JP2000509287A

JP2000509287A - 遺伝子を同定および単離するための遺伝子トラップ構築体

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Publication number: JP2000509287A
Application number: JP10525217A
Authority: JP
Inventors: メルクナーハラルドフォン
Original assignee: メルクナーハラルドフォン; ホルツァディーター
Priority date: 1996-12-06
Filing date: 1997-12-05
Publication date: 2000-07-25
Anticipated expiration: 2017-12-05
Also published as: ES2244013T3; DE59712319D1; PT942999E; CA2274092C; DE19650714A1; EP0942999B1; WO1998024918A1; CA2274092A1; AU5659898A; US6303327B1; AU730845B2; ATE295888T1; JP3325583B2; DK0942999T3; EP0942999A1; KR20000057435A

Abstract

(57)【要約】本発明は、活性化後に第２のレポーター遺伝子を活性化しうる第１のレポーター遺伝子を含む遺伝子トラップ構築体およびこの遺伝子トラップ構築体を遺伝子、特に一時的に発現した遺伝子の同定および／または単離に使用することに関する。本発明は、さらに細胞、好ましくは上記遺伝子トラップ構築体を含む哺乳類細胞に関する。さらに本発明は、この哺乳類細胞を、遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離に使用することに関する。さらには本願発明は、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離するための上記遺伝子トラップ構築体を含むベクター、同様に少なくとも上記遺伝子トラップ構築体またはベクターを含むキットに関する。最後に本願発明は、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝子を同定および単離するための遺伝子トラップ構築体本願発明は、活性化後に第２のレポーター遺伝子（reporter gene）を活性化しうる第１のレポーター遺伝子を含む遺伝子トラップ構築体（gene-trapping co nstruct）、およびこの遺伝子トラップ構築体を遺伝子、特に一時的に発現された（一過性）遺伝子の同定および／または単離に使用することに関する。さらに本願発明は、細胞、好ましくは上記遺伝子トラップ構築体を含む哺乳類細胞に関する。これとともに、本願発明はこの哺乳類細胞を、遺伝子、特に一過性遺伝子（transient genes）の同定および／または単離に使用することに関する。さらには本願発明は、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離するための上記遺伝子トラップ構築体を含むベクター、同様に少なくとも上記遺伝子トラップ構築体またはベクターを含むキットに関する。最後に本願発明は、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離する方法に関する。ここ数年、遺伝子の単離および同定は、遺伝子技術の重要な課題の１つである。このため、永続的に発現された遺伝子の単離および同定を、効果的に行いうる多くの方法が提案されている。ほんの一時的に発現される遺伝子、たとえばプログラムされた細胞死に関与する（責任もつ）遺伝子、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ修正遺伝子および分化特異的遺伝子などを単離および／または同定することは極めて困難である。哺乳類中のこのような遺伝子を同定するには、キイロショウジョウバエを用いた遺伝子分析法は不適であり、“遺伝子トラップ”または“プロモータートラップ”と称されるような、特定のベクターを介して、プロモーターのないレポーター遺伝子と、細胞性遺伝子の調節因子との遺伝子融合を誘発させることに基づいた方法が開発されている。哺乳類に突然変異生成を書込むためのさまざまな種類のベクターが開発されており、これによればレポーター遺伝子は、転写活性領域中も含め、そのときに応じた多くの場所で染色体中に挿入される。遺伝子発現のための選択の間、レポーター遺伝子は内在遺伝子の調節因子と融合し、クローンは保持される。この方法では、ベクターは遺伝子トラップとして働き、遺伝子機能の解析のための極めて有用な手段となる（Hill & Wurst,1993中のレビュー;Hi ll & Wurst,1993;von Melchner、1993;von Melchner & Ruley、1995）。遺伝子トラップベクターは、電気穿孔されたＤＮＡも用いられるが、多くの場合、組換え体レトロウィルスとして形質導入される。レトロウィルスは、それを全ゲノムの始めから終わりまでのいくつかの領域中に組込んでも、隣位のＤＮＡをほとんど損傷させることがないという利点がある（Varmus，1988;Coffinら.,1989;Goff ，1990;Sandmeyerら.,1990;Withers／Wardら.,1994）。遺伝子トラップが、マウスにおける遺伝子機能の実有用な解析手段であることは実証されているといえる。分化全能性マウスＥＳ（胚幹）細胞が細胞性標的（ターゲット）として使用されると、突然変異によって遺伝子機能が不活性化されたことを表現するマウス細胞系（株）（stains）が構築される。相同的組換えによる遺伝子分断を用いるのとは異なり、この遺伝子トラップ法は、遺伝子に限定されず、クローン化された配列を維持させることができ、これにより未知の遺伝子を単離し、同定するための方法となる。とは言えやはり、細胞中で最初に誘発されるであろう遺伝子、すなわち、継続的に転写されない遺伝子、たとえばプログラムされた細胞死に応答する遺伝子、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ修正遺伝子および分化特異的遺伝子などの一過性遺伝子を同定および単離するためには、遺伝子トラップ中に捕獲された一過性細胞性プロモーターを、たとえばプロモーター活性に依存しない永続性シグナルを介して、確実に同定するための付加的な方法が必要である。遺伝子トラップベクターにより感染／電気穿孔されたＥＳ細胞系統中で遺伝子がほぼ５０％スイッチオフされたマウスは、劣性表現型を発現する（FriedrichおよびSoriano,1991;Skarnes ら,1992;von Melchnerら,1992）。この頻度は、レトロウィルスが偶然挿入されるかまたはＤＮＡマイクロインジェクション後に観察されるものよりも１０倍以上高い（Gridleyら、1987;jaenischら、1985）。遺伝子不活性化のこの高い効率は、遺伝子発現の大部分（２−４×１０⁴）において組込まれた特性が発現する細胞系統を単離するのに充分な感度であると思われる。しかしながら、すべての突然変異を原系統中に伝達することはあまり現実的とはいえず、さらには遺伝子に多くの突然変異を導入することは、あまり重要とはいえない。このため、突然変異されたＥＳ細胞クローンを生物学的に重要なプロセスまたは遺伝子にあてはまる突然変異に代えることが望まれている。これに関していえば、興味あるin vitroでの突然変異からＥＳ細胞クローンを予備的に選択することを含み、このためにたとえば分化特異的遺伝子における突然変異を同定するためのレポーター遺伝子を用いる方法は特に好ましい。培養されたＥＳ細胞は、in vivoでは発現されない遺伝子を発現することができるはずであり、胚中と同様にＥＳ細胞中にも、融合遺伝子が発現されたことが１２例見つかっている（De Gregoryら、1994；Reddyら，1992）。さらに、in vitroでの分化における融合遺伝子の発現中の変化は、in vivoでの発生における発現中の変化に極めて近いものを予測させることを示す例もある（Reddyら，1992）。in vitroで調節される遺伝子は、in vivoでも厳密に調節されることは、早くからの観察により一般的に認められている（Muthuchamyら、1993，Rappoteeら、1988； Rogersら、1991；Scholerら、1990；Sharpeら、1990）。したがって本願発明は、遺伝子、特に一過性遺伝子を、とりわけ好都合な手順によって単離および同定することができるような遺伝子トラップ構築体を提供することを目的としている。本願発明のさらなる目的は、この遺伝子トラップ構築体を保持するベクター、同様に細胞とともに、遺伝子の同定および／または単離のためのキットを提供することである。最後に、本願発明の目的は、遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための方法を提供することである。これらの目的は、独立クレーム１、１７および２２、細胞についてのクレーム１９、ベクター、２４、キット、２５および方法クレーム２６の条件によって達成される。本願発明の好ましい実施態様は、下位クレームに示される。ここで“レポーター遺伝子“は、転写に基づいてたとえばタンパク質産物などの認識しうるシグナルを生じさせる核酸配列を意味する。“第１の”レポーター遺伝子は、それが組込まれた隣接位の細胞転写シグナルを介して調節される。一旦、第１のレポーター遺伝子が活性化されると、第１のレポーター遺伝子産物は “第２の”レポーター遺伝子の活性化を引き起こし、この第２の活性は永続的、すなわち、第１レポーター遺伝子をコントロールするＤＮＡ領域の転写活性に影響されない。第２のレポーター遺伝子は、証拠となる遺伝子産物、たとえば酵素、色反応で確認しうるものまたは成長因子などをコードするものであり、そのために選択される。第１および第２レポーター遺伝子の組み合わせにより、一時的に発現されたプロモーターであっても、第２のレポーター遺伝子の産物である永続的シグナルの手段によって顕在化することができる。第１および第２レポーター遺伝子は、通常の構築体中に存在してもよいし、あるいは細胞中のさまざまな場所に存在するさまざまな手段により有効となってもよい。本発明に係る遺伝子トラップ構築体は、この点では結果的に、原理上は公知の遺伝子トラップ構築体の組合わせであり、たとえば第１のレポーター遺伝子構築体に相当するＵＳ５３６４７８３中に記載されたものと、本発明の第２のレポーター遺伝子構築体物にあたるプロモーター活性に関係なく永続的産物を生じうるさらなるデバイスとの組合わせなどである。本願発明のクレーム１によれば、活性化後に第２のレポーター遺伝子を活性化しうる第１のレポーター遺伝子を含む遺伝子トラップ構築体が提供される。第１のレポーター遺伝子は、組換え酵素をコードすることが好ましく、この組換え酵素は特に好ましくはＣｒｅまたはＦｌｐである。好ましい実施態様において、第２のレポーター遺伝子はタンパク質因子をコードすることができ、さらに好ましい実施態様では、第２のレポーター遺伝子はＩＬ−３、特に好ましいさらなる実施態様では、大腸菌β−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）をコードする。第２のレポーター遺伝子は、第２のレポーター遺伝子の隣接位に配置したＤＮＡ断片の組換え酵素による欠失によって、直ちに永続的にそのコントロールを受けるプロモーターの下流に配置されることにより活性化されることが好ましい。削除（欠失）されるＤＮＡ断片は、抗生耐性遺伝子であることが好ましく、その手段によって削除されたＤＮＡ断片は、特に好ましい実施態様では、チミジンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードし、さらなる好ましい実施態様では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードする。第２のレポーター遺伝子が配置される前のプロモーターは、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターであることが好ましい。好ましい実施態様において、欠失したＤＮＡ断片は、たとえばＩｏｘＰまたは frtである配列によって挟まれ（flank）てもよく、組換え酵素により標的とされる。またＵ３および／またはＵ５領域中に位置する標的配列である可能性もある。上記遺伝子トラップ構築体は、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離するために使用することができる。この際には、特に、プログラムされた細胞死に応答する遺伝子、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ修正遺伝子および分化特異的遺伝子の同定および／または単離が含まれる。さらに本願発明は、上記したような遺伝子トラップ構築体を含む細胞、好ましくは哺乳類細胞を提供する。好ましい実施態様において、哺乳類細胞はＩＬ−３に依存し、遺伝子トラップ構築体を含み、第１のレポーター遺伝子がＣｒｅ組換え酵素をコードし、それによってＣｒｅ組換え酵素は、第２のレポーター遺伝子の前に配置するＤＮＡ断片を削除することができ、削除された断片は、チミヂンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードするとともにＩｏｘＰ標的配列により挟まれ、第２のレポーター遺伝子はＩＬ−３をコードし、チミヂンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質遺伝子の欠失に続いてホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの直下流に位置する。哺乳類細胞は、増殖因子依存性の造血前駆細胞（たとえばＦＤＣＰ１）または分化全能性胚性幹細胞であることが特に好ましい。本願発明では、哺乳類細胞を、遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離に用いることができ、この手段によって特にプログラムされた細胞死に応答する遺伝子、細胞周期遺伝子、ＤＮＡ修正遺伝子および分化特異的遺伝子を同定および／または単離することが好ましい。さらに本願発明は、上記遺伝子トラップ構築体を含むベクターを提供する。さらに遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離するための少なくとも１つの上記したような遺伝子トラップ構築体を含むキットを提案する。キットは、第１のレポーター遺伝子を含む第１の構築体と、第２のレポーター遺伝子第２の構築体とによる２つの構築体を含むことが好ましい。キットは、上記のようなベクターを含んでいてもよい。最後に、本願発明は、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離するための方法を提供し、この方法は以下に示す工程を含む： −適切な細胞中、上記のような遺伝子トラップ構築体の挿入 −第１のレポーター遺伝子が、細胞中の遺伝子、好ましくは不活性遺伝子中に組込まれるような細胞の選択 −好ましくは不活性遺伝子の転写開始による第１のレポーター遺伝子の活性化、その結果として第２のレポーター遺伝子が活性化される −第１レポーター遺伝子が組込まれた遺伝子の同定および／または単離。好ましい実施態様において、上記方法は以下のような特徴を有する、すなわち −上記遺伝子トラップ構築体は、第１のレポーター遺伝子としてのＣｒｅ組換え酵素遺伝子を含み、そしてＣｒｅ組換え酵素は第２のレポーター遺伝子の上流に位置するチミヂンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を削除し、これを介してＩＬ−３をコードする第２のレポーター遺伝子．が、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターのコントロール下に入ることを含み、 −遺伝子トラップ構築体は、ＩＬ−３依存性ＦＤＣＰ−１細胞中に挿入され、 −ネオマイシン（たとえばＧ４１８）を含有する培地中で培養されて、Ｃｒｅ組換え酵素を生産しない細胞が選択され、 −これら選択された細胞がＩＬ−３を含まない培地で培養され、プログラムされた細胞死に関する遺伝子が活性化され、 −生存している細胞が選び出されるので、そして −プログラムされた細胞死に関する遺伝子が、一般的な手順により単離される。さらに好ましい実施態様において、上記方法は以下のような特徴を有する、すなわち −上記遺伝子トラップ構築体は、第１のレポーター遺伝子としてのＣｒｅ組換え酵素遺伝子を含み、すなわちＣｒｅ組換え酵素は第２のレポーター遺伝子の上流に配置されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を削除し、これを介してｌａｃＺをコードする第２のレポーター遺伝子が、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターのコントロール下に入ることを含み、 −遺伝子トラップ構築体が、分化全能性胚性幹細胞中に挿入され、 −Ｇ４１８での培養を経て、Ｃｒｅ組換え酵素を生産しない細胞が選択され、 −これら選択された細胞は分化が誘導され、分化特異的遺伝子が活性化され、− これら細胞が単離され、 −これら細胞は、哺乳類の生殖系列中に誘導され、そこで組織の形成に関与し、そして −分化特異的遺伝子が一般的な手順により単離される。プログラムされた細胞死に応答する遺伝子を単離する上記のような方法は、以下の理由のため特に適切である、Ｃｒｅ組換え酵素を発現する遺伝子トラップを用いれば選択マーカーの永続的置換ができ、それらは内在性サイトカイン産製の本質的に致死細胞を活性化することにより、増殖細胞に転換される。このことは、プログラムされた細胞死の間、活性である遺伝子を組込むことを選択することを可能にする。組換え酵素がホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの後に選択マーカーをもってくることにより、選択マーカーの発現たとえばＩＬ−３の発現は、局在遺伝子（遺伝子トラップ中）の発現とは切り離される。細胞をプログラムされた細胞死に関する遺伝子を発現するようにすることがほとんどできそうにないので、このことは本質的に重要である。最後に、本願発明に係る方法は、強く発現される遺伝子には限定されないし、また遺伝子の発現量は、たとえばｃＤＮＡクローニングの場合よりも極めて一様である。さらに遺伝子トラップを単離および／または同定に使用すれば、示差ＲＴ−ＰＣＲ増殖とは異なり、充分な再現性を有し、煩雑ではなく、定量さえも可能になる。結局、遺伝子トラッププロウィルスは、ほぼ５’エキソン内またはこの近くに規則正しく配置され、遺伝子に関して同様の同一転写配向を有し、このことが明らかにクローニングを容易にする。どの場合であっても、ＩＬ−３除去により誘発された細胞転写の特徴は、プログラムされた細胞死の間に起きる複合分子の変化に対する深い洞察を可能する。さらに好ましい実施態様において、分化全能性細胞は、それ自体、全ての生物中に発展することができ、第１のレポーター遺伝子が、第２のレポーター遺伝子の前に配置された断片を削除しうるＣｒｅ組換え酵素をコードし、これによって欠失断片がネオをコードし、かつＩｏｘP標的配列により挟まれ、ｌａｃＺをコードする第２のレポーター遺伝子が、ネオの欠失に次いでpgkの直下流に来るコードする構築体を有している。本発明を、添付された図面を参照して説明する：図１は、本発明における２つの好ましい実施形態を模式的に示すプロセスである。（Ａ）ＩＬ−３を除去した後のＦＬＯＸＩＬ−３中の内在性ＩＬ−３分泌の活性化メカニズム。本来はアポトーシスを発現しない遺伝子中に、Ｕ３−Ｃｒｅ遺伝子トラップが取込まれると、ＩＬ−３除去により一時的に活性化される（左）。レポータープラスミドppgklxtkneoIL-3の位置特定組換えを介して、tkneo遺伝子が除去され、ＩＬ−３遺伝子がpgkプロモーターの直下流に配置される。この結果、ＩＬ−３が、持続的に、遺伝子トラップ中に捕獲された遺伝子のスイッチングオフの後でも連続して合成される。（Ｂ）-pln13-分化全能性胚性幹細胞の分化中のlacZ遺伝子の活性化メカニズム。本来は分化を発現しない遺伝子中に、Ｕ３−Ｃｒｅ遺伝子トラップが取込まれると、遺伝子が分化中に一時的に活性化される。レポータープラスミドppgk1x tkneoLacZの位置特定組換えを介して、LacZ遺伝予が、pgkプロモーターの直下流に配置される。この結果、β−グリコシダーゼが、持続的に、遺伝子トラップ中に捕獲された遺伝子のスイッチングオフの後でも連続して合成される。図２は、胚性幹細胞から分化を誘発しうる遺伝子を単離および分析するためのプロセス全体を示す模式図である。図３は、発現された遺伝子中、Ｕ３−Ｃｒｅ遺伝子トラップ取込みとともにＦＬＯＸＩＬ−３細胞中のppgklxtkneoIL-3プラスミドのＣｒｅ／ＩｏｘＰが介在した組換えを示す。（Ａ）組換え前後のppgklxtkneoIL-3の構築（Ｂ）自律性・母細胞性ＦＬＯＸＩＬ−３細胞のサザーンブロット分析。ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで切断し、アガロースゲル中で分別し、ナイロンメンブラン上に移した。次いで、³²Ｐラベルされたネオ−（左）またはｐｇｋ−特異的プローブと、ハイブリダイズした。レーン１：母細胞性ＦＬＯＸＩＬ−３細胞；レーン２−６：自律性クローン１−５。分子量は１−ｋｂＢＲＬスケールを用いて示す。図４は、ＩＬ−３除去後に単離された自律性クローン中のＵ３−Ｃｒｅ遺伝子トラップ取込みおよび位置特異性組換えを示す。（上）Ｕ３−Ｃｒｅプロウィルスの予想される構築体（左）および組換えられたレポータープラスミド（右）。（下）Ｕ3-Ｃｒｅ／Floxil-3取込み配列群（bank）からＩＬ−３を除去した後に単離したクローンのサザーンブロット分析。個々のクローンのゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで切断し、図３の方法で処理した。次いで、³²ＰラベルしたＣｒｅ− （左）またはpgk-（右）特定プローブと、ハイブリダイズした。レーン１，26-1 1-1：レーン２，26-11-3：レーン３，26-11-4：レーン４，26-11-5：レーン５， 26-11-6：レーン６，26-11-7：レーン７，26-11-8：レーン８，26-12-1：レーン９，26-12-2：レーン１０，26-12-3：レーン１１，26-12-4 ：レーン１２，26-12-5。図示したプローブは、完全に取込んだときの群の代表例を示す。図５は、細胞−プロウィルス融合転写の研究を示す。（上）発現した遺伝子中の取込まれたＵ３−Ｃｒｅ遺伝子トラップから予想される転写。（下）血清除去前および後の細胞−プロウィルス融合転写のノーザンブロット分析。ポリアデニル酸ＲＮＡ（５マイクログラム）を、ホルムアルデヒド−アガロースゲル中に分注し、ナイロンメンブラン上に移した。次いで、³²ＰラベルしたＣｒｅ−またはＧＡＰＤＨ特定プローブと、ハイブリダイズした。奇数はＲＮＡ、偶数は血清除去１６時間後のＲＮＡを示す。レーン５および６は、構成的に発現されたＵ３−Ｃｒｅ取込みを有するクローンからのＲＮＡを含む。図６は、ＩＬ−３除去後の細胞転写の研究を示す。ＩＬ−３が剥奪されたＦＤＣＰ−１細胞から、０、６および１２時間後、ポリアデニル酸ＲＮＡ（レーンあたり５マイクログラム）が誘導された。ノーザンブロット分析が図５の方法にしたがって構成され、³²Ｐでラベルされた５’プロウィルス−フランキング（両側に有する）配列またはＧＡＰＤＨとハイブリダイズした。図７は、胚幹細胞中に、分化調節Ｕ３-Ｃｒｅ遺伝子をトラップする研究を示す。各細胞１５０の９６０プールに、Ｕ3-Ｃｒｅウィルスを感染させ、Ｇ４１８中で選択した。分化誘発を４日以上行った。（左）Ｘ−Ｇａｌ染色前（左）および後（右）の分化誘発（右）調節遺伝子のサザーンブロット分析。ゲノムＤＮＡを、ＢａｍＨＩで切断し、図３の方法で処理した。次いで、³²ＰでラベルしたＣｒｅ−（左）またはpg k-（右）特異的プローブと、ハイブリダイズした。ｕ＝未分化、ｄ＝分化。これらの特徴は実施例で確認される。以下に実施例を用いて本発明を詳細に説明する；実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲は実施例に限定されるものではない。実施例実施例１レポータープラスミドの構築レポータープラスミドppgklxtkneoIL-3の大半の構成要素（ホスホグリセレートトランスフェラーゼプロモーター、loxPターゲット配列、チミジンキナーゼ− ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質、IL-3遺伝子）を、以下のようにして、p-BluescriptII-KSに一緒に入れた。ターゲット配列であるloxPの配列を、pGEM30から誘導した。まず、loxPサイトを、EcoRI/Psti断片として、p-Bluescriptポリリンカーに挿入した。次に、pgk （ホスホグリセレートトキナーゼプロモーター、ppgkCATから得たもの）を、ポリリンカーのXbal/BamHI組換えサイトに連結し、チミジンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合遺伝子を、下流側に位置するEcoRV組換えサイトにクローニングした。IL-3遺伝子（マウスのcDNAとして、pc-Multi-CSF由来）を、まず、pGEM30から、loxPターゲット遺伝子に隣接したポリリンカーのEcoRI サイトにサブクローニングし、次に、プラスミドをClaI/SalIで切断し、末端の充填された末端を再度連結して、EcoRIサイトをもう一つ除去した。次に、IL-3- loxPを、pGEM30からSalI/XhoI断片として回収し、p-Bluescriptポリリンカーにクローニングした。SbaI/AvaI断片としてのウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列(bpa)の１コピーを、ブラント末端とともに、tkneoの下流のClaIサイトにクローニングした。ppgklxtkneoIL-3を得るために、組み立てた配列を含むXhol断片を、pSBC2のSV-40ポリアデニル化サイトの上流側にクローニングした。この独創的構築物でも、IL-3のジシストロン性のtkneo-IL-3転写産物からの翻訳が依然として可能だったので、ブラント末端を有する別のコピーのbpaを、pSBCIIのSal Iサイトにクローニングして、最終的なppgklxtkneoIL-3レポータープラスミドを得た。実施例２loxP 組換えターゲットによって挟まれた２つの選択性のレポーター遺伝子を発現するFDCP1レポーター細胞細胞系の構築使用するFDCP１造血前駆細胞は、成長に関してIL-3に厳密に依存性であり、培地からこの増殖因子を除くと、プログラム細胞死が始まる。 FDCP１細胞は、10%(v/v)のウシ胎仔血清（High Clone Laboratories、米国ユタ州）ならびに10ng/mlの組換えマウスIL-3（Sandoz）を加えたダルベッコの改良イーグル培地（DMEM，Gibco）中で、細胞２×１０⁵個／培地1mlの濃度で培養した。寒天培地は、40%(v/v)ウシ胎仔血性を加えたダブルストレンスDMEM（hycl one）と0.6%(w/v)バクトアガー（Difco）の二回蒸留水への溶液の等量の混合物であった。２、３の培養は、５μＭのガンシクロビル（Sydex）を含むものとした。 Cre組換え酵素によって因子非依存性細胞に形質転換された細胞系を得るために、FDCPI1細胞を、レポータープラスミドppgklxtkneoIL-3でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションを行うにあたっては、BioRad Gene Pulser （BioRad）を、製造業者の指示にしたがって使用した。組換え体は、0.6mg/mlの G418を含有する寒天培地で単離した。１０日後に、発達中のクローンを単離し、上述の懸濁培養中で増幅させた。ppgklxtkneoIL-3（図３A）は、並んで配置された２つの選択性レポーター遺伝子から構成されており、これらは、pgk（ホスホグリセレートトキナーゼ）プロモーターからの転写産物である。この遺伝子の５ ’末端は、HSV2チミジンキナーゼ（Tk）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）融合タンパク質をコードしており、この５’末端部分は、２つのloxP組換えターゲットによって挟まれている。この遺伝子の３’末端は、マウスのIL-3 をコードしており、SV40ポリアデニル化配列で終端している。ジシストロン性の転写産物のIL-3の翻訳を抑制するために、２つの連続して並んだウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列（bpa）をtkneoの下流に挿入した。このことによって、ppgklxtkneoIL-3を発現した細胞であっても、依然として、常にI L-3依存性であると想定することが可能となった。Cre組換え酵素は、通常、直接反復したlox-Pによって挟まれた配列を切断するので、Creが発現すると、tkneo 遺伝子が欠失することになり、それによって、IL-3遺伝子がpgkプロモーターの下流に位置することになるものと推定された。そして、その結果、細胞は、ネオマイシン耐性を失い、IL-3の合成を通じて因子非依存性を獲得するものと推定された。安定なFDCP-1形質転換体をG148で選択し、５つのクローン性細胞系を寒天培地から単離した。単一コピーのプラスミドを発現しており、FLOXIL-3として識別された細胞系を、さらなる分析用に選択した。まず、FLOXIL-3細胞が、依然として成長に関してIL-3依存性であるかどうかの確認を、IL-3を含まない固まりかけの寒天培地で、5×10⁷個の細胞を2×10⁵個／ mlの濃度で平板培養することによって行った。１０日以内に発現したコロニーがなかったので、これらの細胞の内部では、限定的なIL-3の翻訳も、自発的な組換えも生じていなかったことが推定された。この推定結果をさらに確認するために、FLOXIL-3細胞とその親にあたるFDCP-1 細胞を、IL-3を含まない寒天培地で２４時間予備培養し、最終的にIL-3を与えることによって救助した。どちらのタイプの細胞も、似たような動態でプログラム細胞死を開始し、このことから、ppgklxtkneoIL-3の発現によって、因子の除去に対する細胞の応答に変更が生じることのなかったことが示された。なお、細胞の大半は、IL-3なしの状態で１２時間以上にわたって生存していたので、遺伝子トラップによってトランスダクションされた配列が発現する時間は十分にあったはずである。実施例３Cre 組換え酵素（U3-Cre）を発現し、FLOXIL-3細胞を因子非依存性とする遺伝子トラップの構築 U3-Cre遺伝子トラップベクターは、MoMuLVにもとづくpGgU3Neo(en-)ベクターから誘導し、この際に、U3領域のneo遺伝子が、pMCCreから誘導されたCreをコードする配列によって置換された。このプラスミドをヘルパー細胞にトランスフェクションし、組換えウイルスを高い力価で産生している細胞系の残りの部分は、 FLOXIL-3細胞を感染させる際に使用した。さきにも述べたように、ウイルスの複製、そしてU3に挿入しておいた配列のLTR媒介性の複製によって、挿入配列は、隣接する細胞性DNAのちょうど３０ヌクレオチド下流に位置することになる。このことによって、転写遺伝子への組込みによる挿入配列の発現が可能となる。こうしたことから、発現遺伝子中にU3-Creが組み込まれているFLOXIL-3細胞は、形質転換されて因子非依存性細胞になるであろうことが予測された。形質転換の生じた細胞を選択するために、ウイルスで感染させたFLOXIL-3細胞を、IL-3を含まない寒天培地で平板培養した。多数の自律的に成長するコロニーが得られ、これらのコロニーを懸濁培養中で増幅した。組換えレポータープラスミドが発現されたことからも予測されるように、クローンはいずれもG418耐性をなくしており、IL-3なしで生育した。組換えが生じていることを確認するために、５つの自律的クローンからのゲノムDNAを取り出し、このゲノムDNAをBamHIで消化し、サザンブロッティングで分析した。BamHIは、pgkならびにIL-3の５’末端の内側を分断するので、組換えFL OXIL-3細胞は、pgkに特異的なプローブとneoに特異的なプローブの双方とハイブリダイズする３．２kbの内部断片を複製しない（図３Ａ）。この断片は、tkneo をはじめとするloxPに隣接するすべての配列を含んでいるので、欠失に際しては、2.6kbのサイズ減少が生じているはずである。実際、クローンはいずれも、neo とはハイブリダイズしない0.6kgの制限断片を生成し、このことによって、組換えが生じていることが示された（図３Ｂ）。また、ノーザンブロッティングで解析したところ、クローンはいずれも、細胞のプロウイルス転写産物を発現し、このことから、活性細胞のプロモーターのCr e組換え酵素が発現されていることが示された。このようにして、プログラム細胞死の原因遺伝子をはじめとする遺伝子の単離や識別を可能とするような遺伝子トラッピング構築物を含むFLOXIL-3細胞が得られた。実施例４U3-Cre/FloxIL-3 組込み体バンクの構築と、一過的に発現された遺伝子配列の単離 FL0XIL-3細胞にU3-Creレトロウイルスを感染させることによって、2×10⁶個の非依存性のプロウイルス性組込み体からなる組込み体バンクを構築した。感染細胞は、まず、G418中で予備的に選択して、発現遺伝子への完全な組込みを防止した。図４は、この目標が、１６日間の選択の後に達成されたことを示している。組込み体バンクの基本サンプルを、IL-3を含まない寒天培地で平板培養したところ、全部で１１０の自律性クローンを単離、増殖することができた。サザンブロットで調べたところ、これらのクローンのいずれもが、プロウイルスの組込みを示し、組換えレポータープラスミドを例外なく含んでいることが示された（図４）。１１の非依存性で自律性のクローンから得たmRNAを用いたノーザンブロットでは、９つのクローンで、細胞−プロウイルス融合転写産物が極めて弱くのみ発現されているか、まったく発現されていないかのいずれかであることが示された（図５、レーン１，３，７，９，１１，１３，１７，１９，２１）。このことは、 Cre組換え酵素が、レポータープラスミドの組換えが生じるのに十分な程度まで、一過的にのみに発現されたたことを意味するものである。また、これらの融合転写産物の５０％以上が、血清除去によって誘導可能であり、このことから、遺伝子トラップによって遮断された遺伝子には、アポトーシスプログラムあるいは成長の停止が伴うことが示唆された（図５）。最後に、ノーザンブロットによって、公知の方法（von Melchnerら、1992）によってクローニングした５’−プロウイルス−フランキング配列を、野生型FDCP -1細胞のmRNAとハイブリダイズした。調べたプローブの大半が、IL-3で誘導した細胞性転写産物とハイブリダイズした（図６）。これらの遺伝子が、アポトーシスを直接制御しているのか、それとも、プログラム細胞死の結果として活性化されるようなもっと別の機構の一部なのかは、今後の確認を待たねばならない。いずれにしても、IL-3の除去によって誘導した細胞性転写産物の特性を調べておくことは、プログラム細胞死の間に現出する複雑な分子の変化を調べるうえで役に立つはずである。見いだされた遺伝子のさらに詳しい識別ならびに単離は、通常の方法、たとえば、3'RACE、あるいは遺伝子ライブラリーを復元し、見いだされた遺伝子をクローニングし、配列決定することによって実施することができる。実施例５ES レポーター細胞系の構築 Cre組換え酵素による永久的な選択性のレポーター交換に適したES細胞を得るために、２つのレポーター遺伝子を連続して配置したものをマウスホスホグリセレートキナーゼプロモーターで転写したレポーター構築物ppgklxtkneolacZで、Ｄ３細胞をエレクトロポレーションした。レポーター構築物ppgklxtkneolacZは、ホスホグリセレートキナーゼプロモーター、loxPターゲット配列、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、そしてlacZの遺伝子から構成されている。その構成は、レポータープラスミドppgklxtkneoIL-3について記載したパターンの通りであった。５’遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、同じ向きの２つのloxP組換えターゲットで挟まれている。３’遺伝子は、β−ガラクトシダーゼをコードし、SV40ポリアデニル化配列で終端している。SV40-PolyAで終端するゲノム転写産物を抑制し、そうすることによって同時にlacZの翻訳を抑制するために、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼの下流に、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列（bpa）２コピーを連続して位置するように挿入した。したがって、ppgklxtkneolacZを発現する細胞は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼに対して耐性で、lacZに対してネガティブであるような表現型を示すはずである。しかし、Creが発現した場合には、neo遺伝子は組換え酵素から切り出され、lacZをコードする配列がpgkプロモーターのすぐ下流に位置することになるはずである。その結果、組換えレポータープラスミドを発現する細胞は、ネオマイシン耐性を失い、X-Gal（lacＺ⁺）で陽性に染色されることになる。 ppgklxtkneolacZを発現する各種のES細胞系をG418中で単離し、X-Gal染色のバックグラウンドで個々に調べた。１０の細胞系のうち４つは、長期にわたって培養を続けた後も、X-Galによっては規則正しく染色されなかった。LIF（白血病阻害因子、Leukemia inhibiting factor）あるいは栄養物質の層を含まない培地中で、こうした細胞系の分化を誘導しても、lacZ細胞は依然として染色反応で陰性であり、このことから、このlacZ表現型が安定であることが示唆された。さらなる分析を行うために、１コピーのppgklxtkneolacZを発現する細胞系を選んだ。以下では、この細胞系をpln13と称する。 Cre組換え酵素によってpln13のlacZがlacＺ⁺に変わったかどうかを確認するために、Cre発現性のプラスミドであるpMC-Creで細胞をトランスフェクションした。１０日後に、選択されなかったコロニーを釣り上げ、一部をX-Galで染色した。各種のlacＺ⁺細胞からゲノムDNAを抽出し、BamHIで切断し、サザンブロッティングで分析した。いずれの場合も、lacZの表現型は、２kbの欠失を伴っており、このことから、レポータープラスミドに部位特異的組換えが生じていることが示唆された。実施例６U3-Cre の組込みによるpln3でのβ−ガラクトシダーゼの発現 5×10⁴個のpln13細胞を、感染多重度(MOI)＝１で、上述のようにして構築した U3-Creウイルスに感染させた。72時間インキュベートした後、細胞を480のプールに分け、マイクロタイタープレートに播種した。48時間後に一部をX-Galで染色して、活性細胞への組込みについて検出を行った。lacＺ⁺細胞を含んでいた２０のプールのうち３つを、クローン密度で播種した。４つの陽性クローンを選択的に単離し、サザンブロッティングで分析した。これらのクローンは、いずれも、１−２のプロウイルスを含んでおり、このことは、MOI＝1としたことと符合し、また、これらのクローンは、いずれも、組換えレポータープラスミドを含んでいた。また、どのクローンも、細胞−プロウイルス融合転写産物を発現しており、そのサイズは、１００−５００nt程度であると予測された。このように、U3-Cre遺伝子トラップレトロウイルスは、発現遺伝子に組込まれることによって、部位特異的組換えを効果的に媒介する。実施例７誘導性のU3-Cre-プロウイルスの組込みまれたクローンの単離分化によって誘導性となった遺伝子を単離するうえで、U3-Cre/loxP戦略が適当かどうかを確認するために、1.5×10⁵個のpln13細胞を、マイクロタイタープレート１０枚の穴に、細胞150個／穴の濃度で播種し、MOI＝１でU3-Creウイルスに感染させた。活性遺伝子への組込みを防ぐために、細胞をG418上で５日間にわたって選択した。その後、LIF（白血病阻害因子、Leukemia Inhibitory Factor ）あるいはMEF（マウス胚線維芽細胞、Mouse Embryonic Fibroblasts）の不在下で、各穴の一部の分化を誘導して、X-Galで染色した。960個の穴のうち44個が、この試験で陽性に染色された。さらに調べたところ、９つのプールが、LIFならびにMEFの存在下ならびに不在下でlacＺ⁺であり、35のプールが、分化の後にはじめてlacＺ⁺となった。このことから、誘導遺伝子中でU3-Creの組込みが生じていることが示された。図７は、分化特異的遺伝子へのU3-Cre-プロウイルスの組込みが生じている単離クローン３つの例を示す。遺伝子の誘導性は、lacZ(-)（図７Ａ、未分化細胞、左上）からlacZ(+)（図７Ａ、分化細胞、右上）への表現型の変化によって調べた。サザンブロットでは、この変化が、誘導性分化遺伝子へのU3-Cre-プロウイルスの組込みによって生じたレポータープラスミドの部位特異的組換えに基づくものであることが示された（図７Ｂ）。図２には、こうした単離の概略を示す。最初の工程では、U3-Cre遺伝子トラップベクターによる感染と、G418での選択を行う。得られたコロニーは、一部をとり分け、分化を誘導し、X-Galで染色する。染色されたクローンのみを選択し、増殖させ、キメラマウスの構築に使用する。これらのマウスは、また、組織での lacZの分布を測定したり、F2マウスの表現型を決定したり、-/-ES-細胞を単離したりする際にも使用することができる。対応する細胞性遺伝子は、公知の遺伝子トラップ配列から、通常の手段によってクローニングすることができる。このようにして、本発明のこの遺伝子トラッピング構築物は、遺伝子、特に、一過的にのみ発現される遺伝子を単離および／または識別することを可能とするものである。文献リスト Coffln，J．M.，Stoye,J．P.およびFrankel,W．N.（1989）、マウス内在性白血病ウィルスの遺伝学、Ann.N Y Acad．Sci．567,39-49。 Goff，S．P.(1990)、感染した細胞のゲノム中へのレトロウィルスＤＮＡの組込み、Cancer Cells，172-178。 Gridley，T.，Soriano，O.，およびJaenisch，R．(1987)、マウスへの突然変異生成の挿入、Trends Genet．3，162-166。 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【手続補正書】【提出日】平成１１年８月１１日（１９９９．８．１１）【補正内容】請求の範囲１．活性化後に第２のレポーター遺伝子を活性化しうる第１のレポーター遺伝子を含む遺伝子トラップ構築体。２．前記第１のレポーター遺伝子が組換え酵素をコードすることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子トラップ構築体。３．前記組換え酵素がＣｒｅであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子トラップ構築体。４．前記組換え酵素がＦｌｐであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子トラップ構築体。５．前記第２のレポーター遺伝子がタンパク質因子をコードすることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体。６．前記第２のレポーター遺伝子がＩＬ−３をコードすることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子トラップ構築体。７．前記第２のレポーター遺伝子がＬａｃＺをコードすることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子トラップ構築体。８．前記組換え酵素が、前記第２のレポーター遺伝子より先に配置されたＤＮＡ断片を削除し、それにより第２のレポーター遺伝子がプロモーターの下流に置かれ、そのコントロールを受けることによって、第２のレポーター遺伝子が活性化されることを特徴とする請求項２ないし７のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体。９．前記削除される断片が、抗生耐性遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子トラップ構築体。１０．前記削除されるＤＮＡ断片が、チミジンキナーゼーネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードすることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子トラップ構築体。１１．前記削除されるＤＮＡ断片が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードすることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子トラップ構築体。１２．前記プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターであることを特徴とする請求項９、１０または１１に記載の遺伝子トラップ構築体。１３．前記削除されるＤＮＡ断片が、組換え酵素のための標的配列で挟まれていることを特徴とする請求項８ないし１２のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体。１４．前記標的配列がＩｏｘＰであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子トラップ構築体。１５．前記標的配列がｆｒｔであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子トラップ構築体。１６．前記標的配列がＵ３および／またはＵ５領域中に位置することを特徴とする請求項１３、１４または１５に記載の遺伝子トラップ構築体。１７．遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体の使用。１８．プログラムされた細胞死、ＤＮＡ修正、分化および／または細胞周期をコントロールする遺伝子を単離および／または同定するための請求項１７に記載の使用。１９．請求項１ないし１５のいずれかの遺伝子トラップ構築体を含む細胞、好ましくは哺乳類細胞。２０．ＩＬ−３依存性であり、前記第１のレポーター遺伝子がＣｒｅ組換え酵素をコードし、該Ｃｒｅ組換え酵素が第２のレポーター遺伝子より先に配置されたＤＮＡ断片を削除し、該削除された断片が、チミジンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質（ＴＫＮｅｏＰＴ）をコードし、ＩｏｘＰ標的配列で挟まれ、前記第２のレポーター遺伝子がＩＬ−３をコードし、次いでＴＫＮｅｏＰＴ遺伝子を削除した後、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの下流に置かれていることを特徴とする請求項１９に記載の哺乳類細胞。１．造血性ＦＤＣＰ−１または分化全能性幹細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の哺乳類細胞。２２．遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための請求項１９に記載の哺乳類細胞の使用。２３．プログラムされた細胞死、ＤＮＡ修正、分化および／または細胞周期をコントロールする遺伝子を単離および／または同定するための請求項１９または２０または２１に記載の哺乳類細胞の使用。２４．請求項１ないし１６のいずれかの遺伝子トラップ構築体を含むベクター。２５．遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための請求項１から１６に記載の遺伝子トラップ構築体および／または請求項２４に記載のベクターを含むキット。２６．以下の工程を含む、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離する方法： −請求項１ないし１６のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体を適切な細胞中に誘導する −第１のレポーター遺伝子が、細胞中の遺伝子、好ましくは不活性遺伝子に組込まれる細胞を選択する −第１のレポーター遺伝子の活性化、好ましくは不活性遺伝子の転写開始を介して、その結果、第２のレポーター遺伝子が活性化され、および −第１レポーター遺伝子が組込まれた遺伝子を同定および／または単離する。２７．下記の特徴を有する請求項２６の方法： −第１のレポーター遺伝子としてのＣｒｅ組換え酵素遺伝子を含む請求項８に記載の遺伝子トラップ構築体、該Ｃｒｅ組換え酵素が、第２のレポーター遺伝子の上流に配置されたチミヂンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を削除し、これによりＩＬ−３をコードする第２のレポーター遺伝子が、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターのコントロール下に来る、 −上記遺伝子トラップ構築体は、ＩＬ−３依存性ＦＤＣＰ−１細胞中に挿入され、 −ネオマイシン培地中での培養を経て、Ｃｒｅ組換え酵素を生産しない細胞が選択され、 −これら選択された細胞がＩＬ−３を含まない培地で培養され、プログラムされた細胞死に関する遺伝子が活性化され、 −すなわち生存細胞が選び出され、および −プログラムされた細胞死に関する遺伝子が、一般的な手順により単離される。２８．下記の特徴を有する請求項２６の方法： −第１のレポーター遺伝子としてのＣｒｅ組換え酵素遺伝子を含む請求項８に記載の遺伝子トラップ構築体、該Ｃｒｅ組換え酵素が、第２のレポーター遺伝子よりも下流に配置されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を削除し、これによりｌａｃＺをコードする第２のレポーター遺伝子が、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターのコントロール下に来る、 −上記遺伝子トラップ構築体は、分化全能性胚性幹細胞中に挿入され、 −Ｇ４１８での培養を経て、Ｃｒｅ組換え酵素を生産しない細胞が選択され、 −これら選択された細胞は分化が誘導され、分化特異的遺伝子が活性化され、 −これら細胞が単離され、 −哺乳類の生殖系列中に誘導され、そこで組織の形成に関し、そして −分化特異的遺伝子が一般的な手順により単離される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者フォンメルクナーハラルドドイツ国フランクフルトアムマインＤ―60596 テオドール―スターン―カイ７アプタイラングハエマトロジーユニヴァージターツクリーニクム

Claims

【特許請求の範囲】１．活性化後に第２のレポーター遺伝子を活性化しうる第１のレポーター遺伝子を含む遺伝子トラップ構築体。２．前記第１のレポーター遺伝子が組換え酵素をコードすることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子トラップ構築体。３．前記組換え酵素がＣｒｅであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子トラップ構築体。４．前記組換え酵素がＦｌｐであることを特徴とする請求項２に記載の遺伝子トラップ構築体。５．前記第２のレポーター遺伝子がタンパク質因子をコードすることを特徴とする前記請求項のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体。６．前記第２のレポーター遺伝子がＩＬ−３をコードすることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子トラップ構築体。７．前記第２のレポーター遺伝子がＬａｃＺをコードすることを特徴とする請求項５に記載の遺伝子トラップ構築体。８．前記組換え酵素が、前記第２のレポーター遺伝子より先に配置されたＤＮＡ断片を削除し、それにより第２のレポーター遺伝子がプロモーターの下流に置かれ、そのコントロールを受けることによって、第２のレポーター遺伝子が活性化されることを特徴とする請求項２ないし７のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体。９．前記削除される断片が、抗生耐性遺伝子であることを特徴とする請求項８に記載の遺伝子トラップ構築体。１０．前記削除されるＤＮＡ断片が、チミジンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質をコードすることを特徴とする請求項９に記載の遺伝子トラップ構築体。１１．前記削除されるＤＮＡ断片が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードすることを特徴とする請求項１０に記載の遺伝子トラップ構築体。１２．前記プロモーターが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）プロモーターであることを特徴とする請求項９、１０または１１に記載の遺伝子トラップ構築体。１３．前記削除されるＤＮＡ断片が、組換え酵素のための標的配列で挟まれていることを特徴とする請求項８ないし１２のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体。１４．前記標的配列がＩｏｘＰであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子トラップ構築体。１５．前記標的配列がｆｒｔであることを特徴とする請求項１３に記載の遺伝子トラップ構築体。１６．前記標的配列がＵ３および／またはＵ５領域中に位置することを特徴とする請求項１３、１４または１５に記載の遺伝子トラップ構築体。１７．遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための請求項１〜１６のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体の使用。１８．プログラムされた細胞死、ＤＮＡ修正、分化および／または細胞周期をコントロールする遺伝子を単離および／または同定するための請求項１７に記載の使用。１９．請求項１ないし１５のいずれかの遺伝子トラップ構築体を含む細胞、好ましくは哺乳類細胞。２０．ＩＬ−３依存性であり、前記第１のレポーター遺伝子がＣｒｅ組換え酵素をコードし、該Ｃｒｅ組換え酵素が第２のレポーター遺伝子より先に配置されたＤＮＡ断片を削除し、該削除された断片が、チミジンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ融合タンパク質（ＴＫＮｅｏＰＴ）をコードし、ＩｏｘＰ標的配列で挟まれ、前記第２のレポーター遺伝子がＩＬ−３をコードし、次いでＴＫＮｅｏＰＴ遺伝子を削除した後、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターの下流に置かれていることを特徴とする請求項１９に記載の哺乳類細胞。２１．造血性ＦＤＣＰ−１または分化全能性幹細胞であることを特徴とする請求項２０に記載の哺乳類細胞。２２．遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための請求項１９に記載の哺乳類細胞の使用。２３．プログラムされた細胞死、ＤＮＡ修正、分化および／または細胞周期をコントロールする遺伝子を単離および／または同定するための請求項１９または２０または２１に記載の哺乳類細胞の使用。２４．請求項１ないし１６のいずれかの遺伝子トラップ構築体を含むベクター。２５．遺伝子、特に一過性遺伝子の同定および／または単離のための請求項１から１６に記載の遺伝子トラップ構築体および／または請求項２４に記載のベクターを含むキット。２６．以下の工程を含む、遺伝子、特に一過性遺伝子を同定および／または単離する方法： −請求項１ないし１６のいずれかに記載の遺伝子トラップ構築体を適切な細胞中に誘導する −第１のレポーター遺伝子が、細胞中の遺伝子、好ましくは不活性遺伝子に組込まれる細胞を選択する −第１のレポーター遺伝子の活性化、好ましくは不活性遺伝子の転写開始を介して、その結果、第２のレポーター遺伝子が活性化され、および −第１レポーター遺伝子が組込まれた遺伝子を同定および／または単離する。２７．下記の特徴を有する請求項２６の方法： −第１のレポーター遺伝子としてのＣｒｅ組換え酵素遺伝子を含む請求項８に記載の遺伝子トラップ構築体、該Ｃｒｅ組換え酵素が、第２のレポーター遺伝子の下流に配置されたチミヂンキナーゼ−ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を削除し、これによりＩＬ−３をコードする第２のレポーター遺伝子が、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターのコントロール下に来る、 −上記遺伝子トラップ構築体は、ＩＬ−３依存性ＦＤＣＰ−１細胞中に挿入され、 −ネオマイシン培地中での培養を経て、Ｃｒｅ組換え酵素を生産しない細胞が選択され、 −これら選択された細胞がＩＬ−３を含まない培地で培養され、プログラムされた細胞死に関する遺伝子が活性化され、 −すなわち生存細胞が選び出され、および −プログラムされた細胞死に関する遺伝子が、一般的な手順により単離される。２８．下記の特徴を有する請求項２６の方法： −第１のレポーター遺伝子としてのＣｒｅ組換え酵素遺伝子を含む請求項８に記載の遺伝子トラップ構築体、該Ｃｒｅ組換え酵素が、第２のレポーター遺伝子よりも下流に配置されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を削除し、これによりｌａｃＺをコードする第２のレポーター遺伝子が、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーターのコントロール下に来る、 −上記遺伝子トラップ構築体は、分化全能性胚性幹細胞中に挿入され、 −Ｇ４１８での培養を経て、Ｃｒｅ組換え酵素を生産しない細胞が選択され、 −これら選択された細胞は分化が誘導され、分化特異的遺伝子が活性化され、ーこれら細胞が単離され、 −哺乳類の生殖系列中に誘導され、そこで組織の形成に関し、そして −分化特異的遺伝子が一般的な手順により単離される。