질감염으로부터 합계 480개의 블라스티사이딘 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 실시예 6의 (1-1)의 방법에 따라서, PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 23 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계했다. 위치는 도 24에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00016
상기 블라스티사이딘 내성 480주 중 3주에서 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 확인하였다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 5' 및 3'측의 2 표적 서열 외측에 프로브(IGH5' 및 IGH3')을 설정하였다(도 23). 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하고, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제했다:
Figure 112009007627410-PCT00017
1차 스크리닝으로 얻은 3주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 BstEII(5'측) 또는 BamHI(3'측)에 의해(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 표지한 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 대표적인 결과를 도 25에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 14.0 kb, 야생형(비재조합체)으로 10.6 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 7.4 kb, 야생형(비재조합체)으로 9.0 kb이고, 후보 3주로부터 합계 2주(24G8, 24G94)의 상동 재조합체를 확인하였다.
(2) 인간 14번 염색체 장완근위 센트로미어측에의 loxP 서열 삽입
(2-1) 인간 14번 염색체 장완근위 센트로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터ploxPHYGOR/n1의 구축
loxP 서열 삽입용 벡터(타겟팅 벡터)에는, ploxPdownPURO(WO00/10383호)의 FseI 사이트에 FseI*(사이트를 변형시키는 서열)-PmlI-PacI-SrfI-FseI 링커를 삽입한 ploxPdownPURO-HYG를 이용하였다. 상기 FseI*-PmlI-PacI-SrfI-FseI 링커의 염기 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00018
GenBank 데이터베이스로부터 얻은 인간 14번 염색체 장완원위의 염기 서열(등록 번호 AL391156)로부터, ploxPHYGOR/n1 벡터 삽입용의 2개 부위의 표적 서열을 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한, 제한 효소 인식 서열을 부가한 프라이머 올리고뉴클레이티드의 서열을 이하에 나타내었다:
5'측 표적 서열용:
Figure 112009007627410-PCT00019
3'측 표적 서열용:
Figure 112009007627410-PCT00020
실시예 1의 (1-1)의 방법에 따라서, 인간 14번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(A9c11-14chr)의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기한 프라이머를 이용하여 5' 및 3'측의 2개의 재조합 표적 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하였다. 5'측 표적 서열용의 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 10분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 10분을 30 주기, 신장 70℃ 10분으로 행하였다. 또한, 3'측 표적 서열용의 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 6분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 30 주기, 신장 70℃ 10분으로 행하였다. 3'측 표적 서열용 2.0 kb의 증폭 산물은, FseI 및 PacI 소화하여 ploxPdownPURO-HYG 벡터의 FseI-PacI 사이트에 클로닝하였다. 또한, 5'측 표적 서열 5.0 kb의 증폭 산물은, 제한 효소 SalI로 소화시키고, 상기한 2.0 Kb의 표적 서열을 갖는 ploxP4ownPURO-HYG 벡터의 SalI 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 ploxPHYGOR/n1 구조물의 크기는 약 16.1 kb이다. ploxPHYGOR/n1 벡터를 도 26에, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 27에 도시하였다.
(2-2) ploxpPGK-14qtel을 도입한 인간 14번 염색체 보유 DT40 세포에의 장완근위 센트로미어측 loxP. 서열 삽입용 벡터 ploxPHYGOR/n1 벡터 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, ploxPHYGOR/n1 구조물을 제한 효소 SrfI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 실시예 7의 (1-4)에서 제조한 p1oxpPGK-14qtel을 도입한 인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포 24G8 및 24G94에 도입하였다. 푸로마이신(종농도 0.3 ug/ml)으로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다. 6회의 형질감염으로부터 합계 230개(24G8 유래 50개, 24G94 유래 180개)의 푸로마이신 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(2-3) PCR 해석
푸로마이신 내성주의 게놈 DNA를 주형 1로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 실시예 6의 (2-1)의 방법에 따라서, PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 27 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 28중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00021
상기 블라스티사이딘 내성 230주 중 34주(24G8 유래 14주, 24G94 유래 20주)에서 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 확인하였다.
(2-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 5' 및 3'측의 2 표적 서열 외측에 프로브(N5'(i) 및 N3'(i))를 설정하였다(도 27). 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제했다:
Figure 112009007627410-PCT00022
1차 스크리닝으로 얻은 34주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 StuI(로슈)에 의해 소화시켜, 실시예 6의 (1-4)와 동일하게 행하였다. 대표적인 결과를 도 29에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 12.5 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 10.2 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이고, 후보 34주로부터 합계 22주(24G8 유래 14주, 24G94 유래 8주)의 상동 재조합체를 확인하였다. 이들 중에서, 24G8 유래의 클론 24G8n7 및 24G94 유래의 클론 24G94n18 및 24G94n56을 다음 단계 (3)으로 진행시켰다.
(3) Cre-loxP 부위 특이적 재조합 반응에 의한 장완원위의 결실
(3-1) 장완원위 및 근위에 loxP 서열 삽입한 인간 14번 염색체 보유 DT40 잡종 세포에의 Cre 발현 벡터의 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, Cre 발현 벡터 pCAGGS-Cre를 실시예 6의 (2)에서 취득한 24G8n7 및 24G94n18 및 24G94n56 세포에 도입하였다. 하이그로마이신(종농도 1.25 mg/ml)로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다.
24G8n7 세포에서는, 2회의 형질감염으로부터 합계 54개의 하이그로마이신 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다. 24G94n18 및 24G94n56 세포에서는, 10클론을 1풀에 통합하여, 각각 20풀을 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(3-2) PCR 해석
하이그로마이신 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 loxP 서열 사이의 결실을 PCR법에 의해 확인하였다. 장완원위 결실 후에 남은 loxP 서열을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 30의 A 중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00023
Ex Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 35 주기로 행하였다. LoxP 서열 사이의 결실에 의해 장완원위가 결실된 경우, 약 0.8 kb의 증폭이 예측된다. 그 결과, 상기 24G8n7 세포 유래의 하이그로마이신 내성 54주 중 16주에 있어서, 또한 24G94n18 및 24G94n56 세포 유래의 각 20풀 전부에서 예측되는 증폭 산물을 확인하였다.
(3-3) 서던 블롯 해석
장완원위 결실체를 구조 확인 및 선별하기 위해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 장완원위 결실에 의해 생기는 표적 서열, 염색체 대립 유전자 및 프로브의 위치를 도 30의 A 및 도 30의 B에 도시하였다. 상동 재조합의 5' 및 3'측의 2 표적 서열 외측에 프로브(IGH5'(i) 및 N3'(i))을 설정하였다.
1차 스크리닝으로 얻은 24G8n7 세포 유래의 16주 및 24G94n18 세포 유래의 20풀 및 24G94n56 세포 유래의 10풀에서 게놈 DNA를 추출하고 실시예 6의 (1-4)와 동일하게 행하였다. 제한 효소(로슈) 소화는, BstEII(5'측) 또는 StuI(3'측)에 의해 행하였다. 대표적인 결과를 도 31에 도시한다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 7.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 14.0 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 8.3 kb, 야생형(비재조합체)으로 10.2 kb이다. 그 결과, 24G8n7 세포 유래의 12주 및 24G94n56 세포 유래의 10풀에서 장완원위 결실체를 확인하였다.
(3-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠) 및 실시예 6의 (1-1)에서 제조한 ploxpPGK-14qtel 벡터로부터 제한 효소 HindII에 의해 소화, 추출하여 정제한 약 4.2 kb의 5'표적 서열 단편을 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (3-3)에서 취득한 24G8n7 세포 유래의 4클론(G8n7Δc2/c5/d1/d4) 및 24G94n56 세포 유래의 4풀(G94n56Δp21/p25/p28/p30)에 대해서 해석한 결과, 전부에서 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 신호과 단축된 장완의 말단에 2개의 신호를 검출하였다. 대표적인 FISH상을 도 32의 A 및 B에 도시한다.
이상 (3-1) 내지 (3-4)의 실험으로부터, 얻어진 하이그로마이신 내성 DT40 잡종 세포는, 텔로미어를 남기고 장완원위를 결실시킨 인간 14번 염색체 단편(14NΔqHAC)을 보유하는 것을 확인하였다.
(4) 14NΔqHAC 장완근위에의 클로닝 부위의 도입
(4-1) loxP 및 3'neo 서열 삽입용 pSF(G+n1) 벡터의 구축
상기 실시예 6의 (3)에서 제조한 인간 인공 염색체(HAC)에 loxP 및 3'neo 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는, 실시예 1의 (2-1)에서 제조한 pSF1③를 이용하였다. loxP 및 3'neo 삽입 부위인 상동 재조합의 5'측 표적 서열은 상기 실시예 7의 (1-1)에서 취득한 ploxpPGK-14qtel 벡터로 이용한 서열로부터, 3`표적 서열은 GehBank 데이터베이스로부터 얻은 인간 14번 염색체 장완근위의 염기 서열(등록 번호 AL391156)로부터 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00024
5'측 표적 서열은, ploxpPGK-14qtel 벡터로부터 XbaI 및 SnaBI(로슈)로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여 정제한 후, pSF1③ 플라스미드의 NheI-SalII 사이트에 클로닝하였다. 또 3'측 표적 서열은, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하였다. 이 약 5.0 kb의 DNA 단편을 제한 효소 FseI(로슈)로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여 정제한 후, 상기 5' 표적 서열을 삽입한 pSF1③ 플라스미드의 FseI 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 pSF1(G+n1) 구조물의 크기는 약 15.0 kb 있다. 타겟팅 벡터를 도 33에, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 34의 A에 도시하였다.
(4-2) 14NΔqHAC 보유 DT40 세포에의 pSF(G+n1) 벡터 도입
pSF(G+n1) 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 14NΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포 6종(G94n56Δp21/p25/p28/p30, G8n7Δc2/c5)에 각각 도입하였다. 방법은, 실시예 1의 (2-2)에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하였다. G94n56Δp21/p25/p28/p30로는, 각 2회의 형질감염으로부터 합계 321개(각각 117/153/46/7개)의 약제 내성 콜로니를, 또한 G8n7Δc2/c5로는 각 1회의 형질감염으로부터 합계 191개(각각 96/95개)의 약제 내성 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다.
(4-3) PCR 해석
상기 블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 34 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 34 중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00025
LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, PCR 반응액은 MgSO4(종농도 0.5 mM)를 포함하였다. 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 8분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 8분을 2주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 8분을 30 주기, 신장 72℃ 10분으로 행하였다.
얻어진 블라스티사이딘 내성주 중 12주가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 4.5 kb 및 3'게놈 약 5.0 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다(G94n56Δp21/p25/p28/p30 유래; 2/1/2/2, 합계 7주, G8n7Δc2/c5 유래; 1/4, 합계 5주).
(4-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 프로브는, 상동 재조합의 표적 서열의 외측에 IGH5'(i)(실시예 6의 (1-4)) 및 3'측의 표적 서열 외측에 프로브 N3'(ii)를 설정하였다(도 34). N3'(ii) 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제했다:
Figure 112009007627410-PCT00026
1차 스크리닝으로 얻은 12주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 BstEII(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 32P에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 대표적인 결과를 도 35에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석으로 상동 재조합체 19.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 7.6 kb, 3'게놈측 해석으로 상동 재조합체 19.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 8.8 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보 12주로부터 합계 5주의 상동 재조합체를 확인하였다.
이상의 (4-1) 내지 (4-4)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 서열)이 삽입된 14NΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 5주(G94n56Δp21S39, G94n56Δp25S61, G94n56Δp28S7, 8, G8n7Δc2S202, G8n7Δc5S90)을 얻었다. 이 중, G94n56Δp21S39, G94n56Δp25S61, G8n7Δc2S202, G8n7Δc5S90(이하 G4S39, G4S61, G8S202, G8S90이라고 약칭함)의 4주를 다음 단계로 진행시켰다.
(5) CHO 세포에의 14NΔqHAC 벡터 도입
(5-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 14NΔqHAC 벡터의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 6의 (4)에서 얻어진, 장완원위를 결실시켜 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 서열)가 삽입된 14NΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포(G4S39, G4S61, G8S202, G8S90)를 각각 이용하였다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(등록 번호 JCRB9018)를 이용하였다. 방법은, 실시예 1의 (3-1)에 따라서 행하였다. 약 2주간의 선택 배양의 후, 출현한 블라스티사이딘 내성 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 8회(G4S39; 2회, G4S61; 2회, G8S202; 2회, G8S90; 2회)의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 92주(G4S61 유래 19주, G4S39 유래 23주, G8S90 유래 22주, G8S202 유래 28주)의 블라스티사이딘 내성 CHO주를 얻었다.
(5-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 방법은, 실시예 6의 (4-3)에 따라서 행하였다. 또 DT40 세포의 혼입 체크를 위해 닭 β액틴 검출용 프라이머을 GenBank 데이터베이스로부터 얻은 닭 β액틴 유전자의 염기 서열(등록 번호 X00182)로부터 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00027
Ex Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 56℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 35 주기로 행하였다. 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO 세포주 중 67주(G4S61 유래 l5주, G4S39 유래 23주, G8S90 유래 20주, G8S202 유래 9주)에 있어서, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 4.5 kb 및 3'게놈 약 5.0 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것 및 DT40 세포의 혼입이 없는 것을 확인하였다.
(5-3) 서던 블롯 해석
도입한 14NΔqHAC 벡터의 구조를 확인하기 위해서 서던 블롯 해석을 실시예 6의 (4-4)와 동일하게 행하였다. 대표적인 결과를 도 36에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석으로 상동 재조합체 19.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 7.6 kb, 3'게놈측 해석으로 상동 재조합체 19.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 8.8 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보 74주(G4S61 유래 14주, G4S39 유래 16주, G8S90 유래 20주, G8S202 유래 24주)로부터 합계 52주(G4S61 유래 14주, G4S39 유래 16주, G8S90 유래 15주, G8S202 유래 7주)의 상동 재조합체를 확인하였다.
(5-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)을 프로브로 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성 CHO주 중 23주(G4S61 유래 7주, G4S39 유래 11주, G8S202 유래 1주, G8S90 유래 4주)에 대해서 해석한 결과, 합계 9주(G4S61-1, 6, 8, 9, 11, 12, G4S39-13, G8S90-2, 4)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 14NΔqHAC 벡터가 검출되었다. 대표적인 FISH상과 14NΔqHAC 벡터의 핵형을 각각 도 37의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (5-1) 내지 (5-4)의 실험으로부터 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주 9주는 14NΔqHAC 벡터를 보유하는 것이 확인되었다.
실시예 7
(7-1) 14NΔ qHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
14NΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 6에 기재한 14NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포주 2주(G4S39-13, G4S61-1)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 8 ㎍/ml를 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0 xl05 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하여 FISH용 염색체 표본을 제조하였다.
(2) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 2주에 대해서 그 결과를 표 3 및 도 13에 도시하였다. 도 131에서는, 「14ΔqHAC(G)」의 항목에 나타내었다.
표 3: 14NΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성
Figure 112009007627410-PCT00028
14NΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 10계대 후까지의 시점에 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호이 검출되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험에 의해, 14NΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되어 있는 것이 입증되었다.
(7-2) EPO 도입 14AΔ qHAC 벡터 보유 CHO 세포 이식에 의한 생체내 EPO 약효
실시예 3에서 제조한, EPO 도입 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 클론 t7S38-8E5를 면역 세포 차단 캡슐에 봉입한 후, B 세포 결손에 의해 항체 생산할 수 없는 Igμ-/-녹아웃 마우스(Tomizuka, K., et al., PNAS, 97,722-727, 2000) 피하에 이식하고, 말초혈 중의 적혈구수·헤모글로빈·헤마토크릿의 값을 해석함으로써 t7S38-8E5 세포로부터 공급되는 EPO의 생체 내에서의 약효 평가를 행하였다. 상기 3개의 값이 세포 캡슐 이식군에서 대조군과 비교하여 상승하면 EPO 약효있음으로 판단할 수 있다.
EPO 도입 14AΔqHAC 벡터 보유 CHO 세포 클론 t7S38-8E5를 실시예 3의 방법에 따라서 배양하고, 1×106개를 면역 세포 차단 캡슐 TheraCyte immunoisolation 40 μl device(TheraCyte Inc., Irvine, CA)에 첨부된 프로토콜에 따라서 봉입하였다. 이 캡슐을 Igμ-/-녹아웃 마우스 좌측등 피하에 애버틴 마취 하에서 이식하고, 이식 후 경시적으로 안와 채혈하고 말초혈 중의 적혈구수·헤모글로빈·헤마토크릿값을 ADVIA120(바이엘 메디컬사)에 의해 측정하였다. 대조군으로서 캡슐 없이 수술하는 군을 해석하였다. 그 결과를 도 87에 도시한다.
이식 2주 후부터 세포 캡슐 이식군에서 적혈구수·헤모글로빈·헤마토크릿값이 상승하여, 최대 44주까지 상기한 상승한 값이 유지되었다. 이로부터, EPO-14AHAC 보유 CHO 세포 이식에 의한 장기간의 생체 내 EPO 약효가 나타났다.
(7-3) EPO 도입 14 HAC 벡터 보유 인간 정상 섬유아세포 이식에 의한 생체내 EPO 약효
실시예 19에서 제조한, EPO 도입 14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 인간 정상 섬유아세포 HFL-1 세포 클론 tΔ63H으로부터 선택한 tΔ63H15, 또는 tΔ63H15와 마찬가지의 방법으로 제조한 HFL-1 세포 클론 tΔ47H27, 30, 37를 면역 세포 차단 캡슐에 봉입한 후, B 세포 결손에 의해 항체 생산할 수 없는 Igμ-/-녹아웃 마우스 피하에 이식하고, 말초혈 중의 적혈구수·헤모글로빈·헤마토크릿의 값을 해석함으로써, 상기 HFL-1클론으로부터 공급되는 EPO의 생체 내에서의 약효 평가를 행하였다. 상기 3개의 값이 세포 캡슐 이식군에서 대조군과 비교하여 상승하면 EPO 약효 있음이라고 판단할 수 있다.
EPO 도입 14-HAC 보유 HFL-1 세포 클론 tΔ63H15, 또는 tA47H27, 30, 37을 하기 실시예 1 g의 방법에 따라서 배양하고, 106개의 상기 세포를 콜라겐 I 비드(KOKEN)와 함께 면역 세포 차단 캡슐 TheraCyte immunoisolation 40 ㎕ device(TheraCyte Inc., Irvine, CA)에 첨부된 프로토콜에 따라서 봉입하였다. 또한, 세포와 비드는 준비한 캡슐에 1 ml 시린지(텔모(Telmo))에 실리콘 봉입용 어댑터를 장착하고 캡슐 포트(즉, 봉입구)에 접속하여 캡슐 내에 넣었다. 이 캡슐을 6웰 플레이트로 DMEM-20％ FBS 배지를 이용하고 37℃ 6.5％ CO2로 2 내지 6주간 배양 후, 이식 2일전 및 이식 당일에 인간 bFGF(0 또는 10 ng/mD 함유 배지에 교환하고 더욱 배양하였다. 상기 (7-2)와 동일하게 하여 Igμ-/-녹아웃 마우스 좌측 등의 피하에 이식하고, 이식 후 경시적으로 안와 채혈하여 말초혈 중의 적혈구수·헤모글로빈·헤마토크릿값을 ADVIA120(바이엘 메디컬사)에 의해 측정한다.
이에 따라, EPO-14HAC를 보유하는 인간 정상 섬유아세포 이식에 의해서 장기 생체내 EPO 약효를 확인·실시할 수 있다.
(7-4) 14 HAC 벡터의 마우스에서의 자손 전달
14HAC 벡터의 생체 내에서의 안정성 및 자손 전달을 검증하기 위해서, EGFP를 도입한 14HAC 벡터를 제조하고, 마우스 ES 세포에 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의해 도입한 후, 키메라 마우스를 제조·교배하고, 마우스 체세포에서의 HAC 유지율을 해석하였다.
(1) EGFP-14HAC 벡터의 구축
CAG 프로모터 지배 하에 EGFP 유전자를 배치한 플라스미드 pLN1-IRES-EGFP를 제조하고, CHO 세포에서 Cre-loxP 시스템에 의해 14AΔq-HAC 및 14NΔq-HAC 벡터 상에 EGFP 유전자 발현 유닛을 도입하였다.
(1-1) EGFP 발현 플라스미드 pLN1-IRES-EGFP의 제조
pLN1-IRES-EGFP 제조에 앞서서, pLN1-PGK-EGFP를 2 단계로 제조하였다. 단계 1은 pLN1-EPO(Kakeda 등 Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)의 CMV-5'neo 영역의 CMV 프로모터를 PGK 프로모터로 대체하여 제조한 플라스미드 pLN1-PGKEPO를 SalI 소화 후 평활화하고, 또한 EcoR1 소화에 의해 EPO 발현 유닛을 제거하였다. 여기에 pEGFP-N1(클론텍)를 AflII 소화 후 평활화, 또한 EcoRI 소화에 의해 제조한 EGFP-Sv40polyA 유닛을 도입하였다. 단계 2는 단계 1을 SalI-BamHI 소화한 곳에, pCAGGS-Cre(Araki 등, PNAS, 92,160-164, 1995)를 SalI-XbaI 소화에 의해 제조한 CAG 프로모터 전반 부분과, pCAGGS-Cre를 주형으로 하여 PCR 증폭과 XbaI-BamHI 소화에 의해 제조한 CAG 프로모터 후반 부분을 동시에 도입하였다. 이하에 PCR에서 이용한 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112009007627410-PCT00029
다음으로, pLN1-IRES-EGFP를 제조하였다. pLN1(Kakeda 등 Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)을 EcoRI-NcoI 소화하고, CMV 프로모터 및 Sv40polyA를 제거하였다. 여기에, pLN1-PGK-EGFP의 EcoRI-NotI 소화에 의해 제조한 CAG 프로모터 및 EGFP을 포함하는 단편과, pcDNA3.0(인비트로젠) 유래의 IRES 서열을 주형으로 하여 PCR 증폭한 DNA 단편을 NotI-NcoI 소화에 의해 제조한 IRES 단편을 동시에 도입하였다. 이하에 PCR에서 이용한 프라이머 서열을 나타낸다.
Figure 112009007627410-PCT00030
최종적인 pLN1-IRES-EGFP 구조물의 크기는 약 5.7 kb이다.
(1-2) 14AΔqHAC 벡터에의 EGFP 유전자 발현 유닛의 도입
14AΔqHAC 및 14NΔqHAC 벡터에 EGFP 서열을 포함하는 EGFP 유전자 발현 유닛을 삽입한다. loxP 서열을 포함하는 EGFP 발현 플라스미드 pLN1-IRES-EGFP를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다. 14AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 t7S38-6 및 14NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 G4S39-13(실시예 8)를 이용하여, 실시예 3 또는 8의 방법에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 80개(1t7S38-6 유래 40개, G4S39-13 유래 40개)의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
EGFP 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 14AΔq-HAC 및 14NΔq-HAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 pLN1-IRES-EGFP 벡터 상 및 14AΔqHAC 및 14NΔq-HAC 벡터 상에 설계한 프라이머 EGFP374F 및 Neo Rp2에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인하였다. 개략을 도 88에 도시하였다.
Figure 112009007627410-PCT00031
재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 EGFP374F 및 Neo Rp2에 의해 약 1.2 kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-2)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포로부터 합계 80주(t7S38-6 유래 40주, G4S39-13 유래 40주)에서 예상되는 증폭이 확인되었다. 이로부터, 상기한 G418 내성 CHO 잡종. 세포 합계 80주가 loxP 서열에의 EGFP 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것이 입증되었다.
(1-4) 서던 블롯 해석
EGFP-14AΔq-HAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터에서 EGFP 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 프로브는, EGFP 코드 영역의 염기 서열 78 내지 395번째의 318bp를 PCR 증폭하여 제조하였다. 이용한 프라이머 서열을 이하에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00032
염기 서열로부터 예상되는 EcoRI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, EGFP 발현 유닛을 포함하는 7.5 kb이다. 개략을 도 89에 도시하였다.
상기 (1-3)에서 얻은 G418 내성 후보 CHO 잡종 세포 80주로부터 합계 70주(t7S38-6 유래 34주, G4S39-13 유래 36주)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-5) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-4)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 15주(t7S38-6 유래 8주, G4S39-13 유래 7주)에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 11주(t7S38-0 유래 6주; t6EGI-2,6,9,11,24,30, G4S39-13 유래 5주; G13EGI-1,5,15,17,20)에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 EGFP-14AΔqHAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터를 검출하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-5)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 11주는 EGFP-14AΔq-HAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포(t6EGI-2,6,9,11,24,30) 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포(G13ECI-1,5,15,17,20)인 것이 입증되었다.
(2) EGFP-14AΔqHAC 또는 EGFP-14NΔqHAC 벡터 도입 마우스 ES 세포의 제조
(2-1) 마우스 ES 세포 TT2F에의 EGFP-14HAC 벡터 도입
상기 (1)에서 제조한 CHO 클론 t6EGI-11, t6EGI-24, G13EGI-1, G13EGI-5(이하 각각 t11, t24, G1, G5라고 기재함)를 HAC 공여 세포로서, 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의해(Tomizuka 등, Nature Genetics, 16,133-143, 1997) EGFP-14AΔq-HAC 벡터 또는 EGFP-14NΔq-HAC 벡터를 마우스 ES 세포 TT2F 에 도입하였다. 그 결과, 1 내지 2주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 12개의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(2-2) PCR 해석
상기 (7-4)(1-3)의 방법에 의해 EGFP-14AΔqHAC 및 EGFP-14NΔqHAC 벡터 도입 클론 선별을 위해 PCR 해석을 행하였다. 그 결과, 상기 (2-1)에서 단리한 G418 내성 마우스 ES 잡종 콜로니 전부에서 예상되는 증폭이 확인되었다. 이로부터, 상기한 G418 내성 마우스 ES 잡종 세포 12주가 EGFP-14AΔqHAC 및 EGFP-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 것을 확인하였다.
(2-3) 서던 블롯 해석
EGFP-14AΔq-HAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터에서 EGFP 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 상기 (7-4)(1-4)와 같이 하여 서던 블롯 해석을 행하였다. 그 결과, 상기 (2-2)에서 얻은 G418 내성 후보 마우스 ES 잡종 세포 12주로부터 합계 11주에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(2-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-4)에서 얻은 G418 내성 마우스 ES 잡종 세포 중 8주(1-t11, 2-t11, 3-t11, 4-t11, 32-G1, 33-t24, 34-t24, 35-t24)에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 6주에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 EGFP-14AΔqHAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터를 검출하였다.
이상 (2-1) 내지 (2-4)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 마우스 ES 잡종 세포 5주(1-t11, 2-t11, 3-t11, 33-t24, 34-t24)는 EGFP-14AΔq-HAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 마우스 ES 세포인 것이 입증되었다.
(3) 키메라 마우스에서의 14HAC 벡터의 유지율
(2)에서 얻어진 EGFP-14HAC를 보유하는 G418 내성 마우스 ES 잡종 세포를 이용하여, (Tomizuka 등, Nature Genetics, 16,133-143, 1997)의 방법에 따라서 행하여, 키메라 마우스를 얻었다. 키메라 마우스에서의 14HAC 벡터 보유를 확인하기 위해서 상기 (7-4)(2-2)의 방법 및 하기의 프라이머 세트를 이용하여 PCR 해석을 행하였다(개략은 도 88에 나타냄).
Figure 112009007627410-PCT00033
그 결과, 얻어진 키메라 마우스에서 예상되는 증폭을 확인하였다. 종합 정리를 도 90에 도시하였다. 이로부터, 상기한 키메라 마우스 체세포에서 EGFP-14AΔq-HAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터가 보유되어 있는 것을 확인하였다.
(4) EGFP-14AΔq-HAC 및 EGFP-14NΔq-HAC 벡터의 자손 전달
상기 (3)에서 얻어진 키메라 마우스(암컷)과 C57BL6 마우스(수컷)을 교배하고, EGFP-14AΔqHAC 및 EGFP-14NΔqHAC 벡터의 자손 전달을 검증하였다. 방법은 상기 (7-4)(3)과 같이 PCR 해석을 행하고, HAC의 보유를 지표로 평가하였다. 그 결과, EGFP-14AΔqHAC 벡터는, F1 마우스에서 46.6％(N=133), F2 마우스에서 36.9％(N=84)이고, EGFP-14NΔqHAC 벡터는, F1 마우스에서 59.4％(N=79)의 개체에서 예상되는 증폭을 확인하였다. 이로부터, EGFP-14AΔqHAC 및 EGFP-14NΔqHAC 벡터의 자손 전달을 확인하였다.
또한, 상기에서 얻어진 EGFP-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 F1 마우스(수컷)과(암컷)을 교배하여, 새끼 마우스 꼬리 섬유아세포를 채취배양한 후, 카르노이(Carnoy's) 용액에 고정하고, FISH 해석을 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 그 결과, 꼬리 섬유아세포 중에 2카피의 EGFP-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 개체를 확인하였다.
실시예 8
hEPO -14NΔ qHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 hEPO 유전자 발현 해석
(1) hEPO-14NΔqHAC 벡터의 구축
(1-1) 14NΔqHAC 벡터에의 hEPO 유전자의 도입
실시예 6에서 구축한 14NΔqHAC 벡터에 hEPO 유전자 발현 유닛을 삽입한다. loxP 서열을 포함하는 hEPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다. 실시예 6에서 제조한 14NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포(G4S61-1, 9, G4S39-13, G8S90-4)를 이용하고, 실시예 3의 (1-1)과 동일하게 하여 hEPO 유전자 발현 유닛의 삽입을 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 246개(G4S61-1 유래 61개, G4S61-9 유래 75개, G4S39-13 유래 73개, G8S90-4 유래 37개)의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-2) PCR 해석
hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 14NΔqHAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 pLN1-EPO 벡터 상 및 14NΔqHAC 벡터 상에 설계한 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해서, 또한 삽입된 hEPO 유전자를, 플라스미드 벡터 pBS226 상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인하였다. 프라이머 서열 및 PCR는 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7·kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포로부터 합계 116주(G4S61-1 유래 31주, G4S61-9 유래 34주, G4S39-13 유래 35주, G8S90-4 유래 16주에서 예상되는 증폭이 확인되었다. 이로부터, 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 116주가 loxP 서열에의 hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-14NΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 38에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다. 상기 (1-2)에서 얻은 G418 내성 후보 CHO 잡종 세포 합계 130주(G4S61-1 유래 36주, G4S61-9 유래 40주, G4S39-13 유래 35주, G8S90-4 유래 19주)로부터, 합계 60주(G4S61-1 유래 13주, G4S61-9 유래 18주, G4S39-13 유래 19주, G8S90-4 유래 10주)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-3)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 23주에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 15주(G4S61-1E6, 9, G4S61-9E28, 34, 35, 65, G4S39-13E3, 4, 5, 16, 55, 61, 71, G8S90-4E16, 18이라고 이하 칭함)에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 검출하였다. 대표적인 FISH상을 도 39의 A에, 또한 핵형을 도 39의 B 및 도 41에 도시하였다. 도 41에 도시하는 13E4, 13E55, 1E6 및 4E16은 각각 G4S39-13E4, G4S39-13E56, G4S61-1E6 및 G8S90-4E16을 나타낸다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터 얻어진 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 15주는, hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포인 것이 입증되었다.
(2) 14NΔqHAC 벡터에 삽입된 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1-3)에서 단리한 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 48주(G4S61-1E 유래 11주, G4S61-9E 유래 16주, G4S39-13 유래 19주, G8S90-4 유래 5주)를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ml로 대체하여 2일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ml로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 40에 도시하였다. 이로부터, 상기 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 9
hEPO -14NΔ qHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-14NΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 8에서 얻은 CHO 잡종 세포 4주(G4S61-1E6, G4S39-13E4, 55, G8S90-4E16)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 0.8 mg/㎖의 G418을 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하고, hEPO 유전자의 발현 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다. 상기 G4S61-1E6, G4S39-13E4, 55, G8S90-4E16주에 대해서 실시예 8의 (2)의 방법에 따라서 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 41에 도시하였다. 이로부터, 상기 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 4주 전부에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다.
(3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 4주에 대해서 그 결과를 표 4 및 도 41에 도시하였다.
Figure 112009007627410-PCT00034
hEPO-14NΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 10계대 후까지 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호이 검출되었다.
이상의 (1) 내지 (3)의 실험에 의해, hEPO-14NΔqHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 CHO 세포에서, 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 세포당의 카피수가 유지되는 것, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 입증되었다.
실시예 10
hEPO -14NΔ qHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 hEPO 유전자 발현
(1) hEPO-14NΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 제조
(1-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 hEPO-14NΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에의 도입
염색체 공여 세포로서, 실시예 9에서 얻어진 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포주 중, 미소핵 형성능이 높은 클론(G4S61-1E6, G4S39-13E4, 55, G8S90-4E16)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로는, 인간 정상 섬유아세포 HFL-1(이화학 연구소 세포 재료 개발실로부터 입수, 등록 번호 RCB0521)를 이용하였다. 미소핵 융합은 상기 실시예 5의 (1)과 동일하게 행하였다. 약 4주간의 선택 배양의 후, 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하여 이후의 해석을 행하였다. 32회(각 8회×4주)의 미소핵 세포 융합으로부터 47개의 약제 내성 콜로니를 얻었다. 이하에서는, 상기 콜로니 중 염색체 공여 세포로서 G4S61-1E6 세포를 이용하여 얻은 세포를 G6H 세포로, G4S39-13E4 세포를 이용하여 얻은 세포를 G4H 세포로, G4S39-13E55 세포를 이용하여 얻은 세포를 G55H 세포로, G8S90-4E16 세포를 이용하여 얻은 세포를 G16H 세포로 칭한다.
(1-2) PCR 해석
hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는지 여부를 실시예 3의 (1-2)의 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2를 이용하고, 인간 염색체를 STS 마커 D2S1334의 프라이머를 이용하여 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따라서 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 또한, 염색체 공여 CHO 세포의 혼입의 유무를 CHO furin 유전자 특이적 프라이머 furin3'subF 및 furinEx6-28R을 이용하여 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 방법은 상기 실시예 5의 (1-2)와 동일하게 행하였다.
hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포로 염색체 공여 CHO 세포의 혼입이 없는 경우에, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp의 증폭, D2S1334 프라이머에 의해 약 0.6 kbp의 증폭, furin3'subF 및 furinEx6-28R에 의한 증폭 없음이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 블라스티사이딘 내성주 47주로부터 합계 17주(G6H; 2주, G4H; 4주, G55H; 6주, G16H; 5주)에서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이로부터, 상기한 블라스티사이딘 내성주 17주가 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-14NΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조시하기 위해, 상기한 블라스티사이딘 내성주 중 13주에 대해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 19의 B에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다. 그 결과, 상기 (1-2)에서 얻은 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성주 9주(G4H2, 4, 5, G6H3, G16H17, 21, 23, G55H7, 9)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 14번 및 22번 염색체 특이적 α 부수 DNA 프로브(Q-biogene, 후나코시)를 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성주 중 3주(G4H2, G16H17, G55 H7)에 대해서 해석한 결과, 합계 3주가 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에 있어서, 숙주 세포 유래의 1쌍의 인간 14번 및 22번 염색체 센트로미어 영역의 4개 부위와 1카피의 14NΔqHAC 벡터 유래의 1개 부위에 신호이 검출되었다. 그 결과를 도 42의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성주 3주는 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(2) hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포에서의 hEPO 유전자 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 단리한 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성 HFL-1 세포 9주(G4H2, 4, 5, G6H3, G16H17, 21, 23, G55H7, 9)에 대해서, 각각 약 105 세포를 블라스티사이딘(3 ㎍/ml)를 포함하는 선택 배지(20％ FBS, DMEM) 1 ml를 넣은 콜라겐 I 코팅한 24웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 그 결과를 도 21의「14N-HAC」의 항목에 나타내었다.
이로부터, 상기 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 11
hEPO -14NΔ qHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 장기 EPO 발현
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-14NΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 10에서 얻은 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 4주(G4H2, G16H17, G16H21, G55H7)를 사용하였다. 비선택 배양액은 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 3 ㎍/㎖를 첨가하였다. hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포주는 1 내지 3×105 세포를 콜라겐-I 코팅한 T-25 플라스크(팔콘)에 접종하고, 세포 밀도가 90％ 포화될 때까지 배양하고, 다시 1 내지 3×105 세포를 접종하여 6 내지 10계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. 또한, 5 및 10계대 전후에 세포를 회수하여, hEPO 유전자 발현 해석 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 4주를, 약 104 세포로 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지 2 ml를 넣은 콜라겐-I 코팅 24웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지 1 ㎖로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다., 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 43에 도시하였다.
이로부터, 상기 hEPO-14NΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 4주 전부에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다.
이상의 실험에 의해, hEPO-14NΔqHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 HFL-1 세포에서, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 입증되었다.
실시예 12
서브텔로미어 영역을 포함하는 14 HAC (14 gN Δ qHAC ) 벡터의 구축
HAC 벡터가 텔로미어 서열 및 인간 14번 염색체 말단의 약 60 kb의 서브텔로미어 영역을 함유하도록, 장완원위 및 근위에 loxP 서열을 상동 재조합에 의해 삽입하고, Cre에 의한 부위 특이적 재조합 반응에 의해 2개 부위의 loxP 서열 사이의 영역을 추출하고 결실시켜 장완원위 결실 인공 염색체(14gNΔqHAC) 벡터를 구축한다.
(1) 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 14번 염색체 장완 결실
(1-1) 인간 14번 염색체 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxpPGK-14qtel-2의 구축
loxP 서열 삽입용 벡터(타겟팅 벡터)에는, 실시예 6의 (1-1)의 ploxPupBSD-PGK를 이용하였다. GenBank 데이터베이스로부터 얻은 인간 14번 염색체 장완원위의 염기 서열(등록 번호 AB019437)로부터, ploxpPGK-14qtel-2 벡터 삽입의 2개 부위의 표적 서열을 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한, 제한 효소 인식 서열을 부가한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00035
실시예 1의 (1-1)의 방법에 따라서, 인간 14번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(A9c11-14chr)의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기한 프라이머를 이용하여 5' 및 3'측의 2개의 재조합 표적 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, AB01 38KpnIFw/AB01 40ApaIFw에 의한 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 6분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 30 주기, 신장 70℃ 10분으로 행하였다. 또한, AB01 42SpeIFw/AB01 47EcoRV에 의한 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 8분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 8분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 8분을 30 주기, 신장 70℃ 10분으로 행하였다. AB01 38KpnIFw/AB01 40ApaIFw에 의한 2.0 kb의 증폭 산물은, 제한 효소 KpnI 및 ApaI로 소화시키고, ploxPupBSD-PGK 벡터의 KpnI-ApaI 사이트에 클로닝하였다. 또한, AB01 42SpeIFw/AB01 45R에 의한 3.0 kb의 증폭 산물을 SpeI-BamHI 소화하고, 또한 AB01 45F/AB01 47EcoRV에 의한 2.0 kb의 증폭 산물을 BamHI-EcoRV 소화하고, 상기한 2 단편을 한번 pBluescript 벡터에 서브클로닝한 후 SpeI-EcoRV 소화하고, 상기한 2.0 Kb의 표적 서열을 갖는 ploxPupBSD-PGK 벡터의 NheI-EcoRV 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 ploxpPGK-14qtel-2 구조물의 크기는 약 12.1 kb이다. ploxpPGK-14qtel-2 벡터 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 44 및 도 45에 도시하였다.
(1-2) 인간 14번 염색체 보유 DT40 잡종 세포에의 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxpPGK-14qtel-2 벡터 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, ploxpPGK-14qtel-2 구조물을 제한 효소 SrfI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포 DT40(-14)1-2 및 DT40(-14)2-4에 도입하였다. 블라스티사이딘(종농도 8 ug/ml)로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다. DT40(-14)1-2의 경우에는, 6회의 형질감염으로부터 합계 1738개의 블라스티사이딘 내성 콜로니를 DT40(-14)2-4의 경우에는, 4회의 형질감염으로부터 합계 618개의 블라스티사이딘 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 실시예 12의 (1-1)의 방법에 따라서, PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 45 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 46 중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00036
상기 DT40(-14)1-2 유래의 블라스티사이딘 내성 1738주 중 2주에 있어서, DT40(-14)2-4 유래의 블라스티사이딘 내성 618주 중 5주에서 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 확인하였다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 5' 및 3' 측의 2 표적 서열 외측에 프로브(g2-5' 및 g2-3')을 설정하였다(도 45). 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제했다:
Figure 112009007627410-PCT00037
1차 스크리닝으로 얻은 블라스티사이딘 내성주로부터 추출한 게놈 DNA 약 10 μg을 제한 효소(5'측) SacI 또는 BstEII(3'측)에 의해(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 표지한 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 대표적인 결과를 도 47에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 7.2 kb, 야생형(비재조합체)으로 4.8 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 21.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.6 kb이다. DT40(-14)1-2 유래의 후보주 2주로부터 합계 1주(12g5)의 상동 재조합체를, DT40(-14)2-4 유래의 후보주 5주로부터 합계 3주(24g15, 24g67, 24g91)의 상동 재조합체를 확인하였다.
(2) 인간 14번 염색체 장완근위 센트로미어측에의 loxP 서열 삽입
(2-1) ploxpPGK-14qtel을 도입한 인간 14번 염색체 보유 DT40 세포에의 장완근위 센트로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 ploxPHYGOR/n1 벡터 도입
실시예 6의 (2-1)에서 제조한 ploxPHYGOR/n1 구조물을 제한 효소 SrfI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 실시예 13의 (1-4)에서 제조한 ploxpPGK-14qtel-2를 도입한 인간 14번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포 12g5 및 24g15 및 24g67에 도입하였다. 방법은, 실시예 1의 (1-2)에 따랐다. 2 내지 3주간의 선택 배양 후, 푸로마이신 내성 콜로니가 출현하였다. 각 2회, 합계 6회의 형질감염으로부터 합계 252개(12g5 유래 78개, 24g15 유래 128개, 24g67 유래 46개)의 푸로마이신 내성 콜로니를 단리하여 이후의 해석을 행하였다.
(2-2) PCR 해석
상기 (2-1)에서 취득한 푸로마이신 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 실시예 7의 (2-1)의 방법에 따라서, PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 27 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 28중에 화살표로 나타내었다. 상기 푸로마이신 내성으로부터 39주(12g5 유래 13주, 24g15 유래 24주, 24g67 유래 2주)에서 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 확인하였다.
(2-3) 서던 플롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은 실시예 6의 (2-4)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 48에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 12.5 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 10.2 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이고, 상기 (2-2)에서 취득한 후보주 중 25주로부터 합계 23주(12g5 유래 11주, 24g15 유래 10주, 24g67 유래 2주)의 상동 재조합체를 확인하였다. 이들 중에서, 24gl5 유래의 클론 24g15 n28(이하 g5n8이라고 칭함) 및 24g67 유래의 클론 24g67n19(이하 g7n9라고 칭함)를 다음 단계 (3)으로 진행시켰다.
(3) Cre-loxP 부위 특이적 재조합 반응에 의한 장완원위의 결실
(3-1) 장완원위 및 근위에 loxP 서열 삽입한 인간 14번 염색체 보유 DT40 잡종 세포에의 Cre 발현 벡터의 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, Cre 발현 벡터 pCAGGSCre를 실시예 12의 (2)에서 취득한 g5n8 및 g7n9 세포에 도입하였다. 하이그로마이신(종농도 1.25 mg/ml)로 선택 배양을 행하여 2 내지 3주간 후에 약제 내성 콜로니가 출현하였다. 각 2회, 합계 4회의 형질감염으로부터 합계 16개(g5n8 유래 11개, g7n9 유래 5개)의 하이그로마이신 내성 콜로니를 단리하여 이후의 해석을 행하였다.
(3-2) PCR 해석
하이그로마이신 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 loxP 서열 사이의 결실을 PCR법에 의해 확인하였다. 방법은, 실시예 6의 (3-2)에 따라서 행하였다. 장완원위 결실 후에 남은 loxP 서열을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 28 중에 화살표로 나타내었다. 그 결과, 상기 하이그로마이신 내성주 16주 중 12주(g5n8 유래 7주, g7n9 유래 5주)에서 예측되는 증폭 산물을 확인하였다.
(3-3) 서던 플롯 해석
장완원위 결실체를 구조 확인 및 선별하기 위해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 장완원위 결실에 의해 생기는 표적 서열, 염색체 대립 유전자 및 프로브의 위치를 도 30의 B에 도시하였다. 상동 재조합의 5' 및 3'측의 2 표적 서열 외측에 프로브(g2-5'(i) 및 N3'(i))을 설정하였다(도 30의 B). 상기 실시예 13의 (3-2)에서 얻은 하이그로마이신 내성주 9주(g5n8 세포 유래 5주 및 g7n9 세포 유래 4주)로부터 게놈 DNA를 추출하고 실시예 13의 (1-4) 및 (2-4)와 같이 행하였다. 제한 효소(로슈) 소화는, SacI(5'측) 또는 StuI(3'측)에 의해 행하였다. 대표적인 결과를 도 49에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 9.2 kb, 야생형(비재조합체)으로 7.2 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 8.3 kb, 야생형(비재조합체)으로 10.2 kb이다. 그 결과, 합계 5주(g5n8 세포 유래 3주 및 g7n9 세포 유래 2주)에서 장완원위 결실체를 확인하였다.
(3-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (3-3)에서 취득한 5주(g5n8Δc3/Δd1/Δd4, g7n9Δc1/Δc3)에 대해서 해석한 결과, 전부에서 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 신호를 검출하였다. 대표적인 FISH상 및 HAC 벡터의 핵형을 각각 도 50의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (3-1) 내지 (3-4)의 실험으로부터, 얻어진 하이그로마이신 내성 DT40 잡종 세포는, 천연 텔로미어를 남기고 장완원위를 결실시킨 인간 14번 염색체 단편(14gNΔqHAC)을 보유하는 것을 확인하였다.
(4) 14gNΔqHAC 장완근위에의 클로닝 부위의 도입
(4-1) loxP 및 3'neo 서열 삽입용 pSF(g+n1) 벡터의 구축
상기 실시예 12의 (3)에서 제조한 인간 인공 염색체(HAC)에 loxP 및 3' neo 서열을 삽입하기 위해서 기본 플라스미드에는, 실시예 1의 (2-1)에서 제조한 pSF1③를 이용하였다. loxP 및 3'neo 삽입 부위인 상동 재조합의 5'측 표적 서열은 상기 실시예 12의 (1-1)에서 취득한 ploxpPGK-14qtel2 벡터로 이용한 서열로부터, 3'표적 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 얻은 인간 14번 염색체 장완근위의 염기 서열(등록 번호 AL391156)로부터 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00038
5'측 표적 서열은, ploxpPGK-14qtel2 벡터로부터 SalI 및 SrfI(로슈)로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여 정제한 후, pSF1③ 플라스미드의 SalI-SrfI 사이트에 클로닝하였다. 또 3'측 표적 서열은, 인간 14번 염색체를 보유하는 A9c11-14chr 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하였다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, MgSO4(종농도 0.5 mM)를 첨가하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 8분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 8분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 8분을 30 주기, 신장 72℃ 10분으로 행하였다. 이 약 5.0 kb의 DNA 단편을 제한 효소 FseI 및 SrfI(로슈)로 소화시키고, 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여 정제한 후, 상기 5'표적 서열을 삽입한 pSF1③ 플라스미드의 FseI-SrfI 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 pSF1(g+n1) 구조물의 크기는 약 13.2 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 51 및 도 34의 B에 도시하였다.
(4-2) 14gNΔqHAC 보유 DT40 세포에의 pSF(g+n1) 벡터 도입
pSF(g+n1) 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 14NΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포 3종(g5n8Δc3/Δd1, g7n9Δc1)에 각각 도입하였다. 방법은, 실시예 1의 (2-2)에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하였다. 3회의 형질감염으로부터 합계 154개(g5n8Δc3; 99개, g5n8Δd1; 34개, g7n9Δc1; 21개)의 약제 내성 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다.
(4-3) PCR 해석
상기 블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 34의 B 중에 화살표로 나타내었다. 5'측 표적 서열 검출용 프라이머의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00039
방법은 실시예 13의 (4-1)에 따라서 행하였다. 5'측 표적 서열 검출용의 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 6분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 30 주기, 신장 72℃ 10분으로 행하였다. 얻어진 블라스티사이딘 내성주 중, 13주(g5n8Δc3; 3주, g5n8Δd1; 8주, g7n9Δc1; 2주)가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 2.0 kb 및 3'게놈 약 5.0 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(4-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 프로브는, 상동 재조합의 표적 서열의 외측에 g2-5'(i)(실시예 12의 (1-4)) 및 N3'(ii)(실시예 6의 (4-4))를 설정하였다(도 34의 B). 실시예 12의 (4-3)에서 얻은 약제 내성 후보주로부터 게놈 DNA를 추출하여 실시예 12의 (1-4)와 같이 행하였다. 제한 효소(로슈) 소화는, SphI(5'측) 또는 BstEII(3'측)에 의해 행하였다. 대표적인 결과를 도 52에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈 측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 11.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 4.6 kb이고, 3'게놈 측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 15.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 8.8 kb이다. 상기한 것이나 약제 내성 후보주 13주로부터 합계 9주의 상동 재조합체를 확인하였다.
이상의 (4-1) 내지 (4-4)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 서열)이 삽입된 14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 합계 9주(g5n8Δc3s13, g5n8Δd1 s3, 4, 6, 8, 9, 10, g67n19Δc1s9, 21)을 얻었다. 이 중, g5n8Δc3s13 및 g67n19Δc1s9의 2주를 다음 단계로 진행시켰다.
(5) CHO 세포에의 14gNΔqHAC 벡터 도입
(5-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 14gNΔqHAC 벡터의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 12의 (4)에서 얻어진, 장완원위를 결실시켜 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 서열)이 삽입된 14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포(g5n8Δc3s13 및 g67n19Δc1s9)을 각각 이용하였다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(등록 번호 JCRB9018)를 이용하였다. 방법은, 실시예 1의 (3-1)에 따라서 행하였다. 약 2주간의 선택 배양의 후, 출현한 블라스티사이딘 내성 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 4회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 55주(g5n8Δc3s13 유래 32주, g67n19Δc1s9 유래 23주)의 블라스티사이딘 내성 CHO주를 얻었다.
(5-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 방법은, 실시예 6의 (5-2)에 따라서 행하였다. 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO 중 52주(g5n8Δc3s13 유래 29주, g67n19Δc1s9 유래 23주))가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 2.0 kb 및 3'게놈 약 5.0 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것 및 DT40 세포의 혼입이 없는 것을 확인하였다.
(5-3) 서던 블롯 해석
도입한 14gNΔqHAC 벡터의 구조를 확인하기 위해서 서던 블롯 해석을 실시예 12의 (4-4)와 동일하게 행하였다. 대표적인 결과를 도 53에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈 측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 11.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 4.6 kb이고, 3'게놈 측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 15.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 8.8 kb이다. 상기 블라스티사이딘 내성 후보주 36주로부터 합계 35주(g5n8Δc3s13 유래 17주, g67n19Δc1s9 유래 18주)의 상동 재조합체를 확인하였다. 도 53 및 54에 있어서, 「g5S13」 및 「g7S9」은, 각각 g5n8Δc3s13 유래주 및 g67n19Δc1s9 유래를 나타낸다.
(5-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성 CHO주 중 15주(g5n8Δc3s13 유래 6주, g67n19Δc1s9 유래 9주)에 대해서 해석한 결과, 합계 5주(g5n8Δc3s13-9, 12의 2주: 이하 g5S13-9, g5S13-12라고 칭하고, g67n19Δc1s9-11, 12, 17의 3주: 이하 g7S9-11, g7S9-12, g7S9-17이라고 칭함)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 14gNΔqHAC 벡터가 검출되었다. 대표적인 FISH상 및 14gNΔqHAC 벡터의 핵형을 각각 도 54의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (5-1) 내지 (5-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주 5주는, 정상 핵형 또한 1카피의 14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 것이 확인되었다.
실시예 13
14gNΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
14gNΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 7에 기재한 14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포주 2주 g5S13-9, g5S13-12를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 8 ㎍/ml를 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×l05 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하여 FISH용 염색체 표본을 제조하였다.
(2) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다., 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 2주에 대해서 그 결과를 표 5 및 도 13에 도시하였다. 도 13에서는, 14gΔqHAC(g)의 항목에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00040
14gNΔqHAC 벡터는 CHO 세포에서 10계대 후까지의 시점에 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호이 검출되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험에 의해, 14gNΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되어 있는 것이 입증되었다.
실시예 14
hEPO -14 gN Δ qHAC 벡터의 CHO 세포에서의 hEPO 유전자 발현 해석
(1) hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 구축
(1-1) 14gNΔqHAC 벡터에의 hEPO 유전자의 도입
실시예 7에서 구축한 14gNΔqHAC 벡터에 hEPO 유전자 발현 유닛을 삽입한다. loxP 서열을 포함하는 hEPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다., 실시예 13에서 제조한 14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(g5S13-12 및 g7S9-11)를 이용하여, 실시예 3의 (1-1)과 동일하게 하여 hEPO 유전자 발현 유닛의 삽입을 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 169개(g5S13-12 유래 77개, g7S9-11 유래 92개)의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-2) PCR 해석
hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 14gNΔqHAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 pLN1-EPO 벡터 상 및 14gNΔqHAC 벡터 상에 설계한 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해서, 또한 삽입된 hEPO 유전자를, 플라스미드 벡터 pBS226상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인하였다. 프라이머 서열 및 PCR는 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7 kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포로부터 합계 69주(g5S13-12 유래 32주, g7S9-11 유래 37주)에서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이로부터, 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 69주가 loxP 서열에의 hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 플롯 해석
hEPO-14gNΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 55에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다. 상기 (1-2)에서 얻은 G418 내성 후보 CHO 잡종 세포 합계 65주(g5S13-12 유래 24주, g7S9-11 유래 41주)로부터 합계 32주(g5S13-12 유래 10주, g7S9-11 유래 22주)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-3)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 17주에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 5주(g5S13-12 유래 1주; 이하 g5S13-12E23이라고 칭하고, g7S9-11 유래 4주; 이하 g7S9-11E28, 48, 57, 62라고 칭함)에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1으로 염색한 1카피의 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 검출하였다. 대표적인 FISH상 및 hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 핵형을 각각 도 56 A 및 B에 도시하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 5주는, hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포인 것이 입증되었다.
(2) 14gNΔqHAC 벡터에 삽입된 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 1)에서 단리하고 서던 해석으로 hEPO 유전자 발현 유닛의 존재 및 구조를 확인한 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 28주를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ㎖을 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ㎖로 대체하여 7일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ml로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 57에 도시하였다.
이로부터, 상기 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 28주 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 15
hEPO -14 gN Δ qHAC 벡터의 CHO 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 15에서 얻은 CHO 잡종 세포 3주(g5S13-12E23, g7S9-11E28, 62)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 0.8 mg/㎖의 G418을 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하고, hEPO 유전자의 발현 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 3주를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ml로 대체하여 7일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ㎖로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 58에 도시하였다.
이로부터, 상기 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 3주 전부에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다.
(3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 3주에 대해서 그 결과를 표 6 및 도 58에 도시하였다.
Figure 112009007627410-PCT00041
hEPO-14gNΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 10계대 후까지 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호이 검출되었다.
이상의 (1) 내지 (3)의 실험에 의해, hEPO-14gNΔqHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 CHO 세포에서, 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 세포당의 카피수가 유지되는 것, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 입증되었다.
실시예 16
hEPO -14 gN Δ qHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 hEPO 유전자 발현
(1) hEPO-14gNΔqHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 제조
(1-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에의 도입
염색체 공여 세포로서, 실시예 15에서 얻어진 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포주 중, 미소핵 형성능이 높은 클론(g5S13-12E23, g7S9-11E28, 62)을 이용하였다. 염색체 수용 세포로는, 인간 정상 섬유아세포 HFL-1(이화학 연구소 세포 재료 개발실로부터 입수, 등록 번호 RCB0521)를 이용하였다. 미소핵 융합은 상기 실시예 5의 (1)과 동일하게 행하였다. 약 4주간의 선택 배양의 후, 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하여 이후의 해석을 행하였다. 24회의 미소핵 세포 융합으로부터 51개(g5S13-12E23 유래 3개, g7S9-11E28 유래 22개, g7S9-11E62 유래 26개)의 약제 내성 콜로니를 얻었다. 상기 콜로니 중, 염색체 공여 세포로서 g5S13-12E23세포를 이용하여 얻은 세포를 g23H 세포라고, g7S9-11E28 세포를 이용하여 얻은 세포를 g28H 세포라고, g7S9-11-E62 세포를 이용하여 얻은 세포를 g62H 세포라고 이하 칭한다.
(1-2) PCR 해석
hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는지 여부를 실시예 3의 (1-2)의 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2를 이용하여, 인간 염색체를 STS 마커 D2S1334의 프라이머를 이용하여 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따라서 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 또한, 염색체 공여 CHO 세포의 혼입의 유무를 CHO furin 유전자 특이적 프라이머 furin3'subF 및 furinEx6-28R을 이용하고 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 방법은 상기 실시예 5의 (1-2)와 동일하게 행하였다. hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포로 염색체 공여 CHO 세포의 혼입이 없는 경우에, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp의 증폭, D2S1334 프라이머에 의해 약 0.6 kbp의 증폭, furin3'subF 및 furinEx6-28R에 의한 증폭 없음이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 블라스티사이딘 내성주 50주로부터 합계 6주(g23H1, 2, 3, g28H18, 22, g62H26)에서 예상되는 증폭이 확인되었다.
이로부터, 상기한 블라스티사이딘 내성주 6주가 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-14gNΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 상기한 블라스티사이딘 내성주 6주 중 4주(g23H1, 3, g28H18, g62H26)에 대해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 19의 C에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다. 그 결과, 상기 (1-2)에서 얻은 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성주 3주(g23H1, 3, g62H26)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 14번 및 22번 염색체 특이적 α 부수 DNA 프로브(Q-biogene, 후나코시)를 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성주 3주(g23H1, 3, g62H26)에 대해서 해석한 결과, 2주(g23H3, g62H26)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에 있어서, 숙주 세포 유래의 1쌍의 인간 14번 및 22번 염색체 센트로미어 영역의 4개 부위와 1카피의 14gNΔqHAC 벡터 유래의 1개 부위에 신호이 검출되었다. 그 결과를 도 59의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성주 2주는 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(2) hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포에서의 hEPO 유전자 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 단리하고 서던 해석으로 hEPO 발현 유닛 구조를 확인한 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성 HFL-1 세포 3주에 대해서, 각각 약 105 세포를 블라스티사이딘(3 ㎍/ml)를 포함하는 선택 배지(20％ FBS, DMEM) 1 ㎖를 넣은 콜라겐 I 코팅한 24웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지로 대체하여 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 그 결과를 도 21의「14gN-HAC」의 항목에 나타내었다.
이로부터, 상기 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 HFL-1 세포 3주 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 17
hEPO -14 gN Δ qHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-14gNΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 16에서 얻은 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 3주(g23H1, g23H3, g62H26)를 사용하였다. 비선택 배양액은 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 3 ㎍/㎖를 첨가하였다. hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포주는 1 내지 3×105 세포를 콜라겐-I 코팅한 T-25 플라스크(팔콘)에 접종하고, 세포 밀도가 90％ 포화될 때까지 배양하고, 다시 1 내지 3×lO5 세포를 접종하여 5 내지 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. 또한, 5계대 전후 및 10계대 후에 세포를 회수하고, hEPO 유전자 발현 해석 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 2주 g23H1, g62H26을, 약 104 세포로써 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지 2 ㎖을 넣은 콜라겐-I 코팅 24웰 또는 48웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 43에 도시하였다.
이로부터, 상기 hEPO-14gNΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 2주 전부에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다.
이상의 실험에 의해, hEPO-14gNΔqHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 HFL-1 세포에서, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 입증되었다.
실시예 18
Neo 내성 유전자 유닛 제거 hEPO -14AΔqΔ neo - HAC 벡터의 구축
14AΔq-HAC 벡터 상 및 pLN1/EPO 플라스미드 상의 hEPO 발현 유닛 하류에 FRT 서열을 삽입하고, hEPO-14AΔq-HAC 벡터 상에서 FRT/FLPe 부위 특이적 재조합 시스템에 의해 Neo 내성 유전자 발현 유닛을 제거한다. 그 개략을 도 60에 도시하였다.
(1) 14AΔqHAC 클로닝 부위에의 FRT 서열의 도입
(1-1) FRT 서열 도입용 벡터 t1pSF1-FRT의 구축
실시예 1에서 구축한 14AΔqHAC의 클로닝 부위에 FRT 서열을 삽입하기 위해, FRT 서열을 포함하는 올리고 DNA를 합성하고, 실시예 1의 (2-1)에서 구축한 t1pSF 벡터에 클로닝하였다. 합성한 FRT 서열을 포함하는 올리고 DNA 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00042
상기한 FRT 서열을 포함하는 올리고 DNA를 어닐링에 의해 2개쇄화한 후, 제한 효소 FseI로 컷트하고, t1pSF 벡터 FseI 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 t1pSF1-FRT 구조물의 크기는 약 13.5 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 61에 도시하였다.
(1-2) 14AΔqHAC 보유 DT40 세포에의 t1pSF1-FRT 벡터 도입
t1pSF1-FRT 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 14AΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포에 전기 천공에 의해 도입하였다. 방법은, 실시예 1의 (2-2)에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하였다. 12t97sF에서는, 1회의 형질감염으로부터 합계 12개의 약제 내성 콜로니를, 또한 12t134sF에서는 1회의 형질감염으로부터 합계 94개의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 61 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)의 존재를 해석하였다. 방법은, 실시예 1의 (2-3)에 따라서 행하였다.
얻어진 블라스티사이딘 내성 DT40 세포, 12t97SF 유래 12주 중 3주가, 12t134SF 유래 94주 중 2주가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 5 kb 및 3'게놈 약 2 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 5' 및 3'측의 2개 부위의 상동 재조합 표적 서열의 존재를 실시예 1의 (2-4)의 방법에 따라서 해석하였다. 대표적인 결과를 도 62에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석 및 3'게놈측 해석 모두 상동 재조합체로 24.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보, 12t97SF 유래 3주 중 2주(12t97SF1, 12)가, 12t134sF 2주 중 2주(12t134SF6, 21)의 상동 재조합체를 확인하였다.
이상의 (1-1) 내지 (1-4)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위에 FRT 서열이 삽입된 14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 12t97SF 2주(-1, 12): 12t134SF 2주(-6, 21)를 얻었다.
(2) CHO 세포에의 14AΔqF-HAC 벡터 도입
(2-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 14AΔqF-HAC 벡터의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 18의 (1)에서 얻어진, 장완원위를 결실시켜 클로닝 부위에 FRT 서열이 삽입된 14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포(12t97sF1, 12t97sF12, 12t134sF21)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(등록 번호 JCRB9018)를 이용하였다. 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 14AΔqF-HAC 벡터망의 CHO 세포에의 도입은, 실시예 1의 (3)에 따라서 행하였다.
약 2주간의 선택 배양의 후, 출현한 블라스티사이딘 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 3주×2회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 36주(12t97sF1 유래 25주, 12t97sF12 유래 3주, 12t134sF21 유래 8주)의 블라스티사이딘 내성 CHO주를 얻었다.
(2-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성 CHO주의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 것, 및 DT40의 혼입이 없는 것을 확인할 목적으로, NEK2P(+), IGHV3(-) 및 Ggbeta-actin(-)의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 방법은, 실시예 1의 (1-3) 및 실시예 6의 (5-2)에 따랐다. 예측되는 검출 패턴은, NEK2P(+), IGHV3(-) 및 Ggbeta-actin(-)이다. 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주 36주 중 33주(12t97sF1 유래 23주, 12t97sF12 유래 3주, 12t134sF21 유래 7주)가, 염기 서열로부터 예상되는 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(2-3) 서던 블롯 해석
도입한 14AΔqF-HAC 벡터의 구조를 확인하기 위해서 서던 블롯 해석을 실시예 1의 (2-4)와 같이 행하였다. 대표적인 결과를 도 63에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석 및 3'게놈측 해석 모두 상동 재조합체로 24.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 18.2 kb이다. 블라스티사이딘내성 후보 CHO주 27주로부터 합계 26주(12t97sF1 유래 20주, 12t97sF12 유래 2주, 12t134 sF21 유래 4주)의 상동 재조합체를 확인하였다.
(2-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성 CHO주 중 14주(12t97sF1 유래 11주, 12t97sF12 유래 1주, 12t134sF21 유래 2주)에 대해서 해석한 결과, 합계 6주(12t97sF1 유래 5주, 12t97sF12 유래 O주, 12t134sF21 유래 1주)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 14AΔqF-HAC 벡터가 검출되었다. 대표적인 결과를 도 64에 도시하였다.
이상 (2-1) 내지 (2-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주 6주(12t97sF1-2, 5, 8, 17, 21 및 12t134sF21-2)은 Neo 내성 유전자 유닛 제거용14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 것을 확인하였다. 이들 중에서, 12t97sF1-5 및 12t134sF21-2(이하 F1-5 및 F21-2라고 칭함)를 이하의 실험에 이용하였다.
(3) hEPO-14AΔqFrHAC 벡터의 구축
(3-1) hEPO 발현 플라스미드 pLN1-EPO에의 FRT 서열의 도입
hEPO 발현 플라스미드 pLN1-EPO(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 실시예 18의 (1-1)에서 이용한 FRT 서열을 포함하는 합성 올리고 DNA를 삽입한다.
상기한 FRT 서열을 포함하는 올리고 DNA FRT 링커 S와 FRT 링커 AS를 어닐링에 의해 2쇄화하여 제한 효소 SpeI로 소화한 후, pLN1EPO 벡터로부터 제한 효소 XbaI 소화에 의해 neo 내성 유전자 드라이브용의 CMV 프로모터를 제거한 후의, XbaI 사이트에 클로닝하였다. 또한 상기 neo 내성 유전자 드라이브용 CMV 프로모터를 도입한 링커 내의 NheI 사이트에 재도입하였다. 최종적인 pLN1-EPOF 구조물의 크기는 약 4.9 kb이다.
(3-2) 14AΔqF-HAC 벡터에의 hEPO 유전자의 도입
14AΔqF-HAC 벡터에 FRT 서열을 포함하는 hEPO 유전자 발현 유닛을 삽입한다. loxP 및 FRT 서열을 포함하는 hEPO 발현 플라스미드 pLN1-EPOF를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다. 그 개략을 도 65에 도시하였다. 실시예 18의 (2)에서 제조한 14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(F1-5 및 F21-2)를 이용하여, 실시예 3의 (1-1)의 방법에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 92개(F1-5 유래 45개 및 F21-2 유래 47개, 이하 각각 5EF 및 2EF 세포와 칭함)의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(3-3) PCR 해석
hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 14AΔqFHAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 pLN1-EPOF 벡터 상 및 14AΔqFHAC 벡터 상에 설계한 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해서, 또한 삽입된 hEPO 유전자를, 플라스미드 벡터 pBS226 상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인하였다. 프라이머 서열 및 PCR는 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7 kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (3-2)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포로부터 합계 51주(5EF 세포 23주, 2EF 세포 28주)에서 예상되는 증폭이 확인되었다. 이로부터, 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 합계 51주가 loxP 서열에의 hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것이 입증되었다.
(3-4) 서던 블롯 해석
hEPO-14AΔqF-HAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 66에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다. 상기 (3-2)에서 얻은 G418 내성 후보 CHO 잡종 세포 65주로부터 합계 23주(5EF 세포 8주, 2EF 세포 15주)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(3-5) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (3-4)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 16주(F1-5 유래 5주, F21-2 유래 11주)에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 2주(5EF-1, 2EF-36)에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 검출하였다. 대표적인 결과를 도 67의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (3-1) 내지 (3-5)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 2주는, hEPO-14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포인 것이 입증되었다.
(4) hEPO-14AΔqF-HAC 벡터의 CHO 세포에서의 hEPO 유전자 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 1)에서 단리한 hEPO-14AΔqFHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 2주(5EF-1, 2EF-36)를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ㎖로 대체하여 2일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ml로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 표7에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00043
이로부터, 상기 hEPO-14AΔqFHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 4주 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
(5) hEPO-14AΔqF-HAC 벡터로부터의 Neo 내성 유전자 유닛 제거
(5-1) FLPe 발현 벡터 pOG44FLPe의 구축
pOG44 벡터(인비트로젠) 상의 FLP 유전자 서열을 FLPe 유전자 서열(Buchholz, F. 등, Nature Biotech. (USA), 제16권, p657-662)에 L33S, L70F, Y108N, S294P의 4개 부위에 PCR법에 의해 변이를 도입하여 개질시켰다. 우선 FLP(D4, L70)→FLPwt(D4G, L70F)을 제조하고, 계속해서 FLP(D4, L70)과 FLPwt(G4, F70) 양쪽을 이용하여 FLPe(D4·F70/L33S, Y108N, S294P)을 제조하였다. PCR은 LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 30초, 어닐링 60℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 35 주기로 행하였다.
아미노산 서열 치환 D4G 및 L70F를 위해, 1 염기 서열 치환 A14G 및 G210C를 pOG44 벡터를 주형으로 하여 행하였다. PCR법에 의해 행한 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00044
pOG44 벡터로부터 PstI 소화에 의해 FLP 유전자 서열을 잘라낸 후, PstI 소화한 상기 PCR 증폭 단편으로 교체하였다(pOG44-FLPwt(D4G, L70F)).
다음으로 아미노산 서열 치환 S294P를 위해 염기 서열 치환 T880C를 pOG44 벡터를 주형으로 하여 PCR법에 의해 행하였다. 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00045
pOG44 벡터로부터 EcoRV-NsiI 영역을 제거한 후, pOG44 벡터 유래의 DNA 단편(EcoRV-HindIII: 0.5 kb)과 HindIII 및 NsiI 소화한 상기 PCR 증폭 단편을 클로닝하였다(pOG44-FLPe(D4·S294P).
추가로 아미노산 서열 치환 L33S 및 Y108N을 위해 염기 서열 치환 T109C 및 T322A를 PCR법에 의해 행하였다. 이용한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00046
상기 pOG44-FLPwt(D4G, L70F) 벡터를 주형으로 하여, 프라이머 FLPFw(T109C)-FLPRv(T322A)Ev를 이용하여 PCR에 의해 염기 치환을 행하고, 추가로 이 PCR 산물을 주형으로 하여 프라이머 FLPFw(33-81)Bs36-FLPRv(T322A)Ev를 이용하고 5` 말단에 제한 효소 Bsu36I 사이트를 부가하였다. 증폭한 DNA 단편을 제한 효소 Bsu36I 및 EcoRV로 소화시키고, pOG44-FLPe(D4·S294P) 벡터의 Bsu36I-EcoRV 영역과 교체하였다(pOG44-FLPe(D4·F70/L33S, Y108N, S294P). 이상으로부터 pOG44FLPe를 얻었다.
(5-2) FLPe에 의한 Neo 내성 유전자 유닛 제거
상기 실시예 23의 (3)에서 제조한 hEPO-14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 속에서 FLPe 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 FRT 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체로부터 Neo 내성 유전자 유닛을 추출하여 제거한다. 재조합 삽입체의 선별은, Neo 내성 유전자 유닛의 결실을 지표로 하였다.
실시예 18의 (3)에서 제조한 hEPO-14AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(5EF-1 및 21EF-36)을 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8 ml의 행크스 평형염 용액(HBSS)에 현탁하였다. 20 내지 100 μg의 FLPe 효소 발현 벡터 pOG44FLPe 존재 하에서 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 500 μF의 컨덴서에 450 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 전기 천공한 세포를 10％ FBS를 첨가한 F12 배지(인비트로겐)를 포함하는 96웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘) 8매(1 세포/웰에서 4매, 0.1 세포/웰에서 4매)에 접종하였다. 2 내지 3주간 후 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하여, 합계 149개(5EF-1 유래 82개, 21EF-36 유래 67개)의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다.
(5-3) PCR 해석
hEPO-14AΔqF-HAC 벡터 상으로부터 Neo 내성 유전자 유닛 제거되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, pLN1-EPOF 벡터 상 및 상동 재조합 영역 상에 프라이머를 설계하고(도 68) PCR 증폭에 의해 확인하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00047
LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 4.5분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 4.5분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 4.5분을 25 주기, 신장 72℃ 10분으로 행하였다. Neo 내성 유전자 유닛 제거가 되어 있는 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 AL39 54169F에 의해 약 0.4 kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (5-2)에서 얻은 Bsd 내성 CHO 잡종 세포로부터 합계 66주(5EF-1 유래 3, 4주, 21EF-36 유래 32주)에서 예상되는 증폭이 확인되었다. 이로부터, 상기한 Bsd 내성 CHO 잡종 세포 합계 66주가 Neo 내성 유전자 유닛 제거되어 있는 것이 확인되었다.
(5-4) 서던 블롯 해석
hEPO-14AΔqF-HAC 벡터 상에서 Neo 내성 유전자 유닛 제거되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 69에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 EcoRI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, Neo 내성 유전자 유닛이 제거되고 hEPO 발현 유닛만의 경우 3.8 kb, Neo 내성 유전자 유닛 및 hEPO 발현 유닛 양쪽을 포함하는 경우 6.6 kb이다. 상기 실시예 23의 (5-2)에서 얻은 후보 CHO 잡종 세포 66주(5EF-1 유래 34주, 21EF-2 유래 32주)로부터, 합계 36주(5EF-1 유래 18주, 2EF-2 유래 18주)에서 예측되는 크기의 밴드를 검출하였다. 이로부터, 상기 CHO 잡종 세포 36주에 있어서, Neo 내성 유전자 유닛 제거를 확인하였다. Neo 내성 유전자 유닛이 제거된 hEPO-14AΔqF-HAC 벡터를 이하 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터라고 칭한다.
(5-5) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (5-3)에서 얻은 후보 CHO 잡종 세포 중 5EF-1 유래의 8주에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 2주(5EF1Δ38, 5EF1Δ63)에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터를 검출하였다. 대표적인 FISH상 및 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터의 핵형을 각각 도 70의 A 및 B에 도시한다.
이상 (5-1) 내지 (5-5)의 실험으로부터, 얻어진 상기 CHO 잡종 세포 2주는, hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 잡종 세포인 것이 입증되었다.
(6) neo 내성 유전자 유닛 제거 hEPO-14AΔqΔneo-HAC 벡터의 CHO 세포에서의 hEPO 유전자 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 실시예 23의 (5)에서 단리한 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 2주(5EF1Δ38, 5EF1Δ63)를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ml로 대체하여 2일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ㎖로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 표8에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00048
이로부터, 상기 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 2주에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 19
Neo 내성 유전자 유닛 제거 hEPO -14AΔqΔ neoHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 hEPO 유전자 발현
(1) hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터 도입 인간 정상 섬유아세포의 제조
(1-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 hEPO-14AΔqHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에의 도입.
염색체 공여 세포로서, 실시예 18에서 얻어진 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포주 5EF1Δ38 및 5EF1Δ63을 이용하였다. 염색체 수용 세포로는, 인간 정상 섬유아세포 HFL-1(이화학 연구소 세포 재료 개발실로부터 입수, 등록 번호 RCB0521)를 이용하였다. 방법은, 실시예 5의 (1-1)에 따랐다. 약 2 내지 4주간의 선택 배양을 행하고, 출현한 블라스티사이딘 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 6회의 미소핵 세포 융합(5EF1Δ38로 2회, 5EF1Δ63으로 4회)으로부터 56개의 약제 내성 콜로니(5EF1Δ38로부터 8클론, 5EF1Δ63으로부터 48클론)을 얻었다. 상기 콜로니 중, 염색체 공여 세포로서 5EF1Δ38 및 5EF1Δ63을 이용하여 얻은 세포를 각각 이하 tΔ38H 세포 및 tΔ63H 세포라고 칭한다.
(1-2) PCR 해석
hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유할지 여부를 실시예 3의 (1-2)의 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2를 이용하여, 인간 염색체를 STS 마커 D2S1334의 프라이머를 이용하여 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따라서 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 또한, 염색체 공여 CHO 세포의 혼입의 유무를 CHO furin 유전자 특이적 프라이머 furin3'subF 및 furinEx6-28R을 이용하여 PCR 증폭에 의해 확인하였다. 설계한 프라이머 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00049
반응 조건은 94℃ 5분의 후, 변성 94℃ 20초, 어닐링/신장 68℃ 3분간을 32 주기 행하였다. hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포로 염색체 공여 CHO 세포의 혼입이 없는 경우에, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp의 증폭, D2S1334 프라이머에 의해 약 0.6 kbp의 증폭, furin3'subF 및 furinEx6-28R에 의한 증폭 없음이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 블라스티사이딘 내성주 56주로부터 합계 39주(tΔ38H 4주, tΔ63H 35주)에서 예상되는 크기의 밴드를 확인하였다.
이로부터, 상기한 블라스티사이딘 내성주 39주가 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 상기한 블라스티사이딘 내성주 39주 중 31주(tΔ38H; 3주, tΔ63H; 28주)에 대해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 대표적인 결과를 도 71에 도시하였다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다. 그 결과, 상기 (1-2)에서 얻은 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 블라스티사이딘 내성주 28주(tΔ38H; 3주, tΔ63H; 25주)예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 14번 및 22번 염색체 특이적 α 부수 DNA 프로브(Q-biogene, 후나코시)를 이용하여 행하였다. 상기 (1-3)에서 얻은 블라스티사이딘 내성주 중 8주에 대해서 해석한 결과, 합계 8주가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에 있어서, 숙주 세포 유래의 1쌍의 인간 14번 및 22번 염색체 센트로미어 영역의 4개 부위와 1카피의 14AΔqΔneoHAC 벡터 유래의 1개 부위에 신호이 검출되었다. 그 결과를 도 72의 A 및 B에 도시하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성주 8주는 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 HFL-1 세포인 것이 확인되었다.
(2) Neo 내성 유전자 유닛 제거 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터의 HFL-1 세포에서의 hEPO 유전자 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 29주(tΔ38H 4주, tΔ63H 28주)를, 약 104 세포로 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지 1 ㎖을 넣은 콜라겐-I 코팅 24웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지 1 ㎖로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 21의 「14AΔneo-HAC」의 항목에 나타내었다.
이로부터, 상기 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 29주(tΔ38H 3주, tΔ63H 26주)있어서 hEPO의 발현을 확인하였다.
실시예 20
hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포에서의 장기 EPO 발현 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터의 인간 정상 섬유아세포 HFL-1에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 23에서 얻은 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 11주(tΔ38H 3주, tΔ63H 8주)를 사용하였다. 비선택 배양액은 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 3 ㎍/ml를 첨가하였다. hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포주는 1 내지 3×105 세포를 콜라겐-I 코팅한 T-25 플라스크(팔콘)에 접종하고, 세포 밀도가 90％ 포화될 때까지 배양하고, 다시 1 내지 3×105 세포를 접종하여 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. 또한, 5계대 전후 및 10계대 후에 세포를 회수하여, hEPO 유전자 발현 해석 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-14AΔqHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 9주를, 약 104 세포로 20％ FBS를 포함하는 DMEM 배지 1 ml를 넣은 콜라겐-I 코팅 24웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후 7일간 배양하고, 새로운 배지 1 ml로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다. 2회 행한 실험 결과의 평균치를 도 43의「14AΔneo」의 항목에 나타내었다.
이로부터, 상기 hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터를 보유하는 HFL-1 세포 8주에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다.
이상의 실험에 의해, hEPO-14AΔqΔneoHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 HFL-1 세포에서, 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 세포당의 카피수가 유지되는 것, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 입증되었다.
실시예 21
Neo 내성 유전자 유닛 제거 14NΔ qHAC 벡터의 구축
(1) 14NΔqHAC 클로닝 부위에의 FRT 서열의 도입
(1-1) FRT 서열 도입용 벡터 GnpSF1-FRT의 구축
실시예 18에서 구축한 t1pSF1-FRT 벡터를 ScaI-EcoRV 소화하여 FRT 서열을 포함하는 7.4 kb의 DNA 단편에, 실시예 6에서 구축한 pSF1(G+n1) 벡터를 ScaI-BglII-EcoRV 소화하여 얻은 ScaI-BglII 7.0 kb와 BglII-EcoRV 0.55 kb의 DNA 단편을 도입하여 FRT 서열을 포함하는 GnpSFI-FRT 벡터를 제조하였다. 개략을 도 73에 도시하였다. 최종적인 GnpSF1-FRT 구조물의 크기는 약 15.0 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 34의 A에 도시하였다.
(1-2) 14NΔqHAC 보유 DT40 세포에의 GnpSFI(FRT) 벡터 도입
GnpSF1(FRT) 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 14NΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포에 전기 천공에 의해 도입하였다. 방법은, 실시예 1의 (2-2)에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하였다. G4n6Δp25에서는, 2회의 형질감염으로부터 합계 240개의 약제 내성 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 34의 A중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)의 존재를 해석하였다. 방법은, 실시예 7의 (4-3)에 따라서 행하였다.
얻어진 블라스티사이딘 내성 DT40 세포, G4n6Δp25sF 96주 중 52주가, 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 5 kb 및 3'게놈 약 2 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 5' 및 3'측의 2개 부위의 상동 재조합 표적 서열의 존재를 실시예 1의 (2-4)의 방법에 따라서 해석하였다. 대표적인 결과를 도 74에 도시하였다.
염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 19.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 7.6 kb, 3'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 19.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 8.8 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보, G4n6Δp25sF 18주 중 16주의 상동 재조합체를 확인하였다.
이상의 (1-1) 내지 (1-4)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위에 FRT 서열이 삽입된 14NΔqF-HAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 G4n6Δp25sF 16주를 얻었다.
실시예 22
Neo 내성 유전자 유닛 제거 14 gN Δ qHAC 벡터의 구축
(1) 14gNΔqHAC 클로닝 부위에의 FRT 서열의 도입
(1-1) FRT 서열 도입용 벡터 gnpSF-FRT의 구축
실시예 18에서 구축한 t1pSF1-FRT 벡터를 ScaI-EcoRV 소화하여 FRT 서열을 포함하는 7.4 kb의 DNA 단편에, 실시예 6에서 구축한 pSF1(g+n1) 벡터를 ScaI 및 HindIII 및 EcoRV 소화하여 얻은 ScaI-HindIII 5.4 kb와 HindIII-EcoRV 0.45 kb의 DNA 단편을 도입하여 FRT 서열을 포함하는 gnpSFI-FRT 벡터를 제조하였다. 개략을 도 75에 도시하였다. 최종적인 gnpSF1-FRT 구조물의 크기는 약 13.3 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 34의 B에 도시하였다.
(1-2) 14NΔqHAC 보유 DT40 세포에의 gnpSF(FRT) 벡터 도입
gnpSF1(FRT) 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 14NΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포에 전기 천공에 의해 도입하였다. 방법은, 실시예 1의 (2-2)에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하였다. g5n7Δc3에서는, 2회의 형질감염으로부터 합계 116개의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 34의 B중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)의 존재를 해석하였다. 방법은, 실시예 7의 (4-3)에 따라서 행하였다.
얻어진 블라스티사이딘 내성 DT40 세포, g5n7Δc3sFl16주 중 54주가, 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 5 kb 및 3'게놈 약 2 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.,
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 5' 및 3'측의 2개 부위의 상동 재조합 표적 서열의 존재를 실시예 1의 (2-4)의 방법에 따라서 해석하였다. 대표적인 결과를 도 76에 도시하였다.
염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 11.8 kb, 야생형(비재조합체)으로 4.6 kb, 3'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 15.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 8.8 kb이다. 블라스티사이딘 내성 후보, g5n7Δc3sF 36주 중 4주의 상동 재조합체를 확인하였다.
이상의 (1-1) 내지 (1-4)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위에 FRT 서열이 삽입된 14NΔqF-HAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 g5n7Δc3sF 4주를 얻었다.
실시예 23
인간 21번 염색체 장완근위의 결실에 의한 21 HAC (21AΔ qHAC ) 벡터의 제조
(1) HAC 벡터에서의 인간 21번 염색체의 장완근위에의 클로닝 부위(HPRT 재구축형)의 도입
(1-1) loxP 및 5'HPRT 서열 삽입용 kk 벡터의 구축
인간 21번 염색체의 장완근위에 loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V901(Lexicon genetics)를 이용하였다. loxP 삽입 부위인 인간 21번 염색체 근위의 DNA 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 얻었다(AP001657). 상동 재조합의 2개의 표적 서열의 증폭에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00050
MC1-TK 서열을 V830(Lexicon genetics)로부터 RsrII(NEB)에 의해 추출하고, V901 플라스미드의 제한 효소 HindIII의 인식 부위에 클로닝하였다(V901T-1). 다음으로 인간 21번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(A9<21-2>, Shinohara 등, Hum Mol Genet, 10: 1163, 2001년)을 배양하고, 세포로부터 Puregene DNA Isolation kit(Gentra System사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기한 프라이머를 이용하여 재조합의 표적 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 반응 조건은 95℃ 2분의 후, 변성 95℃ 15초, 어닐링 68℃ 4분을 30 주기 행하였다. 서열 번호 110-111로 증폭한 DNA 단편(상동 영역 1)을 제한 효소 EcoRI(닛본 진)와 BglII(닛본 진)로, 서열 번호 112-113로 증폭한 DNA 단편(상동 영역 2)을 XhoII(프로메가)로 소화시키고, 아가로스 겔에 의해 분리하고 정제한 후, V901 플라스미드의 EcoRI와 BamHI 내지 BglII 사이트에 클로닝하였다. 또한 V901 플라스미드의 AscI와 KpnI 사이트에 AscI와 KpnI에 의해 추출한 5'HPRT-loxP-하이그로마이신(hygromysin)를 클로닝하였다. 5'HPRT-loxP-하이그로마이신은 V820(Lexicon genetics의 XbaI 사이트에 올리고 합성한 loxP 서열과 PGK 하이그로마이신(hygro) 서열(Lyons I 박사로부터 분배 공급)을 클로닝함으로써 제조하였다. 최종적인 loxP 삽입 구조물의 크기는 13.5 kb이다(kk 벡터로 함). 타겟팅 벡터, 표적 서열 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 78에 도시한다.
(1-2) 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 세포에의 kk 벡터 도입
인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포는, 동염색체를 보유하는 상기 A9<21-2> 세포를 염색체 공여 세포로 하여 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의해 제조하였다. 염색체 수용 세포인 DT40은 Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)에 등록 번호 JCRB2221로서 등록되어 있고, 입수 가능하다. 이하에 제조법의 개략을 기재한다.
처음에 약 1×108개의 Ag<21-2> 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 25 cm2 원심용 플라스크(눈크) 12개에 세포 밀도가 80％ 포화될 때까지 배양한 A9<21-2> 세포를 콜세미드(0.075 ㎍/ml, 데메콜신, 와코 쥰야꾸)를 포함하는 배양액(20％ 우태아혈청; FBS, 0.8 mg/ml G418, DMEM) 속에서 48시간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 본 실시예에 있어서, DMEM은 닛스이 제약 제조의 것을 이용하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(34℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/ml, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 34℃, 8000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)을 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 DMEM 6 ml에 재현탁하였다. DT40 세포는, 10％ FBS, 1％ CS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에서 배양한 후, DMEM으로 2회 세정하고, 1×107개의 세포를 DMEM 5 ml에 재현탁하였다. 마이크로셀 현탁액을 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하고, 이것에 DT40 세포 현탁액을 중층한 후, 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 폴리에틸렌글리콜(PEG) 1:1.4 용액(Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년)으로 90초간 융합 처리하였다. 융합 세포를 60 ml의 10％ FBS, 1％ 닭 혈청(ChS), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(ME)을 포함하는 RPMI1640 배양액(인비트로겐)에 현탁하고, 96웰 플레이트의 6매에 접종하고 24시간 배양한 후, 1.5 mg/㎖의 G418을 포함하는 배지에서 약 2주간 선택 배양하였다. 2회의 마이크로셀 융합 실험으로부터 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하였다. PCR 해석에 의해 인간 21번 염색체 상에 존재하는 영역 CBR, APP, TTC3, PCP4의 존재를 확인하고, 추가로 인간 특이적 프로브 Cot1(기브코 BRL)를 이용한 형광 계내 혼성화(FISH) 해석에 의해 1카피의 인간 21번 염색체를 보유하는 클론 DT40(21-2-3)을 확인하여 얻었다.
다음으로 kk 벡터를 제한 효소 NotI(Takara) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포에 도입하였다. 1×107개의 DT40(21-2-3) 세포를 0.5 ㎖의 RPMI 배지에 현탁하고, 30 μg DNA 존재 하에서 실온에서 10분간 정치한 후, 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 25 μF의 컨덴서에 550 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 실온에서 10분간 정치한 후, 전기 천공한 세포를, 10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에 현탁하고, 96웰 플레이트(팔콘) 20매에 접종하였다. 24시간 후에 종농도 1.5 mg/ml가 되도록 하이그로마이신 B(Hygromycin B, WAKO)를 가하고, 2 내지 3주간 후에는 내성 콜로니가 출현하였다. 20회의 형질감염으로 얻은 합계 237개의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다(클론명: DT40(kk)).
(1-3) PCR 해석
재조합체를 선별하기 위해서 하이그로마이신 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 이하의 프라이머를 이용하여 PCR법에 의해 검출하였다. 그 프라이머의 위치는 도 78에 도시하였다. 그 서열을 이하에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00051
LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 이하와 같이 행하였다. 5'게놈 해석(서열 번호 114-115); 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 10분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 5분을 25 주기, 신장 72℃ 10분. 3'게놈 해석 (서열 번호 116-117); 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 6분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 7분을 30 주기, 신장 72℃ 10분. PCR 반응액에는 MgSO4(종농도 0.5 mM)를 첨가하였다. 부위 특이적으로 재조합이 발생한 클론에서만, 5'측에서는 4.5 kb의 밴드가 검출되고, 3'측에서는 6.5 kb의 밴드가 검출되었다. 음성 대조군의 DT40 및 DT40(21-2-3)에서는 밴드는 검출되지 않았다. 그 빈도는 237 클론 중 46개이고 재조합 빈도는 약 20％였다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 플롯 해석을 행하였다. 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 21번 염색체를 보유하는 A9<21-2> 세포의 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제하였다. 상동 재조합의 표적 서열의 외측에 5' 프로브-1 (서열 번호 118-'119) 및 3' 프로브-10(서열 번호 120-121)의 2종의 프로브를 설정하였다(도 78).
Figure 112009007627410-PCT00052
1차 스크리닝으로 얻은 것 중의 12주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 SphI(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 32P에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 6.1 kb, 3'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 6.0 kb, 야생형(비재조합체)으로는 5'게놈측 해석 및 3'게놈측 해석 모두 11.5 kb이다. 해석한 12주의 전부에서 상동 재조합체를 확인하였다.
(1-5) 형광 계내 혼성화(FISH) 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 따라서 행하였다. 상기 (1-4)에서 재조합을 확인한 클론 중 6 클론을 인간 cot-1 DNA 및 하이그로마이신(kk 벡터로부터 추출하여 제조)를 프로브로 하여 FISH 해석을 행한 바, 인간 21번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 장완근위에 하이그로마이신 유래의 신호이 검출되었기 때문에 부위 특이적으로 재조합이 발생된 것이 확인되었다.
이상의 (1-1) 내지 (1-5)에 의해 상동 재조합에 의해 인간 21번 염색체 근위 AP001657에 5'-HPRT-loxP-hygro-TK를 삽입하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) 텔로미어 말단절단에 의한 인간 21번 염색체 장완 결실
(2-1) 텔로미어 말단절단용 벡터 pTELhisD-21q의 구축
인간 21번 염색체의 장완원위를 결실시키기 위한 텔로미어 말단절단 벡터(타겟팅 벡터)는, pTELhisD(Kuroiwa 등, Nature Biotech. (USA), 제18권, p.1086-1090, 2000년)을 이용하였다. GenBank 데이터베이스로부터 얻은 인간 21번 염색체 장완원위의 염기 서열(등록 번호 AP001657)로부터, 텔로미어 말단절단 벡터 삽입의 표적 서열을 설계하였다. 이것을 PCR 증폭하기 위한, 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00053
인간 21번 염색체를 보유하는 마우스 A9 잡종 세포(A9<21-2>, Shinohara 등, Hum Mol Genet, 10: 1163, 2001년)을 배양하고, 세포로부터 Puregene DNA Isolation kit(Gentra System사)를 이용하여 게놈 DNA를 추출하였다. 이 게놈 DNA를 주형으로 하고, 상기한 프라이머를 이용하여 재조합의 표적 서열을 PCR법에 의해 증폭하였다. 주형으로서 약 0.1 μg의 게놈 DNA를 사용하고, Innis 등(PCR 실험 메뉴얼, HBJ 출판국, 1991)에 따라서, GeneAmp9700 주기 가열기(Applied Biosystems사)를 사용하여 PCR을 행하였다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 10분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 10분을 25 주기, 신장 72℃ 10분으로 행하였다. 7.0 kb의 증폭 산물을 제한 효소 BamHI(로슈)로 소화시키고, 돌출 말단을 갖는 DNA 단편을 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하고, 정제하였다. 이것을 pTELhisD 플라스미드의 BamHI 사이트에 클로닝하였다. 최종적인 pTELhisD-21q 구조물의 크기는 약 14.4 kb이다. 텔로미어 말단절단 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 79에 도시하였다.
(2-2) 인간 21번 염색체 보유 DT40 세포에의 텔로미어 말단절단 벡터 도입
pTELhisD-21q 구조물을 제한 효소 SrfI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 실시예 23의 (1)에서 제조한 장완근위에 loxP를 도입한 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포에 도입하였다. 1×107개의 DT40(kk139) 세포를 0.5 ㎖의 RPMI 배지에 현탁하고, 30 μg DNA 존재 하에서 실온에서 10분간 정치한 후, 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 25 μF의 컨덴서에 550 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 실온에서 10분간 정치한 후, 전기 천공한 세포를, 10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에 현탁하고, 96웰 플레이트(팔콘) 20매에 접종하였다. 24시간 후에 종농도 0.5 ㎍/㎖가 되도록 히스티디놀(L-Histidinol dihydrochloride, 시그마)를 가하고, 2 내지 3주간 후에는 내성 콜로니가 출현하였다. 5회의 형질감염으로부터 합계 105의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(2-3) PCR 해석
히스티디놀 내성주 게놈 DNA를 주형으로 하여 인간 21번 염색체 상에 존재하는 유전자의 게놈 영역의 존재를 PCR법에 의해 확인하였다. 게놈 영역 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00054
약 0.1 μg의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기 4종의 게놈 영역에 대해서 PCR 증폭(Innis 등, 상기)를 행하였다. Ex Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 5분의 후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 30초, 신장 72℃ 30초를 35 주기 행하였다. 텔로미어 말단절단에 의해 장완원위가 결실된 경우, 상기 4종의 프라이머로는 검출되지 않을 것이 예상된다. 다음으로 상기 프라이머로 검출되지 않은 10클론에 대해서 이하의 프라이머를 이용하여 부위 특이적상동 재조합이 발생되어 있느지를 확인하였다. 그 프라이머의 위치를 도 79에 도시하였다. 서열은 이하와 같다.
Figure 112009007627410-PCT00055
10 클론 중 부위 특이적으로 재조합이 발생한 2 클론에서만 7.5 kb의 밴드가 검출되었다. 음성 대조군의 DT40, DT40(21-2-3)에서는 밴드는 검출되지 않았다.
(2-4) 형광 계내 혼성화(FISH) 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠) 및 FITC 표지한 hisD 단편(pTELhisD 벡터로부터 추출하여 제조)를 프로브로 이용하여 행하였다. 그 결과, 관찰한 분열상의 대부분에서 단축한 인간 21번 염색체 및 Cot1로 염색된 단축한 인간 21번 염색체 장완단에 2개의 FITC 신호이 검출되었다. 숙주인 DT40 세포의 염색체와의 상대적인 크기로부터, 인간 21번 염색체가 단축한 것을 확인하였다.
이로부터, 얻어진 히스티디놀 내성의 2주가 인간 21번 염색체를 장완 결실
(3) 21AΔqHAC 장완근위에의 클로닝 부위(neo 재구축형)의 도입
(3-1) loxP 및 3'neo 및 FRT 서열 삽입용 pSF1(FRT)-C 벡터의 구축
실시예 23의 (2)에서 제조한 인간 인공 염색체(HAC)에 loxP 및 3'neo 및 FRT 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드는 실시예 18의 (1)에서 제조한 t1pSF1(FRT)를 이용하였다. loxP 및 3'neo 및 FRT 서열 삽입 부위인 인간 21번 염색체 장완근위의 염기 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 얻었다(등록 번호 AP001657). 상동 재조합의 2개의 표적 서열 증폭에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00056
인간 21번 염색체를 보유하는 A9<21-2> 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 표적 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 서열 번호 134-135로 증폭한 약 3.4 kb의 DNA 단편(상동 영역 1)을 PacI 및 NheI(로슈)로 소화시키고, 서열 번호 136-137로 증폭한 약 2.8 kb의 DNA 단편(상동 영역 2)을 제한 효소 SalI 및 SrfI(로슈)로 소화시키고, 돌출 말단을 갖는 DNA 단편을 각각 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여, 정제하였다. 다음으로 제한 효소 소화한 상동 영역 1의 DNA 단편과 NheI 및 ScaI로 소화한 t1pSF1(FRT) 플라스미드(실시예 18의 (1)에서 제조)와 실시예 1의 (2-1)에서 제조한 pSF1③를 ScaI 및 PacI로 소화한 3개의 DNA 단편을 3 단편 라이게이션하였다. 이 벡터를 SalI 및 SrfI에 의해 소화하고, 제한 효소 소화한 상동 영역 2를 클로닝하고, pSF1(FRT)-C로 하였다. 최종적인 pSF1(FRT)-C 구조물의 크기는 약 12.6 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 80 및 도 81에 도시하였다. ·
(3-2) 21AΔqHAC 보유 DT40 세포에의 pSF1(FRT)-C 벡터 도입
pSF1(FRT)-C 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 21AΔqHAC를 보유하는 DT40 잡종 세포에 도입하였다. 1×107개의 DT40(kkq7g) 세포를 0.5 ㎖의 RPMI 배지에 현탁하고, 30 μg DNA 존재 하에서 실온에서 10분간 정치한 후, 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 25 μF의 컨덴서에 550 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하지 않고 방전하였다. 실온 10분간 정치한 후, 전기 천공한 세포를, 10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에 현탁하고, 96웰 플레이트(팔콘) 20매에 접종하였다. 24시간 후에 종농도 8 ㎍/㎖가 되도록 블라스티사이딘(Blasticidin S Hydrochloride, 후나코시)를 가하고, 2 내지 3주간 후에는 내성 콜로니가 출현하였다. 4회의 형질감염으로부터 합계 51개의 약제 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(3-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 81 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 81 중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00057
서열 번호 138-116(5'게놈), 서열 번호 139-114(3'게놈)의 조합으로 PCR을 행하였다.
LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 이하와 같이 행하였다. 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 6분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링 /신장 68℃ 7분을 30 주기, 신장 72℃ 10분. PCR 반응액에는 MgSO4(종농도 0.5 mM)로 첨가하였다.
얻어진 블라스티사이딘 내성 DT40 세포 51주 중 23주가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 6.7 kb 및 3'게놈 약 6.1 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(3-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 프로브는 실시예 1의 (1-4)에서 이용한 5' 프로브-1 및 3' 프로브-10을 이용하였다.
1차 스크리닝으로 얻은 것 중의 6주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 SPhI(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in MolecularBiology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 32P에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 7.8 kb, DT40(kkq79)(비재조합체)으로 6.1 kb, 3'게놈측 해석에서는 상동 재조합체로 9.5 kb, DT40(kkq79)(비재조합체)으로 6.0 kb이다. 해석한 6주 전부에서 상동 재조합체를 확인하였다.
(3-5) 형광 계내 혼성화(FISH) 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 따라서 행하였다. 상기 (3-4)에서 재조합을 확인한 6 클론을 인간 cot-1DNA 및 블라스티사이딘(pCMV/Bsd 벡터로부터 추출하여 제조)를 프로브로 하여 FISH 해석을 행한 바, 인간 21번 염색체는 모든 클론에서 숙주 염색체에 전좌하지 않고, 장완근위에 블라스티사이딘 유래의 신호이 검출되었기 때문에 부위 특이적으로 재조합이 발생한 것이 확인되었다.
이상의 (3-1) 내지 (3-5)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위(loxP 서열) 및 3'neo 및 FRT 서열이 삽입된 21AΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포 6주(DT40(21qAHAC)-2, 13, 16, 29, 39, 51)를 얻었다.
(4) CHO 세포에의 21 AΔqHAC 벡터 도입
(4-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 21AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 23의 (3)에서 얻어진, 장완원위를 결실시키고 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 및 FRT 서열)가 삽입된 21AΔqHAC 벡터를 보유하는 DT40 잡종 세포(DT40(21qAHAC)-2, 39, 51)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(등록 번호 JCRB9018)을 이용하였다.
처음에 약 109개의 DT40 잡종 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 세포 밀도가 60 내지 70％ 포화될 때까지 배양한 DT40 잡종 세포를 콜세미드(0.05 ㎍/ml, 인비트로젠)를 포함하는 배양액(10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, RPMI1640) 속에서 13 내지 18시간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 원심 분리에 의해 세포를 회수하고 무혈청 DMEM에 재현탁하고, 미리 폴리 L-리신으로 코팅한 25 cm2 원심용 플라스크(눈크) 12개에 접종하였다. 37℃ 1시간 정치하여 세포가 부착된 후 배양액을 제거하고, 미리 보온(37℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/ml, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 원심 용기에 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8,000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)을 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과정제한 후, 5 ㎖의 DMEM에 현탁하였다. 마이크로셀 현탁액을 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하고, 이것에 DMEM으로 2회 세정한 후 5 ㎖의 DMEM에 현탁한 약 107개의 CHO-K1 세포를 중층한 후, 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 45％ 폴리에틸렌글리콜 1500(PEG1500, 로슈) 10％ DMSO(시그마)를 포함하는 DMEM 용액으로 120초간 융합 처리하였다. 120 ㎖의 10％ FBS를 포함하는 F12 배지(인비트로젠)에 현탁하고, 48웰 플레이트(팔콘) 5매에 접종하고, 24 내지 36시간 후에 블라스티사이딘(8 ㎍/ml)를 포함하는 선택 배지(10％ FBS, F12)에서 배양하였다. 약 2주간의 선택 배양의 후, 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 3회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 16주(DT40(21qAHAC)-2 유래 8주, DT40(21qAHAC)-39 유래 3주, DT40(21qAHAC)-51 유래 5주)의 블라스티사이딘 내성 CHO주를 얻었다.
(4-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출하였다. 방법은, 상기 실시예 1의 (3-3)에 따라서 행하였다. 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO 세포 16주 중 11주가, 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 6.7 kb 및 3'게놈 약 6.1 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인하였다.
(4-3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 블라스티사이딘 내성 CHO주 중 10주에 대해서 해석한 결과, 합계 3주(CHO(21qA-HAC)-5, 6, 17)가, 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 21AΔqHAC 벡터가 검출되었다.
이상 (4-1) 내지 (4-3)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주 3주가 21AΔqHAC 벡터를 보유하는 것을 확인하였다.
실시예 24
21AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
21AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 1에 기재한 CHO 세포주 3주(CHO(21qA-HAC)-5, 6, 17)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 블라스티사이딘 8 ㎍/㎖를 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하고 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하여 FISH용 염색체 표본을 제조하였다.
(2) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00058
21Aδqhac 벡터는, CHO 세포에서 장기 계대 배양 후에도 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호이 검출되었다.
실시예 2에서 나타낸 도 13으로부터, WO2004/031385 공보에서 개시한 21δqhac의 CHO 세포에서의 HAC 유지율(％)은, 배양 개시 시에는, 「약제 선택 있음」의 경우에 86％, 7주 배양후에는, 「약제 선택 없음」의 경우에는 66.0％, 「약제 선택 있음」의 경우에는 86.0％이다. 따라서, 본원 발명의 21번 염색체 유래의 신규 HAC 벡터 21Aδqhac는, 장기간 배양에 있어서도 거의 탈락이 보이지 않고, 종래의 HAC 벡터에 비교하여 현저하게 안정적인 HAC 벡터인 것을 알았다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험에 의해, 21Aδqhac 벡터는, CHO 세포에서 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되어 있는 것이 입증되었다.
실시예 25
Hepo -21Aδ qhac 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 hepo 유전자 발현 해석
(1) hepo-21Aδqhac 벡터의 구축
(1-1) 21Aδqhac 벡터에의 hepo 유전자의 도입
실시예 23에서 구축한 21Aδqhac 벡터에 hepo 유전자 발현 유닛을 삽입한다. Loxp 서열을 포함하는 hepo 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxp 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다. 개략을 도 77에 도시하였다.
실시예 1에서 제조한 21Aδqhac 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포(CHO(21qa-HAC)-5,6)를 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8 ㎖의 행크스 평형염 용액(HBSS)에 현탁하였다. Loxp 서열을 포함하는 hepo 발현 플라스미드 pln1-EPO(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년) 10 μg과 Cre 효소 발현 벡터 pbs185(라이프텍) 10 μg의 존재 하에서 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 500 μF의 컨덴서에 450 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 전기 천공한 세포를 10％ FBS 첨가한 F12 배지(인비트로겐)를 포함하는 48웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘) 5매에 접종하였다. 2일 후에 0.8 g/㎖의 G418(제네티신, 인비트로젠)를 포함하는 배지와 치환하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성 콜로니가 출현하여, 합계 48개(CHO(21qa-HAC)-5 유래 20개, CHO(21qa-HAC)-6 유래 28개)의 콜로니를 단리하여 증식시키고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-2) PCR 해석
Hepo 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 21Aδqhac 벡터 상의 loxp 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxp 서열 부위를 사이에 두도록 pln1-EPO 벡터 상 및 21Aδqhac 벡터 상에 설계한 프라이머 svpanp1 및 Neo Rp2에 의해서, 또한 삽입된 hepo 유전자를, 플라스미드 벡터 pbs226 상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인하였다. 프라이머 서열 및 PCR는 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 svpanp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7 kbp의 증폭이 예상된다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 합계 40주에서 예상되는 증폭을 확인하였다. 이로부터, 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 40주가 loxp 서열에의 hepo 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것이 입증되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
Hepo-21Aδqhac 벡터에서 hepo 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 염기 서열로부터 예상되는 xbai 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hepo 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다(도 14). 상기 (1-2)에서 얻은 G418 내성 후보 CHO 잡종 세포 중의 6주에 대해서 해석을 행한 결과, 합계 3주(CHO(21qahace-13, 14, 37)에서 예측되는 크기의 밴드를 확인하였다.
(2) 21Aδqhac 벡터에 삽입된 hepo 유전자의 발현
Hepo 유전자의 발현을 배양상청 중에 생산되는 hepo 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다.
상기 실시예 103의 (1-3)에서 단리한 hepo-21Aδqhac 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 6주를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하였다. 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ml로 대체하여 2일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ml로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수하였다. Hepo ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량하였다.
이로부터, 상기 hEPO-21AΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포 6주 전부에서 hEPO의 발현을 확인하였다.
(3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)을 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-3)에서 얻은 G418 내성 CHO 잡종 세포 중 6주에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 5주에서 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 hEPO-21AΔqHAC 벡터을 검출하였다.
이상 (1)의 실험으로부터, 얻어진 G418 내성 5주는, hEPO-21AΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포인 것이 입증되었다.
실시예 26
hEPO -21AΔ qHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
hEPO-21AΔqHAC 벡터의 CHO 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하 및 선택 조건 하(대조군)에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 25에서 얻은 CHO 잡종 세포 2주(CHO(21qA-HACE)-13, 14)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 0.8 g/㎖의 G418 을 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 lOcm 직경 디쉬에 접종하고, 1O 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하고, hEPO 유전자의 발현 및 FISH 해석을 행하였다.
(2) 장기 계대 배양 후의 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량하였다. 상기 (1)에서 장기 계대 배양한 hEPO-21 AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO잡종 세포 2주에 대해서, 실시예 3의 (2)의 방법에 따라서 행하였다. 그 결과, 상기 hEPO-21AΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포 2주 전부에서 장기 계대 배양 후에도 hEPO의 발현을 확인하였다.
(3) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 2주에 대해서 그 결과를 표 10에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00059
hEPO-21AΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 장기 계대 배양 후에도 안정적으로 보유되었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호를 검출하였다.
이상의 (1) 내지 (3)의 실험에 의해, hEPO-21AΔqHAC 벡터는, 장기 계대 배양 후의 CHO 세포에서, 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 세포당의 카피수가 유지되는 것, hEPO 유전자의 발현이 유지되는 것이 명백해졌다.
실시예 27
Neo 내성 유전자 유닛 제거 hEPO -21AΔqΔ neo - HAC 벡터의 구축
21AΔq-HAC 벡터 상 및 pLN1/EPOF 플라스미드(실시예 18의 (3)에서 제조) 상의 hEPO 발현 유닛 하류에는 FRT 서열이 삽입되어 있다. hEPO-21AΔq-HAC 벡터 상에서 FRT/FLPe 부위 특이적 재조합 시스템에 의해 Neo 내성 유전자 발현 유닛을 제거한다. 그 개략을 도 82에 도시하였다.
(1) hEPO-21AΔq-HAC 벡터로부터의 Neo 내성 유전자 유닛 제거
(1-1) FLPe에 의한 Neo 내성 유전자 유닛 제거
상기 실시예 25에서 제조한 hEPO-21AΔqF-HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포 속에서 실시예 18의 (5-1)에서 제조한 FLPe 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 FRT 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체로부터 Neo 내성 유전자 유닛을 추출하여 제거한다. 재조합 삽입체의 선별은, Neo 내성 유전자 유닛의 결실을 지표로 하였다.
hEPO-21AΔq-HAC 벡터를 보유하는 CHO 세포(CHO(21qA-HACE)-13 및 CHO(21qA-HACE)-14)을 트립신 처리하고, 5×106 세포를 0.8 ㎖의 행크스 평형염 용액(HBSS)에 현탁하였다. 20 내지 100 μg의 FLPe 효소 발현 벡터 pOG44FLPe 존재 하에서 진 펄서 II(바이오 라드)를 이용하여 전기 천공을 행하였다. 용량 500 μF의 컨덴서에 450 V로 인가하고, 전극간 거리 4 mm의 전기 천공셀을 이용하여 방전하였다. 전기 천공한 세포를 10％ FBS를 첨가한 F12 배지(인비트로겐)를 포함하는 96웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘) 8매(1 cell/well로 4매, 0.1 cell/wellfh 4매)에 접종하였다. 2 내지 3주간 후/블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하여, 합계 120개(CHO(21qA-HACE)-13 유래 60개, CHO(21qA-HACE)-14 유래 60개)의 콜로니를 단리하여, 동일 클론을 2 개의 상이한 24 well 플레이트에 접종하고, 한편으로는 블라스티사이딘에서, 한편으로는 G418과 블라스티사이딘에서 배양하였다. G418을 추가한 well에서 사멸한 클론은 neo 유전자가 결실하고 있다고 생각된다. G418에서 사멸한 클론은 120개 중 12 클론(CHO(21qA-HACE)-13 유래 3개, CHO(21qA-HAqE)-14 유래 9개)였다. 이 클론을 이용하여, 이후의 해석을 행하였다.
(1-2) PCR 해석
hEPO-21AΔq-HAC 벡터 상에서 Neo 내성 유전자 유닛 제거되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, pLN1-EPOF 벡터 상 및 21AΔqHAC 벡터 상에 설계한 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해서, 또한 삽입된 hEPO 유전자를 플라스미드 벡터 pBS226 상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서 확인하였다. 프라이머 서열 및 PCRF Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. Neo 카세트를 포함하는 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7 kbp의 증폭이 예상된다. 한편, Neo 내성 유전자 유닛이 제거되어 있으면, 상기 2종의 프라이머에서는 증폭 산물은 볼 수 없다. 그 결과, 상기 (1-1)에서 얻은 G418 비내성 CHO 잡종 세포 합계 12주 중 합계 10주에서 예상되는 증폭 산물이 보이지 않는 것을 확인하였다. 이로부터, 상기한 Bsd 내성 또한 G418 비내성 CHO 잡종 세포 합계 10주가 Neo 내성 유전자 유닛 제거되어 있는 것이 확인되었다.
(1-3) 서던 블롯 해석
hEPO-21AΔq-HAC 벡터 상에서 Neo 내성 유전자 유닛 제거되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행하였다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 염기 서열로부터 예상되는 EcoRI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, Neo 내성 유전자 유닛이 제거되고 hEPO 발현 유닛만의 경우 4.9 kb, Neo 내성 유전자 유닛 및 hEPO 발현 유닛 양쪽을 포함하는 경우 7.6 kb이다. 상기 실시예 27(1-1)에서 얻은 후보 CHO 잡종 세포 12주(CHO(21qA-HACE)-13 유래 3주, CHO(21qA-HACE)-14 유래 9주)로부터, 합계 10주(CHO(21qA-HACE)-13 유래 2주, CHO(21qA-HACE)-14 유래 8주)에서 예측되는 크기의 밴드를 검출하였다. 이로부터, 상기 CHO 잡종 세포 10주에 있어서, Neo 내성 유전자 유닛 제거를 확인하였다. Neo 내성 유전자 유닛이 제거된 hEPO-21AΔqF-HAC 벡터를 이하 hEPO-21AΔqΔneo-HAC 벡터라고 칭한다.
(1-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (5-3)에서 얻은 후보 CHO 잡종 세포 중 10주에 대해서 해석하였다. 그 결과, 합계 4주(CHO(21qAHACEA)-4,8,10,11)에 있어서, 관찰한 분열상의 대부분에서 정상 핵형 또한 Cot1로 염색된 1카피의 hEPO-21AΔqΔneo-HAC 벡터를 검출하였다.
이상 (1-1) 내지 (1-4)의 실험으로부터, 얻어진 상기 CHO 잡종 세포 4주는, hEPO-21AΔqΔneo-HAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 잡종 세포인 것이 입증되었다.
실시예 28
Cre - loxP 를 이용해서 인간 21번 염색체 장완원위를 결실시킨 21 HAC (21NΔ qHAC ) 벡터의 구축
HAC 벡터가 텔로미어 서열 및 인간 21번 염색체 말단의 짧은 서브텔로미어는 서열(약 8 kb)을 함유하도록, 장완원위 및 근위에 loxP 서열을 상동 재조합에 의해 삽입하고, Cre에 의한 부위 특이적 재조합 반응에 의해 2개 부위의 loxP 서열 사이의 영역을 추출하고 결실시켜 장완원위 결실 인공 염색체(21NΔqHAC) 벡터를 구축한다.
(1) 부위 특이적 재조합 반응에 의한 인간 21번 염색체 장완 결실
(1-1) 인간 21번 염색체 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 벡터 NT의 구축
loxP 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는 V901(Lexicon genetics)를 이용하였다. V830(Lexicon genetics)으로부터 RsrII(NEB)에 의해 MC1-TK 서열을 추출한 후 V901 플라스미드의 제한 효소 BamHI의 인식 부위에 클로닝하였다(클론명: V901T-2). LoxP 삽입 부위인 인간 21번 염색체 원위의 염기 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 얻었다(NT_011515). 상동 재조합의 2개의 표적 서열의 증폭에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00060
인간 21번 염색체를 보유하는 A9<21-2> 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형 로 하여 표적 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 상기한 프라이머를 이용하여, LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 95℃ 2분의 후, 변성 95℃ 15초, 어닐링 68℃ 4분을 30 주기 행하였다. 각각을 제한 효소 EcoRI(닛본 진)내지 HindIII(닛본 진)로 소화시키고, 아가로스 겔에 의해 분리하고 정제한 후, V901T-2 플라스미드의 EcoRI 내지 HindIII 사이트에 클로닝하였다. 또한 V901T-2 플라스미드의 AscI와 KpnI 사이트에 AscI와 KpnI에 의해 추출한 3' HPRT-loxP-BS를 클로닝하였다. 3' HPRT-loxP-BS는 V820(Lexicon genetics)의 XbaI 사이트에 올리고 합성한 loxP 서열과 CMV-BS 서열(인비트로젠)를 클로닝함으로써 제조하였다. 최종적인 loxP 삽입 구조물의 크기는 13 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 83에 도시하였다.
(1-2) 장완근위 loxP 삽입 완료 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 세포에의 장완원위 텔로미어측 loxP 서열 삽입용 NT 벡터 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, NT 구조물을 제한 효소 NotI 소화에 의해 선상 DNA로 하고, 실시예 23의 (1)에서 제조한 장완근위 loxP 삽입 완료 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포 DT40(kk139)에 도입하였다. 블라스티사이딘(종농도 8 ug/ml)로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다. 2회의 형질감염으로부터 합계 12개의 블라스티사이딘 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(1-3) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 실시예 6의 (1-1)의 방법에 따라서, PCR법에 의해 검출하였다. 2개의 표적 서열(도 83 중, 각각 5'게놈 및 3'게놈으로 나타냄)에 대하여, 이들을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 83에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00061
PCR은 서열 번호 138-145(3'게놈), 서열 번호 139-144(5'게놈)의 조합으로 행하였다.
상기 블라스티사이딘 내성 12주 중 5주에서 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 확인하였다.
(1-4) 서던 블롯 해석
상동 재조합체를 선별하기 위한 스크리닝으로서 서던 블롯 해석을 행하였다. 상동 재조합의 3'측의 표적 서열 내측에 프로브를 설정하였다(도 83). 프로브는 이하에 나타내는 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 이용하여, 인간 21번 염색체를 보유하는 A9<21-2> 세포 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭하고, 단리, 정제하였다(3' 프로브-6으로 함).
Figure 112009007627410-PCT00062
1차 스크리닝으로 얻은 5주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 KpnI(로슈)에 의해 소화하고, Ausubbl 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 표지한 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 상동 재조합체로 7.6 kb, 야생형(비재조합체)으로 23 kb이고, 후보 5주로부터 합계 2주(DT40(kkNT)-7,11)의 상동 재조합체를 확인하였다. 이들 2클론을 이용하여 다음 단계 (3)으로 진행시켰다.
(2) 장완근위 및 원위에 loxP를 도입한 인간 21번 염색체의 CHO 세포에의 도입
(2-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 개질 인간 21번 염색체의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 28의 (1)에서 얻어진, 장완근위 및 원위에 loxP를 도입한 인간 21번 염색체를 보유하는 DT40 잡종 세포(DT40(kkNT)-7,11)를 이용하였다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO hprt 결손 세포(휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크로부터 입수, 등록 번호 JCRB0218)를 이용하였다.
처음에 약 109개의 DT40 잡종 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 세포 밀도가 60 내지 70％ 포화될 때까지 배양한 DT40 잡종 세포를 콜세미드(0.05 ㎍/ml, 인비트로젠)를 포함하는 배양액(10％ FBS, 1％ ChS, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, RPMI1640) 속에서 13 내지 18시간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 원심 분리에 의해 세포를 회수하여 무혈청 DMEM에 재현탁하고, 미리 폴리 L-리신으로 코팅한 25 cm2 원심용 플라스크(눈크) 12개에 접종하였다. 37℃ 1시간 정치하여 세포가 부착된 후 배양액을 제거하고, 미리 보온(37℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/ml, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 원심 용기에 플라스크를 삽입하고, 34℃, 8,000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)을 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과 정제한 후, 5 ㎖의 DMEM에 현탁하였다. 마이크로셀 현탁액을 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하고, 이것에 DMEM으로 2회 세정한 후 5 ㎖의 DMEM에 현탁한 약 107개의 CHOhprt-/- 세포를 중층한 후, 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 45％ 폴리에틸렌글리콜 1500(PEG1500, 로슈) 10％ DMSO(시그마)를 포함하는 DMEM 용액으로 120초간 융합 처리하였다. 120 ㎖의 10％ FBS를 포함하는 F12 배지(인비트로젠)에 현탁하고, 48웰 플레이트(팔콘) 5매에 접종하고, 24 내지 36시간 후에 블라스티사이딘(8 ㎍/ml)을 포함하는 선택 배지(10％ FBS, F12)로 배양하였다. 약 2주간의 선택 배양의 후, 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다. 2회의 미소핵 세포 융합으로부터 합계 10주(DT40(kkNT)-7 유래 5주, DT40(kkNT)-11 유래 5주)의 블라스티사이딘 내성 CHOhprt-/-주를 얻었다.
(2-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주 게놈 DNA를 주형으로 하여 인간 21번 염색체 상에 존재하는 유전자의 게놈 영역의 존재를 실시예 23의 (1-3) 및 실시예 28의 (1-3) 기재의 PCR법에 의해 확인하였다. 해석한 10클론 전부에서 증폭 산물을 확인할 수 있었다.
(2-3) 형광 계내 혼성화(FISH) 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FIS, H 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)을 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (2-2)에서 취득한 것 중의 6클론에 대해서 해석한 결과, 전부에서 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 Cot1로 염색된 1카피의 신호를 검출하였다.
(3) Cre-loxP 부위 특이적 재조합 반응에 의한 장완원위의 결실
(3-1) 장완원위 및 근위에 loxP 서열 삽입한 인간 21번 염색체 보유 CHO 잡종 세포에의 Cre 발현 벡터의 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, Cre 발현 벡터 pCAGGS-Cre를 실시예 28의 (2)에서 취득한 CHO(kkNT)-1 및 CHO(kkNT)-5 및 CHO(kkNT)-6 세포에 도입하였다. HAT(SIGMA, 종농도 1x)로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다.
3회의 형질감염으로부터 합계 12개의 HAT 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(3-2) PCR 해석
HAT 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 loxP 서열 사이의 결실을 PCR법에 의해 확인하였다. 장완원위 결실 후에 남은 loxP, 서열을 사이에 둔 염색체 상과 타겟팅 벡터 상에 각각 올리고뉴클레오티드 프라이머쌍을 설계하였다. 그 위치는 도 84 중에 화살표로 나타내었다. 그 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00063
EX Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 94℃ 15초, 어닐링 60℃ 30초, 신장 72℃ 1분을 35 주기로 행하였다. LOXP 서열 사이의 결실에 의해 장완원위가 결실된 경우, 약 350B의 증폭이 예측된다. 또한 서열 번호 148-145, 서열 번호 114-149, 서열 번호 114-145의 조합에서는 5.7 KB, 6.3 KB, 12 KB의 증폭이 예측된다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, 반응 조건은 이하와 같이 행하였다. 서열 번호 148-145, 서열 번호 114-149의 해석; 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 10분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 25 주기, 신장 72℃ 10분. 서열 번호 114-145의 해석; 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 6분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 10분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 6분을 30 주기, 신장 72℃ 10분. PCR 반응액에는 MGSO4(종농도 0.5 MM)를 첨가하였다.
그 결과, 상기 HAT 내성 12주 중 6주에서 상기 조합의 프라이머에서의 예측되는 증폭 산물을 확인하였다.
(3-3) 서던 블롯 해석
장완원위 결실체를 구조 확인 및 선별하기 위해서 서던 블롯 해석을 행하였다. 장완원위 결실에 의해 생기는 표적 서열, 염색체 대립 유전자 및 프로브의 위치를 도 84에 도시하였다. 상동 재조합의 5'측 프로브는 실시예 1의 (1-4)에 기재된 5' 프로브-1을, 3'측 프로브는 실시예 28(1-4)에 기재된 3' 프로브-6을 이용하였다.
1차 스크리닝(PCR)으로 얻은 후보 6 클론 으로부터 게놈 DNA 약 5 MG을 제한 효소 KPNI(로슈)에 의해 소화하고, AUSUBEL 등(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행하였다. 32P에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon92l0(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출하였다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 16.5 kb, 재조합 전의 클론으로 12 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 16.5 kb, 재조합 전의 클론으로 7.6 kb이다. 그 결과, 6주 전부에서 장완원위 결실체를 확인하였다.
(3-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)을 프로브에 이용하여 행하였다. 상기 (3-3)에서 취득한 6클론에 대해서 해석한 결과, 4클론에서 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 장완원위를 결실시킨 인간 21번 염색체 단편이 Cot1로 염색되어 있고, 1카피의 신호를 검출하였다.
이상 (3-1) 내지 (3-4)의 실험으로부터, 얻어진 HAT 내성 CHO 잡종 세포는, 텔로미어 및 서브텔로미어를 남기고 장완원위를 결실시킨 인간 21번 염색체 단편(21NΔqHAC)을 보유하는 것을 확인하였다.
실시예 29
21NΔ qHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 장기 안정성 해석
(1) 비선택 배양 조건 하에서의 장기 계대 배양
21NΔqHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 안정성을 확인하기 위해서, 비선택 조건 하에서 장기 계대 배양을 행하였다. 실시예 28에 기재한 21NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 세포주 2주(CHO(21qN-HAC)17, 18)를 사용하였다. 비선택 배양액은 10％ FBS를 포함하는 F12 배지이고, 선택 배양액은 이것에 1xHAT를 첨가하였다. CHO 세포주는 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 세포 밀도가 80 내지 90％ 포화될 때까지 배양한 세포를 계수하고 다시 5.0×105 세포를 10 cm 직경 디쉬에 접종하고, 10 계대까지 행하였다. 계대 마다 세포수를 계수하여 집단 배가수를 산출하였다. CHO 세포주는 10계대 후에 각각 세포를 회수하여 FISH용 염색체 표본을 제조하였다.
(2) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 세포 집단 배가수 및 HAC 유지율은 2회 행한 결과의 평균치를 산출하였다. 상기 2주에 대해서 그 결과를 표 11에 나타내었다.
Figure 112009007627410-PCT00064
21NΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 10계대 후까지의 시점에 안정적으로 보유되어 있었다. 또한 분열 중기의 염색체상을 관찰한 바, 세포당 1 내지 2개의 신호이 검출되었다.
이상의 (1) 및 (2)의 실험에 의해, 21NΔqHAC 벡터는, CHO 세포에서 비선택 배양 조건에서 안정적으로 보유되는 것, 또한 세포당의 카피수는 유지되어 있는 것이 입증되었다.
실시예 30
hEPO -21NΔ qHAC 벡터의 CHO 잡종 세포에서의 hEPO 유전자 발현 해석
(1) 21NΔqHAC 장완근위에의 클로닝 부위의 도입
(1-1) loxP 및 3'neo 및 FRT 서열 삽입용 pSF1(FRT)-D 벡터의 구축
인간 인공 염색체(21NΔqHAC)에 loxP 및 3'neo 및 FRT 서열을 삽입하기 위한 기본 플라스미드에는, 실시예 18의 (1)에서 제조한 t1pSF1(FRT)를 이용하였다. loxP 및 3'neo 및 FRT 서열 삽입 부위인 인간 21번 염색체 장완근위의 염기 서열은 GenBank 데이터베이스로부터 얻었다(등록 번호 NT_011515). 상동 재조합의 2개의 표적 서열 증폭에 이용한 프라이머 올리고뉴클레오티드의 서열을 이하에 나타내었다:
Figure 112009007627410-PCT00065
인간 21번 염색체를 보유하는 A9<21-2> 세포로부터 추출한 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 표적 서열을 PCR에 의해 증폭하였다. 서열 번호 134-135로 증폭한 약 3.4 kb의 DNA 단편(상동 영역 1)을 PacI 및 NheI(로슈)로 소화시키고, 서열 번호 150-151로 증폭한 약 2.0 kb의 DNA 단편(상동 영역 4)을 제한 효소 SalI 및 SrfI(로슈)로 소화시키고, 돌출 말단을 갖는 DNA 단편을 각각 아가로스 겔 전기 영동에 의해 분리하여, 정제하였다. 다음으로 제한 효소 소화한 상동 영역 1의 DNA 단편과 NheI 및 ScaI로 소화한 t1pSF1(FRT) 플라스미드(실시예 18의 (1)에서 제조)와 실시예 1의 (2-1)에서 제조한 pSF1③를 ScaI 및 PacI로 소화한 것의 3개의 DNA 단편을 3 단편 라이게이션하였다. 이 벡터를 SalI 및 SrfI에 의해 소화하고, 제한 효소 소화한 상동 영역 4을 클로닝한, pSF1(FRT)-D로 하였다. 최종적인 pSF1(FRT)-D 구조물의 크기는 약 11.8 kb이다. 타겟팅 벡터, 표적 서열, 및 상동 재조합에 의해 생기는 염색체 대립 유전자를 도 85 및 도 86에 도시하였다.
(1-2) 장완근위 및 원위에 loxP를 도입한 인간 21번 염색체의 hprt 결손 DT40 세포에의 도입
장완근위 및 원위에 loxP를 도입한 인간 21번 염색체를 보유하는 hprt 결손 DT40 잡종 세포는, 동염색체를 보유하는 실시예 28의 (2)에서 제조한 CHO(kkNT) 6 세포를 염색체 공여 세포로 하여 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의해 제조하였다. 염색체 수용 세포인 hprt 결손 DT40은 DT4032주(Fukagawa et al. Nucleic Acids Research, 1996)를 이용하였다. 이하에 제조법의 개략을 기재한다.
처음에 약 1×108개의 CHO(kkNT) 6 세포로부터 마이크로셀을 제조하였다. 25 cm2 원심용 플라스크(눈크) 12개에 세포 밀도가 80％ 포화될 때까지 배양한 CHO(kkNT) 6 세포를 콜세미드(0.1 ㎍/ml, 데메콜신, 와코 쥰야꾸)를 포함하는 배양액(20％ 우태아혈청; FBS, 0.8 mg/ml G418, F12) 속에서 72시간 배양하여 미소핵 형성을 유도하였다. 본 실시예에 있어서, DMEM은 닛스이 제약 제조의 것을 이용하였다. 배지를 제거한 후, 미리 보온(34℃)하여 놓은 사이토칼라신 B(DMEM 중에 10 ㎍/ml, 시그마) 용액을 원심용 플라스크에 채우고, 34℃, 8000 rpm, 1시간의 원심을 행하였다. 마이크로셀을 무혈청 배지(DMEM)에 현탁하여 회수하고, 기공 크기 8 ㎛, 5 ㎛, 3 ㎛의 필터(와트만)을 장착한 SWINNEX-25(밀리포어)를 이용하여 여과 정제하였다. 정제한 마이크로셀은 DMEM 6 ml에 재현탁하였다. DT4032 세포는, 10％ FBS, 1％ CS, 0.1 mM 2-ME를 포함하는 RPMI1640 배양액에서 배양한 후, DMEM으로 2회 세정하고, 1×107개의 세포를 DMEM 5 ml에 재현탁하였다. 마이크로셀 현탁액을 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하고, 이것에 DT4032세포 현탁액을 중층한 후, 실온, 1500 rpm, 5분간 원심 분리하여 상청을 제거하였다. 폴리에틸렌글리콜(PEG) 1:1.4 용액(Tomizuka 등, Nature Genet. (USA), 제16권, p.133-143, 1997년)으로 90초간 융합 처리하였다. 융합 세포를 60 ㎖의 10％ FBS, 1％ 닭 혈청(ChS), 0.1 mM 2-머캅토에탄올(ME)을 포함하는 RPMI1640 배양액(인비트로젠 제조)에 현탁하고, 96웰 플레이트의 6매에 접종하고 24시간 배양한 후, 1 mg/㎖의 G418을 포함하는 배지에서 약 2주간 선택 배양하였다. 2회의 마이크로셀 융합 실험으로부터 출현한 약제 내성의 콜로니를 단리하였다. G418 내성주 게놈 DNA를 주형으로 하여 인간 21번 염색체 상에 존재하는 유전자의 게놈 영역의 존재를 실시예 28의 (2-2) 기재의 PCR 법에 의해 확인하고, 추가로 인간 특이적 프로브 Cot1(기브코 BRL)를 이용한 형광 계내 혼성화(FISH) 해석에 의해 1카피의 인간 21번 염색체를 보유하는 클론 DT4032(KKNT) 8, 9를 확인하여 얻었다.
(1-3) Cre-loxP 부위 특이적 재조합 반응에 의한 장완원위의 결실
(1-3-1) 장완원위 및 근위에 loxP 서열 삽입한 인간 21번 염색체 보유 DT4032 잡종 세포에의 Cre 발현 벡터의 도입
실시예 1의 (1-2)의 방법에 따라서, Cre 발현 벡터 pCAGGS-Cre를 실시예 30의 (1-2)에서 취득한 DT4032(kkNT)-8 및 DT4032(kkNT)-9 세포에 도입하였다. HAT(SIGMA, 종농도 1x)로 선택 배양을 행하고, 2 내지 3주간 후에는 약제 내성 콜로니가 출현하였다.
4회의 형질감염으로부터 합계 43개의 HAT 내성 콜로니를 단리하여 증식시키고 이후의 해석을 행하였다.
(1-3-2) PCR 해석
HAT 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 2개의 loxP 서열 사이의 결실을 실시예 30의 (3-2)와 동일하게 PCR법에 의해 확인하였다.
그 결과, 상기 HAT 내성 43주 중 40주에서 상기 조합의 프라이머에서의 예측되는 증폭 산물을 확인하였다.
(1-3-3) 서던 블롯 해석·
1차 스크리닝(PCR)으로 얻은 후보중의 25클론으로부터 게놈 DNA를 추출하고 실시예 30의 (3-3)과 동일하게 서던 블롯 해석을 행하였다. 그 결과, 25클론 중 5주에서 장완원위 결실체를 확인하였다.
(1-3-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행하였다. 상기 (1-3-3)에서 취득한 5클론에 대해서 해석한 결과, 4클론에서 정상 핵형 또한 관찰한 분열상의 대부분에서 장완원위를 결실시킨 인간 21번 염색체 단편이 Cot1로 염색되어 있고, 1카피의 신호를 검출하였다.
이상 (1-3-1) 내지 (1-3-4)의 실험으로부터, 얻어진 HAT 내성 DT4032 잡종 세포는, 텔로미어 및 서브텔로미어를 남기고 장완원위를 결실시킨 인간 21번 염색체 단편(21NΔqHAC)을 보유하는 것을 확인하였다.
(1-4) 21NΔqHAC 보유 DT4032세포에의 pSF1(FRT)-D 벡터 도입
pSF1(FRT)-D 구조물을 제한 효소 SrfI(로슈) 소화에 의해 선상화시키고, 장완원위를 결실시킨 21NΔqHAC를 보유하는 DT4032 잡종 세포 3종(DT4032(kkNTC) 15, 17, 22)에 각각 도입하였다. 방법은 실시예 1의 (2-2)에 따라서 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 블라스티사이딘 내성 콜로니가 출현하였다. DT4032(kkNTC) 15로는, 각 2회의 형질감염으로부터 합계 125개의 약제 내성 콜로니를, DT4032(kkNTC) 17로는, 각 2회의 형질감염으로부터 합계 110개의 약제 내성 콜로니를, 또한 DT4032(kkNTC) 22로는 각 2회의 형질감염으로부터 합계 124개의 약제 내성 콜로니를 단리하고, 이후의 해석을 행하였다.
(1-5) PCR 해석
상기 블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 서열 번호 114-139의 프라이머 세트 및 서열 번호 145-138의 프라이머 세트를 이용한 PCR법에 의해 검출할 수 있다. 그 위치는 도 86 중에 화살표로 나타낸다. LA Taq 폴리머라제(다까라 슈조)를 이용하고, PCR 반응액은 MgSO4(종농도 0.5 mM)를 포함하였다. 반응 조건은 94℃ 1분 후, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 72℃ 8분을 3 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 70℃ 8분을 2 주기, 변성 98℃ 5초, 어닐링/신장 68℃ 8분을 30 주기, 신장 72℃ 10분으로 행할 수 있다.
(1-6) 서던 블롯 해석
장완원위 결실체를 구조 확인 및 선별하기 위해서 서던 블롯 해석을 행할 수 있다. 장완원위 결실에 의해 생기는 표적 서열, 염색체 대립 유전자 및 프로브의 위치를 도 86에 도시하였다. 상동 재조합의 5'측 프로브는 실시예 23의 (1-4) 기재의 5' 프로브-1을, 3'측 프로브는 실시예 28의 (1-4) 기재의 3' 프로브-6을 이용한다.
1차 스크리닝(PCR)에서 얻은 주로부터 추출한 게놈 DNA 약 5 μg을 제한 효소 KpnI(로슈)에 의해 소화하고, Ausubel 등(Current Protocols in Molecular Biology,, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 기록된 방법으로 서던 블롯 해석을 행할 수 있다. 32P에 의해 표지된 프로브가 혼성화한 신호를, 이미지 분석기 Typhoon9210(몰리큘러 다이나믹스)에 의해 검출할 수 있다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 11 kb, 재조합 전의 클론으로 16.5 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 6.2 kb, 재조합 전의 클론으로 16.5 kb이다.
이상의 (1-1) 내지 (1-6)의 실험에 의해, 상동 재조합에 의해 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 및 FRT 서열)이 삽입된 21NΔqHAC 벡터를 보유하는 DT4032 잡종 세포를 취득할 수 있다.
(2) CHO 세포에의 21NΔqHAC 벡터 도입
(2-1) 마이크로셀 매개 유전자 전이법에 의한 21NΔqHAC 벡터의 CHO 세포에의 도입
염색체 공여 세포로서, 상기 실시예 30의 (2)에서 얻어진, 장완원위를 결실시키고 클로닝 부위(loxP 및 3'neo 및 FRT 서열)이 삽입된 21NΔqHAC 벡터를 보유하는 DT4032 잡종 세포를 각각 이용한다. 염색체 수용 세포로는 차이니즈 햄스터 유래 세포주 CHO-K1(등록 번호 JCRB9018)를 이용한다. 방법은, 실시예 1의 (3-1)에 따라서 행할 수 있다.
(2-2) PCR 해석
블라스티사이딘 내성주의 게놈 DNA를 주형으로 하여 5' 및 3'측의 2 표적 서열의 존재를 PCR법에 의해 검출할 수 있다. 방법은, 실시예 30의 (1-5)에 따른다. 염기 서열로부터 예상되는 크기(5'게놈 약 7.5 kb 및 3'게놈 약 5.3 kb)의 증폭 산물을 제공하는 것을 확인할 수 있다.
(2-3) 서던 블롯 해석
도입한 21NΔqHAC 벡터의 구조를 확인하기 위해서 서던 블롯 해석을 실시예 30의 (1-6)과 동일하게 행할 수 있다. 염기 서열로부터 예상되는 제한 효소 단편 길이는, 5'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 11 kb, 재조합 전의 클론으로 16.5 kb이고, 3'측 표적 서열에서는 상동 재조합체로 6.2 kb, 재조합 전의 클론으로 16.5 kb이다.
(2-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행할 수 있다.
이상 (2-1) 내지 (2-4)의 실험으로부터, 얻어진 블라스티사이딘 내성 CHO주는 21NΔqHAC 벡터를 보유하는 것을 확인할 수 있다.
(3) hEPO-21NΔqHAC 벡터의 구축
(3-1) 21NΔqHAC 벡터에의 hEPO 유전자의 도입
실시예 30의 (2)에서 구축한 21NΔqHAC 벡터에 hEPO 유전자 발현 유닛을 삽입한다. loxP 서열을 포함하는 hEPO 발현 플라스미드를 준비하고, Cre 재조합 효소를 일과성으로 발현시킴으로써 loxP 서열 간의 부위 특이적 재조합 반응에 의해 인공 염색체에 삽입한다. 재조합 삽입체의 선별은, G418 내성의 획득(프로모터 분단형의 neo 내성 유전자 발현 유닛의 재구성)을 지표로 하였다. 실시예 30의 (2)에서 제조한 21NΔqHAC 벡터를 보유하는 CHO 잡종 세포를 이용하여, 실시예 3의 (1-1)과 동일하게 하여 hEPO 유전자 발현 유닛의 삽입을 행하였다. 2 내지 3주간 후에는 G418 내성의 콜로니를 단리하여 증식시킬 수 있다.
(3-2) PCR 해석
hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체의 선별은, 21NΔqHAC 벡터 상의 loxP 서열 부위에 삽입되었는지 여부를, loxP 서열 부위를 사이에 두도록 pLN1-EPO 벡터 상 및 14NΔqHAC 벡터 상에 설계한 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해서, 또한 삽입된 hEPO 유전자를, 플라스미드 벡터 pBS226 상의 M13RV 및 Neo Rp2 프라이머에 의해서, PCR 증폭에 의해 확인할 수 있다.
프라이머 서열 및 PCR 조건은 Kakeda 등의 방법(Kakeda 등, Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따른다. 재조합 삽입체의 경우에는, 프라이머 SVpANp1 및 Neo Rp2에 의해 약 1.0 kbp, 프라이머 M13RV 및 Neo Rp2에 의해 약 2.7 kbp의 증폭이 예상된다. 이로부터, 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포가 loxP 서열에의 hEPO 유전자 발현 유닛 재조합 삽입체인 것을 확인할 수 있다.
(3-3) 서던 블롯 해석
hEPO-21NΔqHAC 벡터에서 hEPO 발현 유닛 구조가 올바르게 보유되어 있는지 여부를 조사하기 위해서, 서던 블롯 해석을 행할 수 있다. 방법은, Kakeda 등(Gene Therapy; 12: 852-856, 2005년)에 따랐다. 염기 서열로부터 예상되는 XbaI 소화에 의한 제한 효소 단편 길이는, hEPO 발현 유닛을 포함하는 5.5 kb이다.
(3-4) FISH 해석
FISH 해석은 마쯔바라 등(FISH 실험 프로토콜, 슈준샤, 1994)에 기록된 방법에 따라서, 인간 특이적 Cot1(인비트로젠)를 프로브로 이용하여 행할 수 있다. 이상 (3-1) 내지 (3-4)의 실험으로부터 얻어진 상기한 G418 내성 CHO 잡종 세포 ** 주는, hEPO-21NΔqHAC 벡터를 보유하는 정상 핵형의 CHO 세포인 것을 확인할 수 있다.
(4) 21NΔqHAC 벡터에 삽입된 hEPO 유전자의 발현
hEPO 유전자의 발현은 배양상청 중에 생산되는 hEPO 단백질을 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA법)에 의해 정량할 수 있다.
상기 (3)에서 단리한 hEPO-21NΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포를, 약 105 세포를 10％ FBS 첨가한 0.8 mg/㎖의 G418을 포함하는 F12 배지 2 ml를 넣은 12웰 조직 배양용 플라스틱페트리 접시(팔콘)에 접종하고, 합류에 도달 후, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 2 ㎖로 대체하여 2일간 배양하고, 10％ FBS를 첨가한 F12 배지 1 ㎖로 대체하고 24시간 더 배양한 후, 상청을 회수하고 세포수를 계수할 수 있다. hEPO ELISA 키트(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay, R&D 시스템)에 의해, 배양상청 중의 hEPO를 정량할 수 있는 상기 hEPO-21NΔqHAC 벡터를 보유하는 G418 내성 CHO 잡종 세포에서 hEPO의 발현을 확인할 수 있다.
본 발명에 의해 인간 인공 염색체(HAC) 벡터 및 그 제조 방법이 제공된다. 이러한 HAC 벡터는 세포에서 안정적으로 보유되고, 삽입된 외래 DNA를 고발현 가능한 것이다. 따라서, 이러한 HAC 벡터는 유전자 발현 해석, 유전자 치료, 유전자 도입, 단백질 제조 등의 다양한 용도에 유용하다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원은 전체로 참고로서 본 명세서에 도입된다.
서열 목록 프리 텍스트
서열 번호 1 내지 109: 합성 올리고뉴클레오티드
서열 번호 110 내지 117: 프라이머
서열 번호 118 내지 121: 프로브
서열 번호 122 내지 177: 프라이머
서열 번호 178 내지 179: 링커
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Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 82 aggaggatcc tttattgagt gcac 24 <210> 83 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 83 gtgcactcaa taaaggatcc tcct 24 <210> 84 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 84 cgatatcgat gctaagagat gccctaagaa atcc 34 <210> 85 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 85 tatggaggaa tggcagaggg tgacacaggc 30 <210> 86 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 86 acttcctgac taggggagga gtagaaggtg 30 <210> 87 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 87 agtgggcagt ttaccgtaaa tactccaccc 30 <210> 88 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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<213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 94 gatgcccggg ccaatagcca gtcaatcgag aaaccaagcc c 41 <210> 95 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 95 agcggtactg agaggcaatc tttcatgggc 30 <210> 96 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 96 accaaatatc ctgctcaaac tgtaaccc 28 <210> 97 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 97 tggactagtc caggccggcc acgcgtgaag ttcctatact ttctagagaa taggaacttc 60 ggaataggaa cttcgctagc ggccggcctg gactagtcca 100 <210> 98 <211> 100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 98 tggactagtc caggccggcc gctagcgaag ttcctattcc gaagttccta ttctctagaa 60 agtataggaa cttcacgcgt ggccggcctg gactagtcca 100 <210> 99 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 99 aactgcagcc caagcttcca ccatgccaca atttgg 36 <210> 100 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 100 aactgcagtg acttgttgac aatatcgaaa ctcagc 36 <210> 101 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 101 caaagctttg aagaaaaatg cgccttatcc 30 <210> 102 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 102 gatcatatgc atagtaccga gaaactagtg 30 <210> 103 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 103 gaccttcagg tgagaaaata gcatcatgtg 30 <210> 104 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 104 gtgatatcag attgatgttt ttgtccattg 30 <210> 105 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 105 acctaaggtg cttgttcgtc agtttgtgga aaggtttgaa agaccttca 49 <210> 106 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 106 cgggatccct cgagcgagac atgataagat acattgatg 39 <210> 107 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 107 gattttccac atacgttccc aagccactcc 30 <210> 108 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 108 actcagagat ccactgcacc aggatccaag ggagg 35 <210> 109 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic oligonucleotide <400> 109 ccgctcgagc ggctacacca cagacaccat tgttggctac tgctgcc 47 <210> 110 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 110 acctggaatt tcctaccatc ccccataa 28 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 111 atctctccag agggacagca tcataccc 28 <210> 112 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 112 cctgcaagtt atgaccactg gggatttt 28 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 113 ctgcagtgag ccgagatcat accactgt 28 <210> 114 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 114 aaatgcatca ccattctccc agttaccc 28 <210> 115 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 115 ggagatgagg aagaggagaa ca 22 <210> 116 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 116 cctgttctat ggttccagcc tcacattg 28 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 117 gaattcagcg agagcctgac 20 <210> 118 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 118 caggcaactg taacacagtg gtaggta 27 <210> 119 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 119 aacagtagag caatttcagg caggtc 26 <210> 120 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 120 cgcagctttt agctgaacta aggaga 26 <210> 121 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: probe <400> 121 gtgacacagg gatactctgt ccaaaa 26 <210> 122 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 122 ggagcaacag gacctctcat tccttgtt 28 <210> 123 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 123 ccaatgtcag gcactcctgc tctaaatg 28 <210> 124 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 124 gatcctcctg aatgcctg 18 <210> 125 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 125 gtaaatgccc tttggacc 18 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 126 ctgggcaata gagcaagacc 20 <210> 127 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 127 acccatatta tctatggaca attga 25 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 128 tggacaaata taaggcatgt tca 23 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 129 gtcaccttcc tctgcctttg 20 <210> 130 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 130 gaattcactc atcgtaactt cattt 25 <210> 131 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 131 ccttgtagga aggtatagac aatgg 25 <210> 132 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 132 ctgcaatctt tacctccctg gttcaagc 28 <210> 133 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 133 ggccgctcta gaactagtgg atc 23 <210> 134 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 134 gcgttaatta aaccgattaa ctgttctttt ccagta 36 <210> 135 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 135 gcgctagcga agtcaaaaga agtaacttct ttctct 36 <210> 136 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 136 gacagtgtcg acaagtcaaa agaagtaact tctatc 36 <210> 137 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 137 gatgcccggg cgtttccatg aaggatatta atcagt 36 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 138 caacagcatc cccatctctg 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 139 gctcaagatg cccctgttct 20 <210> 140 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 140 gaatgtcccc cattgtcact tcatgttc 28 <210> 141 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 141 ggcaagctta gtccagttgg gaaactgatg ggttcat 37 <210> 142 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 142 ggcgaattcg gattgagaga cacacatagc tggtca 36 <210> 143 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 143 ggcgaattct gtcaacctgc cagttctcag gagttt 36 <210> 144 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 144 cattcatggt agtcattggt gctgttctcc 30 <210> 145 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 145 acttcctgac taggggagga gtagaaggtg 30 <210> 146 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 146 ctggaagaca ctgagataac catgacc 27 <210> 147 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 147 ctgagaagtt ccacaatagc ctgtctc 27 <210> 148 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 148 tggaggccat aaacaagaag ac 22 <210> 149 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 149 ccccttgacc cagaaattcc a 21 <210> 150 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 150 gacagtgtcg accggattga gagacacaca tagctg 36 <210> 151 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 151 gatgcccggg cctgtcaacc tgccagttct caggag 36 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 152 ttcggcttct ggcgtgtgac 20 <210> 153 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 153 cgggatcccg tggcggcggg taattctttg ccaaa 35 <210> 154 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 154 aagcggccgc gactctaggg atccgccctc tccctccc 38 <210> 155 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 155 gacaccatgg ttgtggccat attatcatcg tg 32 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 156 gcatcgactt caaggaggac 20 <210> 157 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 157 cctgcagttc attcaggg 18 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 158 acgtaaacgg ccacaagttc 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 159 gtcctccttg aagtcgatgc 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 160 gcaaaacaat aactgttgtt 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 161 catttatctt ctctggctta 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 162 cagccagtgt tttcctggat 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 163 tctttgctct tctgcaacca 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 164 ggaataggga ttaggaaatg 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 165 acatgaggtt tatttggtgg 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 166 aagacaccag ggagtaacct 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 167 gctgaaccac taagggtgac 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 168 gcatgccttc aatgtgtgac 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 169 cagcagagcc aagatccagt 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 170 gtgccctctg ctctcagact 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 171 tgagctgggt ttcacagttg 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 172 gccatgtcct cagcctttag 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 173 ctggagcatc ctcttcttgg 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 174 ggtcttgtcc ttggctttca 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 175 atggagtcag agggggaaac 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 176 gaccatgacc ccacctctaa 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 177 ggtgggatgg aagagtcaga 20 <210> 178 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: linker <400> 178 gtcgacgcta gcgatatcgc ccgggcttaa ttaaggccgg cc 42 <210> 179 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: linker <400> 179 ggccggcctt aattaagccc gggcgatatc gctagcgtag ac 42 1/49

Claims (61)

  1. 장완원위 및/또는 단완원위가 결실된 인간 염색체 단편이며,
    (i) 인간 염색체 유래의 센트로미어(centromere),
    (ii) 텔로미어(telomere) 서열,
    (iii) 서브텔로미어(subtelomere) 서열, 및
    (iv) 외래 DNA
    를 포함하는 인간 염색체 단편을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열이 포유 동물 염색체의 장완 또는 단완 유래인 HAC 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열이 인간 염색체의 장완 또는 단완 유래인 HAC 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 서브텔로미어 서열이 인간 염색체의 장완 유래인 HAC 벡터.
  5. 제1항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 염색체로부터 장완원위가 결실된 부위에 상기 인간 염색체와 동일하거나 다른 인간 염색체의 장완 유래 서브텔로미 어 서열을 포함하는 것인 HAC 벡터.
  6. 제1항에 있어서, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열이 인간 14번 염색체의 14q32 영역 내의 부위부터 14q-tel 영역까지를 포함하는 서열인 HAC 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열이 인간 21번 염색체의 21q22.3 영역 내의 부위부터 21q-tel 영역까지를 포함하는 서열인 HAC 벡터.
  8. 제1항에 있어서, 서브텔로미어 서열이 약 1 내지 500 kb인 HAC 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 서브텔로미어 서열이 약 5 내지 60 kb인 HAC 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 인간 염색체 단편이 약 19 Mb 이하의 크기인 HAC 벡터.
  11. 제1항에 있어서, 외래 DNA가 단백질을 코딩하는 외래 DNA인 HAC 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 외래 DNA가 상기 인간 염색체 단편에서의 상기 장완원위 또는 단완원위 결실 위치보다 근위인 부위에 삽입되는 것인 HAC 벡터.
  13. 제1항에 있어서, 외래 DNA가 텔로미어 서열로부터 1 내지 500 kb의 영역에 삽입되는 것인 HAC 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 14번 염색체 단편 또는 인간 21번 염색체 단편인 HAC 벡터.
  15. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 염색체의 장완원위가 결실되어 있고 또한 장완근위 및 단완을 포함하는 것인 HAC 벡터.
  16. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 염색체의 단완원위가 결실되어 있고 또한 단완근위를 포함하는 것인 HAC 벡터.
  17. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 염색체의 장완원위 및 단완원위가 함께 결실되어 있고 또한 장완근위 및 단완근위를 포함하는 것인 HAC 벡터.
  18. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편의 장완원위가 인간 염색체 장완의 q11 영역 내 또는 q11 영역 내지 q12 영역 내에서 결실되어 있는 것인 HAC 벡터.
  19. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 14번 염색체 단편이 고, 또한 인간 14번 염색체 단편의 장완원위가 인간 14번 염색체의 AL391156에서 또는 AL391156보다 근위인 위치에서 결실되어 있는 것인 HAC 벡터.
  20. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편이 인간 21번 염색체 단편이고, 또한 인간 21번 염색체 단편의 장완원위가 인간 21번 염색체의 AP001657에서 또는 AP001657보다 근위인 위치에서 결실되어 있는 것인 HAC 벡터.
  21. 제1항 또는 제14항에 있어서, 인간 염색체 단편의 단완원위가 인간 염색체 단완의 p11 영역 내 또는 p11 영역 내지 p12 영역 내에서 결실되어 있는 것인 HAC 벡터.
  22. 제1항에 있어서, 인간 염색체 단편이
    (iv) 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 더 포함하는 것인 HAC 벡터.
  23. 제22항에 있어서, 인간 염색체 단편이 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 포함하는 것인 HAC 벡터.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 인간 염색체 단편의 장완근위 및/또는 단완근위에 삽입되어 있는 것인 HAC 벡터.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열인 HAC 벡터.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열인 HAC 벡터.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 HAC 벡터를 갖는 세포.
  28. (a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
    (b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
    (c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계; 및
    (d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계를 포함하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (b)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위의 결실을 부위 특이적 재조합 효소를 이용하여 행하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 텔로미어 서열과의 치환에 의해 결실시키고, 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 텔로미어 서열을 부가하는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 단계 (b) 및 (c)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위에서 2개 부위 이상을 절단함으로써 상기 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키고, 또한 결실된 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 것인 방법.
  32. 제28항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위에서 2개 부위 이상을 절단함으로써 상기 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키고, 또한 결실된 장완 및/또는 단완의 부위에 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편 유래의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가하는 것인 방법.
  33. 제28항에 있어서, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열이 인간 14번 염색체의 14q32 영역 내의 부위부터 14q-tel 영역까지를 포함하는 서열인 방법.
  34. 제28항에 있어서, 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열이 인간 21번 염색체 의 21q22.3 영역 내의 부위부터 21q-tel 영역까지를 포함하는 서열인 방법.
  35. 제28항에 있어서, 단계 (b)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위를 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완 q11 영역 내 또는 q11 영역 내지 q12 영역 내에서 결실시키는 것인 방법.
  36. 제28항에 있어서, 단계 (b)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편이 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편이고, 또한 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 장완원위를 인간 14번 염색체의 AL391156에서 또는 AL391156보다 근위인 위치에서 결실시키는 것인 방법.
  37. 제28항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편이 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편이고, 또한 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 14q11 영역에서 장완원위를 결실시키고, 결실된 장완원위의 부위에 상기 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 14q32 영역 내의 부위부터 14q-tel 영역까지의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가하는 것인 방법.
  38. 제28항에 있어서, 단계 (b)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편이 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편이고, 또한 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 장완원위를 인간 21번 염색체의 AP001657에서 또는 AP001657보다 근위인 위치에서 결실시키는 것인 방법.
  39. 제28항에 있어서, 단계 (b) 내지 (d)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편이 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편이고, 또한 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 21q11 영역에서 장완원위를 결실시키고, 결실된 장완원위의 부위에 상기 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 21q22.3 영역 내의 부위부터 21q-tel 영역까지의 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가하는 것인 방법.
  40. 제28항에 있어서, (e) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계를 더 포함하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 단계 (e)에서 부위 특이적 재조합 효소가 Cre 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 loxP 서열인 방법.
  42. 제40항에 있어서, 단계 (e)에서 부위 특이적 재조합 효소가 FLPe 효소이고, 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위가 FRT 서열인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 단계 (e)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편이 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편이고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 인간 14번 염색체 또는 인간 14번 염색체 단편의 장완의 AL391156에 또는 AL391156에서의 결실 위치보다 근위인 위치에 삽입하는 것인 방법.
  44. 제40항에 있어서, 단계 (e)에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편이 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편이고, 또한 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 인간 21번 염색체 또는 인간 21번 염색체 단편의 장완의 AP001657에 또는 AP001657에서의 결실 위치보다 근위인 위치에 삽입하는 것인 방법.
  45. 제1항에 있어서, 제28항 내지 제44항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터.
  46. 제45항에 기재된 HAC 벡터를 보유하는 세포.
  47. (a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
    (b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
    (c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
    (d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
    (e) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 1개 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계; 및
    (f) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계
    를 포함하는, 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조 방법.
  48. (a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 세포를 얻는 단계;
    (b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
    (c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열 또는 텔로미어 서열 및 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
    (d) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 2종 이상의 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
    (e) 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 외래 DNA를 삽입하는 단계; 및
    (f) 단계 (e)에서 이용한 것과는 다른 종류의 부위 특이적 재조합 효소의 존재 하에서 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편 상의 약제 내성 유전자를 제거하는 단계
    를 포함하는, 외래 DNA를 포함하는 인간 인공 염색체(HAC) 벡터의 제조 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 인간 염색체가 인간 14번 염색체 또는 인간 21번 염색체인 방법.
  50. 제48항에 있어서, 약제 내성 유전자가 네오마이신 내성 유전자인 방법.
  51. 제1항에 있어서, 제47항 또는 제48항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 외래 DNA를 포함하는 HAC 벡터.
  52. 제51항에 기재된 외래 DNA를 포함하는 HAC 벡터를 보유하는 세포.
  53. 제27항 또는 제52항에 있어서, 인간 세포인 세포.
  54. 제53항에 있어서, 인간 세포가 인간 체세포인 세포.
  55. 제27항 또는 제52항에 있어서, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인 세포.
  56. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 HAC 벡터, 또는 제47항 또는 제48항에 기재된 방법에 의해 얻어지는 외래 DNA를 포함하는 HAC 벡터를 보유하는 세포를 포함하는 의약 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 외래 DNA가 에리트로포이에틴(EPO), 트롬보포이에틴(TPO), 혈액 응고 인자, 폰 빌브랜드 인자(vWF), 디스트로핀, 도파민 합성 효소, 인슐린, 인슐린형 증식 인자(IGF), 인슐린형 증식 인자 결합 단백질(IGFBP), 항체, 텔로메라제, 과립구 콜로니 자극 인자, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 면역 글로블린, 성장 호르몬, 인터루킨 2, 인터루킨 3, 인터루킨 4, 인터루킨 5, 인터루킨 6, 인터루킨 7, 인터루킨 8, 인터루킨 9, 인터루킨 10, 인터루킨 11, 인터루킨 12, 인터루킨 15, CD40 리간드, 인터페론, 아데노신 디아미나아제, α-1 안티트립신, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, 푸린 뉴클레오티드 포스포릴라아제, 성장 억제 인자(GIF), 종양 괴사 인자(TNF), 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M, Flt3 리간드(Flt3L), 스트로마 유래 인자(SDF), 줄기 세포 인자(SCF), 섬유아세포 증식 인자(FGF), 상피 증식 인자(EGF), 혈관 형성 유도 인자(VECF), 안지오포이에틴, 신경 성장 인자(NGF), 뼈 형성 인자(BMP), 액티빈, 트랜스포밍 증식 인자(TGF), 윈트(Wnt), 알 스폰딘(R-spondin), 모노클로날 항체, 올리고클로날 항체, 및 폴리클로날 항체로 이루어지는 군에서 선택되는 1개 이상의 단백질을 코딩하는 것인 의약 조성물.
  58. (a) 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포를 얻는 단계;
    (b) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편의 장완원위 및/또는 단완원위를 결실시키는 단계;
    (c) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 텔로미어 서열을 부가하는 단계;
    (d) 결실되는 장완 및/또는 단완의 부위에 서브텔로미어 서열을 부가하는 단계;
    (e) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 부위 특이적 재조합 효소의 인식 부위를 삽입하는 단계;
    (f) 부위 특이적 재조합 효소의 발현 하에서 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편에 단백질을 코딩하는 외래 DNA를 삽입하는 단계;
    (g) 상기 인간 염색체 또는 인간 염색체 단편을 보유하는 공여 세포로부터 마이크로셀을 제조하는 단계;
    (h) 상기 마이크로셀과 수용 세포를 융합하는 단계;
    (i) 융합한 수용 세포를 배지 속에서 배양하는 단계; 및
    (j) 얻어지는 배양물로부터 상기 단백질을 채취하는 단계
    를 포함하는 단백질의 제조 방법.
  59. 제58항에 있어서, 인간 염색체가 인간 14번 염색체 또는 인간 21번 염색체인 방법.
  60. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 HAC 벡터를 갖는 비인간 동물.
  61. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 기재된 HAC 벡터를 이용하여 원하는 질환을 치료하는 방법.
KR1020097002553A 2006-07-07 2007-07-06 인간 인공 염색체（ｈａｃ） 벡터 및 인간 인공 염색체（ｈａｃ） 벡터를 갖는 인간 세포 의약 KR20090036581A (ko)

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