KR20000057435A - 유전자 동정 및 분리용 유전자 트랩 콘스트럭트 - Google Patents

유전자 동정 및 분리용 유전자 트랩 콘스트럭트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 자신이 활성화되면 이차 리포터 유전자를 활성화시킬 수 있는 일차 리포터 유전자를 포함하는 유전자 트랩 콘스트럭트 (gene trapping construct)와, 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 유전자, 특히 일시적으로 발현되는 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 포유류 세포를 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 벡터; 및 상기 유전자 트랩 콘스트럭트 또는 상기 벡터를 적어도 하나 포함하는 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리용 키트에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리 방법에 관한 것이다.

Description

유전자 동정 및 분리용 유전자 트랩 콘스트럭트{Gene trap construct for identification and isolation of genes}
근래 들어 유전자의 분리 및 동정은 유전자 공학의 주요 목적 중 하나였다. 이를 위해, 영구적으로 발현되는 유전자의 분리 및 동정에 있어 실시되어온 모든 실험 방법들이 사용될 수 있다.
일시적으로만 발현되는 유전자의 분리 및/또는 동정은 이보다 훨씬 어려운데, 이와 같은 유전자의 예로는 세포 예정사 (programmed cell death)를 일으키는 유전자, 세포주기 유전자, DNA 복구 유전자 (DNA repair gene) 및 분화 특이적 유전자 등을 들 수 있다.
초파리 (Drosophila melanogaster)를 사용하는 유전학적 분석 방법이 적당하지 않은 포유류 세포에서 이러한 유전자를 동정하기 위해서, 특정한 벡터에 의해 프로모터를 가지지 않는 리포터 유전자와 세포내 유전자의 제어 요소 (control element)의 유전자 융합이 유도되는 것에 기초하는 방법이 개발되었는데, 이러한 벡터를 "유전자 트랩 (gene traps)" 또는 "프로모터 트랩 (promoter traps)"이라고 한다. 포유류에서 삽입 돌연변이를 일으키기 위해 다양한 벡터가 개발되었으며, 이때 리포터 유전자는 우연에 의존하여 염색체 중 수많은 부위에 삽입되며, 그 중에서도 전사 (transcription)가 활발히 일어나는 유전자 영역에 삽입될 수도 있다. 유전자 발현을 선별하는 과정을 통해, 상기 리포터 유전자가 내생적 (endogenous) 유전자의 조절 요소 (regulatory elements)와 융합이 일어난 클론이 유지된다. 이와 같은 방법으로 상기 벡터는 유전자 트랩으로 작용하며 유전자의 기능을 분석하는데 있어 유용한 수단을 제공한다 (Hill과 Wurst의 리뷰, 1993; Hill과 Wurst, 1993; von Melchner 등, 1993; von Melchner와 Ruley, 1995). DNA 전기천공법 (electroporation) 역시 이용되고는 있지만, 대부분의 경우 유전자 트랩 벡터는 재조합 레트로바이러스로서 형질도입된다. 레트로바이러스를 사용할 때의 장점은 그들이 게놈 전체에 걸쳐 몇몇 장소로 삽입되며 따라서 주변 DNA에 거의 해를 끼치지 않는다는 것이다 (Varmus, 1988; Coffin 등, 1989; Goff, 1990; Sandmeyer 등, 1990; Withers/Ward 등, 1994).
상기 유전자 트랩이 마우스에서 유전자 기능을 분석하는 데 있어 실용적인 도구라는 점이 증명되었다. 전형성능을 가진 (totipotent) 마우스 ES 세포가 세포 표적으로 사용되므로, 돌연변이에 의해 유전자 기능이 불활성화된 마우스 계통이 만들어질 수 있다. 동종 재조합 (homologous recombination)에 기인하는 유전자 분할 (gene splitting)과는 달리, 상기 유전자 트랩 방법은 유전자에만 국한되지 않고 클로닝된 서열을 유지할 수 있어서 미지의 유전자를 분리하고 동정하는 방법이라 할 수 있다.
그럼에도 불구하고 세포에서 처음 유도되어야 하는 유전자들, 즉 항상적으로 전사되지는 않는 유전자들 (예를 들면, 세포 예정사에 관련된 유전자, 세포 주기 유전자, DNA 복구 유전자, 분화 특이적 유전자 등의 일시적 유전자)을 동정하고 분리하기 위해서는 부가적인 과정이 필요한데, 이 과정을 통해 프로모터 활성에 무관한 지속적 신호 등을 통해 유전자 트랩 내에 걸린 일시적 세포내 프로모터를 동정하게 된다. ES 세포 계열에서 감염 또는 전기천공 이후 유전자 트랩에 의해 그 전사가 비활성화되는 유전자 중 대략 50% 정도가 마우스에서는 열성 표현형을 나타낸다 (Friedrich와 Soriano, 1991; Skarnes 등, 1992; von Melchner 등, 1992). 이 확률은 우연히 레트로바이러스가 삽입된 후나 DNA 미세주입 후에 나타나는 빈도보다 10배 더 높은 것이다 (Gridley 등, 1987; Jaenisch 등, 1985). 이와 같이 유전자 비활성화 비율이 높기 때문에 발현되는 유전자의 대부분에서 유전자 삽입을 보이는 세포 계열을 분리하기 수월하다고 볼 수 있다. 그러나, 원 세포계열에 모든 돌연변이를 일으키는 것은 매우 비실용적이며, 게다가 돌연변이 중 대다수는 별다른 중요성을 갖지 않는 유전자에서 일어난다. 결국 돌연변이가 일어난 ES 세포 클론들을 상대적으로 중요한 생물학적 과정 또는 유전자에 돌연변이가 일어난 것으로 교환하는 것이 바람직할 것이다.
이러한 면에서, 바람직한 시험관내 돌연변이로부터 ES 세포 클론을 미리 선별하고 이를 위해 분화 특이적 유전자 등의 유전자에서 일어나는 돌연변이를 동정하기 위한 리포터 유전자를 사용하는 전략이 특히 적당하다. 비록 배양된 ES 세포에서 발현되는 유전자가 생체내에서는 발현되지 않을 수 있으나, 융합 유전자가 배 (embryo) 뿐 아니라 ES 세포에서도 발현되는 사례가 12번 있었다 (De Gregory 등, 1994; Reddy 등, 1992). 게다가 시험관내 분화 과정에서 융합 유전자의 발현 변화를 통해, 생체내 발생 과정에서 일어나는 발현 변화를 비슷하게 예측할 수 있었던 사례도 있었다 (Reddy 등, 1992). 이와 같은 결과는 시험관내에서 조절되는 유전자가 생체내에서도 엄격히 조절된다는 기존의 관찰과 일반적으로 일치하는 것이다 (Muthuchamy 등, 1993; Rappotee 등, 1988; Rogers 등, 1991; Scholer 등, 1990; Sharpe 등, 1990).
본 발명은 자신이 활성화되면 다른 이차 리포터 유전자를 활성화시킬 수 있는 일차 리포터를 포함하는 유전자 트랩 콘스트럭트 (gene-trapping construct)와, 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 유전자, 특히 일시적으로 발현되는 유전자 (이하, "일시적 유전자"라고 약칭함)의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 포유류 세포를 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용되는, 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 벡터와, 최소한 상기 유전자 트랩 콘스트럭트 또는 상기 벡터를 포함하는 키트 (kit)에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리 방법에 관한 것이다.
첨부된 도면은 본 발명을 설명한다:
도 1은 본 발명의 방법을 두 가지 바람직한 실시예로 나타낸 모식도이고,
(A) FLOXIL-3 세포에서 IL-3 투여 중지에 의해 내생적 IL-3 분비가 활성화되는 기전. IL-3 투여를 중지하면, 본래에는 발현되지 않던 아폽토시스 (apoptosis) 유전자에 U3-Cre 유전자 트랩이 삽입된다 (좌측). 리포터 플라스미드 ppgklxtkneoIL3의 위치 특이적 재조합을 통해, tkneo 유전자가 제거되고 IL-3 유전자가 pgk 프로모터의 바로 하류에 위치하게 된다. 이에 따라 상기 유전자 트랩에 걸린 유전자의 발현이 더 이상 지속되지 않더라도 IL-3가 계속 합성된다.
(B) -pln13- 전형성능 ES 세포의 분화 시에 lacZ 유전자가 활성화되는 기전. U3-Cre 유전자 트랩이 본래 발현되지 않던 분화 유전자로 삽입이 분화 기간동안 일시적으로 활성화된다. 리포터 플라스미드 ppgklxneoLacZ 의 위치 특이적 재조합을 통해, LacZ 유전자가 pgk 프로모터의 바로 하류에 위치하게 된다. 그 결과, 상기 유전자 트랩에 걸린 유전자가 더 이상 발현되지 않더라도 베타-갈락토시다제는 계속 합성된다.
도 2는 ES 세포로부터 유도성 분화 유전자를 분리 및 분석하는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이고,
도 3은 발현 중인 유전자 속으로 U3-Cre-유전자 트랩이 삽입된 FLOXIL-3 세포에서 ppgklxtkneoIL3 플라스미드가 Cre/loxP 매개성 재조합되는 것을 나타내고,
(A) 재조합 전후의 ppgklxtkneoIL3 의 구조,
(B) 자가 (autonomous) 및 모 (parental) FLOXIL-3 세포의 서던 블럿 분석. 게놈 DNA를 BamHI으로 잘라 아가로즈 젤에서 분획화하여 나일론 막에 옮겼다.32P로 표지된 neo (좌측) 또는 pgk (우측)에 특이적인 프로브를 써서 혼성화 반응 (hybridization)을 수행하였다. 레인 1: 모 FLOXIL-3 세포; 레인 2~6: 자가 클론 1-5. 분자량은 1-kb BRL 척도를 사용하여 나타내었다.
도 4는 IL-3 투여 중지 이후 분리된 자가 클론에서 U3-Cre 유전자 트랩의 삽입 및 위치 특이적 재조합이 일어나는 것을 나타내고,
(상단) U3-Cre 프로바이러스 및 재조합된 리포터 플라스미드의 예상되는 구조,
(하단) U3-Cre/Floxil-3 삽입 뱅크에 IL-3를 투여 중단한 후 분리한 클론을 서던 블럿한 결과. 각 클론에서 분리된 게놈 DNA를 BamHI으로 잘라 도 3에서와 같이 처리하였다.32P로 표지된 Cre 또는 pgk에 특이적인 프로브를 써서 혼성화 반응을 수행하였다. 레인 1, 26-11-1; 레인 2, 26-11-3; 레인 3, 26-11-4; 레인 4, 26-11-5; 레인 5, 26-11-6; 레인 6, 26-11-7; 레인 7, 26-11-8; 레인 8, 26-12-1; 레인 9, 26-12-2; 레인 10, 26-12-3; 레인 11, 26-12-4; 레인 12, 26-12-5. 상기 프로브는 전체 삽입 뱅크를 대표한다.
도 5는 세포-프로바이러스 융합 전사체를 조사한 것을 나타내고,
(상단) 발현 중인 유전자로 U3-Cre 유전자 트랩이 삽입된 결과로부터 예상되는 전사체
(하단) 혈청 투여 중지 전후에서 수행된 세포-프로바이러스 융합 전사체의 노던 블럿 분석. 폴리아데닐화 RNA (5 ㎍)을 포름알데하이드-아가로즈 젤에서 분획화하고 나일론 막에 옮겼다. 혼성화 반응은32P로 표지된 Cre 또는 GAPDH 특이적 프로브를 사용하여 수행하였다. 홀수는 RNA를 표시하고, 짝수는 혈청 투여 중지 후 16시간에 분리된 RNA를 표시한다. 레인 5 및 6은 U3-Cre 삽입이 항상적으로 발현되는 클론으로부터 분리한 RNA를 담고 있다.
도 6은 IL-3 투여 중지 후 세포 전사체를 조사한 것을 나타내고, 이때 폴리아데닐화 RNA (레인 당 5 ㎍)는 0, 6, 12 시간동안 IL-3 투여 중지한 FDCP-1 세포에서 유래한 것이다. 노던 블럿은 도 5에서 서술한 것과 같이 수행하였고, 혼성화 반응은32P로 표지된 5' 프로바이러스 측면 서열 (flanking sequence) 또는 GAPDH 를 사용하여 수행하였다.
도 7은 U3-Cre 유전자 트랩이 ES 세포 속으로 삽입되는 것이 분화에 의해 조절됨을 나타낸다. 150 개의 세포로 구성되는 960 개의 세포군을 U3-Cre 바이러스로 감염시켜 G418 존재 하에서 선별하였고, 4일 후 분화를 유도하였다.
도 7a는 분화 유도 전 (좌측)과 후 (우측)의 X-Gal 염색 결과를 나타낸 것이고,
도 7b는 상기 조절된 클론의 서던 블럿 분석 결과를 나타낸 것으로, 게놈 DNA를 BamHI으로 잘라서 도 3에서와 같이 처리하였고, 혼성화 반응은32P로 표지된 Cre (좌측) 또는 pgk (우측) 특이적 프로브를 사용하여 수행하였다.
u : 분화되지 않은 클론 (undifferentiated),
d : 분화된 클론 (differentiated)
상기의 상세한 설명은 실시예에서 언급된다.
이하 실시예로써 본 발명을 기술하되, 하기 실시예가 본 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.
따라서 본 발명이 목적은 유전자, 특히 일시적 유전자를 편리하게 분리하고 동정할 수 있도록 하는 유전자 트랩 콘스트럭트를 제조하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 유전자 동정용 및/또는 분리용 키트와 함께, 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 유지하는 벡터와 세포를 제공하는 것이다.
마지막으로 본 발명의 목적은 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적은 본 발명의 청구범위 중 독립항 제 1항, 제 17항 및 제 22항, 세포에 관한 제 19항, 벡터에 관한 제 24항, 키트에 관한 제 25항, 방법에 관한 제 26항에 의해 충족된다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
여기에서 "리포터 유전자"라 함은 예를 들어 단백질 산물과 같은 인식가능한 신호로 전사되는 핵산 서열을 나타낸다. "일차" (first) 리포터 유전자가 삽입된 주변의 세포 전사 신호에 의해 상기 일차 리포터 유전자의 발현이 조절된다. 일단 상기 일차 리포터 유전자가 활성화되면, 상기 일차 리포터 유전자의 산물은 "이차" 리포터 유전자의 활성화를 일으킨다. 이때 이차 리포터 유전자는 영구적으로 활성되는데, 다시 말하면 상기 일차 리포터 유전자를 조절하는 DNA 부위의 전사 활성과는 무관하게 활성화된다는 것이다. 상기 이차 리포터 유전자는 명시가능한 유전자 산물을 코딩할 수 있는데, 이를테면 발색 반응에 의해 확인할 수 있는 효소나 선별가능한 성장인자 등을 그 예로 들 수 있다. 일차 및 이차 리포터 유전자를 조합한 결과, 일시적으로 발현되는 프로모터까지도 이차 리포터 유전자 산물 신호에 의해 영구적으로 표시될 수 있다. 상기 일차 및 이차 리포터 유전자는 공동의 콘스트럭트에 존재할 수도 있고, 세포에서 다양한 위치에 존재하는 다양한 기구에서 사용될 수도 있다. 상기 본 발명의 유전자 트랩 콘스트럭트는 원칙적으로, 상기 일차 리포터 유전자에 해당되는 기존의 일반적인 유전자 트랩 콘스트럭트 (예를 들면 US 5364783에 기술된 것)와, 상기 프로모터 활성과 무관하게 생산되는 영구적 산물을 제공하는 부가적 기구 (즉, 본 예에서는 이차 리포터 유전자 콘스트럭트)의 조합이다.
본 발명의 청구항 제 1항에서, 일차 리포터 유전자를 포함하는 유전자 트랩 콘스트럭트가 제공되는데, 상기 일차 리포터 유전자가 활성화되면 이차 리포터 유전자를 활성화시킬 수 있다. 상기 일차 리포터 유전자는 바람직하게는 재조합효소 (recombinase)를 코딩하며, 특히 상기 재조합효소로 바람직한 것은 Cre 또는 Flp 이다.
바람직한 형태의 상기 이차 리포터 유전자는 단백질 인자를 코딩할 수 있는데, 그 예로는 IL-3 를 코딩하는 유전자, 특히 대장균 베타-갈락토시다제 (LacZ)를 코딩하는 유전자가 바람직하다.
상기 이차 리포터 유전자의 활성화는, 이차 리포터 유전자 측면에 위치한 DNA 단편을 상기 재조합효소가 결실 (deletion)시킴으로서 바람직하게 이루어진다. 이때 상기 결실에 의해 이차 리포터 유전자는 프로모터의 바로 뒤에 위치하면서 상기 프로모터에 의해 영구적으로 조절받게 된다.
상기 결실된 DNA 단편은 항생제 저항성 유전자 (antibiotics-resistant gene)인 것이 바람직한데, 특히 티미딘 키나아제 (thymidine kinase)와 네오마이신 인산전달효소 (neomycin phosphotransferase)의 융합 단백질을 코딩하는 유전자, 그리고 네오마이신 인산전달효소를 코딩하는 유전자가 바람직하다.
상기 이차 리포터 유전자 앞에 위치하는 프로모터로는 인산글리세르산 키나아제의 프로모터 (phosphoglycerate kinase promoter)가 바람직하다.
상기 결실된 DNA 단편을 둘러싸는 서열 (flanking sequences)은 상기 재조합효소의 표적이 되는 것이 바람직한데, 이러한 서열의 예로는 loxP 또는 frt 등을 들 수 있다. 상기 표적 서열이 U3 및/또는 U5 부위에 위치할 수 있는 가능성 또한 있다.
상기에서 기술한 유전자 트랩 콘스트럭트는 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용될 수 있다. 이에 더하여서, 세포 예정사에 관련된 유전자, 세포 주기 유전자, DNA 교정 유전자 및 분화 특이적 유전자의 분리 및/또는 동정에 사용할 수 있다.
또한 본 발명은 상기에서 기술한 것과 같은 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포를 제공한다.
바람직한 실시예에서, 상기 포유류 세포는 IL-3 에 의존적이며 다음과 같은 바람직한 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함한다. 상기에 포함되는 유전자 트랩 콘스트럭트에서는, 일차 리포터 유전자는 Cre 재조합효소를 코딩하고; 이 Cre 재조합효소가 이차 리포터 유전자 앞에 있는 DNA 단편을 결실시킬 수 있으며; 결실된 단편은 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전달효소 융합 단백질을 코딩하고, loxP 표적 서열이 결실되는 단편을 둘러싸고 있으며; 이차 리포터 유전자가 IL-3 를 코딩하며, 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전달효소 융합 단백질의 유전자가 결실되면서 이차 리포터 유전자가 인산글리세르산 키나아제의 프로모터의 바로 하류에 위치하게 된다.
상기 포유류 세포는 FDCP1과 같이 성장인자에 의존적인 조혈 전구세포 (haematopoietic precusor cell) 또는 전형성능을 가진 ES 세포 (totipotent embryonic stem cell)가 특히 바람직하다.
본 발명의 상기 포유류 세포는 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용될 수 있으며, 특히 상기 세포에 의해 세포 예정사에 관련된 유전자, 세포 주기 유전자, DNA 복구 유전자 및 분화 특이적 유전자가 바람직하게 동정 및/또는 분리될 수 있다.
또한 본 발명은 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 벡터를 제공한다.
이에 더하여, 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정용 및/또는 분리용 키트 또한 제공되는데, 이 키트는 적어도 하나의 상기 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함한다.
바람직하게는 상기 키트는 두 개의 콘스트럭트를 포함하는데, 이중에서 일차 콘스트럭트는 일차 리포터 유전자를 포함하고, 이차 콘스트럭트는 이차 리포터 유전자를 포함한다.
상기 키트는 앞에서 기술한 벡터를 포함할 수도 있다.
마지막으로, 본 발명은 유전자, 특히 일시적 유전자를 동정하고 분리하는 방법을 제공하는데, 그 단계는,
1) 어떤 유전자 트랩 콘스트럭트를 적당한 세포 내에 상기한 대로 설치하는 단계,
2) 상기 일차 리포터 유전자가 유전자에 통합된 세포를 선별하는 단계로서, 바람직하게는 비활성 유전자 내에 편입된 세포를 선별하는 단계,
3) 상기 일차 리포터 유전자의 활성화 단계로서, 바람직하게는 비활성 유전자의 전사가 개시되어 일차 리포터 유전자가 활성화되고, 그 결과 이차 리포터 유전자가 활성화되는 단계,
4) 상기 일차 리포터 유전자가 편입된 유전자를 동정 및/또는 분리하는 단계로 구성되는데,
상기 방법의 바람직한 실시 형태는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
1) 상기 유전자 트랩 콘스트럭트는 Cre 재조합효소의 유전자를 일차 리포터 유전자로서 포함하고, 상기 Cre 재조합효소는 상기 이차 리포터 유전자의 상류에 위치한 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전달효소 유전자를 결실시키며, 이러한 과정을 통해 IL-3 를 코딩하는 이차 리포터 유전자가 인산글리세르산 키나아제 프로모터에 의해 조절받게 되고,
2) 상기 유전자 트랩 콘스트럭트는 IL-3 에 의존적인 FDCP-1 세포에 삽입되고,
3) 네오마이신 (이를테면 G418)을 포함하는 배양액에서 Cre 재조합효소를 생산하지 않는 세포를 선별하고,
4) 상기 선별된 세포를 IL-3 가 없는 배양액에서 배양하여 세포 예정사에 관련된 유전자를 활성화시키고,
5) 생존한 세포를 선발하고,
6) 세포 예정사에 관련된 유전자가 통상적인 분리 과정에 의해 분리된다.
상기 방법의 또다른 바람직한 실시 형태는 다음과 같이 나타낼 수 있다:
1) 상기한 대로 유전자 트랩 콘스트럭트는 Cre 재조합효소 유전자를 일차 리포터 유전자로서 포함하고, 상기 Cre 재조합효소가 이차 리포터 유전자의 상류에 위치하는 네오마이신 인산전달효소 유전자를 결실시킴으로써, LacZ 를 코딩하는 이차 리포터 유전자가 인산글리세르산 키나아제 프로모터에 의해 조절받게 되고,
2) 상기 유전자 트랩 콘스트럭트가 전형성능을 가지는 ES 세포로 삽입되고,
3) G418 존재 하에서 Cre 재조합효소를 생산하지 않는 세포를 선별하고,
4) 상기 선별된 세포가 분화되도록 유도하여 그 결과 분화 특이적 유전자를 활성화시키고,
5) 상기 세포를 분리하고,
6) 상기 세포가 포유류 동물의 생식 계열 세포 (germ line)로 도입되어 그곳에서 조직의 형태를 결정짓고,
7) 상기 분화 특이적 유전자를 통상적인 유전자 분리 과정으로 분리한다.
상기 세포 예정사에 관련된 유전자 분리 방법이 특히 효과적인 이유는, Cre 재조합효소를 발현하는 유전자 트랩이 선별 마커를 영구적으로 교체시켜서 사멸해가는 세포의 내생적인 사이토카인 (cytokine) 생산을 활성화시키는 것을 통해 세포가 증식하도록 전환하기 때문이다. 그 결과 세포 예정사 과정 동안 활성화된 유전자로 삽입되는 것을 선별할 수 있게 된다. IL-3와 같은 선별 마커는 (상기 유전자 트랩에서) 마커가 위치한 유전자의 발현과 무관하게 발현되는데 그 이유는 상기 재조합효소가 상기 선별 마커를 인산글리세르산 키나아제 프로모터의 뒤로 옮겨 놓기 때문이다. 세포가 세포 예정사 과정과 관련된 유전자를 계속해서 발현할 수 없기 때문에 이러한 작용은 매우 중요한 특징이 된다. 마지막으로, 본 발명의 방법은 강하게 발현되는 유전자에만 한정되지 않으며, 유전자 표현은 cDNA 클로닝과 같은 경우보다 훨씬 더 균일하다. 게다가 차별적 RT-PCR 증폭 (differential RT-PCR amplification)과는 달리, 분리 및/또는 동정에 유전자 트랩을 사용하는 용도는 재현성이 높고 중복성이 없으며 정량까지도 가능하다. 결국, 상기 유전자 트랩 프로바이러스는 5' 엑손에 위치하거나 그 근처에 위치하고, 그 전사방향은 위치한 유전자의 전사 방향과 일치하므로, 클로닝하기가 용이하다.
어떤 경우든지, IL-3 투여를 중지할 때 유도되는 세포내 전사체를 찾게 되면 세포 예정사동안 일어나는 복잡한 분자적 변화를 보다 깊게 인지할 수 있게 된다.
또다른 실시 형태에 따르면, 전형성능을 가지는 세포, 즉 그 자체가 완전한 개체로 발생할 수 있는 세포는, Cre 재조합효소를 코딩하는 일차 리포터 유전자를 포함한 콘스트럭트를 포함한다. 상기 Cre 재조합효소는 이차 리포터 유전자의 앞쪽에 있는 단편을 제거할 수 있고 이때 제거된 단편은 neo 를 코딩하고 loxP 표적 서열에 의해 둘러싸여 있다. 상기 이차 리포터 유전자는 lacZ 를 코딩하고, neo 가 제거되면 lacZ 는 pgk 의 바로 하류에 위치한다.
〈실시예 1〉 리포터 플라스미드의 제작
리포터 플라스미드 ppgklxtkneoIL-3 의 구성요소 중 대부분 (인산글리세르산 전이효소 프로모터, loxP 표적 서열, 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전이효소 융합 단백질 및 IL-3 유전자)은 다음과 같이 pBluescriptII-KS 에 삽입하였다.
상기 표적 서열 loxP 의 서열은 pGEM30 로부터 유래하였다. 우선, loxP 자리가 EcoRI/PstI 단편의 형태로 Bluescript의 폴리링커에 삽입되었다. 다음에는 pgk (phosphoglycerate kinase promoter; ppgkCAT으로부터 얻음)가 폴리링커의 XbaI/BamHI 재조합 자리로 삽입되었고, 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전이효소 융합 유전자가 하류에 위치한 EcoRV 재조합 자리에 삽입되었다. IL-3 유전자는 pc-Multi-CSF 로부터 유래한 마우스의 cDNA로서, 우선 pGEM30의 폴리링커중 loxP 표적 서열로 둘러싸인 EcoRI 자리로 서브클로닝된 후, 이 플라스미드를 ClaI/SalI으로 자르고 말단을 채워 둔단으로 만든 다음 다시 붙여서 부가된 EcoRI 자리를 제거한다. pGEM30를 SalI/XhoI 으로 잘라서 IL-3-loxP를 얻은 후 이를 Bluescript 폴리링커에 클로닝하였다. 소의 생장 호르몬 폴리-A 서열 (bpa)의 사본을 포함하는 XbaI/AvaI 단편을 tkneo의 하류에 있는 ClaI 자리에 둔단 접합하여 클로닝한다. ppgklxtkneoIL-3를 얻기 위해, 조합된 서열들을 포함한 XhoI 단편을 pSBC2의 SV-40 폴리-A 자리 상류에 삽입하였다. 이렇게 제조된 첫 콘스트럭트는 두 개의 시스트론을 가지는 (dicistronic) tkneo-IL-3 전사체로부터 여전히 IL-3을 번역할 수 있으므로, 둔단을 가지는 bpa의 두 번째 사본이 pSBCII의 SalI 자리로 삽입되어 최종적으로 ppgklxtkneoIL-3 리포터 플라스미드를 얻을 수 있었다.
〈실시예 2〉 loxP 재조합 표적으로 둘러싸인 두가지 선별 리포터 유전자를 발현하는 FDCP1 리포터 세포 계열의 제작
본 실시예에서 사용된 FDCP1 조혈 전구세포는 그 성장에 있어서 IL-3 에 대한 의존성이 높고, IL-3 가 배양액에 없으면 세포 예정사 (programmed cell death) 과정을 개시한다.
FDCP1 세포를 10% (v/v) 태송아지혈청 (foetal calf serum, High Clone Laboratories, Utah, USA)와 10 ng/ml 재조합된 마우스 IL-3 (Sandoz 제품)를 포함하는 DMEM (Dulbeccos modified Eagle's medium, Gibco)에서 2×105cell/ml의 농도로 배양하였다. 고체 배양의 경우, 40% (v/v) 태송아지혈청 (Hyclone 제품)을 포함하며 표준농도보다 두배 높은 DMEM 배지와 0.6 % (w/v) 박토아가 (Difco 제품)를 이차증류수에 녹인 것을 동일 부피로 섞어 배지를 제조하였다. 일부 배양의 경우 5 μM 간시클로버 (ganciclovir, Syndex 제품)를 포함시켰다.
Cre 재조합효소 유전자로 형질전환시켜 성장인자에 독립적으로 성장하는 세포 계열을 얻기 위해, 전기천공법을 사용하여 FDCP1 세포를 리포터 플라스미드 ppgklxtkneoIL-3로 형질전환시켰다. 전기천공법은 바이오래드 진 펄서 (Biorad 제품)을 사용하였고, 제조업자가 제시한 방법에 따라 실시하였다. 재조합체는 0.6 mg/ml G418을 포함하는 한천 배지에서 선별하여 분리하였다. 10일 후, 발생한 클론을 분리하고 앞에서 서술한대로 현탁 배양하여 클론을 증폭하였다. ppgklxtkneoIL-3 (도 3 참조)는 두 개의 선별 리포터 유전자로 구성되는데, 이들 유전자는 나란히 배열되어 있고 pgk (인산글리세르산 키나아제) 프로모터로부터 전사된다. 5' 말단의 유전자는 HSV2 티미딘 키나아제 (Tk) 네오마이신 인산전이효소 (neo) 융합 단백질을 코딩하며 두 개의 loxP 재조합 표적에 의해 둘러싸여 있다. 유전자의 3' 말단 부위는 마우스 IL-3를 코딩하는 유전자이며 SV40 폴리-A 서열에서 종결된다. 두 시스트론으로 구성되는 (dicistronic) 전사체가 IL-3로 번역되는 것을 억제하기 위해, 연속적으로 배열된 두 개의 소 성장호르몬 (bovine growth hormone) 폴리-A 서열이 tkneo의 하류에 삽입되었다. 이와 같이 하여 ppgklxtkneoIL-3를 발현하는 세포라도 여전히 IL-3에 의존적이 된다고 할 수 있다. 전형적으로 Cre 재조합효소는 반복된 (direct repetition) lox-P 서열 사이에 존재하는 서열을 절단할 수 있으므로, Cre 발현이 tkneo 유전자를 결실시킴에 따라 IL-3 유전자가 pgk 프로모터의 하류에 자리잡게 되었다고 할 수 있다. 그 결과 상기 세포는 네오마이신 저항성을 잃는 대신 IL-3를 합성하여 IL-3에 대한 비의존성을 얻게 되었다.
안정적인 FDCP-1 형질전환체를 G418 존재 하에서 선별하였고 다섯 개의 세포 계열이 한천 배지에서 분리되었다. 한 개의 플라스미드 사본를 발현하는 세포 계열을 선별, 동정하여 FLOXIL-3로 명명하고 이후의 분석에 사용하였다.
상기 FLOXIL-3 세포가 IL-3 존재 여부에 따라 성장에 영향을 받는지 알아보기 위해, 5×107개의 상기 세포를 IL-3 가 포함되지 않은 반쯤 고형화한 한천배지 (half-set agar culture)에 2×105cells/ml의 농도로 깔아주었다. 10일까지 배양한 결과 콜로니는 전혀 관찰되지 않았으므로, 상기 세포에서 IL-3 번역 또는 자연적 재조합 (spontaneous recombination)이 일어나지 않았음을 확인할 수 있었다.
이를 보다 확증하기 위해, FLOXIL-3 및 그 모세포인 FDCP-1 세포를 24시간동안 IL-3 가 포함되지 않은 한천 배지에서 전배양하고 이후 IL-3를 처리하였다. 두 세포종은 동력학적으로 유사하게 세포 예정사 과정을 개시하였으며, 이는 ppgklxtkneoIL-3 발현이 상기 성장인자의 투여 중단에 대한 세포 반응을 변화시키지 않는다는 사실을 나타낸다. 더욱이 대부분의 세포는 IL-3 없이 12시간 이상 생존하였으므로, 유전자 트랩에 의해 형질도입될 서열이 발현되기 위한 시간을 충분히 확보할 수 있다.
〈실시예 3〉 Cre 재조합효소 (U3-Cre)를 발현하고 FLOXIL-3 세포를 인자 독립적으로 변화시킬 수 있는 유전자 트랩의 제작
U3-Cre 유전자 트랩 벡터는 MoMuLV에 기초하는 pGgU3Neo(en-) 벡터로부터 유래한 것으로, U3 부위의 neo 유전자가 pMCCre에서 유래한 Cre 유전자로 대치되어 제조되었다. 상기 플라스미드는 헬퍼 세포 속으로 트랜스펙션시켰고 재조합 바이러스를 고효율로 생산하는 남은 세포 계열을 FLOXIL-3 세포의 감염에 사용하였다. 앞에서 이미 밝혔듯이, 바이러스 복제 및 U3로 삽입되는 서열의 LTR 매개성 복제는 30 뉴클레오타이드를 이웃하는 세포 DNA의 하류에 정확히 위치시킨다. 이러한 특성 때문에 전사 활성을 갖는 유전자로 삽입되면 상기 서열이 발현될 수 있다. 이로부터 예측할수 있는 점은, 전사 활성을 갖는 유전자로 U3-Cre가 삽입된 FLOXIL-3 세포는 성장인자에 비의존적인 세포로 형질전환된다는 것이다. 이러한 세포를 선별하기 위해서, 바이러스로 감염된 FLOXIL-3 세포를 IL-3 가 없는 한천 배지에 도말하였다. 독립적으로 생장하는 콜로니를 다수 얻고 이를 현탁 배양하여 증폭하였다. 재조합 리포터 유전자 플라스미드를 발현하는 세포로부터 예상할 수 있는 것처럼, 모든 클론은 G418에 대한 저항성을 상실하였고 IL-3 없이 생장할 수 있었다.
재조합 여부를 확증하기 위해서, 다섯 개의 자가 클론 (autonomous clone)으로부터 게놈 DNA를 분리하고 이를 BamHI으로 절단하여 서던 블럿을 수행하였다. BamHI 효소는 pgk와 IL-3의 5' 말단 내부를 분할하므로, pgk 에 특이적인 프로브와 neo 에 특이적인 프로브에 모두 혼성화 (hybridize)할 수 있는 3.2 kb 내부 절편은 재조합 FLOXIL-3 세포에 의해 복제되지 않는다 (도 3 참조). 상기 절편은 tkneo 서열을 포함하며 loxP에 의해 둘러싸인 서열을 모두 포함하므로, 결실이 일어나면 2.6 kb 만큼 그 크기가 감소할 것이다. 실제로 모든 클론이 neo 와는 혼성화하지 않는 0.6 kb 제한 절편을 나타내었으므로, 이들 클론에서 재조합 현상이 일어났음을 확인할 수 있었다.
뿐만 아니라, 노던 블럿 분석을 통해 모든 클론은 프로바이러스의 전사체를 발현하였으므로, Cre 재조합효소가 활성을 가진 세포 프로모터에 의해 조절되어 발현되었음이 입증되었다.
이와 같이 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 FLOXIL-3 세포를 얻을 수 있었으며, 이를 사용하여 세포 예정사를 일으키는 유전자 등을 분리하고 동정할 수 있었다.
〈실시예 4〉 U3-Cre/FLOXIL-3 삽입 뱅크의 제조와 일시적으로 발현되는 유전자 서열의 분리
2×106개의 개별 프로바이러스 삽입체로 구성되는 삽입 뱅크 (integration bank)의 제조를 위해, FLOXIL-3 세포를 U3-Cre 레트로바이러스로 감염시켰다. 상기 감염된 세포를 G418 존재 하에서 선별하여 발현 중인 유전자로 완전 삽입되는 것을 막았다. 도 4는 16일 간의 선별을 통해 이러한 목적이 성취되었음을 보여준다. IL-3 가 없는 아가 배지에 삽입 뱅크의 시료를 도말한 다음, 총 110 개의 자가 클론을 분리하고 증폭하였다. 서던 블럿 분석을 통해, 모든 클론에서 프로바이러스 삽입이 일어났으며 예외없이 재조합 리포터 플라스미드를 포함하고 있다는 것을 확인할 수 있었다 (도 4 참조).
11개의 독립적인 자가 클론의 mRNA로 노던 블럿 분석한 결과, 9개 클론에서 세포-프로바이러스 융합 전사체가 매우 약하게 발현되거나 전혀 발현되지 않았다 (도 5에서 1, 3, 7, 9, 11, 13, 17, 19, 21번 레인). 이러한 사실은 Cre 재조합효소는 리포터 플라스미드의 재조합을 일으키기에 충분할 정도로 일시적으로만 발현된다는 것을 의미한다. 또한 상기 융합 전사체 중 50% 이상이 혈청 투여 중단에 의해 발현 유도되었는데, 이러한 사실은 상기 유전자 트랩에 걸린 유전자가 세포 생장 중 아폽토시스 (apoptosis) 프로그램과 관련되어 있다는 점을 암시한다.
마지막으로 5' 프로바이러스 주변 서열은 공지의 방법 (von Melchner 등, 1992)을 이용하여 클로닝하였으며, 이를 야생형 FDCP-1 세포에서 분리한 mRNA와 노던 블럿 상에서 혼성화시켰다. 그 결과, 대다수의 프로브는 IL-3에 의해 유도된 세포 전사체와 혼성화하였다 (도 6 참조). 이러한 유전자가 아폽토시스를 직접 조절하는지 아니면 세포 예정사 과정의 결과로서 활성화되는 다른 기전의 일부인지는 아직 결정되지 않았다. 어떤 경우든지, IL-3 투여 중단에 의해 유도되는 세포 전사체를 규명함으로써, 세포 예정사에 관한 복잡한 분자적 변화를 보다 깊이 이해할 수 있다.
상기 밝혀진 유전자를 동정하고 분리하는 보다 상세한 방법은 통상 방법에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 이를테면, 3' RACE 또는 유전자 라이브러리의 복구 및 밝히고자 하는 유전자의 클로닝과 염기서열 분석 등을 들 수 있다.
〈실시예 5〉 ES 리포터 세포 계열의 제작
Cre 재조합효소를 써서 영구적으로 선별 리포터를 교환하는데 있어서 적당하게 사용할 수 있는 ES 세포 계열을 얻기 위해, 전기천공법을 사용하여 D3 세포를 리포터 콘스트럭트 ppgklxneolacZ 로 형질전환시켰다. 상기 ppgklxneolacZ 속에는 두 개의 리포터 유전자가 나란히 배열되어 있고 마우스의 인산글리세르산 키나아제 프로모터에 의해 그 전사가 조절된다. 상기 리포터 콘스트럭트 ppgklxneolacZ 의 구성 요소로는 인산글리세르산 키나아제 프로모터, loxP 표적 서열, 네오마이신 인산전이효소 유전자 및 lacZ 유전자가 있으며, 상기 콘스트럭트의 제작 과정은 이미 기술된 리포터 플라스미드 ppgklxtkneoIL-3 의 제작 방법을 따른다.
5' 유전자는 네오마이신 인산전이효소를 코딩하며 동일한 방향으로 배열된 두 개의 loxP 재조합 표적에 의해 둘러싸여 있다. 3' 유전자는 베타-갈락토시다제를 코딩하며 SV40 폴리-A 서열로 끝난다. SV40-폴리-A 에서 게놈 전사체 말단제조를 억제하여 lacZ 번역을 억제하기 위해, 두 개의 연속배열된 소성장호르몬 폴리-A 서열 (bpa)이 네오마이신 인산전이효소의 하류에 삽입되었다. 그러므로, ppgklxneolacZ 를 발현하는 세포는 네오마이신 인산전이효소에 대해 저항성을 가져야 하며, lacZ에 대해서는 음성 반응을 보여야 한다. 그러나 Cre 가 발현되는 경우에는, neo 유전자는 재조합효소에 의해 잘려나가고, lacZ를 코딩하는 서열이 pgk 프로모터의 바로 하류에 위치하게 된다. 그 결과, 재조합된 리포터 플라스미드를 가지는 세포는 네오마이신 저항성을 잃고 X-Gal로 염색시 양성 반응 (lacZ+)을 나타낸다.
ppgklxneolacZ를 발현하는 다양한 ES 세포 계열을 G418 존재 하에 선별하여 각각 X-Gal 염색시켰다. 오랜 기간동안 배양하더라도 열 개의 세포 계열 중 네 개는 X-Gal로 염색되지 않았다. 이들 세포 계열을 LIF (Leukaemia Inhibiting Factor) 또는 영양층 (nutrient layers)을 포함하지 않는 배양 조건에서 분화시켜도 lacZ 세포는 여전히 음성 염색 반응을 보였으며, 이는 상기 세포의 lacZ 표현형이 안정하다는 사실을 나타낸다. 한 사본의 ppgklxneolacZ를 가지고 있는 세포 계열을 선발하여 이후의 분석에 사용하였는데, 이하에서는 이 세포 계열을 pln13으로 칭한다.
pln13에서 Cre 재조합효소가 lacZ 양성 반응을 일으킬 수 있는지 확인하기 위해, pln13을 Cre 발현 플라스미드인 pMC-Cre로 형질전환시켰다. 10일 후 선별되지 않은 콜로니를 선택하여 분주한 것을 X-Gal로 염색해 보았다. 다양한 lacZ 양성 세포로부터 게놈 DNA를 분리하여 BamHI 효소로 잘라 서던 블럿을 수행하였다. 모든 경우에 lacZ 표현형은 2 kb 결실과 연관되어 있었다. 이러한 사실은 리포터 플라스미드에 위치 특이적 재조합이 일어났음을 보여 준다.
〈실시예 6〉 pln13 세포에서 U3-Cre 삽입을 통한 베타-갈락토시다제의 발현
5×104개의 pln13 세포를 MOI (Multiplicity Of Infection) 값을 1로 하여 상기와 같이 제작된 U3-Cre 바이러스로 감염시켰다. 72시간동안 배양한 후, 세포를 480 개 군으로 나누어서 마이크로타이터 플레이트에 분주하였다. 48시간 후, 분주한 세포를 X-Gal 로 염색하여 활성화된 세포에 삽입이 일어났는지 조사하였다. lacZ 양성 세포를 포함하는 20 군 중 3 군을 적당한 밀도로 분주하여 4 개의 양성 클론을 선별 분리하였다. 분리된 클론을 서던 블럿 분석한 결과, 모두 1~2 개의 프로바이러스를 포함한 것으로 밝혀져 MOI 값이 1이라는 점과 일치하며, 또한 각 클론이 재조합 리포터 플라스미드를 포함한다는 사실도 확증되었다. 또한 각 클론은 세포-프로바이러스 융합 전사체를 발현하였으며, 그 전사체의 크기는 100~500 뉴클레오타이드 정도로서 예상되는 크기와 일치하였다.
이와 같이, U3-Cre 유전자 트랩 레트로바이러스는 발현 활성을 가진 유전자로 삽입될 수 있으므로 위치 특이적 재조합을 효율적으로 매개한다.
〈실시예 7〉 U3-Cre-프로바이러스 삽입 유도가 가능한 클론의 분리
분화로 인해 유도되는 유전자를 분리하기에 U3-Cre/loxP 전략이 적당한지를 확인하기 위해, 1.5×105개의 pln13 세포를 10 개의 마이크로타이터 플레이트에 컵 당 150 세포의 농도로 분주한 후 MOI 값이 약 1이 되도록 U3-Cre 바이러스로 감염시켰다. 전사 활성을 가지는 유전자로 삽입되는 것을 피하기 위해, 세포를 G418 존재 하에서 5일 간 선별하였다. 그 다음에 LIF (Leukemia Inhibiting Factor) 또는 MEF (Mouse Embryo Fibroblasts)가 없는 조건에서 각 컵의 세포를 분화 유도시키고 X-Gal로 염색하였다. 960 컵 중 44 컵에서 양성 반응이 나왔다. 계속 검사한 결과 9개 군이 LIF 및 MEF 존재에 관계없이 양성 반응을 나타낸 반면, 35개 군은 분화 후에만 lacZ 양성 반응으로 변화하여 U3-Cre 삽입이 발현 유도된 유전자에서 일어났음을 확증하였다.
도 7은 분리된 세 개의 클론에서 U3-Cre-프로바이러스가 분화 특이적 유전자로 삽입된 예를 보여 준다. 상기 유전자의 발현 유도 가능성은, LacZ 음성 (도 7a의 좌측 상단 미분화 세포 참조)에서 LacZ 양성 (도 7a의 우측 상단 분화된 세포 참조)으로 표현형 변화가 일어났음을 통해 확인하였다. 서던 블럿 결과, 이러한 변화가 일어난 원인은, U3-Cre-프로바이러스가 유도가능한 분화 유전자로 삽입되어 일어나는 리포터 플라스미드의 위치 특이적 재조합 때문이라는 것이 밝혀졌다 (도 7b 참조).
도 2는 이러한 방식의 분리 과정을 나타낸 개요도이다. 첫 번째 단계에서는 U3-Cre 유전자 트랩 벡터로 감염시키고 G418 로 선별한다. 이렇게 얻은 콜로니를 분주하여 분화를 유도하고 X-Gal로 염색한다. 염색된 클론만을 선발하여 증폭하고 키메라 마우스를 제작하는데 사용한다. 한편, 이들 마우스는 조직에서 LacZ 분포를 결정하는데 사용되거나 F2 마우스의 표현형을 결정하고 열성 동형접합자 (-/-) ES 세포를 분리하는데 사용할 수 있다.
관련된 세포 유전자는 통상적인 방법에 의해 유전자 트랩 서열로부터 클로닝될 수 있다.
이와 같은 방법으로, 본 발명의 유전자 트랩 콘스트럭트는 유전자, 특히 일시적으로 발현되는 유전자를 분리 및/또는 동정할 수 있게 한다.

Claims (28)

  1. 자신이 활성화되면 이차 리포터 유전자를 활성화시킬 수 있는 일차 리포터 유전자를 포함하는 유전자 트랩 콘스트럭트 (gene-trapping construct).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 일차 리포터 유전자는 재조합효소 (recombinase)를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 재조합효소는 Cre 인 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 재조합효소는 Flp 인 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이차 리포터 유전자는 단백질 인자를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 이차 리포터 유전자는 IL-3를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  7. 제 5항에 있어서, 상기 이차 리포터 유전자는 LacZ를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  8. 제 2항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 재조합효소가 이차 리포터 유전자의 앞에 위치한 DNA 단편을 결실시켜 이차 리포터 유전자를 적당한 프로모터의 조절을 받도록 프로모터 하류에 위치시킴으로써 이차 리포터 유전자의 활성화를 일으키는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 결실되는 단편은 항생제 저항성 유전자인 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 결실되는 DNA 단편은 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전이효소 융합 단백질를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 결실되는 DNA 단편은 네오마이신 인산전이효소를 코딩하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  12. 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 인산글리세르산 키나아제 (pgk) 프로모터인 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  13. 제 8항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결실된 DNA 단편은 재조합효소의 표적 서열에 의해 둘러싸이는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  14. 제 13항에 있어서, 상기 표적 서열은 loxP 인 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  15. 제 13항에 있어서, 상기 표적 서열은 frt 인 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 U3 및/또는 U5 부위에 위치하는 것을 특징으로 하는 유전자 트랩 콘스트럭트.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 유전자 트랩 콘스트럭트를 유전자, 특히 일시적 유전자 (transient genes)의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도.
  18. 제 17항에 있어서, 세포 예정사 (programmed cell death), DNA 복구 (DNA repair), 분화 (differentiation) 및/또는 세포 주기 (cell cycle)를 조절하는 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도.
  19. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 세포, 바람직하게는 포유류 세포.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 포유류 세포는 IL-3 에 의존적이고; 일차 리포터 유전자는 Cre 재조합효소를 코딩하고; Cre 재조합효소는 이차 리포터 유전자 앞에 위치한 DNA 단편을 결실시킬 수 있고; 결실된 단편은 티미딘 키나아제-네오마이신 전이효소 융합 단백질 (TKNeoPT)을 코딩하며 loxP 표적 서열로 둘러싸여 있고; 이차 리포터 유전자는 IL-3를 코딩하며 상기 TKNeoPT 유전자가 결실되면 인산글리세르산 키나아제 프로모터의 하류에 위치하게 되는 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  21. 제 20항에 있어서, 상기 포유류 세포는 조혈성 FDCP-1 세포 (haemopoietic FDCP-1 cell) 또는 전형성능을 가지는 ES 세포 (totipotent embryonic stem cell)인 것을 특징으로 하는 포유류 세포.
  22. 제 19항의 포유류 세포를 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도.
  23. 제 19항 내지 제 21항 중 어느 한 항의 포유류 세포를 세포 예정사, DNA 복구, 분화 및/또는 세포 주기를 조절하는 유전자의 동정 및/또는 분리에 사용하는 용도.
  24. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 유전자 트랩 콘스트럭트를 포함하는 벡터.
  25. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 최소한 하나 이상의 유전자 트랩 콘스트럭트 및/또는 제 24항의 벡터를 포함하는, 유전자, 특히 일시적 유전자의 동정 및/또는 분리용 키트.
  26. (단계 1) 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항의 유전자 트랩 콘스트럭트를 적당한 세포로 도입하는 단계;
    (단계 2) 일차 리포터 유전자가 유전자, 바람직하게는 비활성 유전자로 삽입된 세포를 선별하는 단계;
    (단계 3) 바람직하게는 유전자의 전사를 개시하여 일차 리포터 유전자가 활성화되고, 그 결과 이차 리포터 유전자가 활성화되는 단계; 및
    (단계 4) 상기 일차 리포터 유전자가 삽입된 유전자를 동정 및/또는 분리하는 단계로 구성되는
    유전자, 특히 일시적 유전자를 동정 및/또는 분리하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서, 제 8항의 유전자 트랩 콘스트럭트는 일차 리포터 유전자로서 Cre 재조합효소를 포함하고, 상기 Cre 재조합효소는 이차 리포터 유전자의 하류에 위치하는 티미딘 키나아제-네오마이신 인산전이효소 유전자를 결실시키고, 그 결과 IL-3를 코딩하는 이차 리포터 유전자가 인산글리세르산 키나아제 프로모터의 조절을 받게 되며; 상기 유전자 트랩 콘스트럭트가 IL-3 에 의존적인 FDCP-1 세포로 삽입되며; 네오마이신 배지에서 배양하여 Cre 재조합효소를 합성하지 않는 세포를 선별하며; 상기 선별된 세포를 IL-3가 포함되지 않은 세포 배양액에서 배양하여 세포 예정사를 일으키는 유전자를 활성화시키며; 생존하는 세포를 선발하며; 상기 세포 예정사를 일으키는 유전자를 통상의 방법에 의해 분리하는 것을 특징으로 하는 유전자, 특히 일시적 유전자를 동정 및/또는 분리하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서, 제 8항의 유전자 트랩 콘스트럭트가 Cre 재조합효소 유전자를 일차 리포터 유전자로서 포함하고, 상기 Cre 재조합효소는 이차 리포터 유전자의 하류에 존재하는 네오마이신 인산전이효소 유전자를 결실시키고, 상기 이차 리포터 유전자는 lacZ를 코딩하는 동시에 인산글리세르산 키나아제 프로모터의 조절을 받으며; 상기 유전자 트랩 콘스트럭트는 전형성능 ES 세포로 삽입되며; G418이 포함된 배양액에서 배양하여 Cre 재조합효소를 생산하지 않는 세포를 선별하며; 상기 선별된 세포를 분화 유도시켜 분화 특이적 유전자를 활성화시키며; 상기 세포를 분리하며; 상기 세포를 포유류 동물의 생식 계열 (germ line)로 도입하고 그곳에서 조직의 형성을 일으키며; 상기 분화 특이적 유전자를 통상의 방법에 의해 분리하는 것을 특징으로 하는 유전자, 특히 일시적 유전자를 동정 및/또는 분리하는 방법.
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