JPWO2008013067A1 - ヒト人工染色体(hac)ベクター及びヒト人工染色体(hac)ベクターを有するヒト細胞医薬 - Google Patents
ヒト人工染色体(hac)ベクター及びヒト人工染色体(hac)ベクターを有するヒト細胞医薬Info
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Abstract
Description
哺乳動物細胞への遺伝子導入において汎用されるプラスミド、コスミド、細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、ウイルスなどの従来ベクターは、エピソームの場合には導入遺伝子の発現が一過性である点が、一方宿主細胞の染色体に組込まれる(インテグレーション)場合には宿主染色体の遺伝子を破壊する、導入遺伝子のコピー数が制御されない、導入遺伝子が不活性化される、組込まれた宿主染色体上の制御配列の影響を受ける、などの点が問題として挙げられる。
これらを解決する一つの方法として、本発明者の研究グループはヒト21番染色体を出発材料として、構造が明らかで不要な遺伝子を除去した、外来DNAを簡便に導入可能な新規のHAC(21HAC)ベクター系を構築した(特許文献1及び非特許文献1)。この中で21HACベクターは、ヒトを含む哺乳動物細胞を宿主として自律複製/分配が可能で安定に保持されること、宿主染色体を破壊することなく一定コピー数の遺伝子が導入可能であることを示した。また、ex vivoホルモン補充遺伝子治療を意図したモデルとして治療用遺伝子ヒトエリスロポイエチン(hEPO)を導入した21HACベクターをヒト正常初代培養繊維芽細胞に移入できること、EPOを長期間持続発現できること、その発現量はCHO細胞での約1/1000に発現抑制を受けること、HAC移入正常初代培養繊維芽細胞を単一コロニーから最大3.8×107細胞まで増幅できること、非選択条件下で6又は9代継代後65.5〜90.9%保持されること、を示してきた(特許文献1及び非特許文献2)。
一方、ヒヒにおけるex vivo EPO補充遺伝子治療モデルでは、レトロウイルスベクターでhEPO遺伝子導入したヒヒ初代培養MSCs(0.81〜6.6×106細胞/kg)のカプセル皮下移植により血中EPO濃度上昇、貧血回復が報告されている(非特許文献3)が、遺伝子治療のためには、細胞あたりの更なる発現量向上が求められる。またヒト正常初代培養繊維芽細胞の分裂限界を考慮すると細胞分裂回数を少なくするのが望ましく、in vivoで効果を発揮できる状態の治療用HAC移入細胞を効率よく増幅するためには、ベクター安定性について改善・向上する余地が残されている。
上記課題を解決する一つの手段は、ベクターの基本骨格となるヒト染色体として安定性の高いヒト染色体を用いて機能的なテロメアを持つHACベクターを構築することである。
外来遺伝子の発現は、挿入された部位周辺のクロマチン構造や制御配列の有無により影響されることが知られている。また染色体を安定に維持するには機能的な十分な長さのテロメアが必要であること(非特許文献4)が知られている。HAC上において、クロマチン構造や制御配列の影響排除のためインスレーターを利用した事例(非特許文献23)はあるが、クロマチン構造や制御配列の影響排除の検証はなされておらず、またテロメア配列を操作するものではない。また、HAC上においてテロメラーゼなどによるテロメア配列の付加・テロメア長の回復等、テロメア配列操作によるHACベクター安定性向上の検討はなされていない。
相同組換え効率の向上
外来遺伝子を導入する際、遺伝子導入細胞の選別のために薬剤耐性遺伝子の導入が汎用される。多くの場合、薬剤耐性遺伝子は目的の外来遺伝子と並列して同一ベクター上に配置される。遺伝子発現ユニットが複数並列すると、それらが互いに干渉し外来遺伝子の発現量が減弱することが知られている。従来、高発現生産系細胞の構築において、発現量向上のために、例えば薬剤耐性遺伝子をexonとして分断配置しスプライシングを経て発現させることにより薬剤耐性能を下げることで、導入外来遺伝子を高発現する細胞の選別が行われている(非特許文献22)が、薬剤耐性遺伝子そのものの除去により外来遺伝子の発現が顕著に向上した報告はこれまでない。
また、薬剤耐性遺伝子除去については、抗体軽鎖κ遺伝子座に外来遺伝子をノックインする際、下流に存在する薬剤耐性遺伝子除去により相同組換え効率が向上することがマウスES細胞において知られている(特許文献2)が、これも外来遺伝子発現を向上するものではない。
ヒト染色体の安定性と遺伝子発現
マウスES細胞の実験では、導入した染色体断片が大きいほどこれを保持する細胞のキメラ個体中での寄与率が下がることが知られている。本発明者の研究グループは、マウス胚幹細胞に抗体遺伝子を含むヒト14番、2番、22番染色体断片を移入し、キメラ個体が作製できること、移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現すること、ヒト染色体断片がキメラ個体で安定に保持されること、生殖系列を経て次世代伝達可能なことを示した(非特許文献5及び6)。また、ヒト抗体重鎖遺伝子を保持するマウスを作製する目的で単離されたヒト14番染色体由来の自然断片SC20及びこれに抗体軽鎖遺伝子を含むヒト22番染色体領域をクローニングしたHACについて、マウスでの安定性と生殖系列伝達を確認した(非特許文献7)。さらに上記SC20由来HACは、体細胞核移植により作出したクローンウシ個体で安定に保持されること、移入された抗体遺伝子が個体中で機能発現することを示してきた(非特許文献8)。一方、上記のヒト14番染色体由来の自然断片及びHACについて、ヒト正常初代培養細胞及びヒト細胞株での安定性及び発現の検討は未だなされていない。また、ヒト21番染色体を除くその他のヒト染色体由来の自然断片及びHACについても、ヒト正常初代培養細胞及びヒト細胞株での発現・安定性の検討は未だ十分になされていない。ヒトX染色体由来のミニ染色体がヒト細胞株で保持された報告(非特許文献9)があるが、このミニ染色体では継代後に顕著な多コピー化が認められており、一定のコピー数を維持するには至っていない。
テロメアによる発現・安定性の制御
テロメアは、染色体末端に位置する繰り返し配列で、酵母からヒトを含む哺乳動物細胞まで広い生物種で保存されており、ヒト正常細胞の場合、(TTAGGG)の繰返しが15〜0.4kbの長さに及ぶ。テロメアは、細胞分裂の進行とともに短縮し、テロメア長の減少にともなって異常染色体(融合・脱落・分断・異数化など)の出現・増加が観察されることから、染色体の保護・安定維持に必要と考えられている(非特許文献10及び11)。以上のことから、十分な長さの機能的なテロメア構造を持つことにより染色体の安定性が向上すると考えられる。
テロメア長は、テロメラーゼの強制発現により、或いはテロメア結合タンパク質(POT・TRF2)の欠失により人為的に伸長できる(非特許文献12及び13)。これらの方法によりヒト正常初代培養細胞及びヒト細胞株において分裂回数の増加・寿命延長は実証されたが、染色体安定性を回復・向上できるかについては依然として明らかでない。また、不死化細胞において、Crisis後に内在性のテロメラーゼ活性が上昇し短縮したテロメアが一定の長さに伸長・維持されると異常染色体の出現頻度は増減せず維持された(非特許文献14)例はあるが、この場合も染色体安定性の回復・向上には至っていない。
サブテロメアは、染色体末端のテロメア(TTAGGG)n繰返し配列のセントロメア側に隣接して位置し、分節・重複ドメインや(TTAGGG)n様の繰返し配列を持つ、約300〜500kbにわたる染色体領域を指す。分節・重複ドメイン構造の持つ高ホモロジーのために、同一染色体上のサブテロメア内又は異なる染色体上のサブテロメア間において高頻度で転位や組換えが生じやすいことが知られている(非特許文献15〜17)。ヒト14番染色体長腕のサブテロメア長は、分節重複領域として499kbが同定され、また(TTAGGG)nのテロメア配列と上記サブテロメア領域との間に20kb以下の未同定配列の存在が示唆されている(非特許文献18)。サブテロメアの機能は、その高ホモロジーを利用した組換え促進によるテロメラーゼ非存在下でのテロメア修復・維持、サブテロメアの可塑性による新しい環境への適応、疾患を引き起こす転位・欠損の誘導などが示唆されているが、その詳細はまだ明らかではない。
テロメア又はテロメア及びサブテロメアと遺伝子発現の関係については、テロメア配列のランダム挿入により染色体末端がテロメア配列に置換した染色体を有する細胞において、テロメア近位での外来導入遺伝子発現がヘテロクロマチン化によるサイレンシング(テロメアポジション効果(Telomere position effect);TPE)をうけることが観察されている(非特許文献19)。TPEに関しては、テロメア伸長とサイレンシングは相関性がある(非特許文献20)とする報告がある。一方、内在性のテロメア領域遺伝子群の発現については、継代前後のヒト新生児包皮繊維芽細胞において、遺伝子発現パターンとテロメア長減少及びテロメア端からの距離は相関性がなかった(非特許文献21)。以上のように、テロメアと遺伝子発現の関係についてはこれまで議論が決着されていない。
本発明者らは、上記課題を解決するために、ヒト染色体に存在するテロメア配列及びサブテロメア配列に着目し、人工染色体末端にテロメア配列及び/又はサブテロメア配列を含むヒト人工染色体ベクターの構築を試みた。
その一例として、ヒト14番染色体の長腕から、ヒト14番染色体のセントロメア領域、テロメア配列及びサブテロメア配列の一部を残して既知の遺伝子の殆どを削除し、長腕近位にloxP配列を部位特異的に挿入した、改変ヒト染色体(14HAC)ベクターを作製した(図1)。この14HACベクターを保持するCHO雑種細胞を非選択条件下で長期継代培養すると、14HACベクターは、殆ど脱落することなく一定コピー数で保持されること、この14HACベクターの安定性は従来の21HACベクター(WO2994/031385号)を顕著に上回ること、を確認した(図13)。更にCre/loxPシステムにより赤血球増殖因子であるヒトエリスロポイエチン(hEPO)遺伝子を導入した14HACベクターを保持するCHO雑種細胞では、従来の21HACベクターと比べて2.5倍のhEPOの発現向上を確認した。更にこのhEPO遺伝子を導入した14HACベクターを保持するヒト正常初代培養繊維芽細胞において、従来の21HACベクターの11.7倍の顕著なhEPO発現向上を確認した(図21)。
更にまた、上記の作用効果が何に起因するかを調べることを目的として、テロメア配列とヒト14番染色体由来のサブテロメア配列の一部を持つHACベクターの発現効率を比較した結果、該HACベクターは、テロメア配列のみを長腕削除末端に持つ場合と比べて、ヒト正常繊維芽細胞において約4倍のhEPO発現向上を実現した。両者は、その構造において長腕削除末端のサブテロメア配列の他は基本骨格の染色体、外来遺伝子(hEPO)導入位置は同じであることから、上記の顕著な発現上昇は、サブテロメア配列を、削除された長腕末端に持つようにヒト14番染色体を改変したことによりもたらされたと考えられた。
ヒト人工染色体ベクターにおけるサブテロメア配列の存在は、外来遺伝子又は外来DNAの発現上昇のみならず、形質導入された細胞内での該ベクターの安定的な保持、子孫伝達率の向上などにも正の影響を及ぼすことが判った。このような作用効果は、ヒト14番人工染色体ベクターだけでなくヒト21番染色体から同様に作製したヒト人工染色体(HAC)ベクターでも観察されたことから、上記の作用効果は、ヒト14番及び21番染色体以外の任意のヒト染色体から同様に作製されたHACベクターであっても、ヒト14番及び21番染色体由来のHACベクターと同様の作用効果を奏することを意味する。
これらの知見から、ヒト染色体に基づいて構築したHACベクターにより上記目的(又は課題)を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
さらに、本発明者は上記課題を解決するために、ヒト正常細胞又はヒト細胞株において導入遺伝子を高発現し安定に保持される染色体ベクターを構築することを課題として鋭意研究を行った。外来遺伝子を導入する際、遺伝子発現ユニットが複数並列すると互いに干渉して転写方向下流に位置するユニットの発現が減弱することが知られている(Proudfoot NJら、Nature、第332巻、p.562−565、1986年、Kadesch Tら、Mol Cell Biol、第6巻、p.2593−2601、1986年)。上記のhEPO導入21HACベクター(WO2994/031385号)はhEPO遺伝子発現ユニットの下流に隣接してneo耐性遺伝子発現ユニットが存在する。そこでhEPO遺伝子発現を向上させる方法として、HACベクター上からhEPO遺伝子発現ユニットの下流に隣接するneo耐性遺伝子発現ユニットを除去することが考えられる。すなわち、ヒト染色体の長腕から既知の遺伝子の殆どを削除した改変染色体を得、この改変染色体上の長腕近位にloxP配列及びFRT配列とhCMVプロモーターを部位特異的に挿入し、この改変染色体を保持するCHO雑種細胞においてCre/loxPシステムによりhEPO遺伝子を外来遺伝子として改変染色体に導入し、FLPe/FRTシステムによりneo耐性遺伝子発現ユニットを除去し、更にこのhEPO導入改変染色体保持するヒト正常初代培養繊維芽細胞に移入したところ、例えば本発明の14HACベクターの場合、従来の21HACベクターと比べて平均18.5倍のhEPO発現向上を確認した(図21)。これらの知見から、本発明者らは、耐性遺伝子発現ユニットを削除したHACベクターにより上記目的(又は課題)を達成することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の概要は以下の通りである。
本発明は、その第1の態様において、長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、ヒト染色体由来のセントロメアと、前記の削除された長腕及び/又は短腕の遠位末端部位に付加又は結合されたテロメア配列及び/又はサブテロメア配列(好ましくはヒト染色体由来のサブテロメア配列)とを含むヒト染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体ベクターを提供する。
本発明は、一実施形態において、長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、(i)ヒト14番染色体由来のセントロメア、(ii)テロメア配列、並びに(iii)サブテロメア配列を含むヒト14番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体(HAC)ベクターを提供する。
本発明はまた、別の実施形態において、長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、(i)ヒト21番染色体由来のセントロメア、(ii)テロメア配列、並びに(iii)サブテロメア配列を含むヒト21番染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体(HAC)ベクターを提供する。
本明細書の全体を通して、本発明に係るHACベクターは、天然に存在するヒト染色体断片又は自然発生したヒト染色体断片を含むものではないが、それが上記特徴を有しかつ人為的に単離された場合には本発明に包含されるものとする。
また別の実施形態において、上記HACベクターは、(iv)特定の部位に挿入された外来DNA(又は外来遺伝子若しくは外来核酸)を含むものであってもよい。
本発明の別の実施形態において、前記ヒト染色体断片のサイズは、通常約1Mb以上、例えば約1Mb以上であって約19Mb以下であり、好ましくは約18Mb以下であり、さらに好ましくは約17Mb以下である。しかし、このサイズは、上記の範囲に特に限定されないものとし、ヒト染色体の種類、ヒト染色体から長腕遠位又は短腕遠位を削除した後に染色体断片に残る長腕近位の長さ、或いは短腕近位又は短腕の長さ、などによって影響される。
本発明の実施形態によれば、ヒト染色体断片は、ヒト染色体の長腕遠位が削除されておりかつ長腕近位及び短腕を含むか、或いはヒト染色体の短腕遠位が削除されておりかつ短腕近位を含むか、或いはヒト染色体の長腕遠位及び短腕遠位がともに削除されておりかつ長腕近位及び短腕近位を含むことができる。
また、ヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位は、標的とする切断領域の塩基配列、例えば米国National Center for Biotechnology information(NCBI)のオンラインゲノムデータベース Human Genome Resources,(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/)の塩基配列を基にして標的配列(ターゲティングベクター)を設計し、それを用いて切断・削除することができる。
本発明の別の実施形態によれば、ヒト染色体断片の長腕遠位は、ヒト染色体長腕のq11領域内又はq11領域からq12領域内で削除される。
本発明のさらに別の実施形態によれば、ヒト染色体断片の短腕遠位は、ヒト染色体短腕のp11領域内又はp11領域からp12領域内で削除される。
例えば、前記ヒト14番染色体の長腕遠位は、例えば14q領域内、好ましくは14q11領域内において削除され、より好ましくはAL391156において又はAL391156よりも近位の位置において、具体的にはAL391156〜CR383659の間で削除され、さらに好ましくはAL512310〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL929601〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL589182〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL589743〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL929602〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL512624〜CR383659の間で、さらに好ましくはCR383657〜CR383659の間で、さらに好ましくはCR383659において削除される。
また、前記ヒト14番染色体の短腕遠位は、例えば14p領域内において削除され、好ましくは14p11領域から14p12領域内において削除され、さらに好ましくは14p11.1領域から14p11.2領域内において削除され、さらに好ましくは14p11.1領域内において削除され、さらに好ましくはRNR2、PABPCP2からなる群より選択されるいずれか1の位置において削除される。
また、別の例として、ヒト21番染色体の長腕遠位は、例えば21q領域内、好ましくは21q11領域内、より好ましくは21q11.1領域から21q11.2領域内において削除される。削除位置は、例えば、21q11.1のNT_011512よりも近位、好ましくはNT_011512含有領域内のうちAL16202よりも近位、より好ましくはAL16202含有領域内のAP001657又はAP001657よりも近位である。
また、前記ヒト21番染色体の短腕遠位は、例えば21p領域内において削除され、好ましくは21p11.1領域から21p11.2領域内において削除され、さらに好ましくは21p11.1領域内において削除され、さらに好ましくはAL163201の位置において削除される。
また、一実施形態において、テロメア配列はTTAGGGなどの繰り返し配列を持つ塩基配列である。この配列は人工的に合成された配列及びヒトを含む哺乳動物の染色体長腕又は短腕由来のものなどが挙げられるが、特に限定されない。テロメア配列は、好ましくはヒト染色体由来のテロメア配列であり、より好ましくはサブテロメア配列と同じ染色体に由来するものである。
本発明の一実施形態において、前記テロメア配列の長さは、約0.4〜50kbであり、好ましくは約0.4〜25kbであり、さらに好ましくは約0.4〜15kbである。
一実施形態において、サブテロメア配列は、ヒト染色体の長腕又は短腕由来のサブテロメア配列であり、任意のヒト染色体由来の、例えばヒト14番染色体又はヒト21番染色体由来のサブテロメア配列である。具体的な実施形態において、上記ヒト染色体断片は、ヒト染色体から長腕遠位が削除された部位に、該ヒト染色体と同じ又は異なる、好ましくは同じ、ヒト染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。
さらなる本発明の別の実施形態において、前記サブテロメア配列の長さは、約1〜500kbであり、好ましくは約1〜300kbであり、さらに好ましくは約1〜100kbであり、さらに好ましくは約5〜60kbであり、さらに好ましくは5〜40kb、さらに好ましくは約25〜60kbでありさらに好ましくは約25〜40kbである。
好ましい実施形態において、ヒト14番又は21番染色体断片は、上記のように削除された長腕遠位の部位にそれぞれヒト14番又は21番染色体の長腕由来のテロメア配列及びサブテロメア配列を含む。
一実施形態において、ヒト14番染色体由来のサブテロメア配列及びテロメア配列は、ヒト14番染色体の14q32領域内の部位から14q−tel領域までの配列である。好ましくは、ヒト14番染色体の14q32.33領域から14q−tel領域までの配列であり、さらに好ましくはヒト14番染色体のAB019439、AB019438、AB019437のいずれかのマーカーから14q−tel領域までの配列であり、特に好ましくは、ヒト14番染色体のAB019437から14q−tel領域までの配列である。
また、別の実施形態において、ヒト21番染色体由来のサブテロメア配列及びテロメア配列は、ヒト21番染色体の21q22.3領域から21q−tel領域内のテロメア末端までの配列及びテロメア配列である。サブテロメア配列は、好ましくは、ヒト21番染色体の21q−tel領域内の任意の部位からテロメア末端までの配列であり、さらに好ましくは21q−tel領域内のNT_011515からテロメア末端までの配列である。
さらなる実施形態において、本発明に係るヒト人工染色体ベクターは、前記ヒト染色体断片が少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位をさらに含むことができる。例えば、ヒト染色体断片の長腕近位及び/又は短腕近位に部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入される。
好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト染色体の長腕又は短腕の削除部位(又は削除位置)よりもセントロメア側(すなわち、「近位」)に挿入される。
例えばヒト14番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、14q領域内において、好ましくはヒト14番染色体の長腕近位の14q11領域内における前記削除位置より近位において、さらに好ましくはAL391156〜CR383659の間、さらに好ましくはAL512310〜CR383659の間、さらに好ましくはAL929601〜CR383659の間、さらに好ましくはAL589182〜CR383659の間、さらに好ましくはAL589743〜CR383659の間、さらに好ましくはAL929602〜CR383659の間、さらに好ましくはAL512624〜CR383659の間、さらに好ましくはCR383657〜CR383659の間、さらに好ましくはCR383659における前記削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト14番染色体の短腕に、例えば14p領域内において、さらに好ましくはヒト14番染色体の短腕近位の14p11領域から14p12領域内において、さらに好ましくはヒト14番染色体の短腕近位の14p11領域内における前記削除位置より近位に挿入される。
さらに、例えばヒト21番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、21q領域内において、好ましくはヒト21番染色体の長腕近位の21q11.1領域から21q11.2領域内における削除位置より近位において、例えば、21q11.1のNT_011512領域における、好ましくはNT_011512含有領域内のうちAL16202領域における、より好ましくはAL16202含有領域内のAP001657の削除位置か或いはAP001657における削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト21番染色体の短腕に、例えば21p領域内において、好ましくは21p11.1領域から21p11.2領域内において、さらに好ましくはヒト21番染色体の短腕近位の21p11.1領域内において、さらに好ましくはAL163201の位置における前記削除位置より近位に挿入される。
好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である。別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である。
本発明の別の実施形態において、本発明に係るヒト人工染色体ベクターは、少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を含むヒト染色体断片を含むものであり、例えば、前記ヒト染色体の長腕近位及び/又は短腕近位に少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されている。これにより1種類の部位特異的組換え酵素/認識部位を外来遺伝子の導入に使用し、別の種類の部位特異的組換え酵素/認識部位を不要になった薬剤耐性遺伝子発現ユニットの除去などに使用することが可能となる。
この場合における部位特異的組換え酵素の複数の認識部位は、上記と同様に、ヒト染色体の長腕又は短腕の削除部位よりもセントロメア側(近位)に挿入される。
例えばヒト14番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、上記と同様であり、すなわち、14q領域内において、好ましくはヒト14番染色体の長腕近位の14q11領域内における前記削除位置より近位において、さらに好ましくはAL391156〜CR383659の間、さらに好ましくはAL512310〜CR383659の間、さらに好ましくはAL929601〜CR383659の間、さらに好ましくはAL589182〜CR383659の間、さらに好ましくはAL589743〜CR383659の間、さらに好ましくはAL929602〜CR383659の間、さらに好ましくはAL512624〜CR383659の間、さらに好ましくはCR383657〜CR383659の間、さらに好ましくはCR383659における前記削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト14番染色体の短腕に、例えば14p領域内において、さらに好ましくはヒト14番染色体の短腕近位の14p11領域から14p12領域内において、さらに好ましくはヒト14番染色体の短腕近位の14p11領域内における前記削除位置より近位に挿入される。
さらに、例えばヒト21番染色体の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、21q領域内において、好ましくはヒト21番染色体の長腕近位の21q11.1領域から21q11.2領域内における削除位置より近位において、例えば、21q11.1のNT_011512領域における、好ましくはNT_011512含有領域内のうちAL16202領域における、より好ましくはAL16202含有領域内のAP001657の削除位置か或いはAP001657における削除位置より近位に挿入される。また別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト21番染色体の短腕に、例えば21p領域内において、好ましくは21p11.1領域から21p11.2領域内において、さらに好ましくはヒト21番染色体の短腕近位の21p11.1領域内において、さらに好ましくはAL163201の位置における前記削除位置より近位に挿入される。
また好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がCre酵素及び/又はFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列及び/又はFRT配列である。
また第2の態様において、本発明は、上記ヒト人工染色体(HAC)ベクターを保持する細胞を提供する。かかる細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞(例えば胚性及び体性幹細胞、体細胞、正常体細胞、上皮細胞、神経細胞、線維芽細胞、良性又は悪性腫瘍細胞、内皮細胞、真皮細胞、基底細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、間質細胞、骨髄細胞、血球細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、毛細胞、肝臓細胞、すい臓細胞、腎臓細胞、羊膜細胞、視覚細胞、聴覚細胞、嗅覚細胞)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、3T3細胞、BHK細胞、293細胞、A9細胞などを用いることができる。
また、本発明は、その第3の態様において、以下のステップを含むヒト人工染色体(HAC)ベクターの作製方法を提供する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;並びに
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ。
テロメア配列とサブテロメア配列を1つの配列として作製したときには、ステップ(c)及びステップ(d)を1つのステップとして上記配列を、上記削除された長腕及び/又は短腕の部位に付加することができる。
本発明の一実施形態において、ステップ(a)においては、前記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞として相同組換え効率の高いものを用いる。好ましい実施形態においては、相同組換え効率の高い細胞はニワトリDT40細胞由来のものである。
また本発明の一実施形態において、ステップ(b)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除は、部位特異的組換え酵素を用いて行うことができる。例えば、部位特異的組換え酵素を用いて、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を、テロメア配列及び/又はサブテロメア配列との置換により削除することができる。
好ましい実施形態においては、ヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の長腕遠位を14q領域、好ましくは14q11領域から14q12領域において削除し、短腕遠位を14p12領域内において削除する。またさらに好ましい実施形態においては、ヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の長腕遠位をAL391156において又はAL391156よりも近位の位置において、具体的にはAL391156〜CR383659の間において、さらに好ましくはAL512310〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL929601〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL589182〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL589743〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL929602〜CR383659の間で、さらに好ましくはAL512624〜CR383659の間で、さらに好ましくはCR383657〜CR383659の間で、さらに好ましくはCR383659〜CR383659の間において削除する。別の実施形態において、ヒト14番染色体の短腕遠位を例えば14p領域内において削除し、好ましくは14p11領域から14p12領域内において削除し、さらに好ましくは14p11.1領域から14p11.2領域内において削除し、さらに好ましくは14p11.1領域内において削除し、さらに好ましくはRNR2、PABPCP2からなる群より選択されるいずれか1の位置において削除する。
別の実施形態において、ヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の長腕遠位を21q領域、好ましくは21q11.1領域から21q11.2領域内において削除し、短腕遠位を21p11.1領域から21q11.2領域内において削除する。ヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の長腕遠位を、例えば、21q11.1のNT_011512を含む領域内、好ましくはNT_011512含有領域内のうちAL16202を含む領域内、より好ましくはAL16202含有領域内のAP001657において或いはAP001657より近位において削除する。また、前記ヒト21番染色体の短腕遠位を、例えば21p領域内において、好ましくは21p11.1領域から21p11.2領域内において、さらに好ましくは21p11.1領域内において、さらに好ましくはAL163201の位置において削除する。
また更に本発明の一実施形態において、ステップ(b)及び(c)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除をテロメア配列との置換により削除して、ヒト染色体断片にテロメア配列を付加することができる。別の実施形態において、ステップ(b)及び(c)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除をテロメア配列及びヒト染色体由来のサブテロメア配列との置換により削除して、ヒト染色体断片にテロメア配列及びサブテロメア配列を付加することができる。上記ヒト染色体由来のサブテロメア配列は、ヒト染色体、限定するものではないが、例えばヒト14番染色体及びヒト21番染色体由来のものであることが好ましい。
好ましい実施形態において、ステップ(b)及び(c)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位における少なくとも2箇所を切断することにより、該長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加することができる。
別の好ましい実施形態において、ステップ(b)〜(d)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位における少なくとも2箇所を切断することにより、該長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び/又は短腕の部位に該ヒト染色体又はヒト染色体断片由来のテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する。
また、好ましい実施形態においては、テロメア配列及びサブテロメア配列は、ヒト14番染色体の14q32領域内の部位から14q−tel領域までの配列である。さらに好ましくは、ヒト14番染色体の14q32.33領域から14q−tel領域までの配列である。
また、別の好ましい実施形態において、ヒト21番染色体由来のサブテロメア配列及びテロメア配列は、ヒト21番染色体の21q22.3領域から21q−tel領域内のテロメア末端までの配列及びテロメア配列である。サブテロメア配列は、好ましくは、ヒト21番染色体の21q−tel領域内の任意の部位からテロメア末端までの配列であり、さらに好ましくは21q−tel領域内のNT_011515からテロメア末端までの配列である。
具体的な実施形態において、部位特異的組換えシステム、例えばCre−loxPシステム又はFLPe−FRTシステムの利用により基本骨格となる出発材料であるヒト染色体由来の天然テロメア配列及び/又はサブテロメア配列を残すように、長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除を行う。例えば、ステップ(b)〜(d)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕q11領域内又はq11−q12領域内において長腕遠位を削除して、削除された長腕に該ヒト染色体又はヒト染色体断片のテロメア配列及びサブテロメア配列、例えばヒト14番染色体の場合、例えば14q32領域内の部位から14q−tel領域までのテロメア配列及びサブテロメア配列、またヒト21番染色体の場合、例えば21q22.3領域内の部位から21q−tel領域までのテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する。
前記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位の削除は、例えば、長腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら2つの認識部位間を欠失して行う。
好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の長腕遠位の14q32領域より遠位にかつ長腕近位の14q11領域より近位に、更に好ましくはの長腕遠位のAB019437より遠位にかつ長腕近位のAL391156より近位に挿入される。また、別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の長腕遠位の21q22領域より遠位にかつ長腕近位の21q11領域より近位に、更に好ましくは長腕遠位の21q22.3より遠位に、例えばNT_011515の位置に、かつ、長腕近位の21q11.2より近位に、例えばNT_011512より遠位に、好ましくはAL16202より遠位に、例えばNT_011515の位置に、より好ましくはAP001657の位置に又はAP001657より遠位に、それぞれ挿入される。
別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である。さらに好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である。
さらにまた、前記ヒト染色体又はヒト染色体断片の短腕遠位の削除は、例えば、短腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら2つの認識部位間を欠失して行う。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト染色体又はヒト染色体断片の短腕遠位の例えば短腕p領域内より遠位に、好ましくはp11領域内またはp11領域からp12領域内より遠位に、さらに好ましくはp11領域内より遠位に、かつ、短腕近位のp11領域内またはp11領域からp12領域内より近位に挿入される。
例えば、ヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、短腕遠位の例えば14p領域内より遠位に、好ましくは14p11領域から14p12領域内より遠位に、さらに好ましくは14p11領域内より遠位に、かつ、短腕近位の14p11領域から14p12領域内より近位に、好ましくは14p11領域内より近位に、さらに好ましくは14p11.1領域から14p11.2領域内より近位に、さらに好ましくは14p11.1領域内より近位に、さらに好ましくはRNR2、PABPCP2からなる群より選択されるいずれか1の位置より近位に挿入される。またヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の場合、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト21番染色体の短腕の例えば21p領域内より遠位に、好ましくは21p11.1領域から21p11.2領域内より遠位に、さらに好ましくは21p11領域内より遠位に、かつ、短腕近位の21p11領域から21p12領域内より近位に、好ましくは21p11領域内より近位に、さらに好ましくは21p11.1領域から21p11.2領域内より近位に、さらに好ましくは21p11.1領域内より近位に、さらに好ましくはAL163201の位置より近位に挿入される。
また好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である。さらに好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である。
別の実施形態において、本発明に係るHACベクターの作製方法は、(e)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップをさらに含んでもよい。
本発明の一実施形態において、ステップ(e)においては、部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である。別の実施形態において、ステップ(e)においては、部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である。
さらなる実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片のAL391156における前記削除位置又はAL391156より近位の位置に、さらに好ましくはヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の短腕近位の14p12領域内における前記削除位置より近位の位置に挿入することができる。
部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えば14q領域内において、好ましくはヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の長腕近位の14q11領域内における前記削除位置より近位において、さらに好ましくはAL391156、さらに好ましくはAL512310、さらに好ましくはAL929601、さらに好ましくはAL589182、さらに好ましくはAL589743、さらに好ましくはAL929602、さらに好ましくはAL512624、さらに好ましくはCR383657、さらに好ましくはCR383659領域内における前記削除位置より近位において、また例えばヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の短腕近位の14p領域内、さらに好ましくはヒト14番染色体の短腕近位の14p12領域内、さらに好ましくは14p11領域内、における前記削除位置より近位に挿入することができる。
別の実施形態において、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片のAP001657における前記削除位置又はAP001657より近位の位置に、さらに好ましくはヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の短腕近位の21p11−p12領域内における削除位置より近位の位置に挿入することができる。
さらに本発明は、その第4の態様において、上記作製方法により得られる、ヒト人工染色体(HAC)ベクターを提供する。
本発明はさらに、その第5の態様において、以下のステップを含むことを特徴とする、外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法を提供する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ
(e)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;並びに
(f)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ。
また本発明の第6の態様において、以下のステップを含むことを特徴とする外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法を提供する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ;
(d)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(e)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;並びに
(f)ステップ(e)で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ。
好ましい実施形態において、ヒト染色体は、ヒト14番染色体及びヒト21番染色体である。
一実施形態において、少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素とその認識部位は、Cre酵素とloxP配列、及びFLPe酵素とFRET配列である。また一実施形態において、薬剤耐性遺伝子はネオマイシン耐性遺伝子である。
上記の第5及び第6の態様の一実施形態において、外来DNAの挿入位置、すなわち部位特異的組換え酵素の挿入位置は、前述の部位特異的組換え酵素の挿入位置と同じである。例えば、ヒト14番染色体については、長腕近位14q11より近位、さらに好ましくは長腕近位のAL391156(GenBank登録番号)における前記削除位置より近位、又はヒト14番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の14p12領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト21番染色体については、長腕近位の21q11.2より近位、好ましくは21q11.1より近位、より好ましくはAL16202より近位、さらに好ましくは長腕近位のAP001657(GenBank登録番号)の削除位置か又はAP001657における削除位置より近位、或いはヒト21番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の21p11.2領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。
好ましい実施形態において、外来DNAの挿入位置は、前記ヒト染色体断片端のテロメア配列から約1〜500kbであり、好ましくは約1〜300kbであり、さらに好ましくは約1〜100kbであり、さらに好ましくは約5〜60kbであり、さらに好ましくは5〜40kbであり、さらに好ましくは約25〜60kbであり、さらに好ましくは約25〜40kbである。
また第7の態様において、本発明は、上記作製方法により得られる、外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターである。
さらに第8の態様において、本発明は、外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターを保持する細胞を提供する。かかる細胞としては、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞(例えば胚性及び体性幹細胞、体細胞、正常体細胞、上皮細胞、神経細胞、線維芽細胞、良性又は悪性腫瘍細胞、内皮細胞、真皮細胞、基底細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、間質細胞、骨髄細胞、血球細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、毛細胞、肝臓細胞、すい臓細胞、腎臓細胞、羊膜細胞、視覚細胞、聴覚細胞、嗅覚細)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、3T3細胞、BHK細胞、293細胞、A9細胞などを用いることができる。
本発明はさらに、その第9の態様において、上記HACベクター又は外来DNAを含むHACベクターを保持する細胞を含む医薬組成物を提供する。かかる場合、外来DNAは、以下のものに限定されないが、例えばエリスロポイエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TPO)、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子(vWF)、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン2、インターロイキン3、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン9、インターロイキン10、インターロイキン11、インターロイキン12、インターロイキン15、CD40リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α−1アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子(GIF)、腫瘍壊死因子(TNF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンM、Flt3リガンド(Flt3L)、ストローマ由来因子(SDF)、幹細胞増殖因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管形成誘導因子(VEGF)、アンジオポイエチン、神経成長因子(NGF)、骨形成因子(BMP)、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、ウイント(Wnt)、アールスポンジン(Rspondin)、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などをコードする遺伝子を挙げることができる。
また本発明は、その第10の態様において、以下のステップを含む、外来DNAを受容細胞に導入する方法を提供する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(i)融合した受容細胞において外来DNAの導入を確認するステップ。
本発明の一実施形態において、上記受容細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞(ES細胞)、並びに間質系幹細胞及び組織幹/前駆細胞などであってもよい。
さらに本発明は、その第11の態様において、以下のステップを含む、外来DNAを発現する細胞の作製方法を提供する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(i)融合した受容細胞において外来DNAを発現する細胞を選択するステップ。
本発明の一実施形態において、上記受容細胞は、動物細胞、好ましくは哺乳動物細胞である。また、上記受容細胞は、多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞(ES細胞)、並びに間質系幹細胞及び組織幹/前駆細胞などであってもよい。
またさらに本発明は、その第12の態様において、以下のステップを含む、タンパク質の製造方法を提供する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片にタンパク質をコードする外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;
(i)融合した受容細胞を培地中で培養するステップ;並びに
(j)得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
本発明の一実施形態において、上記タンパク質としては、例えば、エリスロポイエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TPO)、血液凝固因子、第八因子、第九因子、フォンヴィルブランド因子(vWF)、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン2、インターロイキン3、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン9、インターロイキン10、インターロイキン11、インターロイキン12、インターロイキン15、CD40リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α−1アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子(GIF)、腫瘍壊死因子(TNF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンM、Flt3リガンド(Flt3L)、ストローマ由来因子(SDF)、幹細胞増殖因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管形成誘導因子(VEGF)、アンジオポイエチン、神経成長因子(NGF)、骨形成因子(BMP)、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、ウイント(Wnt)、アールスポンジン(Rspondin)、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などが挙げられる。
本発明に関わる用語の定義は以下の通りである。
本明細書中、「ヒト人工染色体ベクター」又は「HACベクター」とは、ヒト染色体に基づいて作製された人工染色体を指す。
また本明細書中、「ヒト染色体」とは、ヒト細胞由来の天然のDNAとタンパク質との複合体を指す。正常なヒト染色体は23種(雄は24種)(すなわち、常染色体である1番染色体から22番染色体、並びに、性染色体であるX染色体及びY染色体)46本存在し、それぞれ約50〜300Mbの長さのDNAを含むことが知られている。また「ヒト染色体断片」とは、独立染色体として安定に複製及び分配が可能な染色体の部分断片を指し、断片の大きさは通常1Mb以上だが、それ以下の場合もある。
本明細書中、染色体に関して「長腕」及び「短腕」とは、染色体上のセントロメア両側の腕(アーム)を指し、その長さに応じて長腕(q)及び短腕(p)と称される。またヒト染色体に関して「長腕遠位」及び「長腕近位」とは、長腕上のセントロメアから遠い位置(すなわちテロメア側)にある領域(遠位)及びセントロメアに近接する領域(近位)を意味する。具体的には、ヒト14番染色体の場合には長腕遠位はAL359218よりもテロメア側、長腕近位はAL391156よりもセントロメア側であり、ヒト21番染色体の場合には長腕遠位は21q22.2よりもテロメア側であり、長腕近位は21q11.2である。さらに「短腕遠位」及び「短腕近位」とは、短腕上のセントロメアから遠い位置にある領域(遠位)及びセントロメアに近接する領域(近位)を意味する。例えば、ヒト14番染色体の場合にはリボソーマルRNA領域において境界がある。
本明細書中、「部位特異的組換え酵素」及び「部位特異的組換え酵素の認識部位」とは、ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でDNAの組換えを起こす現象に関して用いられる用語であり、それぞれその部位特異的に組換えを起こす酵素及び該酵素により認識される部位を指す。
本明細書中、「テロメア配列」とは、TTAGGGの繰返し配列(TTAGGG)nを持つ配列を指す。テロメア配列の長さは、約0.4〜50kbであり、好ましくは約0.4〜25kbであり、さらに好ましくは約0.4〜15kbである。該テロメア配列は化学的に合成された又は人工的に生成されたものでも、染色体に由来するものでもよい。
本明細書中、「サブテロメア配列」とは、真核細胞中の染色体末端のテロメア(TTAGGG)nの繰返し配列のセントロメア側に隣接して位置し、分節・重複ドメインや(TTAGGG)n様の繰返し配列を持つ、約300〜500kbにわたる染色体領域を指す。サブテロメア配列は、任意の染色体に由来するサブテロメア配列の全体若しくは一部でもよいし、又は任意の染色体に由来する複数のサブテロメア配列が結合されたものでもよいし、又は任意の染色体に由来するサブテロメア配列に他の配列が付加されたものでもよい。本発明においては、例えば部位特異的組換えを利用したテロメアトランケーションや転座によるテロメア配列又はサブテロメア配列の付加を行いうる。
本明細書中、「外来DNA」とは、対象とする細胞にとって外部から導入されるDNAを指し、物質生産、疾患治療及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列(例えばプロモーター配列)などをコードするDNAを意味し、同種又は異種のいずれでもよい。
本明細書中、「細胞」とは、生物個体・組織に由来する細胞を指す。例えば、体細胞、正常体細胞、生殖細胞、体性幹細胞、腫瘍細胞、不死化細胞株、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、精子由来幹細胞(GS細胞)等を意味し、同種又は異種のいずれでもよく、ヒト由来の上記細胞(ヒト細胞)でもよい。
本明細書中、「供与細胞」及び「受容細胞」とは、ヒト人工染色体ベクターを移入又は導入する場合に、最初に該ベクターを保持する細胞(供与細胞)と、供与細胞から該ベクターが移入される細胞(受容細胞)を指す。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2006−188392号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
図2は、テロメアトランケーション用ベクターpTELpuro−t1の構造を示す。図中、telはテロメア側を、cenはセントロメア側を示す。またpuroはピューロマイシン遺伝子を示し、Tel配列はテロメア配列を示し、その配列中の黒矢印は反復配列を示す。
図3は、ヒト染色体14qへのpTELpuro−t1ベクター導入についてのPCR解析の結果を示す。
図4は、ヒト染色体14qへのpTELpuro−t1ベクター導入により生じるアレルを示す。
図5は、ヒト染色体14qへのpTELpuro−t1ベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図6は、ヒト染色体14qへのpTELpuro−t1ベクター導入DT40雑種細胞のFISH解析の結果を示す。(A)ヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞。(B)長腕削除されたヒト14番染色体断片を保持するDT40雑種細胞。
図7は、loxP及び3’neo配列挿入用t1pSF1ベクターの構造を示す。図中、Oriは複製開始点、Aprはアンピシリン耐性遺伝子、Sv40pAはSV40ポリAをそれぞれ示す。
図8は、14AΔqHACへのt1pSF1ベクター導入についてのPCR解析の結果を示す。
図9は、14AΔqHACへのt1pSF1ベクター導入により生じるアレルを示す。
図10は、14AΔqHACへのt1pSF1ベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図11は、14AΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図12は、14AΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図12AはFISH像を示し、図12Bは14AΔqHACベクターの核型を示す。
図13は、14ΔqHACベクター(14AΔqHAC、14NΔqHAC(G)、14gNΔqHAC(g))、及び21ΔqHACベクターのCHO雑種細胞における非選択条件下での長期安定性解析の結果を示す。
図14は、hEPO遺伝子導入により生じる14HACベクターのアレルを示す。図中、hEPOはヒトエリスロポエチン遺伝子、CMVはサイトメガロウイルスプロモーターを示す。
図15は、hEPO遺伝子導入14AΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図16は、hEPO−14AΔqHACベクター保持CHO雑種細胞でのhEPO遺伝子発現を示す。
図17は、hEPO−14AΔqHACベクター保持CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図17AはFISH像を示し、図17BはhEPO−14AΔqHACベクターの核型を示す。
図18は、hEPO−14AΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期発現・安定性解析の結果を示す。
図19は、hEPO−14A/N/gNΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞のサザン解析の結果を示す。(A)hEPO−14AΔqHAC;(B)hEPO−14NΔqHAC;(C)hEPO−14gNΔqHAC。
図20は、hEPO−14AΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞:FISH解析の結果を示す。図20AはFISH像を示し、図20BはhEPO−14AΔqHACベクターの核型を示す。
図21は、hEPO−14A/N/gNΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞HFL−1でのhEPO遺伝子発現を示す。
図22は、ヒト14番染色体長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターploxpPGK−14qtelの構造を示す。
図23は、ヒト染色体14qへのploxpPGK−14qtelベクター導入により生じるアレルを示す。
図24は、ヒト染色体14qへのploxpPGK−14qtelベクター導入についてのPCR解析の結果を示す。
図25は、ヒト染色体14qへのploxpPGK−14qtelベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図26は、ヒト14番染色体長腕近位セントロメア側loxP配列挿入用ベクターploxPHYGOR/n1の構造を示す。
図27は、ヒト染色体14qへのploxPHYGOR/n1ベクター導入により生じるアレルを示す。
図28は、ヒト染色体14qへのploxPHYGOR/n1ベクター導入についてのPCR解析の結果を示す。
図29は、ヒト染色体14qへのploxPHYGOR/n1及びploxpPGK−14qtelベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図30は、Cre−loxP部位特異的組換え反応によるヒト染色体14q遠位削除で生じる染色体アレル(図30A:G/n1;図30B:g/n1)を示す。
図31は、14NΔqHAC保持DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図32は、14NΔqHAC保持DT40雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図32AはG94n56細胞、図32BはG94n56Δp25細胞におけるFISH像を示す。
図33は、loxP及び3’neo配列挿入用pSF1(G+n1)ベクターの構造を示す。
図34は、14NΔqHACへのpSF1(G+n1)又はGnpSF1−FRTベクター導入(A)、及び14gNΔqHACへのpSF1(g+n1)又はgnpSF1−FRTベクター導入(B)により生じるアレルを示す。
図35は、14NΔqHACへのpSF1(G+n1)ベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図36は、14NΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図37は、14NΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図37AはFISH像を示し、図37Bは14NΔqHACベクターの核型を示す。
図38は、hEPO遺伝子導入14NΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図39は、hEPO−14AΔqHACベクター保持CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図39AはFISH像を示し、図39BはhEPO−14AΔqHACベクターの核型を示す。
図40は、hEPO−14NΔqHACベクター保持CHO雑種細胞でのhEPO遺伝子発現を示す。
図41は、hEPO−14NΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期発現・安定性解析の結果を示す。
図42は、hEPO−14NΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞のFISH解析の結果を示す。図42AはFISH像を示し、図42BはhEPO−14NΔqHACベクターの核型を示す。
図43は、hEPO−14ΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞での長期hEPO遺伝子発現を示す。
図44は、ヒト14番染色体長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターploxpPGK−14qtel−2の構造を示す。
図45は、ヒト染色体14qへのploxpPGK−14qtel−2ベクター導入により生じるアレルを示す。
図46は、ヒト染色体14qへのploxpPGK−14qtel−2ベクター導入についてのPCR解析の結果を示す。
図47は、ヒト染色体14qへのploxpPGK−14qtel−2ベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図48は、ヒト染色体14qへのploxPHYGOR/n1及びploxpPGK−14qtel−2ベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図49は、14gNΔqHAC保持DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図50は、14gNΔqHAC保持DT40雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図50AはFISH像を示し、図50Bは14gNΔqHACベクターの核型を示す。
図51は、loxP及び3’neo配列挿入用pSF1(g+n1)ベクターの構造を示す。
図52は、14gNΔqHACへのpSF1(g+n1)ベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図53は、14gNΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図54は、14gNΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図54AはFISH像を示し、図54Bは14gNΔqHACベクターの核型を示す。
図55は、hEPO遺伝子導入14gNΔqHACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図56は、hEPO−14gNΔqHACベクター保持CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図56AはFISH像を示し、図56BはhEPO−14gNΔqHACベクターの核型を示す。
図57は、hEPO−14gNΔqHACベクター保持CHO雑種細胞でのhEPO遺伝子発現を示す。
図58は、hEPO−14gNΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期発現・安定性解析の結果を示す。
図59は、hEPO−14gNΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞のFISH解析の結果を示す。図59AはFISH像を示し、図59BはhEPO−14gNΔqHACベクターの核型を示す。
図60は、FLP−FRTによるneo耐性遺伝子ユニットの除去の概要を示す。
図61は、14AΔqHACへのt1pSF1−FRTベクター導入により生じるアレルを示す。
図62は、14AΔqHACへのt1pSF1−FRTベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図63は、14AΔqF−HACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図64は、14AΔqF−HACベクター移入CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。
図65は、hEPO遺伝子導入により生じる14AΔqF−HACベクターのアレルを示す。
図66は、hEPO遺伝子導入14AΔqF−HACベクター移入CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図67は、hEPO−14AΔqF−HACベクター保持CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図67AはFISH像を示し、図67BはhEPO−14AΔqF−HACベクターの核型を示す。
図68は、neo耐性遺伝子ユニットの除去により生じる14AΔqF−HACベクター上のアレルを示す。
図69は、hEPO−14AΔqΔneo−HACベクター保持CHO雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図70は、hEPO−14AΔqΔneo−HACベクター保持CHO雑種細胞のFISH解析の結果を示す。図70AはFISH像を示し、図70BはhEPO−14AΔqΔneo−HACベクターの核型を示す
図71は、hEPO−14AΔqΔneo−HACベクター保持ヒト正常繊維芽細胞のサザン解析の結果を示す。
図72A及びBは、hEPO−14AΔqΔneo−HACベクター保持ヒト正常繊維芽細胞のFISH解析の結果を示す。
図73は、FRT配列導入用ベクターGnpSF1−FRTの構造を示す。
図74は、14NΔqHACへのGnpSF1−FRTベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図75は、FRT配列導入用ベクターgnpSF1−FRTの構造を示す。
図76は、14gNΔqHACへのgnpSF1−FRTベクター導入DT40雑種細胞のサザン解析の結果を示す。
図77は、21HACベクターの構築を示す。上側の図は、テロメアトランケーションによる21AΔqHACの作製手順を示し、また下図は、Cre−loxPによる欠失を利用した21NΔqHACの作製手順を示す。
図78は、ヒト21番染色体上の長腕AP001657においてloxP配列を挿入する方法の概略を示す。
図79は、ヒト21番染色体上の長腕AP001657において部位特異的切断を行う方法の概略を示す。
図80は、loxP及び3’neo及びFRT配列挿入用pSF1(FRT)−Cベクターを示す。
図81は、21AΔqHACへのpSF1(FRT)−Cベクター導入により生じるアレルを示す。図中、5’HPRTは5’ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼを示し、Hygはハイグロマイシン遺伝子を示し、Tkはチミジンキナーゼ遺伝子を示す。FRTはFLPリコンビナーゼターゲットを示し、BSはブラストサイジン耐性遺伝子を示し、Aprはアンピシリン耐性遺伝子を示す。
図82は、FLP−FRTによるneo耐性遺伝子ユニットの除去を示す。
図83は、ヒト21番染色体上の長腕NT_011515においてloxP配列を挿入する方法の概略を示す。
図84は、Creベクター導入により生じる長腕が削除されたヒト21番染色体上のアレルを示す。
図85は、loxP及び3’neo及びFRT配列挿入用pSF1(FRT)−Dベクターを示す。
図86は、21NΔqHACへのpSF1(FRT)−Dベクター導入により生じるアレルを示す。
図87は、EPOのインビボ薬効の経時変化を示すグラフである。図87Aは赤血球(RBC)数を示し、図87Bはヘモグロビン(HGB)数を示し、図87Cはヘマトクリット(HCT)値を示す。また、図中、菱形はCMV(サイトメガロウイルスプロモーター支配下にhEPO遺伝子を導入した14AΔqHACベクターを保持するCHO細胞クローンt7S38−8E5)の平均(N=3;28週N=2;32週以降N=1)、四角はコントロール(sham operation)の平均(N=3;20週、28週及び44週N=2)をそれぞれ示す。
図88は、EGFP−14HACベクターのPCR解析結果の概略を示す。図88Aはヒト14番染色体ベクターにEGFP(高感度緑色蛍光タンパク質;enhanced green fluorescent protein)遺伝子を導入して得られたEGFP−14HACベクターの構造を示す。図88Bは、14AΔq−HACベクター及びの14NΔq−HACベクターのセントロメア側及びテロメア側におけるヒトマーカーの有無を示す。
図89は、pLN1IRESEGFPをCHO雑種細胞株に導入(+)したとき、又は非導入(−)のときの、サザンブロット解析による断片サイズとベクター上の位置との関係を示す。
図90は、EGFP−14AΔq−HACベクター又はEGFP−14NΔq−HACベクターを保持する種々のESクローンから作製されたキメラマウスにおける、HACの保持をPCRで判定した結果を示す。
本発明は、ヒト人工染色体ベクター(以下、「本HACベクター」ともいう)に関するものであり、該HACベクターは、ヒト染色体に基づいて作製され、長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除され、かつテロメア配列及びサブテロメア配列を含む、特にサブテロメア配列を含む、ヒト染色体断片を含むことを特徴とするものである。
本発明において、ヒト染色体の種類は、特に限定されないものとし、ヒト1番染色体から22番染色体、X染色体及びY染色体からなる群から選択される。また、本発明において、ヒト染色体中の多型等の変異は許容の範囲内である。後述の実施例では、ヒト14番染色体及びヒト21番染色体を例示し、これらのヒト染色体又はヒト染色体断片からのヒト人工染色体ベクターの作製を示すが、そこに記載される方法、手段等は、その他のヒト染色体にも同様に適用して本発明のヒト人工染色体ベクターを作製することを可能にする。
以下に、本HACベクターの作製、ベクターへの外来DNAの挿入、及び本HACベクターの用途について記載する。
1.ヒト人工染色体(HAC)ベクターの作製
本HACベクターは、上述したようにヒト染色体に基づいて作製する。本HACベクターの作製には、以下の(a)〜(c)のステップが含まれる:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;並びに
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ。
また、本HACベクターの作製は、以下のステップ(e):
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップを含んでもよい。
ここで、上記ステップ(b)と(c)と(d)の順序、及び上記ステップ(b)、(c)、(d)及び(e)の順序は特に限定されない。
ステップ(a):ヒト染色体を保持する細胞の作製
本HACベクターの作製においては、ヒト染色体(例えばヒト14番染色体及びヒト21番染色体を含むすべてのヒト常染色体)又はその断片を保持する細胞を用意する。そのような細胞としては、ヒト染色体又はその断片のみを保持し、かつその後の操作のために相同組換え率の高いものが好ましい。従って本発明においてはまずこれらの条件を満たすような細胞を作製する。
ヒト染色体を保持する細胞は、例えば、ヒト単一染色体を保持する公知のマウスA9雑種細胞ライブラリーからヒト染色体を保持するクローンを選択し、その染色体を相同組換え率の高い細胞に移入することにより作製することができる。マウスA9雑種細胞ライブラリーは、薬剤耐性遺伝子で標識されたヒト単一染色体を保持するものであり、例えば、WO00/10383号、Tanabe,H.ら(Chromosome Res.,8:319−334,2000)などに記載されている。例えばヒト14番染色体を保持するマウスA9雑種細胞は、Japanese Collection of Research Bioresources(JCRB)にJCRB2214(細胞名A9(Hygro14))として登録されており、その詳細な情報・培養法なども入手可能である。
上述のようにして入手したマウスA9雑種細胞に保持されるヒト染色体を、相同組換え率の高い細胞に移入する。ここで「相同組換え率の高い細胞」とは、その細胞において相同組換え操作を行った際に、相同組換えの頻度が高い細胞を指し、そのような細胞としては、例えば、ニワトリDT40細胞(Diekenら,Nature Genetics,12:174−182,1996)、マウスES細胞(相沢慎一,バイオマニュアルシリーズ8,ジーンターゲティング,羊土社,1995)、などが挙げられる。特に、操作の簡便性などの点から、本発明においてはニワトリDT40細胞を利用することが好ましい。
染色体の移入は、当技術分野で公知の染色体移入法に従って行うことができる。例えば、所望の染色体を1本だけ導入する手法として、Koiら(Koiら,Jpn.J.Cancer Res.,80:413−418,1973)に記載されているミクロセル法が挙げられる。この手法は、ある種の細胞において紡錘体形成を阻害する薬剤により誘導されるミクロセルを分離し、これを受容細胞と融合することにより、少数の染色体を導入するというものである。このミクロセル法を利用してヒト染色体を移入する具体的な操作手順に関しては、例えばWO97/07671号及びWO00/10383号を参照されたい。以上のようにしてヒト染色体を保持する細胞を作製することができる。
あるいは、本発明においては、全長のヒト染色体ではなく、部分断片化した染色体、例えばヒト14番染色体の部分断片(SC20)を保持する細胞を使用することも可能である(SC20;Tomizukaら,P.N.A.S.,97:722−727,2000年)。SC20は、ヒト14番染色体の長腕遠位及び長腕近位の多くの部分を欠失していることが報告されている(Tomizukaら,P.N.A.S.,97:722−727,2000年;Kuroiwaら,Nature Biotech.(USA),第18巻,p.1086−1090,2000年)。具体的には、SC20は、ヒト14番染色体長腕のテロメア配列からAL137229(GenBank登録番号)を含む領域、及びこれよりさらにセントロメア側のAL121612(GenBank登録番号)からAL157858(GenBank登録番号)のテロメア側から24−26kbまでを含む領域を保持している。また、AL137229(GenBank登録番号)とAL121612(GenBank登録番号)間の領域、及びAL157858(GenBank登録番号)のテロメア側24−26kbからセントロメア間の領域を欠失している。一方、SC20においてヒト14番染色体の短腕領域は保持されている。SC20の問題点は、14番染色体14q32領域の遺伝子を複数含んでいることであるが、本明細書に記載された方法でSC20を縮小化することにより、様々な細胞種で安定に維持され、かつ余分な遺伝子を含まないHACベクターを得ることができる。なお、SC20染色体断片を保持するニワトリDT−40細胞(SC20)は、独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター(日本国茨城県つくば市東1丁目1番地1中央第6)に2001年5月9日付けで国際寄託され、受託番号FERM BP−7583が与えられている。
ステップ(b):ヒト染色体の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除
ステップ(c):テロメア配列の付加
ステップ(d):サブテロメア配列の付加
HACベクターの作製においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞において、当該染色体又は染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除する。染色体の削除は、当技術分野で公知の方法により行うことができ、例えば部位特異的組換え酵素系を利用して行うことができる。また本HACベクターの作製においては、染色体又は染色体断片の削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列の付加及びサブテロメア配列を付加するが、これも例えば部位特異的組換え酵素系を利用して行うことができる。部位特異的組換え酵素系の使用は、当技術分野で周知であり、例えば後述するステップ(e)の項に例示される部位特異的組換え酵素とその認識部位を用いることができる。例えば好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である。別の好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である。
ステップ(b)〜(d)の順序は特に限定されるものではなく、例えば長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除した後、テロメア配列及びサブテロメア配列を付加してもよいし、テロメア配列との置換によって長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除した後、サブテロメア配列を挿入してもよいし、あるいはテロメア配列及びサブテロメア配列との置換によって長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除してもよい。これらのステップの順序は、目的とする本HACベクターが最終的に得られるのであれば、任意の順序でかつ任意に反復して実施することができる。
長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除は、その結果得られるヒト染色体断片のサイズが、テロメア配列及びサブテロメア配列を含めて、通常約1Mb以上、例えば約1Mb以上約19Mb以下となるように、好ましくは約18Mb以下、さらに好ましくは約17Mb以下となるように行う。
ヒト染色体断片の長腕及び/又は短腕の部位に付加されるテロメア配列はTTAGGGなどの繰り返し配列を持つ塩基配列からなるものであればいずれでもよい。テロメア配列は、例えば、TTAGGGの繰り返し配列に基づいて化学的に合成してもよいし、あるいは任意の染色体(例えばヒト染色体)から公知の方法を用いて作製することもできる。付加されるテロメア配列の長さは、約0.4〜50kbであり、好ましくは約0.4〜25kbであり、さらに好ましくは約0.4〜15kbである。
またヒト染色体断片の長腕及び/又は短腕の部位に付加されるサブテロメア配列は、哺乳動物染色体由来のサブテロメア配列、好ましくはヒト染色体由来のサブテロメア配列、より好ましくはヒト常染色体由来のサブテロメア配列、例えばヒト14番染色体又はヒト21番染色体由来のサブテロメア配列である。ヒト染色体由来のサブテロメア配列を用いる場合、任意の染色体の長腕及び/又は短腕由来のサブテロメア配列を用いることができる。ヒト染色体上のサブテロメアについては、Linardopoulou EVら、Nature,第437巻、p.94−100,2005年、Riethman Hら、Chromosome Res.,第13巻、p.505−515,2005年、Mefford H.C.ら、Nat Rev Genet.,第3巻、p.91−102,2002年などの文献に、その詳細な構造、長さなどが記載されており、当業者であれば、これらの文献の記載に基づいて好適なサブテロメア配列を選択し設計することができる。
付加されるサブテロメア配列の長さは、約1〜500kbであり、好ましくは約1〜300kbであり、さらに好ましくは約1〜100kbであり、さらに好ましくは約5〜60kbであり、さらに好ましくは5〜40kbであり、さらに好ましくは約25〜60kbであり、さらに好ましくは約25〜40kbである。また使用するサブテロメア配列は、任意のヒト染色体に存在するサブテロメア領域の全体であってもよいし、その一部であってもよい。本HACベクターにおいては、細胞内での安定性などを考慮してサブテロメア配列は約5〜60kbの一部を用いることが好ましい。サブテロメア配列は、任意のヒト染色体から公知の手法、例えば部位特異的組換え酵素系の利用、を用いて入手することができる。好ましくは、ヒト染色体断片は、ヒト染色体の長腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、該ヒト染色体と同じ又は異なる、好ましくは同じ、ヒト染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。
好ましい実施形態においては、ヒト染14番色体断片は、ヒト14番染色体の長腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、テロメア配列及びヒト14番染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。ヒト14番染色体由来のサブテロメア配列は、例えばヒト14番染色体の14q32領域より遠位の部分(すなわち14q−tel領域までの部分)であり、具体的には、ヒト14番染色体の14q32.33領域、若しくはヒト14番染色体のAB019439からAB019437の間、AB019438からAB019437の間、好ましくはAB019437における位置より遠位の部分のサブテロメア配列である。
別の好ましい実施形態においては、ヒト21番染色体断片は、ヒト21番染色体の長腕遠位が削除された部位に付加又は結合された、テロメア配列及びヒト21番染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む。ヒト21番染色体由来のサブテロメア配列は、例えばヒト21番染色体の21q22.3領域より遠位の部分、例えば21q−tel領域内のNT_011515からテロメア末端までの配列である。なお、テロメア末端とは染色体から続くテロメアの端の部分をいい、染色体の末端(染色体末端)と同じ意味である。テロメア配列はテロメア末端を当然に含む。
例えば1つの例として、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除は、WO00/10383号に記載されているテロメア配列との置換(テロメアトランケーション)により行うことができる。また同様にして、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除は、テロメア配列との置換によって行うことができる。すなわち、ステップ(b)及び(c)において、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位をテロメア配列と置換することによって、長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加する。長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、例えば、ヒト染色体を保持する細胞において、テロメア配列を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置にテロメア配列の挿入されたクローンを取得した後、テロメアトランケーションによる欠失変異体を得るというものである(Itzhakiら、Nature Genet.,第2巻、p283−p287,1992年、及びBrownら、P.N.A.S.,第93巻、p7125−7130,1996年を参照されたい)。ここで染色体の所望の位置とは、削除対象の長腕遠位又は短腕遠位の切断位置であり、この位置にテロメア配列が相同組換えにより置換・挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される(テロメアトランケーション)。所望の位置は、ターゲティングベクターを構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができる。
例えばインタクトなヒト14番染色体の長腕配列を削除する場合を例として説明する。
ヒト14番染色体の長腕14q領域内、好ましくは14q11領域内、さらに好ましくはAL391156からCR383659(GenBank登録番号)の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、削除することができる。標的配列の設計は、ヒト14番染色体の長腕がAL391156において又はAL391156よりも近位の位置において削除されるように、具体的にはAL391156〜CR383659の間、より好ましくはAL512310〜CR383659の間、さらに好ましくはAL929601〜CR383659の間、さらに好ましくはAL589182〜CR383659の間、さらに好ましくはAL589743〜CR383659の間、さらに好ましくはAL929602〜CR383659の間、さらに好ましくはAL512624〜CR383659の間、さらに好ましくはCR383657〜CR383659の間、さらに好ましくはCR383659の塩基配列に基づいて行われる。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト14番染色体上の例えば14p領域内、好ましくは14p11領域から14p12領域内、好ましくは14p11領域内、さらに好ましくはRNR2、さらに好ましくはPABPCP2(米国 National Center for Biotechnology Information(NCBI)のオンラインゲノムデータベース
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI))の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。ヒト14番染色体の配列情報は、セントロメア領域を除く長腕全体について塩基配列が上記のデータベース上に公開されている(図1も参照)。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のHACベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また例えば、ヒト14番染色体の長腕配列をSC20よりもさらにセントロメア側に削除する場合、AL157858の塩基配列に基づいて標的配列を設計し、その標的配列よりもテロメア側においてテロメアトランケーションが起こるようにすることによって、標的配列を設定した領域において長腕遠位を切断、削除することができる。また例えば短腕遠位を削除する場合には、ヒト14番染色体上の14p領域内、好ましくは14p11領域から14p12領域内、さらに好ましくは14p11領域内、さらに好ましくは14p11.1領域から14p11.2領域内、さらに好ましくは14p11.1領域内、よりさらに好ましくはRNR2、さらに好ましくはPABPCP2(米国National Center for Biotechnology Information(NCBI)のオンラインゲノムデータベース
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi?ORG=hum&CHR=14&BEG=0.00&ENI))の塩基配列に基づいて標的配列を設計することができる。標的配列の設計は、上述した領域に限定されず、所望のHACベクターを作製するように当業者であれば適宜設計することが可能である。
また別の方法の例として、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除は、例えばZheng B.ら、Mol Cell Biol.,第20巻、p648−p655,2000年に記載されているように、2箇所の部位特異的組換え酵素の認識部位間の欠失により、前記長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除が基本骨格となる出発材料のヒト染色体又はその断片由来のサブテロメア配列を残し、テロメア配列を付加するように行うことが好ましい。すなわち、ステップ(b)及び(c)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位における少なくとも2箇所を切断・欠失させることにより、該長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加することができる。また、ステップ(b)〜(d)において、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位上の少なくとも2箇所を切断・欠失させることにより、ヒト染色体又はその断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除すると共に、削除された長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及び当該ヒト染色体由来のサブテロメア配列を付加する。
長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するための具体的な手順は、例えば、ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞において、部位特異的組換え酵素の認識部位を保持するターゲティングベクターを構築し、相同組換えにより染色体上の所望の位置に部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入されたクローンを取得した後、部位特異的組換え酵素による組換え反応により欠失変異体を得るというものである。ここで染色体の所望の位置とは、削除対象の長腕遠位及び長腕近位又は短腕遠位及び短腕近位の切断位置であり、この位置に部位特異的配列が相同組換えにより置換・挿入されて、長腕遠位又は短腕遠位が削除される。所望の位置は、ターゲティングベクターを構築する際に標的配列の設計により適宜設定することができる。
例えば、前記ヒト染色体又はその断片の長腕遠位の削除は、長腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら2つの認識部位間を欠失して行う。また本発明の別の実施形態においては、前記長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除が基本骨格となる出発材料の染色体由来のテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を残すように行われる。例えば、前記ヒト14番染色体の長腕遠位の削除は、長腕遠位及び近位に少なくとも2つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えにより2つの認識部位間を欠失して行う。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト14番染色体の長腕遠位の14q32領域より遠位に及び長腕近位の14q11領域より近位に、更に好ましくは、ヒト14番染色体の長腕遠位のAB019437より遠位に及び長腕近位のAL391156より近位に挿入される。
また例えば、前記ヒト14番染色体の短腕遠位の削除は、短腕遠位及び近位に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、部位特異的組換えによりこれら2つの認識部位間を欠失して行う。好ましい実施形態においては、部位特異的組換え酵素の認識部位は、ヒト14番染色体の短腕遠位の例えば14p領域内より遠位に、好ましくは14p12領域内より遠位に、さらに好ましくは14p11領域内より遠位に挿入され、かつ短腕近位の14p12領域内より近位に、さらに好ましくは14p11領域内より近位に、さらに好ましくは14p11.2領域内より近位に、さらに好ましくは14p11.1領域内より近位に、さらに好ましくはRNR2、PABPCP2からなる群より選択されるいずれか1の位置より近位に挿入されている。
さらにまた、部位特異的組換え酵素の認識部位は、例えばヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片のAP001657における削除位置又はAP001657より近位の位置に、さらに好ましくはヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の短腕近位の21p11−p12領域内における削除位置より近位の位置に挿入することができる。
上述のようにして、テロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を残すようにして長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除したヒト染色体断片を形成させ、それを保持する細胞が得られる。このようにテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列をヒト染色体断片末端に配置することにより、細胞における発現及び/又は安定性を達成することができる。
更にまた、上述のようにして、長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片を形成させ、それを保持する細胞が得られる。このような染色体のサイズの縮小化により、細胞における安定性を達成することができる。また、本HACベクターを保持する細胞、及び後述する本HACベクターが導入される細胞の機能・増殖などに悪影響を与えないように、悪影響を及ぼすと推定される染色体領域を除去することができる。
ステップ(e):部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入
本HACベクターの作製においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。このステップ(e)は、上記ステップ(b)、(c)及び(d)の前、これらのステップの間又はこれらのステップの後のいずれで行ってもよく、これらの順番は特に限定されない。すなわち、ヒト染色体又はヒト染色体断片において、長腕遠位及び/又は長腕遠位を削除し、テロメア配列及びサブテロメア配列を付加した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入してもよいし、部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入した後で長腕遠位及び/又は長腕遠位を削除し、テロメア配列及びサブテロメア配列を付加してもよいし、あるいは長腕遠位及び/又は長腕遠位を削除した後で部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入し、その後テロメア配列及びサブテロメア配列を付加してもよい。
当技術分野においては、ある酵素が特定の認識部位を認識して特異的にその認識部位でDNAの組換えを起こす現象が知られており、本発明においてはそのような酵素及び認識部位の系を利用するが、その種類は下記の例に特に限定されない。例えば、そのような系としては、Cre/loxPシステムが知られている(例えば、Sauer,B.ら,P.N.A.S.,85:5166−5170,1988を参照されたい)。CreはバクテリオファージP1由来の38KDのタンパク質であり、リコンビナーゼのInt(インテグラーゼ)ファミリーに属するものである。この酵素は、約34bpの認識部位loxP配列を認識して、この部位で特異的にDNAの組換えを起こす。またこのloxP配列の方向性によって、2つのloxP配列間DNAの欠失又は転座が生じることが知られている。またその他の、特異的な配列を認識して組換え反応を起こす系としては、出芽酵母由来のレコンビナーゼFLP(Broachら,Cell,21:501−508,1980)、ファージphiC31由来のインテグラーゼ(Thorpeら,P.N.A.S.,95:5505−5510,1998)などがあり、哺乳動物細胞でもこれらの酵素によるDNA組換え反応が起きることが報告されている(Kochら,Gene,249:135−144,2000;Thyagarajanら,Mol.Cell.Biol.,21:3926−3934,2000)。
ヒト染色体に、上記部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するには、公知の遺伝子組換え手法、例えば相同組換え法を利用することができる。部位特異的組換え酵素の認識部位の挿入位置は、当業者であれば、必須ではない遺伝子の位置などを考慮して適宜設定することができる。例えば、ヒト染色体の長腕近位又は短腕近位の任意の位置に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入する。かかる挿入位置としては、例えば、ヒト14番染色体については長腕近位14q11より近位、さらに好ましくは長腕近位のAL391156(GenBank登録番号)における前記削除位置より近位、又はヒト14番染色体の短腕近位の14p12領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト21番染色体については、長腕近位の21q11.2より近位、好ましくは21q11.1より近位、好ましくはAL16202より近位、さらに好ましくは長腕近位のAP001657(GenBank登録番号)における削除位置又はAP001657より近位、或いはヒト21番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の21p11.2、領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。
また、後述する外来DNAの挿入位置として、例えば前記部位特異的組換え酵素認識部位を用いることができる。従って、かかる挿入位置としては、例えば、ヒト14番染色体については長腕近位14q11より近位、さらに好ましくは長腕近位のAL391156(GenBank登録番号)における前記削除位置より近位、又はヒト14番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の14p12領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト21番染色体については、長腕近位の21q11.2より近位、、好ましくは21q11.1より近位、好ましくはAL16202より近位、さらに好ましくは長腕近位のAP001657(GenBank登録番号)における削除位置又はAP001657より近位、或いはヒト21番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の21p11.2領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。
その後、後述する外来DNAの導入手法に従ってリポーター遺伝子を導入し、その発現を確認することによって、ヒト染色体上に挿入した認識部位の位置の適否を確認することができる。
上記例示した認識部位のうち1種類を1つ又は複数挿入してもよいし、あるいは、異なる系の認識部位を複数挿入してもよい。後述するように、本HACベクターは、部位特異的組換え酵素の認識部位を有するため、外来DNAを部位特異的に導入が可能であり、さらに、認識部位の設定により外来DNAの導入位置を決定できるため、外来DNAの導入位置が一定となりポジション効果(position effect)を回避できる。また外来DNAの導入操作も簡便となる。さらに異なる系の認識部位を複数挿入することによって、複数の外来DNAを逐次挿入もできる。また、複数種の部位特異的酵素の認識部位を組み合わせて用いることにより、1種の部位特異的酵素の認識部位を利用して外来DNAを導入した後、ベクター上に存在する薬剤耐性遺伝子などの不要な遺伝子を別の種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を利用して欠失・削除することができる。
上述のようにしてヒト染色体を改変して作製した本HACベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位の他、プロモーター、薬剤耐性遺伝子などのベクター構築において一般的に挿入される配列又はエレメントが挿入されていてもよい。またインスレーター(例えば特開2006−948494号参照)、細胞骨格接着領域(Matrix attachment region:MAR)、ヒト又はその他の生物種のゲノム領域など、遺伝子発現制御及び/又は細胞機能制御及び/又は組織機能制御及び/又は個体発生制御及び/又は生体機能統御に関わる配列又はエレメントが挿入されていてもよい。更にまたテロメラーゼなどの細胞寿命をコントロールするような遺伝子及び/又はチミジンキナーゼなどの自殺遺伝子及び/又は遺伝子発現制御や細胞機能制御や組織機能制御や個体発生制御や生体機能統御などに関わる遺伝子が挿入されていてもよい。そのような配列及び/又はエレメント及び/又は遺伝子は、上述したように相同組換え法を利用して本HACベクターの所望の位置に挿入できる。
さらに本発明者は、上述のように作製した本HACベクターを保持する細胞を、選択薬剤を含まない培地で長期にわたり継代培養し、経時的にHACベクターの保持率をFISH法により検定したところ、本HACベクターは宿主細胞(例えばCHO細胞)において安定に保持されること、その安定性は、従来の21HACベクターを顕著に上回ることを確認できた。また、継代培養において、そのHACベクターの脱落が少ないことのみならず、導入したHACベクターのコピー数が過度に増減することなく安定に維持されることを確認できた。
さらにまた、驚くべきことに、本HACベクターを用いることによって、テロメア配列の近傍に外来DNAを挿入した場合であっても、従来報告されていたテロメアポジション効果(TPE)による外来遺伝子発現抑制事象を受けることなく、該外来DNAを高発現することができる。ここで近傍とは、テロメア末端からセントロメア側へ向かって約1〜500kbの領域をいい、好ましくは約1〜300kbであり、さらに好ましくは約1〜100kbであり、さらに好ましくは約5〜60kbであり、さらに好ましくは5〜40kbであり、さらに好ましくは約25〜60kbであり、さらに好ましくは約25〜40kbである。
2.HACベクターへの外来DNAの導入(ステップ(f))
上記HACベクターの作製において、部位特異的組換え酵素の存在下にて外来DNAを挿入するステップ(f)を行うことにより、本HACベクターに外来DNAを導入することができる。このステップ(f)は、上述したステップ(e)の後に行うものであるが、ステップ(b)、(c)及び(d)との順序は特に限定されず、ステップ(b)、(c)及び(d)の前、これらのステップの間又はこれらのステップの後に行うことができる。従って、ステップ(b)〜(f)の順序は明細書に記載する順序に限定されないことに留意されたい。
外来DNAとは、対象とする細胞にとって外部から導入されるDNAを指し、遺伝子及びその他の機能配列などをコードするDNAである。本発明において導入対象となる外来DNAとしては、物質生産、疾患治療及び機能改変又は機能分析などのために発現させることが望まれる遺伝子及びその他の機能配列などをコードするDNAであれば特に限定されない。その他の機能配列とは、遺伝子が発現するために機能する配列を指し、例えば、プロモーター、エンハンサー、シグナル配列などが挙げられる。
外来DNAの導入は、部位特異的組換え酵素の系を利用して行うことができる。例えば、Cre酵素の認識部位であるloxP配列と外来DNAを保持するターゲティングベクターを構築する。続いて本HACベクター(ヒト14番染色体断片)を保持する細胞において、Cre酵素を細胞内で発現させることにより、loxP配列とテロメア配列に挟まれた領域と、上記ターゲティングベクターとの部位特異的組換えにより、外来DNAを本HACベクター上に挿入させることができる(黒岩ら,Nature Biotech.,18:1086−1090,2000)。
本HACベクターには、部位特異的組換え酵素の認識部位(loxP配列)を保持する環状DNAが挿入できる。このため大腸菌を宿主としたプラスミド、BAC、PACや、酵母を宿主とした環状YACなど既存のベクターによりクローン化されたDNAを挿入することができる。またヒト染色体に基づいて作製されていることから、本HACベクターに導入可能な外来DNAのサイズの上限は100kbオーダーまで拡張され、従来発現実験に用いられてきたプラスミドベクターに組み込まれたcDNAだけではなく、遺伝子の発現制御領域を含むゲノムDNAも導入可能である。
外来DNAの挿入位置は、上述したように、例えば前記部位特異的組換え酵素認識部位を用いることができる。かかる挿入位置としては、例えば、ヒト14番染色体については長腕近位14q11より近位、さらに好ましくは長腕近位のAL391156(GenBank登録番号)における前記削除位置より近位、又はヒト14番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の14p12領域内における前記削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、ヒト21番染色体については、長腕近位の21q11.2より近位、、好ましくは21q11.1より近位、好ましくはAL16202より近位、さらに好ましくは長腕近位のAP001657(GenBank登録番号)における削除位置又はAP001657より近位、或いはヒト21番染色体の短腕上、好ましくは短腕近位の21p11.2領域内における削除位置より近位などが挙げられるが、この位置に特に限定されない。また、複数の部位特異的組換え酵素の認識部位を利用することにより本HACベクターから不要になった薬剤耐性遺伝子発現ユニットやDNAエレメント等を除去できる。例えば、上記Cre−loxPシステムにより導入した外来遺伝子発現ユニット下流に存在するNeo耐性遺伝子ユニットを除去する場合、上記外来DNAを保持するターゲッティングベクター上の外来遺伝子発現ユニットの下流、及び本HACベクター上のNeo耐性遺伝子ユニット下流にloxPとは別種類の認識部位(FRT配列)を導入したコンストラクトを構築する。上記に従い外来DNAを導入した本HACベクターを保持する細胞において、FLPe酵素を細胞内で発現させることによりFRT配列に挟まれたNeo耐性遺伝子ユニット領域を部位特異的組換えにより切出し除去できる(例えば図60参照)。
なお、上記のような薬剤耐性遺伝子の除去は、ヒト14番及び21番染色体に限定されることなく、任意のヒト染色体に基づくヒト人工染色体ベクターの作製において実施することができると考えられる。従って、本発明は、以下のステップを含む外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターの作製方法に関する:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ;
(d)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(e)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;並びに
(f)ステップ(e)で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ。
上記方法に従って作製された外来DNAを含むヒト人工染色体ベクターは、薬剤耐性遺伝子が除去されており、その結果、外来DNAを高発現することができる(例えばヒト14番染色体ベクターに関する図21参照)。
従来のcDNA強制発現ベクターを用いた遺伝子導入法では、過剰発現による細胞毒性や増殖抑制などの副作用が生じ、導入遺伝子を恒常的に発現する細胞株が得られない例が多い。この問題点を克服し、生理的な発現パターンを保ちながらなおかつ発現を人工的に制御するには、テトラサイクリンなどを利用した遺伝子発現誘導系の適用が望ましい。導入可能なインサートサイズが大きく、一定のコピー数が安定に保持されるという本HACベクターの特徴はこのような目的に適っている。
組織特異的/生理的な遺伝子発現は、遺伝子をコードするゲノム領域からの転写、転写産物の編集、核外への輸送、翻訳の各段階で制御を受ける。一つの遺伝子に対して複数のプロモーターがあって転写開始点が異なる、或いはスプライシングにバリエーションが生じることで、組織特異的なアイソフォームが発現することが知られている。クローン化cDNAは一つの遺伝子に由来する複数の転写産物バリアントの1つにすぎない。生理的な遺伝子発現を再現するためには、ゲノムDNAとして制御配列を含んだ遺伝子領域を導入することが望ましい。本HACベクターの利用はこのような目的に適うものである。
ヒトゲノムプロジェクトでは、ゲノムDNAはBACクローンとして単離され、塩基配列が決定された。このため公開されているデータベース(GenBankなど)では、塩基配列はBAC単位でも登録されている。遺伝子機能解析の1手段としてトランスジェニックマウスの作製がある。本HACベクターをプラットフォームとしてBACを挿入することで、常に挿入部位が同一の条件で遺伝子の発現を解析することが可能になる。多くのBACベクターはloxP配列を保持しているため、本HACベクターへの挿入をネガティブ選別する系を用いれば、塩基配列既知のBACを本HACベクターにカセット形式で簡便に挿入できると考えられる。
上述した以外にも、本HACベクターへの外来DNAの導入手法及び導入の利点があり、以下にそのいくつかを例示する。
(1)相互転座による染色体部分断片の導入
部位特異的組換え(例えばCre酵素によるloxP配列間の部位特異的組換え)は、線状染色体と環状インサート(外来DNA)の場合は挿入反応が起こるが、線状染色体同士では相互転座の反応が起きる。これを利用すれば環状インサートにクローニングできないMb単位以上の染色体断片を本HACベクターに導入することができる(Kuroiwaら,Gene Ther.9:708−712,2002)。
(2)挿入体選別法
本明細書の実施例に記載する方法においては、本HACベクターへの外来DNAの挿入は、薬剤耐性遺伝子の再構成を指標としたポジティブ選別を利用している(組換え体のポジティブ選別に関しては、WO00/10383号を参照されたい)。これに代わって、チミジンキナーゼ/ガンシクロビル系などのネガティブ選別により、インサート挿入体(外来DNAが挿入されたもの)を得ることも可能である。この場合、挿入する環状DNAには部位特異的組換え酵素の認識部位のみが含まれていればよい。ゲノムプロジェクトで用いられたBACライブラリーはloxP配列を含んでいるので、このようなネガティブ選別の系が確立できれば配列既知のゲノムクローンを本HACベクターに容易に挿入することが可能になる。
(3)複数インサートの挿入
本発明において好ましく用いられるloxP配列はP1ファージに由来する野生型の配列であり、Cre酵素によるHACベクター上のloxP配列への環状インサートの挿入反応は可逆的である。本明細書に記載する実施例においては、Cre酵素を一過性に発現させ、薬剤耐性の獲得を指標に部位特異的な組換え体を選別することにより構成的な挿入体が得られた。一度環状インサートが挿入されると、HACベクター上に2つのloxP配列が残る。このため再度Cre酵素を発現させると逆反応(環状インサートの切り出し)が起きる可能性もあり、二次的にインサートを挿入するなどのさらなるHACベクターの改変は困難となる。一方、塩基置換を行った変異loxP配列の組み合わせによっては、反応方向及び反応の特異性を限定できるとの報告がある(Hoessら,Nucleic Acids Res.,14:2287−2300,1986;Arakiら,Nucleic Acids Res.,25:868−872,1997;Leeら,Gene,216:55−65,1998)。このような変異loxP配列を用いることで、上述した逆反応を起こさず、複数の環状インサートを逐次挿入する系も構築可能である。
(4)コピー数依存的発現制御
αグロビン遺伝子トランスジェニックマウスを用いて宿主染色体上にランダムに挿入された遺伝子のコピー数とmRNA発現量の関係を解析した報告(Sharpeら、Proc Natl Acad Sci USA,90:11262,1993)では、発現量と導入遺伝子コピー数との間に相関は認められない。これは、トランスジェニック動物系統により導入遺伝子の発現量が大きく異なり、また導入した遺伝子のコピー数に比例しない発現が起こるポジション効果と呼ばれる現象によるものであると考えられ、トランスジェニック動物における遺伝子導入においては頻繁に起こる現象である。また、導入遺伝子のポジション効果を排除して比較するため外来DNAの挿入位置を予め宿主染色体上に導入した部位特異的組換え酵素の認識部位(例えばloxPサイト)に確定し部位特異的組換え反応(例えばCre−loxP系)によりプラスミドベクターから目的のDNAユニットを導入するトランスジェニックマウスの報告(Garrickら、Nature Genet.,18:56−59,1998)があるが、ここでもコピー数依存的発現制御は実現されていない。
一方、チロシナーゼゲノム領域を導入したYACを用いて作製したトランスジェニックマウスにおいて、導入したゲノム領域のコピー数依存的なチロシナーゼ発現が認められたが(Schedlら、Nature,362:258−261,1993)、生理的発現制御領域を含むゲノムを用いる点でポジション効果の影響を受けないと考えられ、本発明のような生理的制御領域を含まない人工的な遺伝子発現ユニットのみを多コピー化して発現させるものではない。また、各種のエピソームベクターは、宿主染色体と独立に存在し外来DNA挿入位置も決まっているが、細胞内でのベクター自身のコピー数を厳密に制御するには至っていない(Morlinoら、ppl Environ Microbiol.、65:4808−4013,1999;Cooperら、Proc Natl Acad Sci USA.,94:6450−6455,1997)。
本発明においては、同一及び/又は異種の目的遺伝子の発現ユニットを多コピー連結して並列配置し、HACベクター上の決まった位置(例えばloxPサイト)に導入することにより、宿主染色体に変異を与えることなくコピー数依存的発現制御を行なうことができる。
従って、本発明の方法により、外来DNAとして多コピーの目的遺伝子を所望の細胞に導入し、該細胞において該目的遺伝子をコピー数依存的に発現させることが可能であると共に、該細胞を用いて作出したトランスジェニック動物においては、ポジション効果を受けることなく従来困難であったコピー数依存的な目的遺伝子の発現を達成することが可能となる。
3.HACベクターの細胞への移入
本HACベクター又は外来DNAを含む本HACベクターを保持する細胞から、それらのベクターをその他の細胞へ移入することができる。移入先となる細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞(哺乳動物細胞)などが挙げられる。本発明においては、無傷の状態でヒト染色体を移入可能であることが知られているチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を用いることが好ましい(WO00/10383号参照)。CHO細胞は、効率良くミクロセルを形成することが知られており(例えば、Koiら、SCIENCE 260:361−364,1993)、これにより本HACベクターをCHO細胞からさらに別の細胞(CHO細胞以外の細胞)へ移入することも可能である。また、本発明においては、本HACベクターを多分化能を有する細胞に移入することも可能である。「多分化能を有する細胞」とは、所定の操作により、特定の細胞又は組織に分化可能な細胞を意味する。例えば、宿主胚への注入又は集合胚形成などの操作を行うことによって、キメラ動物の2種類以上の細胞又は組織に分化可能な細胞、具体的には、胚性幹細胞(ES細胞)、胚性生殖細胞(EG細胞)、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、精子由来幹細胞(GS細胞)などが含まれる。また、例えば、増殖因子(例:トランスフォーミング増殖因子;TGF)などを添加した誘導培地における培養により、骨細胞、軟骨細胞又は脂肪細胞に分化可能な細胞、具体的には、体性幹細胞(例:間葉系間細胞)などが含まれる。
本明細書中で使用される「胚性幹細胞」とは、ES細胞とも称され、未分化性(全能性)を維持したまま増殖可能なことを特徴とする初期胚由来の培養細胞を意味する。すなわち胚性幹細胞は、動物初期胚中の胚盤胞の内部に存在する未分化幹細胞である内部細胞塊の細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。また「胚性生殖細胞」とは、EG細胞とも称され、上記胚性幹細胞とほぼ同等の能力を有することを特徴とする始原生殖細胞由来の培養細胞を意味する。胚性生殖細胞は、受精後数日〜数週間、例えばマウスの場合には約8.5日経過した胚から得た始原生殖細胞を培養し、未分化状態を保ったままで増殖し続けるように樹立された細胞株である。
また、ヒトを対象とした遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、ガン化などを避けるための安全性の観点から、不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましいとされている。本発明においては、ヒト染色体由来HACベクターのヒト正常繊維芽細胞(HFL)への移入が可能であることが示された。また、本発明の方法により、繊維芽細胞以外のヒト正常体細胞へのヒト14番染色体由来断片又はヒト染色体由来HACベクターの移入が可能である。さらに、本発明の方法に従って作製されたヒト染色体由来HACベクターであれば、ヒト染色体に制限されることなく、ヒト正常体細胞に移入することが可能である。
HACベクターの細胞への移入は、ミクロセル法を利用して行うことができる。ミクロセル法は、上記「1.ヒト人工染色体(HAC)ベクターの作製」の項に記載のように行うことができる。
また、HACベクターの細胞への移入は、体細胞核移植法を利用して行うことができる。体細胞核移植法は、Kuroiwa Yら Natute Biotech、第20巻、p889−894、2002年に記載のように行うことができる。
また、本HACベクターの細胞への移入について、最初に用意したヒト染色体又は染色体断片を保持する細胞から、ヒト染色体への改変を行うステップの前、ステップの間、又はステップ後のいずれの段階においてもヒト染色体(HACベクター)を他の細胞へ移入することが可能である。
4.HACベクターの用途
本発明の目的は、ベクターという基本ツールとその利用技術の提供であり、学術研究から産業に至る非常に幅広い領域に波及効果をもたらすことが期待される。(i)宿主染色体に挿入されず独立して維持される(宿主遺伝子の変異や癌化の懸念がない)、(ii)一定のコピー数で長期間安定に保持される(過剰発現、発現消失の懸念がない)、(iii)導入可能なDNAの長さの制限がない(正常な発現制御を保証するDNAエレメントを含む遺伝子や複数遺伝子を同時に導入可能である)、という本HACベクターの特徴は、従来のベクターで不可能であった多くのことを可能にすると想像される。本HACベクターの用途としては、限定するものではないが主要なものを挙げると、(i)動物培養細胞における遺伝子機能解析用ベクター、(ii)ヒト疾患遺伝子治療用ベクター、(iii)ヒト臓器幹細胞、胚幹細胞(ES細胞)への遺伝子導入用ベクター、(iv)遺伝子導入動物作製用ベクター(例:ヒト疾患モデル動物作製、KO動物と組み合わせた特定遺伝子のヒト化)、などが考えられる。以下に、本HACベクターの用途の一例として、(1)外来DNAの受容細胞への導入、(2)外来DNAを発現する細胞の作製、(3)タンパク質の製造、(4)遺伝子機能解析用ベクター、(5)幹細胞への遺伝子導入用ベクター、(6)培養フィーダー作製用ベクター、(7)ヒト疾患治療用ベクター、及び(8)遺伝子導入動物作製用ベクターを説明する。
(1)外来DNAの受容細胞への導入
本HACベクターは、細胞中で外来DNAを挿入したり、外来DNAが挿入されたHACベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来DNAを所望の受容細胞に導入することができる。外来DNAの受容細胞への導入には、例えば以下のステップが含まれる:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の存在下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(i)融合した受容細胞において外来DNAの導入を確認するステップ。
ステップ(a)〜(f)は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ(g)及び(h)においては、ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞から、ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体又はその断片を移入する。移入対象となるヒト染色体又はその断片は、ステップ(b)〜(f)における染色体又はその断片の改変前、改変ステップの途中、又は改変後のものとすることができる。従って、例えばステップ(f)においてヒト染色体又はその断片に外来DNAを挿入する前に、ヒト染色体又はその断片を保持する供与細胞から、ミクロセル法を利用して受容細胞に当該染色体又はその断片を移入してもよい。その後、ステップ(f)の外来DNAの挿入操作を受容細胞において行って、外来DNAが挿入されたヒト染色体又はその断片を受容細胞に保持させることもできる。これらのステップは他の順序で行うこともでき、ステップ(f)〜(h)の順序は、上記順序に限定されない。
ミクロセル法は、上記「1.ヒト人工染色体(HAC)ベクターの作製」の項に記載のように行うことができる。ここで用いる受容細胞は、特に限定されるものではないが、動物細胞、特に哺乳動物細胞(例えばマウス細胞、ヒト細胞など)が好ましい。また、上述したような多分化能を有する細胞、例えば胚性幹細胞(ES細胞)、並びに間質系幹細胞及び組織幹/前駆細胞などを受容細胞として用いることも可能である。
続いて、ステップ(i)においては、受容細胞に外来DNAが導入(移入)されているか否かを確認する。この確認は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば、外来DNAの制限酵素部位に対応するプローブを用いたサザンブロット解析などにより、外来DNAの導入を確認することができる。
本HACベクターを用いることにより、大きなサイズの外来DNAを細胞に導入し、安定に保持させることが可能となる。
(2)外来DNAを発現する細胞の作製
本HACベクターは、上述したように、細胞中で外来DNAを挿入したり、外来DNAが挿入されたHACベクターを他の細胞に移入したりできるため、外来DNAを発現する細胞を作製することもできる。外来DNAを発現する細胞の作製には、例えば以下のステップが含まれる:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;並びに
(i)融合した受容細胞において外来DNAを発現する細胞を選択するステップ。
ステップ(a)〜(h)は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ(i)においては、受容細胞において外来DNAの発現を確認し、外来DNAを発現する細胞を選択する。外来DNAの発現の確認は、当技術分野で公知の手法により行うことができ、例えば、外来DNAに対応するプローブを用いたノーザン・ブロット法などが挙げられる。あるいは、外来DNAによりコードされるタンパク質を、該タンパク質に対する抗体、該タンパク質の活性を検出することができる手段を用いて検出することにより、外来DNAの発現を確認することも可能である。
本HACベクターを用いることにより、大きなサイズの外来DNAを発現する細胞を作製することが可能となる。
(3)タンパク質の製造
本HACベクターを利用することにより、上述したように、外来DNAを細胞に導入することや、外来DNAを発現する細胞を作製することができるため、当該外来DNAによりコードされるタンパク質を製造することができる。タンパク質の製造には、例えば以下のステップが含まれる:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片にタンパク質をコードする外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;
(i)融合した受容細胞を培地中で培養するステップ;並びに
(j)得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ。
ステップ(a)〜(h)は、上述したように行うことができ、ステップを行う順序はこれに限定されない。
ステップ(i)では、ステップ(h)で融合した受容細胞を培地中で培養する。受容細胞を培養するための培地は、炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、上記受容細胞の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよく、当業者であれば適切な培地を選択し、また必要により適宜修正を加えて培地を調製することができる。また、振盪培養又は通気攪拌培養等の好気的条件、温度、pH、培養期間なども適宜設定する。
培養後、ステップ(j)に記載するように、得られる培養物からタンパク質を採取する。「培養物」とは、培養上清のほか、培養細胞又は細胞の破砕物のいずれをも意味するものである。培養終了後、該培養物よりタンパク質を採取するには、通常のタンパク質精製手段等を用いて得ることが出来る。例えば、細胞内に生産された場合は、常法により細胞を超音波破壊処理、磨砕処理、加圧破砕等によりタンパク質を抽出する。必要に応じてプロテアーゼ阻害剤を添加する。また、培養上清に生産された場合は、培養液そのものを用いることが出来る。そして、この溶液を濾過、遠心分離等を行い固形部分を除去し、必要によりプロトタミン処理等により核酸を除去する。
次いで、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈殿物を採取し、粗タンパク質溶液を得る。該タンパク質溶液を各種クロマトグラフィー、電気泳動等にかけて精製酵素標品を得る。例えば、セファデックス、ウルトラゲル若しくはバイオゲル等を用いるゲル濾過、イオン交換体クロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、アフィニティクロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等を用いる分画法を適宜選択し、又はこれらを組合せることにより、精製された目的のタンパク質を得ることが出来る。しかし、上記培養法、精製法は一例であって、これに限定されるものではない。
本発明において、製造対象となるタンパク質は、製造が望まれるタンパク質であれば特に限定されるものではないが、一例としては、エリスロポイエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TPO)、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子(vWF)、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン2、インターロイキン3、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン9、インターロイキン10、インターロイキン11、インターロイキン12、インターロイキン15、CD40リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α−1アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子(GIF)、腫瘍壊死因子(TNF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンM、Flt3リガンド(Flt3L)、ストローマ由来因子(SDF)、幹細胞増殖因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管形成誘導因子(VEGF)、アンジオポイエチン、神経成長因子(NGF)、骨形成因子(BMP)、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、ウイント(Wnt)、アールスポンジン(R−spondin)、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体などが挙げられる。このような製造対象のタンパク質をコードする遺伝子(すなわち外来DNA)は、例えば公の遺伝子データベースなどを利用してその配列情報を入手することができる。
(4)遺伝子機能解析用ベクター
本HACベクターに挿入した外来DNAは、細胞中でコピー数依存的かつ安定的に発現されるため、本HACベクターは、遺伝子機能を解析するために利用することができる。
標的遺伝子をコードする塩基配列の一部に相補的な配列からなる二本鎖RNA(double−stranded RNA;dsRNA)を発現させることにより標的遺伝子の発現を抑制する手法、RNA干渉が知られている(例えば、短鎖干渉RNA(siRNA)に関しては、Elbashirら、Nature,411:494−498,2001;McCaffreyら、Nature,418:38−39,2002を参照。また、Shinagawa,T.ら、Genes & Development,17:1340−1345,2003も参照)。dsRNAをコードするDNAを遺伝子発現誘導系とともにHACベクター上に導入することにより、標的遺伝子のコンディショナルな機能抑制が可能である。また、遺伝子発現誘導系に替えてゲノム領域を利用することで組織特異的/生理的な部位での機能抑制が可能である。また、ゲノム中に存在するマイクロRNA(miRNA)の機能解析を行なうことも可能である。
また、目的分子による作用効果を解析しようとする場合に、その目的分子の用量依存性を指標として解析する手法がある。この手法において、本発明に従って目的分子をコードする遺伝子の発現ユニットのコピー数を変えてHACベクター上へ導入し、細胞等(組織、個体も含む)に移入することにより、該細胞等におけるコピー数依存的発現制御に基づいて用量依存性解析を行なうことが可能である。また、遺伝子発現制御のために発現誘導系やゲノム領域を利用することでコンディショナル又は組織特異的/生理的な機能解析が可能である。
(5)幹細胞への遺伝子導入用ベクター
本発明の方法により作製したHACベクターは、胚性幹(ES)細胞又は間葉系幹細胞(Mesenchimal Stem Cell;MSC)への遺伝子導入用ベクターとして利用することができる。そして上記HACベクターはES細胞又はMSCにおいて長期間安定に存在できる。
また、本発明の方法により作製したHACベクター移入ES細胞から分化誘導した組織細胞においてもHACベクターが安定に保持されると考えられる。
また近年、様々な組織の幹細胞及び骨髄由来の多能性細胞が同定されている(横田ら、実験医学(増刊)、19巻15号、2001年、羊土社、岡野ら、実験医学(増刊)、21巻8号、2003年、羊土社、Liら、Nature Med.,online:31 August 2003,doi:10.1038/nm925)。本発明の方法により作製したHACベクターは、組織幹/前駆細胞、例えば骨髄、血液、神経、筋肉、肝臓、膵臓、皮膚、内耳などに由来する多能性幹/前駆細胞、への遺伝子導入用ベクターとして利用可能である。
さらに、ES細胞、MSC、及び組織幹/前駆細胞のヒト臨床応用を考える場合、治療処置に必要な量の細胞を増幅し、所望の分化状態で提供することが求められる。従来では、多分化能を保持したまま幹細胞だけを大量に増幅することは容易ではなく、課題の一つとなっている(日野ら、実験医学、19巻15号増刊:10、2001、羊土社)。例えば、造血幹細胞や神経幹細胞を生体組織から採取し培養すると、幹細胞だけでなく幹細胞から分化した前駆細胞や成熟細胞も同時に増幅されるため、臨床用途には好ましくない(岡野 榮之、実験医学、19巻15号増刊:80−90、2001、羊土社)。
本発明においては、多分化能保持に関わる因子、例えばマウスES細胞では、活性化型Stat3,Oct−3/4、Nanogなどの転写因子(Niwaら、Genes Dev.,12:2048−2060,1998;Matsudaら、EMBO J.,18:4261−4269,1999;Niwaら、Nature Genet.,24:372−376,2000;Mitsuiら、Cell,113:631−642,2003;Chambersら、Cell,113:643−655,2003)をコードするDNAを導入したHACベクターを作製し幹細胞へ移入することにより、宿主染色体を変異させることなく多分化能を保持しかつ簡便に幹細胞を増幅させるために利用することが可能である。
また、幹細胞の分化制御においては、関与する分子の発現量のコントロールが重要な要素になっている。例えば、マウスES細胞における上記Oct−3/4による分化制御においてその発現量が生理的発現レベルを100%とした場合は未分化状態を維持するが、50%以下の場合は栄養外胚葉に分化し、また150%以上では原始内胚葉に分化する(Niwaら、Nature Genet.,24:372−376,2000)。このような発現レベルの変化により分化を制御する場合には、本発明の方法により作製したHACベクターに遺伝子発現ON/OFF誘導系(例えばテトラサイクリンによる発現誘導系)を導入することにより、厳密な発現量のコントロールが可能となる。
また、本発明の方法により作製したHACベクターに遺伝子発現ON/OFF誘導系(例えばテトラサイクリンによる発現誘導系)と複数の分化誘導因子とを組み合わせて導入することにより、多分化能保持状態と分化誘導状態を切替えることが可能である。
幹細胞による組織再生を行う場合、移植細胞又はドナー由来の再生組織は、長期間(望ましくは生涯)にわたりレシピエント個体の一部となり機能する。それ故に癌化などの生理的制御の逸脱をドナー細胞に誘発する原因(例えば遺伝子変異)を与える操作は極力避けることが望ましい。本HACベクターは、宿主染色体と独立に存在できることから、遺伝子導入を宿主染色体に変異を与えずに行なうことができる。また本明細書中実施例に示すとおり、ヒト細胞中で安定に存在できることから、長期間にわたり安定に目的分子を発現することができる。
本発明の方法に従って、分化させた組織で生理的に発現する遺伝子のゲノム領域又は組織特異的発現制御領域を含むゲノム配列下に目的の遺伝子を融合したDNAを導入したHACベクターを作製し、上記HACベクターを移入した幹細胞を用いることにより、再生した組織において生理的/組織特異的に目的分子を発現することが可能である。
また、本発明の方法により作製したHACベクターを保持する幹細胞を分化誘導した後、導入遺伝子の発現が必要なければHACベクターは不用となる場合がある。分化誘導後にHACベクター脱落クローンを、方法を特に限定するものではないが例えば選択培養における薬剤耐性を指標にして選別することにより、不用となったHACベクターを排除することが可能である。
(6)培養支持フィーダー細胞作製用ベクター
細胞培養法の一つとして、培養器底面に付着性細胞を敷き詰めた培養支持フィーダー細胞上に目的の細胞を播種し共培養する方法が知られている(日本生化学会編、新生化学実験講座14発生分化老化、1992年、東京化学同人)。例えば造血前駆細胞を増殖させる場合には、SCF、Flt3L、TPO、IL−6、sIL−6Rなどの必要な因子をそれぞれ例えば組換え体タンパク質として準備し、培養液に添加して培養する(Uedaら、J Clin Invest.,105:1013−1021,2000)。従来法により培養添加物の遺伝子を培養支持フィーダー細胞へ導入することが可能であるが、宿主染色体へのランダム挿入による変異・ポジション効果、発現不活化、多コピー発現ユニット並列による下流遺伝子発現の減弱などにより、全ての因子について望みの発現量を制御して供給することは困難と考えられる。本発明の方法によりこれらの必要因子をコードするDNA全て(又は一部)を導入したHACベクターを作製し、培養支持フィーダー細胞へ移入することにより、組換え体タンパク質などを後から加えることなく単なる共培養だけで簡便に必要な因子を全て補給することが可能である。また、遺伝子発現誘導系を利用することでこれら因子のコンディショナルな発現制御が可能である。
(7)ヒト疾患治療用ベクター
ヒト疾患治療用のベクターは、ウイルス性及び非ウイルス性ベクターが従来から各種研究されているが、免疫反応の惹起、導入DNAサイズの限界、宿主染色体挿入変異、低導入効率・低発現効率、発現量制御が困難(金田 安史、臨床免疫、39巻:551−558、2003年、科学評論社、小澤 敬也編、遺伝子治療、1997年、羊土社)など、様々な課題が指摘されている。いずれのベクターにも共通する課題として、「望ましい発現量を、望ましいタイミングで制御する」ことが求められている。
HACベクターを用いた遺伝子細胞治療の戦略として、(i)1次的に欠損している酵素やタンパク質の補充、(ii)2次的に減少している代謝産物を補充する対症療法、(iii)細胞に新機能を付加し、細胞の生存を高める方法(例えば改変細胞を用いる組織再生において、HACベクターはゲノムを導入することにより生理的/組織特異的遺伝子発現制御を行なうことが可能である。またこれにより過剰発現又は発現不足による機能障害などの副作用を回避することができる。)、(iv)Gain of functionの形で進行する変性疾患の障害をくいとめる方法(例えばパーキンソン病におけるGDNF補充治療)などが挙げられる。
すなわち、本HACベクターは、ヒト疾患治療用ベクターとして使用することが可能であり、治療用の外来DNAを導入したHACベクターを細胞へ移入後、その細胞を患者に投与するための医薬組成物として調製すること、および本HACベクターを用いた遺伝子治療が可能である。また、かかるヒト疾患治療用ベクターは、疾患の治療のみならず、疾患の予防にも使用することが可能である。
適用範囲を特に限定するものではないが、以下にヒト疾患治療用ベクターとしての適用例を示す。
(A)テロメラーゼの利用
遺伝子細胞治療や組織再生治療において材料となる細胞は、その安全性観点から不死化細胞ではなく正常細胞を用いることが望ましい。しかし正常体細胞は、一定回数分裂すると増殖・分裂が止まりやがて死滅する、すなわち老化することが知られている(井出 利憲、実験医学、16巻18号増刊:18−24、1998、羊土社)。治療効果を長期間持続させるために、治療用細胞は一定期間、望ましくは罹患者の生涯を通して維持されることが必須である。染色体末端に存在する繰返し配列テロメアの修復酵素であるテロメラーゼは、正常細胞内で過剰発現させることにより細胞老化時に認められるテロメア短縮を抑制し、細胞の寿命を延長できることが知られている(Bodnarら、Science,279:349−352,1998)。またテロメラーゼは、細胞内で過剰発現させても不死化又は癌化を導くものではないことが示されている(真貝 洋一、実験医学、16巻18号増刊:25−30、1998、羊土社、Jiangら、Nature Gent.,21:111−114,1999)。それゆえ、本発明の方法によりヒトテロメラーゼ(hTERT)をコードする遺伝子をHACベクター上に導入し標的となる細胞へ移入することにより、HAC移入細胞の寿命を延長し、不死化又は癌化させることなく治療効果を長期間持続させることが可能である。また、遺伝子発現制御を発現誘導系やゲノム領域を利用することにより、コンディショナル又は組織特異的/生理的なテロメラーゼ発現が可能である。
(B)自己抗体生成の抑制
組換え体タンパク質製剤を開発する場合、投与時の自己抗体(活性中和抗体)の生成が障害となっている(Liら、Blood,98:3241−3248,2001)。患者への投与方法を特に限定するものではないが、本発明の方法により作製した目的タンパク質をコードするゲノムを導入したHACベクターを、ヒト細胞、例えば産生組織の正常ヒト細胞へ移入後、これを患者へ移植する。該患者においてHACベクターから目的タンパク質を生理的/組織特異的に発現・供給することにより、患者における自己抗体生成の抑制が可能である。
また、組織特異的マイクロRNA(miRNA)標的部位を導入遺伝子に付加するなどにより(Brown BDら、Nature Medicine、第12巻、p585−591、2006年)、特定の組織・細胞において導入遺伝子を消失させることが可能であり、導入遺伝子に対する自己抗体生成の抑制、免疫応答回避が可能である。
(C)免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクター
再発白血病に対する治療法として、移植片対白血病反応により移植リンパ球が腫瘍特異的細胞傷害性T細胞として白血病細胞を攻撃することを応用したドナーリンパ球輸注療法(Kolbら、Blood,76:2462−2465,1990)が知られている。上記療法の副作用として、移植細胞がレシピエント組織を攻撃し障害を与える移植片対宿主病が知られているが、これに対するひとつの対処法として、ドナーリンパ球へのレトロウイルスによる薬剤誘導性の自殺遺伝子導入及び薬剤投与によるドナーリンパ球の除去が行われている(小野寺ら、ゲノム医学,3巻:45,2003,メディカルレヴュー社)。上記方法の場合、ドナーリンパ球の染色体に変異を与える危険性が残る。
本発明の方法により作製したHACベクターは、宿主染色体に変異を与えない免疫遺伝子細胞療法における遺伝子導入用ベクターとして利用することが可能である。また、抗腫瘍活性促進を目的とした治療、例えばリンパ腫におけるCD40リガンドによる免疫活性化療法(加藤ら、ゲノム医学,3巻:53,2003,メディカルレヴュー社)や遺伝子ワクチン療法など、における遺伝子導入用ベクターとしても利用することが可能である。
(D)モノクロナール完全ヒト抗体補充
近年ヒト抗体産生マウスを利用した、完全ヒトモノクロナール抗体医薬品の創製が試みられている(石田ら、Bioベンチャー、2巻:44、2002、羊土社、Moriら,Cell Death and Differentiation,in press,2003,Proceedings of American Association for Cancer Research,Volume 44,2nd Edition,July 2003,p1285,#6422)。しかし、これを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なTPO投与のため病院への通院が必要となり患者のQOLの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法により作製したHACベクター上に、目的の抗体を産生するハイブリドーマから単離した目的抗体をコードするゲノム領域を導入し、例えば患者造血幹細胞やB細胞へ上記HACベクターを移入後、患者へ再移植することにより、完全ヒト抗体を生理的発現制御により補充・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし患者のQOLを向上させることが可能である。
(E)単一遺伝性疾患における欠損補充
(E−1)血友病
血友病Aは、血液凝固第8因子の変異、血友病Bは血液凝固第9因子の変異が原因となって起こる、伴性劣性遺伝性出血疾患である。治療法として第8又は第9因子濃縮製剤投与による補充療法が有効であるが、出血後投与では重篤な合症が生じること、濃縮製剤への病原体混入の可能性、反復投与による自己抗体(活性中和抗体)の発生、常時出血への対処準備による患者QOLの低下、高額な医療費など課題は多く、遺伝子治療法による解決が期待されている。従来ベクターによる臨床遺伝子治療研究が行われているが、十分な発現を長期間持続できず有意な治療効果を得るに至っていない。また、レトロウイルス及びアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを直接投与する臨床研究において被験者の精液中にベクター遺伝子が検出され生殖細胞への遺伝子導入の危険性が指摘されている(望月ら、ゲノム医学,3巻:25,2003,メデイカルレヴュー社)。第8因子をコードする遺伝子は、全長ゲノムで約1.5Mb、cDNAで約7kbにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長cDNAの導入は可能であるが発現量の低下が、またAAVベクターでは、導入DNAサイズが約4.9kb以下に限られるため全長遺伝子を導入できないことが課題となっている。
本発明の方法により血液凝固第8因子又は第9因子をコードするDNAを導入したHACベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記HACベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、罹患者への移植により補充することが可能である。また、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記血液凝固第8因子又は第9因子のゲノム領域を導入したHACベクターを、例えばヒト細胞へ移入後、該細胞の罹患者への移植により、生理的組織特異的発現により該因子を補充することが可能である。
(E−2)X−SCID(X連鎖重症複合免疫不全症)
重症複合免疫不全症(SCID)は、液性及び細胞性免疫が先天的に障害される疾患である。SCIDの約半数がX連鎖のX−SCIDであり、その原因はインターロイキン2ファミリーの受容体が共有する共通γ鎖の変異であることが知られている。治療法として、造血幹細胞移植が行われているが、液性免疫の回復は不十分で免疫グロブリンの定期的投与が必要となる。そこで造血幹細胞へ共通γ鎖を導入し移植する遺伝子細胞治療法による解決が期待されている。1999年からレトロウイルスにより共通γ鎖を導入した造血幹細胞移植の臨床研究が行われていたが、近年フランスにおいて移植細胞の白血病化が複数例報告された(Hacein−Bey−Abinaら、N Engl J Med.,348:255−256,2003;Marshallら、Science,299:320,2003)。何れのケースも遺伝子導入細胞染色体中の原ガン遺伝子の一つであるLMO2遺伝子領域にベクター配列挿入変異が認められ、LMO2活性化と腫瘍化との関連が疑われている(久米ら、ゲノム医学,3巻:9,2003,メデイカルレヴュー社)。
本発明の方法により共通γ鎖をコードするDNAを導入したHACベクターを作製することが可能である。そして上記HACベクターを遺伝子導入用ベクターに用いることにより宿主染色体へのベクター配列挿入変異の危険を回避することが可能である。また、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記HACベクターを、ヒト細胞(例えばヒト骨髄由来正常造血幹細胞)へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現による共通γ鎖の欠損機能相補を行うことが可能である。
(E−3)デイシェンヌ型筋ジストロフィー;DMD
デイシェンヌ型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異によるジストロフィンの機能欠損が原因である、X連鎖劣性単一遺伝子性疾患の一つである(Hoffmanら、Cell,51:919−928,1987)。DMDの治療は、ジストロフィンが細胞骨格タンパク質であるため直接投与による補充は不可能であり、遺伝子治療法が期待されている。
ジストロフィン遺伝子は、全長ゲノムで約2.3Mb、cDNAで14kbにわたる。非ウイルスベクターやアデノウイルスベクターでは、全長cDNAの導入は可能であるが発現量の低下が課題となっている(Liuら、Mol.Ther.,4:45,2001;DelloRussoら,Proc Natl Acad Sci USA,99:12979−12984,2002)。またAAVベクターでは、導入DNAサイズが約4.9kb以下に限られるため全長遺伝子を導入できず、また骨格筋への遺伝子導入実験において免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められた(Yuasaら、Gene Therapy,9:1576−1588,2002)、などの課題が存在する。
遍在的な発現を誘導するCMVプロモーター制御下にジストロフィンミニ遺伝子を導入したAAVベクターによる骨格筋への遺伝子導入実験においては、免疫反応が引き起こされ導入遺伝子産物の発現低下が認められたが、プロモーターとして骨格筋特異的なMCKプロモーターを使用することにより上記免疫応答が改善された(Yuasaら、Gene Ther.,9:1576−1588,2002)。このことから、ジストロフィンの発現には生理的組織特異的発現が必要であることが示唆される。
本発明の方法によりジストロフィンをコードするゲノム領域を導入したHACベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記HACベクターを、ヒト細胞(特に限定するものではないが例えば自家ヒト正常筋芽細胞)へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現によるジストロフィン補充を行うことが可能である。
(E−4)適用対象疾患を特に限定するものではないが、例えば以下に示す単一性遺伝子疾患;α−1アンチトリプシン欠損症、嚢胞性繊維症(CFTR)、慢性肉芽腫症、家族性高コレステロール症、ファンコーニ貧血、ゴーシェ病、ハンター症候群、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ欠損症、ADA−SCID、白血球接着欠損症、Canavan病、脳梁萎縮、ファブリー病、筋萎縮性側索硬化症、リソソーム病、フォンヴィルブランド病、サラセミア、などにおいて、本発明の方法により原因遺伝子を導入したHACベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、欠損分子の補充・相補を行うことが可能である。なお、疾患原因遺伝子情報については、米国National Center for Biotechnology Information(NCBI)のオンライン文献データベース
PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed)
又はOMIMTM−Online Mendelian Inheritance in ManTM
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=OMIM)を参照されたい。
(F)その他疾患
(F−1)トロンボポイエチン(Thrombopoietin;TPO)は、血小板産生制御及び造血幹/前駆細胞の増殖を担う因子であり、例えば再生不良性貧血などの血液疾患、化学療法後の造血回復などへの適用が期待されている。しかし、TPO組換え体タンパク質投与時の活性中和抗体生成が医薬品開発の障害となっている(Liら、Blood,98:3241−3248,2001)。従って、TPOを慢性疾患へ適用する場合には、定期的なTPO投与のため病院への通院が必要となり患者のQOLの障害となることが予測される。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。
本発明の方法によりTPOゲノムを導入したHACベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的/組織特異的にTPOを発現・供給することにより、自己抗体生成を抑制することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし、患者のQOLを向上させることが可能である。
(F−2)エリスロポイエチン(Erythropoietin;EPO)は、赤血球増殖因子であり、例えば糖尿病や腎疾患における腎性貧血などの治療薬として市販されている。慢性疾患(例えば糖尿病による腎性貧血など)では定期的なEPO投与のため病院への通院が必要であり患者のQOLの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。本発明の実施例14に示したように、EPO cDNA導入したHACベクターをヒト正常繊維芽細胞へ移入し患者へ移植することにより、該患者においてEPOを発現・供給することが可能である。また、本発明の方法により、EPOゲノム領域を導入したHACベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的/組織特異的にEPOを発現・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし、患者のQOLを向上させることが可能である。
(F−3)パーキンソン病
パーキンソン病は、中脳黒質緻密部ドーパミン合成細胞の進行性の変性脱落により運動機能が障害される神経疾患である。治療法の一つとして、欠損したドーパミン補充を目的としたL−DOPA投与法があるが、中等以上の症状では薬効が減弱することや副作用による患者のQOL制限・投与量減少などの課題が存在する。これら課題は、ドーパミン濃度が線状体内で一定しないこと及び投与したL−DOPAが線状体以外で作用することに起因するため、線状体での一定したドーパミンの生理的発現が求められる(武田ら、メデイカルサイエンスダイジェスト、29巻:20、2003年、ニュー・サイエンス社)。現在、ドーパミン合成に関わる酵素3種類を各々導入したAAVベクターによる遺伝子治療研究がなされているが、いずれも生理的発現制御を行うまでには至っていない。また、ドーパミン合成細胞の変性脱落抑制を目的とした治療法にGDNF(Grial−cell Derived Neuronal Factor)投与があるが、被殻下にカテーテル留置による持続投与で効果が認められた(Gillら、Nature Med.,9:589−595,2003)一方で感染の危険性や患者のQOL制限などが課題となっている。AAVベクターによる遺伝子治療研究により動物モデルで効果が示された(Wangら、Gene Ther.,9:381−389,2002)が、こちらも生理的発現制御を行うまでには至っていない。
本発明の方法により、ドーパミン合成に関わる酵素群又はGDNFゲノム領域を導入したHACベクターを作製することが可能である。そして、患者への投与方法を特に限定するものではないが、上記HACベクターを、ヒト細胞(例えばヒト正常神経幹/前駆細胞)へ移入し、罹患者へ移植することにより、生理的組織特異的発現による導入遺伝子産物の補充が可能である。
(F−4)糖尿病
インスリン依存型糖尿病において、組換え体タンパク質製剤投与による治療が行われている。慢性疾患では定期的な投与のため病院への通院が必要であり、患者のQOLの障害となっている。また、組換え体タンパク質製剤の製造には多大なコストがかかり、その結果として高額な医療費負担が生じることも課題の一つとなっている。インスリンの血中濃度は至適範囲がせまいため、多すぎても少なすぎても副作用が生じ、時には生命の危険に至る場合がある。また、遺伝子治療の研究がなされているが、体内におけるインスリン濃度のコントロールが課題となっている(森谷ら、蛋白質 核酸 酵素、40巻:2764、1995、共立出版)。
本発明の方法によりインスリンゲノムを導入したHACベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、ヒト細胞、例えば産生組織の細胞、へ移入し、生理的/組織特異的に発現・供給することが可能である。また上記により定期的な通院治療回数を減らし患者のQOLを向上させることが可能である。
(F−5)適用対象疾患を特に限定するものではないが、例えば脳腫瘍、末梢動脈疾患(虚血など)、慢性間接リュウマチ、動脈再狭窄、肘部トンネル症候群、冠動脈疾患、アルツハイマー病、潰瘍、骨盤骨折、腎疾患、悪性腫瘍、などにおいて、本発明の方法に従って、疾患治癒に必要と考えられる物質をコードする遺伝子を導入したHACベクターを作製し、患者への投与方法を特に限定するものではないが、例えばヒト細胞へ移入して患者へ移植するなどによって、欠損分子の補充・相補を行うことが可能である。
(8)遺伝子導入動物作製用ベクターおよびHACベクターを有する非ヒト動物
本発明の方法により作製したHACベクターは、遺伝子導入動物作製用ベクターとして利用可能である。例えば、上記非特許文献5、6又は7の方法に従い、外来遺伝子を含む本HACベクターとしてマウス胚性幹細胞に移入しキメラ個体の作製が可能である。また移入した外来遺伝子を個体中で機能発現させること、及び上記外来遺伝子を含む本HACベクターをキメラ個体で安定に保持させ生殖系列を経て次世代伝達させることが可能である。また、さらに外来遺伝子を含む本HACベクターは、Kuroiwaら(2002年;上記)の方法に従い、体細胞核移植によりクローンウシ個体を作出し、個体中で安定に保持させ移入された外来遺伝子を個体中で機能発現させることが可能である。また、本願発明のHACを保持する動物を公知の手法(例えば、本出願人等による出願である、国際公開WO97/07671、WO03/041495及びWO03/097812に記載される、胚性幹細胞を使用する方法、核移植法など)によって作製することもできる。動物種としては特に限定はないが、好ましくは哺乳動物、特に好ましくはウシ、ヤギ、豚、羊、犬、ラット、マウス、サル、などが挙げられる。
なお、下記実施例1〜5においては、ヒト14番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトHACベクター(以下、「テロメア型14HAC」又は「14AΔqHAC」などという)を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例6〜11においては、ヒト14番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列及びヒト14番染色体に由来する約25Kbのサブテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトHACベクター(以下、「テロメア・短サブテロメア型HAC」又は「14NΔqHAC」などという)を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例12〜17においては、ヒト14番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列及びヒト14番染色体に由来する約60Kbのサブテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトHACベクター(以下、「テロメア・長サブテロメア型HAC」又は「14gNΔqHAC」などという)を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例18〜22においては、上記の3種のヒトHACベクター上のNeo耐性遺伝子ユニットの除去を行った。
下記実施例23〜25においては、ヒト21番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトHACベクター(以下、「テロメア型21HAC」又は「21AΔqHAC」などという)を作製し、その安定性及び導入された外来遺伝子の発現を確認した。
下記実施例26〜30においては、ヒト21番染色体の長腕遠位が削除され、長腕遠位にテロメア配列及びヒト21番染色体に由来する約8Kbのサブテロメア配列が付加され、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位が挿入されたヒトHACベクター(以下、「テロメア・サブテロメア型HAC」又は「21NΔqHAC」などという)を作製した。
実施例1
ヒト14番染色体長腕遠位の削除によるテロメア型14HAC(14AΔqHAC)ベクターの作製
(1)テロメアトランケーションによるヒト14番染色体長腕削除
(1−1)テロメアトランケーション用ベクターpTELpuro−t1の構築
ヒト14番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクター(ターゲティングベクター)は、pTELpuro(Kuroiwaら,Nature Biotech.(USA),第18巻,p.1086−1090,2000年)を用いた。GenBankデータベースより得たヒト14番染色体長腕遠位の塩基配列(登録番号AL391156)から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをPCR増幅するための、制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
ヒト14番染色体を保持するマウスA9雑種細胞(A9c11−14chr、Shinoharaら,Hum Mol Genet,10:1163−1175,2001年)を培養し、細胞からPuregene DNA Isolation kit(Gentra System社)を用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をPCR法により増幅した。鋳型として約0.1μgのゲノムDNAを使用し、Innisら(PCR実験マニュアル,HBJ出版局,1991)に従い、サーマルサイクラーはGeneAmp9700(Applied Biosystems社)を使用してPCRを行った。TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃10分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃10分を25サイクル、伸長72℃10分で行った。7791FNhe1/10680R(XhoI)による2.9kbの増幅産物を制限酵素NheI及びXhoIにて、10657F(XhoI)/14620RbamHIによる3.9kbの増幅産物を制限酵素XhoI及びBamHI(ロシュ)で消化して、突出末端をもつDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これをpTELpuroプラスミドのXbaI−BamHIサイトにクローニングした。最終的なpTELpuro−t1コンストラクトのサイズは約12.8kbである。テロメアトランケーションベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図2及び図3に示した。
(1−2)ヒト14番染色体保持DT40細胞へのテロメアトランケーションベクター導入
ヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞は、同染色体を保持する上記A9c11−14chr細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるDT40はJapanese Collection of Research Bioresources(JCRB)に登録番号JCRB2221として登録されており、入手可能である。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約1×108個のA9c11−14chr細胞からミクロセルを調製した。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が〜80%飽和程度まで培養したA9c11−14chr細胞をコルセミド(0.075μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20%ウシ胎仔血清;FBS,0.8mg/ml G418,DMEM)中で48時間培養して微小核を誘導した。実施例において、DMEMはニッスイ製薬製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温(34℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃,8000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルはDMEM6mlに再懸濁した。DT40細胞は、10%FBS、1%CS(仔ウシ血清)、0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液にて培養後、DMEMで2回洗浄し、1×107個をDMEM5mlに再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温、1500rpm,5分間遠心し、これにDT40細胞懸濁液を重層後、室温,1500rpm,5分間遠心し上清を取り除いた。ポリエチレングリコール(PEG)1:1.4溶液(Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133−143,1997年)で90秒間融合処理した。融合細胞を60mlの10%FBS、1%ニワトリ血清(ChS)、0.1mM 2−メルカプトエタノール(ME)を含むRPMI1640培養液(インビトロジェン製)に懸濁し、96穴プレートの6枚に播いて24時間培養した後、1mg/mlのG418を含む培地で約2週間選択培養した。2回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。PCR解析によりヒト14番染色体上に存在する領域NEK2P、LOC122727、AL390798、AL121820、AL157858、AL137190、AL137229、IGHMC、IGHV3、及びAB019437の存在を確認し、更にヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析により1コピーのヒト14番染色体を保持するクローンDT40(−14)1−2及びDT40(−14)2−4を確認し取得した。
pTELpuro−t1コンストラクトを制限酵素SrfI消化により線状化DNAとし、ヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞に導入した。1×107個のDT40(−14)1−2又はDT40(−14)2−4細胞を0.5mlのRPMI培地に懸濁し、30μgDNA存在下で室温10分間静置した後、ジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに550Vで印加、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温10分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、10%FBS、1%ChS、0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液に懸濁し、96穴プレート(ファルコン)20枚に播種した。24時間後に終濃度0.3μg/mlとなるようピューロマイシン(Puromycin dihydrochloride,シグマ)を加え、2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。DT40(−14)1−2では、2回のトランスフェクションから合計276の薬剤耐性コロニーを、またDT40(−14)2−4では4回のトランスフェクションから合計294の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ピューロマイシン耐性株ゲノムDNAを鋳型としてヒト14番染色体上に存在する遺伝子及びSTSマーカーD14S272及び以下の6遺伝子又はゲノム領域の存在をPCR法により確認した。STSマーカーのプライマーオリゴヌクレオチドの配列は米国National Center for Biotechnology InformationのオンラインデータベースUniSTS(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unists)において閲覧可能である。上記のSTSマーカーの登録番号はUniSTS:45129である。その他にGenBankデータベースより入手した塩基配列をもとに設計した遺伝子又はゲノム領域プライマーオリゴヌクレオチドの位置を図3(図中、プライマーを矢印で表す)に、配列を以下に示す:
なお、STSマーカーD14S282のプライマーは公知のものを使用した。
約0.1μgのゲノムDNAを鋳型として、上記6種の遺伝子又はゲノム領域とD14S272マーカーの計7種についてPCR増幅(Innisら,前記)を行った。TaqポリメラーゼはEx Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃5分の後、変性94℃15秒、アニーリング56℃30秒、伸長72℃30秒を35サイクル行った。テロメアトランケーションにより長腕遠位が削除された場合NEK2P、LOC122727、及び70−5を保持し、AL395409−AL395811、AL397258−397656、D14S272マーカー、及びIGHV3を保持しないことが予想される。AL397258−397656の有無で1次スクリーニングした後、残りのマーカー解析を行った。ピューロマイシン耐性570株のうち6株(DT40(−14)1−2由来5クローン、DT40(−14)2−4由来1クローン)において予想される増幅結果が得られた。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの標的配列内にプローブを設定した(図4)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した:
1次スクリーニングで得た6株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素SphI(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。代表的な結果を図5に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は相同組換え体で10.4kb、野生型(非組換え体)で11.1kbであり、候補6株から合計6株の相同組換え体を確認した。
(1−5)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)及びFITC標識したPGK−puro断片(pTELpuroベクターより切出して調製)をプローブに用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト14番染色体及びCot1で染まった短縮したヒト14番染色体長腕端に2個のFITCシグナルが検出された。代表的なFISH像を図6a及びbに示す。図6aにおいて白矢印はテロメアトランケーションを行う前の全長のヒト14番染色体を、図6bにおいて白矢印は長腕遠位を削除したヒト14番染色体断片を示している。宿主であるDT40細胞の染色体との相対的な大きさから、ヒト14番染色体が短縮したことを確認した。
以上より、得られたピューロマイシン耐性の6株(12t97、12t134、12t159、12t201、12t225、及び24t8)がヒト14番染色体を長腕削除により短縮した、テロメア配列を末端に持つ人工染色体(14AΔqHAC)を保持することを確認した。
(2)14AΔqHAC長腕近位へのクローニング部位の導入
(2−1)loxP及び3’neo配列挿入用t1pSF1ベクターの構築
実施例(1−1)で作製したヒト人工染色体(HAC)にloxP及び3’neo配列を挿入するための基本プラスミドには、pSF1(ライフテック)を用いた。loxP及び3’neo挿入部位であるヒト14番染色体長腕近位の塩基配列はGenBankデータベースより得た(登録番号AL391156)。相同組換えの2つの標的配列増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として2つの標的配列をPCRにより増幅した。約5kbのDNA断片制限酵素SalI(ロシュ)で、約2kbのDNA断片をFseI及びPacI(ロシュ)で消化し、突出末端をもつDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これらをpSF1▲3▼プラスミドのSalIないしFseI−PacIサイトにクローニングした。pSF1▲3▼ベクターは、pSF1プラスミドのXhoIサイトに、相同組換え体の選別に用いるブラストサイジン耐性遺伝子を、pCMV/Bsd(インビトロジェン)より制限酵素XhoI(ロシュ)及びSalI(ロシュ)消化により約1.3kbの断片として切り出し3’neo配列と逆の転写方向に導入しさらに上記のブラストサイジン耐性遺伝子導入pSF1コンストラクトをApaI(ロシュ)消化後平滑末端化した部位へSNESPFリンカー(SalI−NheI−EcoRV−SrfI−PacI−FseI)を導入して構築した。以下にSNESPFリンカーのDNA配列を示す。
最終的なコンストラクトのサイズは約13.4kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図7〜9に示した。なお、このようにして得られたコンストラクトをt1pSF1ベクターという。
(2−2)14AΔqHAC保持DT40細胞へのt1pSF1ベクター導入
t1pSF1コンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した14AΔqHACを保持するDT40雑種細胞に導入した。1×107個の12t97又は12t134細胞を0.5mlのRPMI培地に懸濁し、30μgDNA存在下で室温10分間静置した後、ジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに550Vで印加、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温10分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、10%FBS、1%ChS、0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液に懸濁し、96穴プレート(ファルコン)20枚に播種した。24時間後に終濃度8μg/mlとなるようブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride、フナコシ)を加え、2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。12t97では、2回のトランスフェクションから合計56の薬剤耐性コロニーを、また12t134では1回のトランスフェクションから合計43個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(2−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列(図7中、それぞれSalI−SalI配列及びPacI−FseI配列で示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図8中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は以下のとおり行った。5’genome解析;94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃10分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃10分を25サイクル、伸長72℃10分。3’genome解析;94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃6分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃6分を30サイクル、伸長72℃10分。PCR反応液にはMgSO4(終濃度0.5mM)で添加した。
得られたブラストサイジン耐性DT40細胞99株のうち12株が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約5kb及び3’genome約2kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(2−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの標的配列の外側にN5’(i)及びN3’(ii)の2種類のプローブを設定した(図9)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅し、単離、精製した。
1次スクリーニングで得た12株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素StuI(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。代表的な結果を図10に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析及び3’genome側解析ともに相同組換え体で24.6kb、野生型(非組換え体)で18.2kbである。ブラストサイジン耐性候補12株から合計7株の相同組換え体を確認した。
以上の(2−1)〜(2−4)の実験により、相同組換えによりクローニング部位(loxP配列)が挿入された14AΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞7株(12t97S1、12t97S38、12t134S1、12t134S2、12t134S3、12t134S5、及び12t159S1)を取得した。
(3)CHO細胞への14AΔqHACベクター移入
(3−1)ミクロセル法による14AΔqHACベクターのCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例1(2)で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位(loxP配列)が挿入された14AΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞(12t97S1、12t97S38、及び12t134S2)を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(登録番号JCRB9018)を用いた。
はじめに約109個のDT40雑種細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したDT40雑種細胞をコルセミド(0.05μg/ml,インビトロジェン)を含む培養液(10%FBS,1%ChS,0.1mM 2−メルカプトエタノール,RPMI1640)中で13〜18時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清DMEMに再懸濁し、予めポリL−リジンでコーティングした25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に藩種した。37℃1時間静置し細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器にフラスコを挿入し、34℃、8,000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した後、5mlのDMEMに懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温,1500rpm,5分間遠心し、これにDMEMで2回洗浄後5mlのDMEMに懸濁した約107個のCHO−K1細胞を重層後、室温,1500rpm,5分間遠心し上清を取り除いた。45%ポリエチレングリコール1500(PEG1500、ロシュ)10%DMSO(シグマ)を含むDMEM溶液で120秒間融合処理した。120mlの10%FBSを含むF12培地(インビトロジェン)に懸濁し、48穴プレート(ファルコン)5枚に播種し、24〜36時間後にブラストサイジン(8μg/ml)を含む選択培地(10%FBS,F12)で培養した。約2週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。6回の微小核細胞融合から計28株(12t97S1由来9株、12t97S38由来10株、12t134S2由来9株)のブラストサイジン耐性CHO株を得た。
(3−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。方法は、上記実施例1(2−3)に従って行った。得られたブラストサイジン耐性CHO細胞22株のうち20株が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約5kb及び3’genome約2kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(3−3)サザンブロット解析
移入した14AΔqHACベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例1(2−4)と同様に行った。代表的な結果を図11に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析及び3’genome側解析ともに相同組換え体で24.6kb、野生型(非組換え体)で18.2kbである。ブラストサイジン耐性候補20株から合計19株(12t97S1由来6株、12t97S38由来8株、12t134S2由来5株)の相同組換え体を確認した。
(3−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性CHO株のうち17株について解析した結果、計8株(12t97S1由来1株;−1、12t97S38由来4株;−3、−6、−8、−9、12t134S2由来3株;−3、−5、−6)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーの14AΔqHACベクターが検出された。代表的なFISH像及び14AΔqHACベクターの核型をそれぞれ図12A及びBに示す。
以上(3−1)から(3−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性CHO株8株が14AΔqHACベクターを保持することを確認した。
実施例2
14AΔqHACベクターのCHO細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
14AΔqHACベクターのCHO細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例1に記載したCHO細胞株3株(12t97S38−6,−8,−9、以後12t7Sを略してt7S38−6,−8,−9と表記する)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン8μg/mlを添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収しFISH用染色体標本を作製した。
(2)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。その結果を表1及び図13に示す。
14AΔqHACベクターは、CHO細胞において長期継代培養後も安定に保持されていた。また分裂中期の染色体像を観察したところ、細胞あたり1ないし2個のシグナルが検出された。
以上の(1)及び(2)の実験により、14AΔqHACベクターは、CHO細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例3
hEPO−14AΔqHACベクターのCHO雑種細胞でのhEPO遺伝子発現解析
(1)hEPO−14AΔqHACベクターの構築
(1−1)14AΔqHACベクターへのhEPO遺伝子の導入
実施例1で構築した14AΔqHACベクターへhEPO遺伝子発現ユニットを挿入する。具体的には、loxP配列を含むhEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。概略を図14に示す。
実施例1で作製した14AΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞(t7S1−1、t7S38−6、t7S38−8)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。loxP配列を含むhEPO発現プラスミドpLN1−EPO(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)10μgとCre酵素発現ベクターpBS185(ライフテック)10μgの存在下でジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%FBS添加したF12培地(インビトロジェン製)を含む48穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)5枚に播種した。2日後に0.8g/mlのG418(GENETICIN、インビトロジェン)を含む培地と置き換えた。2〜3週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計113個(t7S1−1由来6個、t7S38−6由来70個、t7S38−8由来37個)のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−2)PCR解析
hEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、14AΔqHACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにpLN1−EPOベクター上及び14AΔqHACベクター上に設計したプライマーSVpANp1及びNeo Rp2によって、また挿入されたhEPO遺伝子を、プラスミドベクターpBS226上のM13RV及びNeo Rp2プライマーによって、PCR増幅により確認した。プライマー配列及びPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbp、プライマーM13RV及びNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。その結果、上記(1−1)で得たG418耐性CHO雑種細胞から計65株(t7S1−1由来6株、t7S38−6由来37株、t7S38−8由来22株)において予想される増幅を確認した。以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞65株がloxP配列へのhEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14AΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図15に示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである(図15)。上記(1−2)で得たG418耐性候補CHO雑種細胞64株から合計33株(t7S1−1由来4株、t7S38−6由来13株、t7S38−8由来16株)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(2)14AΔqHACベクターへ挿入されたhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現を培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記実施例3(1−3)において単離したhEPO−14AΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞33株を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え2日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図16に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14AΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞33株全てにおいてhEPOの発現を確認した。また、その発現量は長腕削除型EPO−21ΔqHACを上回ることを示した。
(3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−3)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち14株について解析した。その結果、計9株(t7S1−1由来3株;E4、E5、E6、t7S38−6由来3株;E25、E30、E34、t7S38−8由来3株;E5、E7、E21)において観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−14AΔqHACベクターを検出した。代表的なFISH像とhEPO−14AΔqHACベクターの核型をそれぞれ図17A及びBに示す。
以上(1)の実験から、得られたG418耐性9株は、hEPO−14AΔqHACベクターを保持する正常核型のCHO細胞であることを確認した。
実施例4
hEPO−14AΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−14AΔqHACベクターのCHO細胞における安定性を確認するために、非選択条件下及び選択条件下(対照群)で長期継代培養を行った。実施例3で得たCHO雑種細胞3株(t7S38−6E25、t7S38−6E34、t7S38−8E5)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン8μg/mlを添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収し、hEPO遺伝子の発現及びFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。上記(1)で長期継代培養したhEPO−14AΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞3株について、実施例3(2)の方法に従って行った。その結果、上記hEPO−14AΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞3株全てにおいて長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。2連で行った実験結果の平均値を図18に示す。図18に示すクローン6E25、6E34及び8E5は、それぞれt7S38−6E25、t7S38−6E34及びt7S38−8E5を表す。
(3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記3株についてその結果を表2及び図18に示す。
以上の(1)から(3)の実験により、hEPO−14AΔqHACベクターは、長期継代培養後のCHO細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例5
hEPO−14AΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞でのhEPO遺伝子発現
(1)hEPO−14AΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
(1−1)微小核融合法によるhEPO−14AΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1への移入
染色体供与細胞として、実施例3で得られたhEPO−14AΔqHACベクターを保持するCHO細胞株のうち、微小核形成能が高いクローン(t7S38−6E25、t7S38−6E34及びt7S38−8E5)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。はじめに約107個のt7S38−6E25又はt7S38−8E5細胞からミクロセルを調製した。すなわち、25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)24本に細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養したt7S38−6E25又はt7S38−8E5細胞をコルセミド(0.1μg/ml,インビトロジェン)を含む培養液(20%FBS,0.8mg/mlG418,F12)中で3日間培養して微小核を誘導した。培地を除いた後、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、34℃,8,000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルは50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP(Difco)を含むDMEM2mlに再懸濁した。HFL−1細胞を90%飽和の状態まで培養した25cm2培養用フラスコ(ファルコン)2本に精製した微小核細胞を加え37℃にて15分間静置した後、45%ポリエチレングリコール1500(PEG1500、ロシュ)10%DMSO(シグマ)を含むDMEM溶液で1分間かけて融合した。20%FBSを含むDMEM培地にて24時間培養した後、トリプシン処理により細胞を分散し、コラーゲンIコート処理した48穴組織培養用プラスチックプレート(ファルコン)2枚に播種した。1日後にブラストサイジン(3μg/ml)を含む選択培地(20%FBS、DMEM)に置き換えた。約4週間の選択培養を行った。出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。28回(t7S38−6E25;13回、t7S38−6E34;2回、t7S38−8E5;13回)の微小核細胞融合から138個(t7S38−6E25由来;56個、t7S38−6E34由来;26個、t7S38−8E5;56個)の薬剤耐性コロニーを得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞としてt7S38−6E25細胞を用いて得た細胞をt25H細胞と、細胞を用いて得た細胞をt5H細胞と以下称する。
(1−2)PCR解析
hEPO−14AΔqHACベクターを保持するか否かを実施例3(1−2)のプライマーSVpANp1及びNeo Rp2を用いて、ヒト染色体をSTSマーカーD2S1334のプライマーを用いてKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従いPCR増幅により確認した。また、染色体供与CHO細胞の混入の有無をCHO furin遺伝子特異的プライマーfurin3’subF及びfurinEx6−28Rを用いてPCR増幅により確認した。設計したプライマー配列を以下に示す:
反応条件は、94℃5分の後、変性94℃20秒、アニーリング/伸長68℃3分間を32サイクル行った。hEPO−14AΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞で染色体供与CHO細胞の混入が無い場合に、プライマーSVpANp1及びNeoRp2により約1.0kbpの増幅、D2S1334プライマーにより約0.6kbpの増幅、furin3’subF及びfurinEx6−28Rによる増幅なし、が予想される。その結果、上記(1−1)で得たブラストサイジンン耐性株138株から計7株(t5H3、4、26、27、28、29、t25H2)において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のブラストサイジンン耐性株6株がhEPO−14AΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞であることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14AΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジンン耐性株のうち5株(t5H3、7、26、27、28)についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図19のAに示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。その結果、上記(1−2)で得たhEPO−14AΔqHACベクターを保持するブラストサイジンン耐性株5株全てにおいて予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト14番及び22番染色体特異的αサテライトDNAプローブ(Q−Biogene、フナコシ)を用いて行った。ブラストサイジン耐性株のうち3株(t5H3、26、28)について解析した結果、3株(t5H3、26、28)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の1対のヒト14番及び22番染色体セントロメア領域の4箇所と1コピーの14AΔqHACベクター由来の1箇所にシグナルが検出された。その結果を図20A及びBに示す。
以上(1−1)から(1−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性株3株はhEPO−14AΔqHACベクターを保持する正常核型のHFL−1細胞であることが確かめられた。
(2)hEPO−14AΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞におけるhEPO遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)において単離したhEPO−14AΔqHACベクターを保持するブラストサイジン耐性HFL−1細胞4株について、それぞれ約105細胞をブラストサイジン(3μg/ml)を含む選択培地(20%FBS、DMEM)1mlをいれたコラーゲンIコートした24穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地に置き換え更に24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。その結果を図21の「14A−HAC」の項目に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14AΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞3株全てにおいてhEPOの発現を確認した。
実施例6
ヒト14番染色体長腕遠位の削除による14HAC(14NΔqHAC)ベクターの構築
HACベクターがテロメア配列及びヒト14番染色体末端の短いサブテロメア配列(約5kb)を含有するように、長腕遠位及び近位にloxP配列を相同組換えにより挿入し、Creによる部位特異的組換え反応により2箇所のloxP配列間の領域を切出し削除して長腕遠位欠失人工染色体(14NΔqHAC)ベクターを構築する。
(1)部位特異的組換え反応によるヒト14番染色体長腕削除
(1−1)ヒト14番染色体長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターploxpPGK−14qtelの構築
loxP配列挿入用ベクター(ターゲティングベクター)には、ploxPupBSD(WO00/10383号)のKpnIサイトにKpnI*(サイトをつぶす配列)−SrfI−PacI−PmlI−KpnIリンカーを挿入したploxPupBSD―PGKを用いた。上記KpnI*−SrfI−PacI−PmlI−KpnIリンカーの塩基配列を以下に示す:
GenBankデータベースより得たヒト14番染色体長腕遠位の塩基配列(登録番号AB019437)から、ploxpPGK−14qtelベクター挿入の2箇所の標的配列を設計した。このTel側標的配列(合計約9.5kb)は、以下に示すようにA9/#14ゲノムをテンプレートとして4断片に分けてPCR増幅した後pUC18上へクローニングし、制限酵素消化により5’及び3’側標的配列断片を切出して作製した。
断片(i);0kb−2.9kb(5’端にSalIサイトを付加、3’端にはBamHIサイトが内在する)は、LA−PCRで増幅後、制限酵素SalI及びBamHIで消化しpUC18のSalI−BamHIサイトへ導入した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
断片(ii);2.3kb−5.4kb(5’端にBamHIサイトが、3’端にAccIサイトが内在する)は、LA−PCRで増幅後、制限酵素BamHI及びAccIで消化し、pBluescriptのBamHI−AccIサイトへ導入した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
断片(iii);4.5kb−6.7kb(5’端にAccIサイトが、3’端にKpnIサイトが内在する)は、LA−PCRで増幅後、制限酵素AccI及びKpnIで消化し上記断片(ii)を含むpBluescriptのAccI−KpnIサイトへ導入した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
断片(iv);6.3kb−9.5kb(5’端にKpnIサイトが内在し、3’端にEcoRIサイトを付加)は、LA−PCRで増幅後、制限酵素KpnI及びEcoRIで消化し上記断片(i)を含むpUC18のKpnI−EcoRIへ導入した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
上記の断片(ii)及び(iii)を含むpBluescriptを制限酵素BamHI及びKpnIで消化し、上記の断片(i)及び(iv)を含むpUC18のBamHI−KpnIサイトへ導入し、Tel側標的配列(合計約9.5kb)をクローニングした。PCRは、実施例1(1−1)の方法に従い、ヒト14番染色体を保持するマウスA9雑種細胞(A9c11−14chr)のゲノムDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて、TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性94℃30秒、アニーリング60℃30秒、伸長72℃3分を30サイクル、伸長70℃10分で行った。
5’領域(tel側)4.4kbは上記Tel側標的配列(合計約9.5kb)を含むpUC18を制限酵素SphI消化により線状化し、KpnI−SphIリンカー付加後、制限酵素KpnI及びApaIで消化し、精製して上記ploxPupBSD−PGKベクターのKpnI−ApaIサイトへクローニングした。KpnI−SphIリンカーの配列を以下に示す:
また、3’領域(cen側)4.0kbは、Tel側標的配列(合計約9.5kb)を含むpUC18から制限酵素EcoRI消化しpBluescriptのEcoRIサイトへサブクローニングした後、制限酵素HindIIIで消化後平滑末端化し、更に制限酵素BamHIで消化し精製して、上記5’領域(tel側)4.4kbを含むploxPupBSD−PGKベクターのNheI−EcoRVサイトへクローニングした。最終的なploxpPGK−14qtelコンストラクトのサイズは約15.7kbである。ploxpPGK−14qtelベクターを図22に、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図23に示した。
(1−2)ヒト14番染色体保持DT40細胞への長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターploxpPGK−14qtelベクター導入
実施例1(1−2)の方法に従い、ploxpPGK−14qtelコンストラクトを制限酵素SrfI消化により線状化DNAとし、ヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞DT40(#14)2−4に導入した。ブラストサイジン(終濃度8ug/ml)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。2回のトランスフェクションから合計480個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在を実施例6(1−1)の方法に従い、PCR法により検出した。2つの標的配列(図23中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対
を設計した。その位置は図24に矢印で示した。その配列を以下に示す:
上記ブラストサイジン耐性480株のうち3株において5’及び3’側の2標的配列の存在を確認した。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの5’及び3’側の2標的配列外側にプローブ(IGH5’及びIGH3’)を設定した(図23)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した:
1次スクリーニングで得た3株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素BstEII(5’側)又はBamHI(3’側)により(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。代表的な結果を図25に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で14.0kb、野生型(非組換え体)で10.6kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で7.4kb、野生型(非組換え体)で9.0kbであり、候補3株から合計2株(24G8、24G94)の相同組換え体を確認した。
(2)ヒト14番染色体長腕近位セントロメア側へのloxP配列挿入
(2−1)ヒト14番染色体長腕近位セントロメア側loxP配列挿入用ベクターploxPHYGOR/n1の構築
loxP配列挿入用ベクター(ターゲティングベクター)には、ploxPdownPURO(WO00/10383号)のFseIサイトにFseI*(サイトをつぶすような配列)−PmlI−PacI−SrfI−FseIリンカーを挿入したploxPdownPURO−HYGを用いた。上記FseI*−PmlI−PacI−SrfI−FseIリンカーの塩基配列を以下に示す:
GenBankデータベースより得たヒト14番染色体長腕遠位の塩基配列(登録番号AL391156)から、ploxPHYGOR/n1ベクター挿入用の2箇所の標的配列を設計した。これをPCR増幅するための、制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
実施例1(1−1)の方法に従い、ヒト14番染色体を保持するマウスA9雑種細胞(A9c11−14chr)のゲノムDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて5’及び3’側の2つの組換え標的配列をPCR法により増幅した。TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用いた。5’側標的配列用の反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃10分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃10分を30サイクル、伸長70℃10分で行った。また、3’側標的配列用の反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃6分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃6分を30サイクル、伸長70℃10分で行った。3’側標的配列用2.0kbの増幅産物は、FseI及びPacI消化しploxPdownPURO−HYGベクターのFseI−PacIサイトへクローニングした。また、5’側標的配列5.0kbの増幅産物は、制限酵素SalIで消化し、上記の2.0Kbの標的配列を持つploxPdownPURO−HYGベクターのSalIサイトへクローニングした。最終的なploxPHYGOR/n1コンストラクトのサイズは約16.1kbである。ploxPHYGOR/n1ベクターを図26に、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図27に示した。
(2−2)ploxpPGK−14qtelを導入したヒト14番染色体保持DT40細胞への長腕近位セントロメア側loxP配列挿入用ベクターploxPHYGOR/n1ベクター導入
実施例1(1−2)の方法に従い、ploxPHYGOR/n1コンストラクトを制限酵素SrfI消化により線状化DNAとし、実施例7(1−4)で作製したploxpPGK−14qtelを導入したヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞24G8及び24G94に導入した。ピューロマイシン(終濃度0.3ug/ml)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。6回のトランスフェクションから合計230個(24G8由来50個、24G94由来180個)のピューロマイシン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(2−3)PCR解析
ピューロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在を実施例6(2−1)の方法に従い、PCR法により検出した。2つの標的配列(図27中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図28中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
上記ブラストサイジン耐性230株のうち34株(24G8由来14株、24G94由来20株)において5’及び3’側の2標的配列の存在を確認した。
(2−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの5’及び3’側の2標的配列外側にプローブ(N5’(i)及びN3’(i))を設定した(図27)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した:
1次スクリーニングで得た34株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素StuI(ロシュ)により消化し、実施例6(1−4)と同様に行った。代表的な結果を図29に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で12.5kb、野生型(非組換え体)で18.2kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で10.2kb、野生型(非組換え体)で18.2kbであり、候補34株から合計22株(24G8由来14株、24G94由来8株)の相同組換え体を確認した。これらのうち、24G8由来のクローン24G8n7及び24G94由来のクローン24G94n18及び24G94n56を次のステップ(3)へ進めた。
(3)Cre−loxP部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(3−1)長腕遠位及び近位へloxP配列挿入したヒト14番染色体保持DT40雑種細胞へのCre発現ベクターの導入
実施例1(1−2)の方法に従い、Cre発現ベクターpCAGGS−Creを実施例6(2)で取得した24G8n7及び24G94n18及び24G94n56細胞に導入した。ハイグロマイシン(終濃度1.25mg/ml)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
24G8n7細胞においては、2回のトランスフェクションから合計54個のハイグロマイシン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。24G94n18及び24G94n56細胞においては、10クローンを1プールにまとめ、それぞれ20プールを増殖させ以後の解析を行った。
(3−2)PCR解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として2つのloxP配列間の欠失をPCR法により確認した。長腕遠位欠失後に残ったloxP配列を夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図30A中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
TaqポリメラーゼはEx Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性94℃15秒、アニーリング60℃30秒、伸長72℃1分を35サイクルで行った。LoxP配列間の欠失により長腕遠位が削除された場合、約0.8kbの増幅が予測される。その結果、上記24G8n7細胞由来のハイグロマイシン耐性54株のうち16株において、また24G94n18及び24G94n56細胞由来の各20プール全てにおいて予測される増幅産物を確認した。
(3−3)サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行った。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図30A及び図30Bに示した。相同組換えの5’及び3’側の2標的配列外側にプローブ(IGH5’(i)及びN3’(i))を設定した。
1次スクリーニングで得た24G8n7細胞由来の16株及び24G94n18細胞由来の20プール及び24G94n56細胞由来の10プールからゲノムDNAを抽出し実施例6(1−4)と同様に行った。制限酵素(ロシュ)消化は、BstEII(5’側)又はStuI(3’側)により行った。代表的な結果を図31に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で7.6kb、野生型(非組換え体)で14.0kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で8.3kb、野生型(非組換え体)で10.2kbである。その結果、24G8n7細胞由来の12株及び24G94n56細胞由来の10プールにおいて長腕遠位欠失体を確認した。
(3−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)及び実施例6(1−1)で作製したploxpPGK−14qtelベクターから制限酵素HindIIにより消化、切出し精製した約4.2kbの5’標的配列断片をプローブに用いて行った。上記(3−3)で取得した24G8n7細胞由来の4クローン(G8n7Δc2/c5/d1/d4)及び24G94n56細胞由来の4プール(G94n56Δp21/p25/p28/p30)について解析した結果、全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーのシグナルと短縮された長腕の末端に2個のシグナルを検出した。代表的なFISH像を図32A及びBに示す。
以上(3−1)から(3−4)の実験から、得られたハイグロマイシン耐性DT40雑種細胞は、テロメアを残して長腕遠位を削除したヒト14番染色体断片(14NΔqHAC)を保持することを確認した。
(4)14NΔqHAC長腕近位へのクローニング部位の導入
(4−1)loxP及び3’neo配列挿入用pSF(G+n1)ベクターの構築
上記実施例6(3)で作製したヒト人工染色体(HAC)にloxP及び3’neo配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例1(2−1)で作製したpSF1▲3▼を用いた。loxP及び3’neo挿入部位である相同組換えの5’側標的配列は上記実施例7(1−1)で取得したploxpPGK−14qtelベクターで用いた配列から、3‘標的配列はGenBankデータベースより得たヒト14番染色体長腕近位の塩基配列(登録番号AL391156)から設計した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
5’側標的配列は、ploxpPGK−14qtelベクターからXbaI及びSnaBI(ロシュ)で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、pSF1▲3▼プラスミドのNheI−SalIIサイトにクローニングした。また3’側標的配列は、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅した。この約5.0kbのDNA断片を制限酵素FseI(ロシュ)で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、上記5’標的配列を挿入したpSF1▲3▼プラスミドのFseIサイトにクローニングした。最終的なpSF1(G+n1)コンストラクトのサイズは約15.0kbある。ターゲティングベクターを図33に、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図34Aに示した。
(4−2)14NΔqHAC保持DT40細胞へのpSF(G+n1)ベクター導入
pSF(G+n1)コンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した14NΔqHACを保持するDT40雑種細胞6種(G94n56Δp21/p25/p28/p30、G8n7Δc2/c5)にそれぞれ導入した。方法は、実施例1(2−2)に従って行った。2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。G94n56Δp21/p25/p28/p30では、各2回のトランスフェクションから合計321個(それぞれ117/153/46/7個)の薬剤耐性コロニーを、またG8n7Δc2/c5では各1回のトランスフェクションから合計191個(それぞれ96/95個)の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
(4−3)PCR解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列(図34中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図34中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、PCR反応液にはMgSO4(終濃度0.5mM)で添加した。反応条件は94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃8分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃8分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃8分を30サイクル、伸長72℃10分で行った。
得られたブラストサイジン耐性株のうち12株が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約4.5kb及び3’genome約5.0kb)の増幅産物を与えることを確認した(G94n56Δp21/p25/p28/p30由来;2/1/2/2、計7株、G8n7Δc2/c5由来;1/4、計5株)。
(4−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためサザンブロット解析を行った。プローブは、相同組換えの標的配列の外側にIGH5’(i)(実施例6(1−4))及び3’側の標的配列外側にプローブN3’(ii)を設定した(図34)。N3’(ii)プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した:
1次スクリーニングで得た12株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素BstEII(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。代表的な結果を図35に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析で相同組換え体19.8kb、野生型(非組換え体)で7.6kb、3’genome側解析で相同組換え体19.8kb、野生型(非組換え体)で8.8kbである。ブラストサイジン耐性候補12株から合計5株の相同組換え体を確認した。
以上の(4−1)〜(4−4)の実験により、相同組換えによりクローニング部位(loxP及び3’neo配列)が挿入された14NΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞5株(G94n56Δp21S39、G94n56Δp25S61、G94n56Δp28S7、8、G8n7Δc2S202、G8n7Δc5S90)を取得した。このうち、G94n56Δp21S39、G94n56Δp25S61、G8n7Δc2S202、G8n7Δc5S90(以下G4S39、G4S61、G8S202、G8S90と略称する)の4株を次のステップへ進めた。
(5)CHO細胞への14NΔqHACベクター移入
(5−1)ミクロセル法による14NΔqHACベクターのCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例6(4)で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位(loxP及び3’neo配列)が挿入された14NΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞(G4S39、G4S61、G8S202、G8S90)をそれぞれ用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(登録番号JCRB9018)を用いた。方法は、実施例1(3−1)に従って行った。約2週間の選択培養の後、出現したブラストサイジン耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。8回(G4S39;2回、G4S61;2回、G8S202;2回、G8S90;2回)の微小核細胞融合から計92株(G4S61由来19株、G4S39由来23株、G8S90由来22株、G8S202由来28株)のブラストサイジン耐性CHO株を得た。
(5−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。方法は、実施例6(4−3)に従って行った。またDT40細胞の混入チェックのためトリβアクチン検出用プライマーをGenBankデータベースより得たトリβアクチン遺伝子の塩基配列(登録番号X00182)から設計した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
TaqポリメラーゼはEx Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性94℃15秒、アニーリング56℃30秒、伸長72℃30秒を35サイクルで行った。得られたプラストサイジン耐性CHO細胞株のうち67株(G4S61由来15株、G4S39由来23株、G8S90由来20株、G8S202由来9株)において、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約4.5kb及び3’genome約5.0kb)の増幅産物を与えること及びDT40細胞の混入が無いことを確認した。
(5−3)サザンブロット解析
移入した14NΔqHACベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例6(4−4)と同様に行った。代表的な結果を図36に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析で相同組換え体19.8kb、野生型(非組換え体)で7.6kb、3’genome側解析で相同組換え体19.8kb、野生型(非組換え体)で8.8kbである。ブラストサイジン耐性候補74株(G4S61由来14株、G4S39由来16株、G8S90由来20株、G8S202由来24株)から合計52株(G4S61由来14株、G4S39由来16株、G8S90由来15株、G8S202由来7株)の相同組換え体を確認した。
(5−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性CHO株のうち23株(G4S61由来7株、G4S39由来11株、G8S202由来1株、G8S90由来4株)について解析した結果、計9株(G4S61−1、6、8、9、11、12、G4S39−13、G8S90−2,4)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーの14NΔqHACベクターが検出された。代表的なFISH像と14NΔqHACベクターの核型をそれぞれ図37A及びBに示す。
以上(5−1)から(5−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性CHO株9株は14NΔqHACベクターを保持することが確かめられた。
実施例7
(7−1)14NΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
14NΔqHACベクターのCHO雑種細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例6に記載した14NΔqHACベクターを保持するCHO細胞株2株(G4S39−13、G4S61−1)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン8μg/mlを添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収しFISH用染色体標本を作製した。
(2)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記2株についてその結果を表3及び図13に示す。図13においては、「14ΔqHAC(G)」の項目に示す。
以上の(1)及び(2)の実験により、14NΔqHACベクターは、CHO細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
(7−2)EPO導入14AΔqHACベクター保持CHO細胞移植によるインビボEPO薬効
実施例3で作製した、EPO導入14AΔqHACベクターを保持するCHO細胞クローンt7S38−8E5を免疫細胞遮断カプセルへ封入後、B細胞欠損により抗体産生できないIgμ−/−ノックアウトマウス(Tomizuka,K.,et al.,PNAS,97,722−727,2000)皮下へ移植し、末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリットの値を解析することによりt7S38−8E5細胞から供給されるEPOのインビボでの薬効評価を行った。上記3つの値が細胞カプセル移植群において対照群と比べ上昇すればEPO薬効有りと判断できる。
EPO導入14AΔqHACベクター保持CHO細胞クローンt7S38−8E5を実施例3の方法に従って培養し、1x106個を免疫細胞遮断カプセルTheraCyte immunoisolation 40μl device(TheraCyte Inc.、Irvine,CA)へ添付のプロトコールに従って封入した。このカプセルをIgμ−/−ノックアウトマウス左背皮下へアバチン麻酔下で移植し、移植後経時的に眼窩採血して末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリット値をADVIA120(バイエルメディカル社)により測定した。対照群としてカプセルなしの手術のみの群を実施した。その結果を図87に示す。
移植後2週から細胞カプセル移植群において赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリット値が上昇し、最大44週まで上記の上昇した値が維持された。以上により、EPO−14AHAC保持CHO細胞移植による長期のインビボEPO薬効が示された。
(7−3)EPO導入14HACベクター保持ヒト正常線維芽細胞移植によるインビボEPO薬効
下記実施例19で作製した、EPO導入14AΔqΔneoHACベクターを保持するヒト正常線維芽細胞HFL−1細胞クローンtΔ63Hから選択したtΔ63H15、またはtΔ63H15と同様の方法で作製したHFL−1細胞クローンtΔ47H27,30,37を免疫細胞遮断カプセルへ封入後、B細胞欠損により抗体産生できないIgμ−/−ノックアウトマウス皮下へ移植し、末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリットの値を解析することにより、上記HFL−1クローンから供給されるEPOのインビボでの薬効評価を行った。上記3つの値が細胞カプセル移植群において対照群と比べて上昇すればEPO薬効有りと判断できる。
EPO導入14−HAC保持HFL−1細胞クローンtΔ63H15、またはtΔ47H27,30,37を下記実施例19の方法に従って培養し、106個の上記細胞をコラーゲンIビーズ(KOKEN)とともに免疫細胞遮断カプセルTheraCyteimmunoisolation 40μl device(TheraCyteInc.、Irvine,CA)へ添付のプロトコールに従って封入した。なお、細胞とビーズは準備したカプセルへ1mlシリンジ(テルモ)にシリコン封入用アダプターを装着してカプセルポート(封入口)へ接続しカプセル内へ入れた。このカプセルを6ウェルプレートにてDMEM−20%FBS培地を用いて37℃6.5% CO2で2〜6週間培養後、移植2日前および移植当日にヒトbFGF(0または10ng/ml)入り培地に交換して更に培養した。上記(7−2)と同様にしてIgμ−/−ノックアウトマウス左背皮下へ移植し、移植後経時的に眼窩採血して末梢血中の赤血球数・ヘモグロビン・ヘマトクリット値をADVIA120(バイエルメディカル社)により測定する。
上記のように、EPO−14HACを保持するヒト正常線維芽細胞移植によって長期インビボEPO薬効を確認・実施することができる。
(7−4)14HACベクターのマウスにおける子孫伝達
14HACベクターのインビボにおける安定性および子孫伝達を検証するために、EGFPを導入した14HACベクターを作製し、マウスES細胞へミクロセル法により移入後、キメラマウスを作製・交配して、マウス体細胞におけるHAC保持率を解析した。
(1)EGFP−14HACベクターの構築
CAGプロモーター支配下にEGFP遺伝子を配置したプラスミドpLN1−IRES−EGFPを作製し、CHO細胞においてCre−loxPシステムにより14AΔq−HAC及び14NΔq−HACベクター上へEGFP遺伝子発現ユニットを導入した。
(1−1)EGFP発現プラスミドpLN1−IRES−EGFPの作製
pLN1−IRES−EGFP作製に先立って、pLN1−PGK−EGFPを作製した。これは、2ステップで行った。まずステップ1は、pLN1−EPO(KakedaらGene Therapy;12:852−856,2005年)のCMV−5’neo領域のCMVプロモーターをPGKプロモーターに置き換えて作製したプラスミドpLN1−PGKEPOをSalI消化後平滑化し、さらにEcoRI消化によりEPO発現ユニットを除去した。ここへpEGFP−N1(クロンテック)をAflII消化後平滑化、さらにEcoRI消化により調製したEGFP−Sv40polyAユニットを導入した。次のステップ2は、ステップ1をSalI−BamHI消化したところへ、pCAGGS−Cre(Arakiら、PNAS,92,160−164,1995)をSalI−XbaI消化により調製したCAGプロモーター前半部分と、pCAGGS−Creを鋳型にしてPCR増幅とXbaI−BamHI消化により調製したCAGプロモーター後半部分を同時に導入した。以下にPCRで用いたプライマー配列を示す。
次に、pLN1−IRES−EGFPを作製した。pLN1(KakedaらGene Therapy;12:852−856,2005年)をEcoRI−NcoI消化し、CMVプロモーター及びSv40polyAを除去した。ここへ、pLN1−PGK−EGFPのEcoRI−NotI消化により調製したCAGプロモーター及びEGFPを含む断片と、pcDNA3.0(インビトロジェン)由来のIRES配列を鋳型にしてPCR増幅したDNA断片をNotI−NcoI消化により調製したIRES断片を同時に導入した。以下にPCRで用いたプライマー配列を示す。
最終的なpLN1−IRES−EGFPコンストラクトのサイズは約5.7kbである。
(1−2)14AΔqHACベクターへのEGFP遺伝子発現ユニットの導入
14AΔqHAC及び14NΔqHACベクターへEGFP配列を含むEGFP遺伝子発現ユニットを挿入する。loxP配列を含むEGFP発現プラスミドpLN1−IRES−EGFPを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。14AΔqHACベクターを保持するCHO細胞t7S38−6及び14NΔqHACベクターを保持するCHO細胞G4S39−13(実施例8)を用いて、実施例3または8の方法に従って行った。2〜3週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計80個(1t7S38−6由来40個、G4S39−13由来40個)のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
EGFP遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、14AΔq−HAC及び14NΔq−HACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにpLN1−IRES−EGFPベクター上及び14AΔqHAC及び14NΔq−HACベクター上に設計したプライマーEGFP374FおよびNeo Rp2によって、PCR増幅により確認した。概略を図88に示した。
組換え挿入体の場合は、プライマー EGFP 374FおよびNeo Rp2により約1.2kbpの増幅が予想される。その結果、上記(1−2)で得たG418耐性CHO雑種細胞から計80株(t7S38−6由来40株、G4S39−13由来40株)において予想される増幅が確認された。以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞計80株がloxP配列へのEGFP遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
(1−4)サザンブロット解析
EGFP−14AΔq−HAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターにおいてEGFP発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。プローブは、EGFPコード領域の塩基配列78〜395番目の318bpをPCR増幅して作製した。用いたプライマー配列を以下に示す。
塩基配列から予想されるEcoRI消化による制限酵素断片長は、EGFP発現ユニットを含む7.5kbである。概略を図89に示した。
上記(1−3)で得たG418耐性候補CHO雑種細胞80株から合計70株(t7S38−6由来34株、G4S39−13由来36株)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−5)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−4)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち15株(t7S38−6由来8株、G4S39−13由来7株)について解析した。その結果、計11株(t7S38−6由来6株;t6EGI−2,6,9,11,24,30、G4S39−13由来5株;G13EGI−1,5,15,17,20)において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのEGFP−14AΔqHAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターを検出した。
以上(1−1)から(1−5)の実験から、得られたG418耐性11株はEGFP−14AΔq−HACベクターを保持する正常核型のCHO細胞(t6EGI−2,6,9,11,24,30)及びEGFP−14NΔq−HACベクターを保持する正常核型のCHO細胞(G13EGI−1,5,15,17,20)であることを確認した。
(2)EGFP −14AΔqHAC又はEGFP−14NΔqHACベクター移入マウスES細胞の作製
(2−1)マウスES細胞TT2FへのEGFP −14HACベクター移入
上記(1)で作製したCHOクローンt6EGI−11,t6EGI−24,G13EGI−1,G13EGI−5(以下それぞれt11,t24,G1,G5と記す)をHACドナー細胞として、ミクロセル法により(Tomizukaら,Nature Genetics,16,133−143,1997)EGFP −14AΔq−HACベクター又はEGFP−14NΔq−HACベクターをマウスES細胞TT2Fへ移入した。その結果、1〜2週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計12個のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(2−2)PCR解析
上記(7−4)(1−3)の方法によりEGFP−14AΔqHAC及びEGFP−14NΔqHACベクター移入クローン選別のためにPCR解析を行った。その結果、上記(2−1)で単離したG418耐性マウスES雑種コロニー全てにおいて予想される増幅が確認された。以上より、上記のG418耐性マウスES雑種細胞12株がEGFP−14AΔqHAC及びEGFP−14NΔqHACベクターを保持することを確認した。
(2−3)サザンブロット解析
EGFP−14AΔq−HAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターにおいてEGFP発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記(7−4)(1−4)と同様にしてサザンブロット解析を行なった。その結果、上記(2−2)で得たG418耐性候補マウスES雑種細胞12株から合計11株において予測されるサイズのバンドを確認した。
(2−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−4)で得たG418耐性マウスES雑種細胞のうち8株(1−t11,2−t11,3−t11,4−t11,32−G1,33−t24,34−t24,35−t24)について解析した。その結果、計6株において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのEGFP−14AΔqHAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターを検出した。
以上(2−1)から(2−4)の実験より、得られたG418耐性マウスES雑種細胞5株(1−t11,2−t11,3−t11,33−t24,34−t24)はEGFP−14AΔq−HAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターを保持する正常核型のマウスES細胞であることを確認した。
(3)キメラマウスにおける14HACベクターの保持率
(2)で得られたEGFP−14HACを保持するG418耐性マウスES雑種細胞を用いて、(Tomizukaら,Nature Genetics,16,133−143,1997)の方法に従って行い、キメラマウスを取得した。キメラマウスにおける14HACベクター保持を確認するために上記(7−4)(2−2)の 方法及び下記のプライマーセットを用いてPCR解析を行った(概略は図88)。
その結果、得られたキメラマウスにおいて予想される増幅を確認した。まとめを図90に示す。以上より、上記のキメラマウス体細胞においてEGFP −14AΔq−HAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターが保持されていることを確認した。
(4)EGFP−14AΔq−HAC及びEGFP−14NΔq−HACベクターの子孫伝達
上記(3)で得られたキメラマウス(雌)とC57BL6マウス(雄)とを交配し、EGFP−14AΔqHAC及びEGFP−14NΔqHACベクターの子孫伝達を検証した。方法は上記(7−4)(3)と同様にPCR解析を行い、HACの保持を指標に評価した。その結果、EGFP−14AΔqHACベクターは、F1マウスにおいて46.6%(N=133)、F2マウスにおいて36.9%(N=84)で、EGFP−14NΔqHACベクターは、F1マウスにおいて59.4%(N=79)の個体においてにおいて予想される増幅を確認した。以上より、EGFP−14AΔqHAC及びEGFP−14NΔqHACベクターの子孫伝達を確認した。
さらに、上記で得られたEGFP−14AΔqHACベクターを保持するF1マウス(雄)と(雌)とを交配し、仔マウス尾線維芽細胞を採取培養後、カルノア固定し、FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。その結果、尾線維芽細胞中に2コピーのEGFP−14AΔqHACベクターを保持する個体を確認した。
実施例8
hEPO−14NΔqHACベクターのCHO雑種細胞でのhEPO遺伝子発現解析
(1)hEPO−14NΔqHACベクターの構築
(1−1)14NΔqHACベクターへのhEPO遺伝子の導入
実施例6で構築した14NΔqHACベクターへhEPO遺伝子発現ユニットを挿入する。loxP配列を含むhEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。実施例6で作製した14NΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞(G4S61−1、9、G4S39−13、G8S90−4)を用いて、実施例3(1−1)と同様にしてhEPO遺伝子発現ユニットの挿入を行った。2〜3週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計246個(G4S61−1由来61個、G4S61−9由来75個、G4S39−13由来73個、G8S90−4由来37個)のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−2)PCR解析
hEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、14NΔqHACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにpLN1−EPOベクター上及び14NΔqHACベクター上に設計したプライマーSVpANp1及びNeo Rp2によって、また挿入されたhEPO遺伝子を、プラスミドベクターpBS226上のM13RV及びNeo Rp2プライマーによって、PCR増幅により確認した。プライマー配列及びPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbp、プライマーM13RV及びNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。その結果、上記(1−1)で得たG418耐性CHO雑種細胞から計116株(G4S61−1由来31株、G4S61−9由来34株、G4S39−13由来35株、G8S90−4由来16株において予想される増幅が確認された。以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞116株がloxP配列へのhEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14NΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図38に示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。上記(1−2)で得たG418耐性候補CHO雑種細胞計130株(G4S61−1由来36株、G4S61−9由来40株、G4S39−13由来35株、G8S90−4由来19株)から、計60株(G4S61−1由来13株、G4S61−9由来18株、G4S39−13由来19株、G8S90−4由来10株)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−3)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち23株について解析した。その結果、計15株(G4S61−1E6、9、G4S61−9E28、34、35、65、G4S39−13E3、4、5、16、55、61、71、G8S90−4E16、18と以下称する)において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−14NΔqHACベクターを検出した。代表的なFISH像を図39Aに、また核型を図39B及び図41に示す。図41に示す13E4、13E55、IE6及び4E16は、それぞれG4S39−13E4、G4S39−13E56、G4S61−1E6及びG8S90−4E16を表す。
以上(1−1)から(1−4)の実験から得られた上記のG418耐性CHO雑種細胞15株は、hEPO−14NΔqHACベクターを保持する正常核型のCHO細胞であることを確認した。
(2)14NΔqHACベクターへ挿入されたhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1−3)において単離したhEPO−14NΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞48株(G4S61−1E由来11株、G4S61−9E由来16株、G4S39−13由来19株、G8S90−4由来5株)を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え2日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図40に示す。以上の結果から、上記hEPO−14NΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞全てにおいてhEPOの発現を確認した。
実施例9
hEPO−14NΔqHACベクターのCHO細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−14NΔqHACベクターのCHO雑種細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例8で得たCHO雑種細胞4株(G4S61−1E6、G4S39−13E4、55、G8S90−4E16)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれに0.8mg/mlのG418を添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収し、hEPO遺伝子の発現及びFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。上記G4S61−1E6、G4S39−13E4、55、G8S90−4E16株について実施例8(2)の方法に従って2連で行った実験結果の平均値を図41に示す。以上より、上記hEPO−14NΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞4株全てにおいて長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。
(3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記4株についてその結果を表4及び図41に示す。
以上の(1)から(3)の実験により、hEPO−14NΔqHACベクターは、長期継代培養後のCHO細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例10
hEPO−14NΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞でのhEPO遺伝子発現
(1)hEPO−14NΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
(1−1)ミクロセル法によるhEPO−14NΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1への移入
染色体供与細胞として、実施例9で得られたhEPO−14NΔqHACベクターを保持するCHO細胞株のうち、微小核形成能が高いクローン(G4S61−1E6、G4S39−13E4,55、G8S90−4E16)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。微小核融合は上記実施例5(1)と同様に行った。約4週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。32回(各8回×4株)の微小核細胞融合から47個の薬剤耐性コロニーを得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞としてG4S61−1E6細胞を用いて得た細胞をG6H細胞と、G4S39−13E4細胞を用いて得た細胞をG4H細胞と、G4S39−13E55細胞を用いて得た細胞をG55H細胞と、G8S90−4E16細胞を用いて得た細胞をG16H細胞と、以下称する。
(1−2)PCR解析
hEPO−14NΔqHACベクターを保持するか否かを実施例3(1−2)のプライマーSVpANp1及びNeo Rp2を用いて、ヒト染色体をSTSマーカーD2S1334のプライマーを用いてKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従いPCR増幅により確認した。また、染色体供与CHO細胞の混入の有無をCHO furin遺伝子特異的プライマーfurin3’subF及びfurinEx6−28Rを用いてPCR増幅により確認した。方法は上記実施例5(1−2)と同様に行った。
hEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞で染色体供与CHO細胞の混入が無い場合に、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbpの増幅、D2S1334プライマーにより約0.6kbpの増幅、furin3’subF及びfurinEx6−28Rによる増幅なし、が予想される。その結果、上記(1−1)で得たブラストサイジン耐性株47株から計17株(G6H;2株、G4H;4株、G55H;6株、G16H;5株)において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のブラストサイジン耐性株17株がhEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞であることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14NΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジン耐性株のうち13株についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図19のBに示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。その結果、上記(1−2)で得たhEPO−14NΔqHACベクターを保持するブラストサイジン耐性株9株(G4H2、4、5、G6H3、G16H17、21、23、G55H7、9)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト14番及び22番染色体特異的αサテライトDNAプローブ(Q−biogene、フナコシ)を用いて行った。ブラストサイジン耐性株のうち3株(G4H2、G16H17、G55H7)について解析した結果、計3株が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の1対のヒト14番及び22番染色体セントロメア領域の4箇所と1コピーの14NΔqHACベクター由来の1箇所にシグナルが検出された。その結果を図42A及びBに示す。
以上(1−1)から(1−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性株3株はhEPO−14NΔqHACベクターを保持する正常核型のHFL−1細胞であることが確かめられた。
(2)hEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞におけるhEPO遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)において単離したhEPO−14NΔqHACベクターを保持するブラストサイジン耐性HFL−1細胞9株(G4H2、4、5、G6H3、G16H17、21、23、G55H7、9)について、それぞれ約105細胞をブラストサイジン(3μg/ml)を含む選択培地(20%FBS、DMEM)1mlをいれたコラーゲンIコートした24穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地に置き換え更に24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immnunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。その結果を図21の「14N−HAC」の項目に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞全てにおいてhEPOの発現を確認した。
実施例11
hEPO−14NΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞での長期EPO発現
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−14NΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例10で得たhEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞4株(G4H2、G16H17、G16H21、G55H7)を使用した。非選択培養液は20%FBSを含むDMEM培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン3μg/mlを添加した。hEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞株は1〜3×105細胞をコラーゲン−IコートしたT−25フラスコ(ファルコン)に播種し、細胞密度が90%飽和程度まで培養し、再び1〜3×105細胞を播種し6〜10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、5及び10継代前後に細胞を回収し、hEPO遺伝子発現解析及びFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)で長期継代培養したhEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞4株を、約104細胞にて20%FBSを含むDMEM培地2mlをいれたコラーゲン−Iコート24穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図43に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14NΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞4株全てにおいて長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。
以上の実験により、hEPO−14NΔqHACベクターは、長期継代培養後のHFL−1細胞において、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例12
サブテロメア領域を含む14HAC(14gNΔqHAC)ベクターの構築
HACベクターがテロメア配列及びヒト14番染色体末端の約60kbのサブテロメア領域を含有するように、長腕遠位及び近位にloxP配列を相同組換えにより挿入し、Creによる部位特異的組換え反応により2箇所のloxP配列間の領域を切出し削除して長腕遠位欠失人工染色体(14gNΔqHAC)ベクターを構築する。
(1)部位特異的組換え反応によるヒト14番染色体長腕削除
(1−1)ヒト14番染色体長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターploxpPGK−14qtel−2の構築
loxP配列挿入用ベクター(ターゲティングベクター)には、実施例6(1−1)のploxPupBSD−PGKを用いた。GenBankデータベースより得たヒト14番染色体長腕遠位の塩基配列(登録番号AB019437)から、ploxpPGK−14qtel−2ベクター挿入の2箇所の標的配列を設計した。これをPCR増幅するための、制限酵素認識配列を付加したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
実施例1(1−1)の方法に従い、ヒト14番染色体を保持するマウスA9雑種細胞(A9c11−14chr)のゲノムDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて5’及び3’側の2つの組換え標的配列をPCR法により増幅した。TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、AB01 38KpnIFw/AB01 40ApaIFwによる反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃6分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃6分を30サイクル、伸長70℃10分で行った。また、AB01 42SpeIFw/AB01 47EcoRVによる反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃8分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃8分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃8分を30サイクル、伸長70℃10分で行った。AB01 38KpnIFw/AB01 40ApaIFwによる2.0kbの増幅産物は、制限酵素KpnI及びApaIにて消化し、ploxPupBSD−PGKベクターのKpnI−ApaIサイトへクローニングした。また、AB01 42SpeIFw/AB01 45Rによる3.0kbの増幅産物をSpeI−BamHI消化し、またAB01 45F/AB01 47EcoRVによる2.0kbの増幅産物をBamHI−EcoRV消化し、上記の2フラグメントを一度pBluescriptベクターにサブクローニングした後SpeI−EcoRV消化し、上記の2.0Kbの標的配列を持つploxPupBSD−PGKベクターのNheI−EcoRVサイトへクローニングした。最終的なploxpPGK−14qtel−2コンストラクトのサイズは約12.1kbである。ploxpPGK−14qtel−2ベクター標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図44及び図45に示した。
(1−2)ヒト14番染色体保持DT40雑種細胞への長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターploxpPGK−14qtel−2ベクター導入
実施例1(1−2)の方法に従い、ploxpPGK−14qtel−2コンストラクトを制限酵素SrfI消化により線状化DNAとし、ヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞DT40(−14)1−2及びDT40(−14)2−4に導入した。ブラストサイジン(終濃度8ug/ml)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。DT40(−14)1−2の場合は、6回のトランスフェクションから合計1738個のブラストサイジン耐性コロニーをDT40(−14)2−4の場合は、4回のトランスフェクションから合計618個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在を実施例12(1−1)の方法に従い、PCR法により検出した。2つの標的配列(図45中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図46中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
上記DT40(−14)1−2由来のブラストサイジン耐性1738株のうち2株において、DT40(−14)2−4由来のブラストサイジン耐性618株のうち5株において5’及び3’側の2標的配列の存在を確認した。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの5’及び3’側の2標的配列外側にプローブ(g2−5’及びg2−3’)を設定した(図45)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した:
1次スクリーニングで得たブラストサイジン耐性株から抽出したゲノムDNA約10μgを制限酵素(5’側)SacI又はBstEII(3’側)により(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。代表的な結果を図47に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で7.2kb、野生型(非組換え体)で4.8kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で21.8kb、野生型(非組換え体)で18.6kbである。DT40(−14)1−2由来の候補株2株から合計1株(12g5)の相同組換え体を、DT40(−14)2−4由来の候補株5株から合計3株(24g15、24g67、24g91)の相同組換え体を確認した。
(2)ヒト14番染色体長腕近位セントロメア側へのloxP配列挿入
(2−1)ploxpPGK−14qtelを導入したヒト14番染色体保持DT40細胞への長腕近位セントロメア側loxP配列挿入用ベクターploxPHYGOR/n1ベクター導入
実施例6(2−1)で作製したploxPHYGOR/n1コンストラクトを制限酵素SrfI消化により線状化DNAとし、実施例13(1−4)で作製したploxpPGK−14qtel−2を導入したヒト14番染色体を保持するDT40雑種細胞12g5及び24g15及び24g67に導入した。方法は、実施例1(1−2)のに従った。2〜3週間の選択培養後、ピューロマイシン耐性コロニーが出現した。各2回、計6回のトランスフェクションから合計252個(12g5由来78個、24g15由来128個、24g67由来46個)のピューロマイシン耐性コロニーを単離して以後の解析を行った。
(2−2)PCR解析
上記(2−1)で取得したピューロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在を実施例7(2−1)の方法に従い、PCR法により検出した。2つの標的配列(図27中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図28中に矢印で示した。上記ピューロマイシン耐性から39株(12g5由来13株、24g15由来24株、24g67由来2株)において5’及び3’側の2標的配列の存在を確認した。
(2−3)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。方法は実施例6(2−4)に従った。代表的な結果を図48に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で12.5kb、野生型(非組換え体)で18.2kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で10.2kb、野生型(非組換え体)で18.2kbであり、上記(2−2)で取得した候補株のうち25株から合計23株(12g5由来11株、24g15由来10株、24g67由来2株)の相同組換え体を確認した。これらのうち、24g15由来のクローン24g15n28(以下g5n8と称する)及び24g67由来のクローン24g67n19(以下g7n9と称する)を次のステップ(3)へ進めた。
(3)Cre−loxP部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(3−1)長腕遠位及び近位へloxP配列挿入したヒト14番染色体保持DT40雑種細胞へのCre発現ベクターの導入
実施例1(1−2)の方法に従い、Cre発現ベクターpCAGGSCreを実施例12(2)で取得したg5n8及びg7n9細胞に導入した。ハイグロマイシン(終濃度1.25mg/ml)で選択培養を行い2〜3週間後に薬剤耐性コロニーが出現した。各2回、計4回のトランスフェクションから合計16個(g5n8由来11個、g7n9由来5個)のハイグロマイシン耐性コロニーを単離して以後の解析を行った。
(3−2)PCR解析
ハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として2つのloxP配列間の欠失をPCR法により確認した。方法は、実施例6(3−2)に従って行った。長腕遠位欠失後に残ったloxP配列を夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図28中に矢印で示した。その結果、上記ハイグロマイシン耐性株16株のうち12株(g5n8由来7株、g7n9由来5株)において予測される増幅産物を確認した。
(3−3)サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行った。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図30Bに示した。相同組換えの5’及び3’側の2標的配列外側にプローブ(g2−5’(i)及びN3’(i))を設定した(図30B)。上記実施例13(3−2)で得たハイグロマイシン耐性株9株(g5n8細胞由来5株及びg7n9細胞由来4株)からゲノムDNAを抽出し実施例13(1−4)及び(2−4)と同様に行った。制限酵素(ロシュ)消化は、SacI(5’側)又はStuI(3’側)により行った。代表的な結果を図49に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で9.2kb、野生型(非組換え体)で7.2kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で8.3kb、野生型(非組換え体)で10.2kbである。その結果、合計5株(g5n8細胞由来3株及びg7n9細胞由来2株)において長腕遠位欠失体を確認した。
(3−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(3−3)で取得した5株(g5n8Δc3/Δd1/Δd4、g7n9Δc1/Δc3)について解析した結果、全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーのシグナルを検出した。代表的なFISH像及びHACベクターの核型をそれぞれ図50A及びBに示す。
以上(3−1)から(3−4)の実験から、得られたハイグロマイシン耐性DT40雑種細胞は、天然テロメアを残して長腕遠位を削除したヒト14番染色体断片(14gNΔqHAC)を保持することを確認した。
(4)14gNΔqHAC長腕近位へのクローニング部位の導入
(4−1)loxP及び3’neo配列挿入用pSF(g+n1)ベクターの構築
上記実施例12(3)で作製したヒト人工染色体(HAC)にloxP及び3’neo配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例1(2−1)で作製したpSF1▲3▼を用いた。loxP及び3’neo挿入部位である相同組換えの5’側標的配列は上記実施例12(1−1)で取得したploxpPGK−14qtel2ベクターで用いた配列から、3’標的配列はGenBankデータベースより得たヒト14番染色体長腕近位の塩基配列(登録番号AL391156)から設計した。これをPCR増幅するためのプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
5’側標的配列は、ploxpPGK−14qtel2ベクターからSalI及びSrfI(ロシュ)で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、pSF1▲3▼プラスミドのSalI−SrfIサイトにクローニングした。また3’側標的配列は、ヒト14番染色体を保持するA9c11−14chr細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅した。TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、MgSO
4(終濃度0.5mM)を添加し、反応条件は94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃8分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃8分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃8分を30サイクル、伸長72℃10分で行った。この約5.0kbのDNA断片を制限酵素FseI及びSrfI(ロシュ)で消化し、アガロースゲル電気泳動により分離し精製後、上記5’標的配列を挿入したpSF1▲3▼プラスミドのFseI−SrfIサイトにクローニングした。最終的なpSF1(g+n1)コンストラクトのサイズは約13.2kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図51及び図34Bに示した。
(4−2)14gNΔqHAC保持DT40細胞へのpSF(g+n1)ベクター導入
pSF(g+n1)コンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した14NΔqHACを保持するDT40雑種細胞3種(g5n8Δc3/Δd1,g7n9Δc1)にそれぞれ導入した。方法は、実施例1(2−2)に従って行った。2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。3回のトランスフェクションから合計154個(g5n8Δc3;99個、g5n8Δd1;34個、g7n9Δc1;21個)の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
(4−3)PCR解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図34B中に矢印で示した。5’側標的配列検出用プライマーの配列を以下に示す:
方法は、実施例13(4−1)に従って行った。5’側標的配列検出用の反応条件は94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃6分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃6分を30サイクル、伸長72℃10分で行った。得られたブラストサイジン耐性株のうち、13株(g5n8Δc3;3株、g5n8Δd1;8株、g7n9Δc1;2株)が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約2.0kb及び3’genome約5.0kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(4−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためサザンブロット解析を行った。プローブは、相同組換えの標的配列の外側にg2−5’(i)(実施例12(1−4))及びN3’(ii)(実施例6(4−4))を設定した(図34B)。実施例12(4−3)で得た薬剤耐性候補株からゲノムDNAを抽出し実施例12(1−4)と同様に行った。制限酵素(ロシュ)消化は、SphI(5’側)又はBstEII(3’側)により行った。代表的な結果を図52に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側標的配列では相同組換え体で11.8kb、野生型(非組換え体)で4.6kbであり、3’genome側標的配列では相同組換え体で15.8kb、野生型(非組換え体)で8.8kbである。上記や薬剤耐性候補株13株から合計9株の相同組換え体を確認した。
以上の(4−1)〜(4−4)の実験により、相同組換えによりクローニング部位(loxP及び3’neo配列)が挿入された14gNΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞合計9株(g5n8Δc3s13、g5n8Δd1s3、4、6、8、9、10、g67n19Δc1s9、21)を取得した。このうち、g5n8Δc3s13及びg67n19Δc1s9の2株を次のステップへ進めた。
(5)CHO細胞への14gNΔqHACベクター移入
(5−1)ミクロセル法による14gNΔqHACベクターのCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例12(4)で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位(loxP及び3’neo配列)が挿入された14gNΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞(g5n8Δc3s13及びg67n19Δc1s9)をそれぞれ用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(登録番号JCRB9018)を用いた。方法は、実施例1(3−1)に従って行った。約2週間の選択培養の後、出現したブラストサイジン耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。4回の微小核細胞融合から計55株(g5n8Δc3s13由来32株、g67n19Δc1s9由来23株)のブラストサイジン耐性CHO株を得た。
(5−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。方法は、実施例6(5−2)に従って行った。得られたブラストサイジン耐性CHOのうち52株(g5n8Δc3s13由来29株、g67n19Δc1s9由来23株))が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約2.0kb及び3’genome約5.0kb)の増幅産物を与えること及びDT40細胞の混入が無いことを確認した。
(5−3)サザンブロット解析
移入した14gNΔqHACベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例12(4−4)と同様に行った。代表的な結果を図53に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側標的配列では相同組換え体で11.8kb、野生型(非組換え体)で4.6kbであり、3’genome側標的配列では相同組換え体で15.8kb、野生型(非組換え体)で8.8kbである。上記ブラストサイジン耐性候補株36株から合計35株(g5n8Δc3s13由来17株、g67n19Δc1s9由来18株)の相同組換え体を確認した。図53及び54において、「g5S13」及び「g7S9」は、それぞれg5n8Δc3s13由来株及びg67n19Δc1s9由来を表す。
(5−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性CHO株のうち15株(g5n8Δc3s13由来6株、g67n19Δc1s9由来9株)について解析した結果、計5株(g5n8Δc3s13−9,12の2株:以下g5S13−9、g5S13−12と称する、g67n19Δc1s9−11,12,17の3株:以下g7S9−11、g7S9−12、g7S9−17と称する)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーの14gNΔqHACベクターが検出された。代表的なFISH像及び14gNΔqHACベクターの核型をそれぞれ図54A及びBに示す。
以上(5−1)から(5−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性CHO株5株は、正常核型かつ1コピーの14gNΔqHACベクターを保持することが確かめられた。
実施例13
14gNΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
14gNΔqHACベクターのCHO細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例7に記載した14gNΔqHACベクターを保持するCHO細胞株2株g5S13−9、g5S13−12を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン8μg/mlを添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収しFISH用染色体標本を作製した。
(2)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記2株についてその結果を表5及び図13に示す。図13においては、14gΔqHAC(g)の項目に示す。
以上の(1)及び(2)の実験により、14gNΔqHACベクターは、CHO細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例14
hEPO−14gNΔqHACベクターのCHO細胞でのhEPO遺伝子発現解析
(1)hEPO−14gNΔqHACベクターの構築
(1−1)14gNΔqHACベクターへのhEPO遺伝子の導入
実施例7で構築した14gNΔqHACベクターへhEPO遺伝子発現ユニットを挿入する。loxP配列を含むhEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。実施例13で作製した14gNΔqHACベクターを保持するCHO細胞(g5S13−12及びg7S9−11)を用いて、実施例3(1−1)と同様にしてhEPO遺伝子発現ユニットの挿入を行った。2〜3週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計169個(g5S13−12由来77個、g7S9−11由来92個)のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−2)PCR解析
hEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、14gNΔqHACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにpLN1−EPOベクター上及び14gNΔqHACベクター上に設計したプライマーSVpANp1及びNeo Rp2によって、また挿入されたhEPO遺伝子を、プラスミドベクターpBS226上のM13RV及びNeo Rp2プライマーによって、PCR増幅により確認した。プライマー配列及びPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbp、プライマーM13RV及びNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。その結果、上記(1−1)で得たG418耐性CHO雑種細胞から計69株(g5S13−12由来32株、g7S9−11由来37株)において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞69株がloxP配列へのhEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14gNΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図55に示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。上記(1−2)で得たG418耐性候補CHO雑種細胞計65株(g5S13−12由来24株、g7S9−11由来41株)から計32株(g5S13−12由来10株、g7S9−11由来22株)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−3)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち17株について解析した。その結果、計5株(g5S13−12由来1株;以下g5S13−12E23と称する、g7S9−11由来4株;以下g7S9−11E28,48,57,62と称する)において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−14gNΔqHACベクターを検出した。代表的なFISH像及びhEPO−14gNΔqHACベクターの核型をそれぞれ図56A及びBに示す。
以上(1−1)から(1−4)の実験から、得られたG418耐性5株は、hEPO−14gNΔqHACベクターを保持する正常核型のCHO細胞であることを確認した。
(2)14gNΔqHACベクターへ挿入されたhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記1)において単離しサザン解析でhEPO遺伝子発現ユニットの存在及び構造を確認したhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞28株を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え7日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図57に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞28株全てにおいてhEPOの発現を確認した。
実施例15
hEPO−14gNΔqHACベクターのCHO細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−14gNΔqHACベクターのCHO細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例15で得たCHO雑種細胞3株(g5S13−12E23、g7S9−11E28,62)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれに0.8mg/mlのG418を添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収し、hEPO遺伝子の発現及びFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)で長期継代培養したhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞3株を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え7日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図58に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞3株全てにおいて長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。
(3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数及びHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記3株についてその結果を表6及び図58に示す。
以上の(1)から(3)の実験により、hEPO−14gNΔqHACベクターは、長期継代培養後のCHO細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例16
hEPO−14gNΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞でのhEPO遺伝子発現
(1)hEPO−14gNΔqHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
(1−1)ミクロセル法によるhEPO−14ENΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1への移入
染色体供与細胞として、実施例15で得られたhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞株のうち、微小核形成能が高いクローン(g5S13−12E23、g7S9−11E28,62)を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。微小核融合は上記実施例5(1)と同様に行った。約4週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し以後の解析を行った。24回の微小核細胞融合から51個(g5S13−12E23由来3個、g7S9−11E28由来22個、g7S9−11E62由来26個)の薬剤耐性コロニーを得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞としてg5S13−12E23細胞を用いて得た細胞をg23H細胞と、g7S9−11E28細胞を用いて得た細胞をg28H細胞と、g7S9−11E62細胞を用いて得た細胞をg62H細胞と以下称する。
(1−2)PCR解析
hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するか否かを実施例3(1−2)のプライマーSVpANp1及びNeo Rp2を用いて、ヒト染色体をSTSマーカーD2S1334のプライマーを用いてKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従いPCR増幅により確認した。また、染色体供与CHO細胞の混入の有無をCHO furin遺伝子特異的プライマーfurin3’subF及びfurinEx6−28Rを用いてPCR増幅により確認した。方法は上記実施例5(1−2)と同様に行った。hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞で染色体供与CHO細胞の混入が無い場合に、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbpの増幅、D2S1334プライマーにより約0.6kbpの増幅、furin3’subF及びfurinEx6−28Rによる増幅なし、が予想される。その結果、上記(1−1)で得たブラストサイジン耐性株50株から計6株(g23H1、2、3、g28H18、22、g62H26)において予想される増幅が確認された。
以上より、上記のブラストサイジン耐性株6株がhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞であることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14gNΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジン耐性株6株のうち4株(g23H1、3、g28H18、g62H26)についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図19のCに示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。その結果、上記(1−2)で得たhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するブラストサイジン耐性株3株(g23H1、3、g62H26)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト14番及び22番染色体特異的αサテライトDNAプローブ(Q−biogene、フナコシ)を用いて行った。ブラストサイジン耐性株3株(g23H1,3、g62H26)について解析した結果、2株(g23H3、g62H26)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の1対のヒト14番及び22番染色体セントロメア領域の4箇所と1コピーの14gNΔqHACベクター由来の1箇所にシグナルが検出された。その結果を図59A及びBに示す。
以上(1−1)から(1−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性株2株はhEPO−14gNΔqHACベクターを保持する正常核型のHFL−1細胞であることが確かめられた。
(2)hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞におけるhEPO遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)において単離しサザン解析でhEPO発現ユニット構造を確認したhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するブラストサイジン耐性HFL−1細胞3株について、それぞれ約105細胞をブラストサイジン(3μg/ml)を含む選択培地(20%FBS、DMEM)1mlをいれたコラーゲンIコートした24穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地に置き換え更に24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。その結果を図21の「14gN−HAC」の項目に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14gNΔqHACベクターを保持する正常核型のHFL−1細胞3株全てにおいてhEPOの発現を確認した。
実施例17
hEPO−14gNΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−14gNΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例16で得たhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞3株(g23H1、g23H3、g62H26)を使用した。非選択培養液は20%FBSを含むDMEM培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン3μg/mlを添加した。hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞株は1〜3×105細胞をコラーゲン−IコートしたT−25フラスコ(ファルコン)に播種し、細胞密度が90%飽和程度まで培養し、再び1〜3×105細胞を播種し5〜10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、5継代前後及び10継代後に細胞を回収し、hEPO遺伝子発現解析及びFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)で長期継代培養したhEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞2株g23H1、g62H26を、約104細胞にて20%FBSを含むDMEM培地2mlをいれたコラーゲン−Iコート24穴又は48穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地に置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図43に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14gNΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞2株全てにおいて長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。
以上の実験により、hEPO−14gNΔqHACベクターは、長期継代培養後のHFL−1細胞において、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例18
Neo耐性遺伝子ユニット除去hEPO−14AΔqΔneo−HACベクターの構築
14AΔq−HACベクター上及びpLN1/EPOプラスミド上のhEPO発現ユニット下流にFRT配列を挿入し、hEPO−14AΔq−HACベクター上からFRT/FLPe部位特異的組換えシステムによりNeo耐性遺伝子発現ユニットを除去する。その概略を図60に示す。
(1)14AΔqHACクローニング部位へのFRT配列の導入
(1−1)FRT配列導入用ベクターt1pSF1−FRTの構築
実施例1で構築した14AΔqHACのクローニング部位へFRT配列を挿入するために、FRT配列を含むオリゴDNAを合成し、実施例1(2−1)で構築したt1pSFベクターへクローニングした。合成したFRT配列を含むオリゴDNA配列を以下に示す:
上記のFRT配列を含むオリゴDNAをアニーリングにより2本鎖化した後、制限酵素FseIでカットし、t1pSFベクターFseIサイトへクローニングした。最終的なt1pSF1−FRTコンストラクトのサイズは約13.5kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図61に示した。
(1−2)14AΔqHAC保持DT40細胞へのt1pSF1−FRTベクター導入
t1pSF1−FRTコンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した14AΔqHACを保持するDT40雑種細胞にエレクトロポレーションにより導入した。方法は、実施例1(2−2)に従って行った。2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。12t97sFでは、1回のトランスフェクションから合計12個の薬剤耐性コロニーを、また12t134sFでは1回のトランスフェクションから合計94個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列(図61中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)の存在を解析した。方法は、実施例1(2−3)に従って行った。
得られたブラストサイジン耐性DT40細胞、12t97SF由来12株のうち3株が、12t134SF由来94株のうち2株が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約5kb及び3’genome約2kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。5’及び3’側の2箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例1(2−4)の方法に従って解析した。代表的な結果を図62に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析及び3’genome側解析ともに相同組換え体で24.6kb、野生型(非組換え体)で18.2kbである。ブラストサイジン耐性候補、12t97SF由来3株のうち2株(12t97SF1、12)が、12t134sF 2株のうち2株(12t134SF6、21)の相同組換え体を確認した。
以上の(1−1)〜(1−4)の実験により、相同組換えによりクローニング部位にFRT配列が挿入された14AΔqF−HACベクターを保持するDT40雑種細胞12t97SF 2株(−1、12)、12t134SF 2株(−6、21)を取得した。
(2)CHO細胞への14AΔqF−HACベクター移入
(2−1)ミクロセル法による14AΔqF−HACベクターのCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例18(1)で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位にFRT配列が挿入された14AΔqF−HACベクターを保持するDT40雑種細胞(12t97sF1、12t97sF12、12t134sF21)を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(登録番号JCRB9018)を用いた。ミクロセル法による14AΔqF−HACベクターのCHO細胞への移入は、実施例1(3)に従って行った。
約2週間の選択培養の後、出現したブラストサイジン耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。3株×2回の微小核細胞融合から計36株(12t97sF1由来25株、12t97sF12由来3株、12t134sF21由来8株)のブラストサイジン耐性CHO株を得た。
(2−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性CHO株のゲノムDNAを鋳型として、14AΔqF−HACベクターを保持すること、及びDT40の混入がないことを確認する目的で、NEK2P(+)、IGHV3(−)及びGgbeta−actin(−)の存在をPCR法により検出した。方法は、実施例1(1−3)及び実施例6(5−2)に従った。予測される検出パターンは、NEK2P(+)、IGHV3(−)及びGgbeta−actin(−)である。得られたブラストサイジン耐性CHO株36株のうち33株(12t97sF1由来23株、12t97sF12由来3株、12t134sF21由来7株)が、塩基配列から予想される増幅産物を与えることを確認した。
(2−3)サザンブロット解析
移入した14AΔqF−HACベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例1(2−4)と同様に行った。代表的な結果を図63に示す。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析及び3’genome側解析ともに相同組換え体で24.6kb、野生型(非組換え体)で18.2kbである。ブラストサイジン耐性候補CHO株27株から合計26株(12t97sF1由来20株、12t97sF12由来2株、12t134sF21由来4株)の相同組換え体を確認した。
(2−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性CHO株のうち14株(12t97sF1由来11株、12t97sF12由来1株、12t134sF21由来2株)について解析した結果、計6株(12t97sF1由来5株、12t97sF12由来0株、12t134sF21由来1株)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーの14AΔqF−HACベクターが検出された。代表的な結果を図64に示す。
以上(2−1)から(2−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性CHO株6株(12t97sF1−2、5、8、17、21及び12t134sF21−2)はNeo耐性遺伝子ユニット除去用14AΔqF−HACベクターを保持することを確認した。これらのうち、12t97sF1−5及び12t134sF21−2(以下F1−5及びF21−2と称する)を以下の実験に用いた。
(3)hEPO−14AΔqF−HACベクターの構築
(3−1)hEPO発現プラスミドpLN1−EPOへのFRT配列の導入
hEPO発現プラスミドpLN1−EPO(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)へ実施例18(1−1)で用いたFRT配列を含む合成オリゴDNAを挿入する。
上記のFRT配列を含むオリゴDNA FRT linkerSとFRT linkerASをアニーリングにより2本鎖化し制限酵素SpeIで消化した後、pLN1EPOベクターから制限酵素XbaI消化によりneo耐性遺伝子ドライブ用のCMVプロモーターを除去した後のXbaIサイトへクローニングした。更に上記neo耐性遺伝子ドライブ用CMVプロモーターを導入したリンカー内のNheIサイトへ再導入した。最終的なpLN1−EPOFコンストラクトのサイズは約4.9kbである。
(3−2)14AΔqF−HACベクターへのhEPO遺伝子の導入
14AΔqF−HACベクターへFRT配列を含むhEPO遺伝子発現ユニットを挿入する。loxP及びFRT配列を含むhEPO発現プラスミドpLN1−EPOFを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。その概略を図65に示す。実施例18(2)で作製した14AΔqF−HACベクターを保持するCHO細胞(F1−5及びF21−2)を用いて、実施例3(1−1)の方法に従って行った。2〜3週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計92個(F1−5由来45個及びF21−2由来47個、以下それぞれ5EF及び2EF細胞と称する)のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(3−3)PCR解析
hEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、14AΔqFHACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにpLN1−EPOFベクター上及び14AΔqFHACベクター上に設計したプライマーSVpANp1及びNeo Rp2によって、また挿入されたhEPO遺伝子を、プラスミドベクターpBS226上のM13RV及びNeo Rp2プライマーによって、PCR増幅により確認した。プライマー配列及びPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbp、プライマーM13RV及びNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。その結果、上記(3−2)で得たG418耐性CHO雑種細胞から計51株(5EF細胞23株、2EF細胞28株)において予想される増幅が確認された。以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞計51株がloxP配列へのhEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
(3−4)サザンブロット解析
hEPO−14AΔqF−HACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図66に示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。上記(3−2)で得たG418耐性候補CHO雑種細胞65株から合計23株(5EF細胞8株、2EF細胞15株)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(3−5)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(3−4)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち16株(F1−5由来5株、F21−2由来11株)について解析した。その結果、計2株(5EF−1、2EF−36)において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−14AΔqHACベクターを検出した。代表的な結果を図67A及びBに示す。
以上(3−1)から(3−5)の実験から、得られたG418耐性2株は、hEPO−14AΔqF−HACベクターを保持する正常核型のCHO細胞であることを確認した。
(4)hEPO−14AΔqF−HACベクターのCHO細胞でのhEPO遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記1)において単離したhEPO−14AΔqFHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞2株(5EF−1、2EF−36)を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え2日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を表7に示す。
(5)hEPO−14AΔqF−HACベクターからのNeo耐性遺伝子ユニット除去(5−1)FLPe発現ベクターpOG44FLPeの構築
pOG44ベクター(インビトロジェン)上のFLP遺伝子配列をFLPe遺伝子配列(Buchholz,F.ら、Nature Biotech.(USA),第16巻、p657−662)へL33S、L70F、Y108N、S294Pの4箇所にPCR法により変異を導入して改変した。まずFLP(D4、L70)→FLPwt(D4G、L70F)を作製し、続いてFLP(D4、L70)とFLPwt(G4、F70)両方を用いてFLPe(D4・F70/L33S、Y108N、S294P)を作製した。PCRは、LA Taqポリメラーゼ(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性98℃30秒、アニーリング60℃30秒、伸長72℃30秒を35サイクルで行った。
アミノ酸配列置換D4G及びL70Fのため、塩基配列置換A14G及びG210CをpOG44ベクターを鋳型として行った。PCR法により行った用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す:
pOG44ベクターからPstI消化によりFLP遺伝子配列を切り出した後、PstI消化した上記PCR増幅断片に入れ替えた(pOG44−FLPwt(D4G、L70F))。
次にアミノ酸配列置換S294Pのため塩基配列置換T880CをpOG44ベクターを鋳型としてPCR法により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す:
pOG44ベクターからEcoRV−NsiI領域を除去した後、pOG44ベクター由来のDNA断片(EcoRV−HindIII:0.5kb)とHindIII及びNsiI消化した上記PCR増幅断片をクローニングした(pOG44−FLPe(D4・S294P)。
更にアミノ酸配列置換L33S及びY108Nのため塩基配列置換T109C及びT322AをPCR法により行った。用いたオリゴヌクレオチドプライマーの配列を以下に示す:
上記pOG44−FLPwt(D4G、L70F)ベクターを鋳型として、プライマーFLPFw(T109C)−FLPRv(T322A)Evを用いてPCRにより塩基置換を行い、更にこのPCR産物を鋳型にしてプライマーFLPFw(33−81)Bs36−FLPRv(T322A)Evを用いて5‘末端に制限酵素Bsu36Iサイトを付加した。増幅したDNA断片を制限酵素Bsu36I及びEcoRVで消化し、pOG44−FLPe(D4・S294P)ベクターのBsu36I−EcoRV領域と入れ替えた(pOG44−FLPe(D4・F70/L33S、Y108N、S294P)。以上によりpOG44FLPeを取得した。
(5−2)FLPeによるNeo耐性遺伝子ユニット除去
上記実施例23(3)で作製したhEPO−14AΔqF−HACベクターを保持するCHO細胞中でFLPe組換え酵素を一過性に発現させることでFRT配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体からNeo耐性遺伝子ユニットを切出し除去する。組換え挿入体の選別は、Neo耐性遺伝子ユニットの欠失を指標とした。
実施例18(3)で作製したhEPO−14AΔqF−HACベクターを保持するCHO細胞(5EF−1及び21EF−36)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。20〜100μgのFLPe酵素発現ベクターpOG44FLPe存在下でジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%FBSを添加したF12培地(インビトロジェン製)を含む96穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)8枚(1細胞/ウエルで4枚、0.1細胞/ウエルで4枚)に播種した。2〜3週間後ブラストサイジン耐性コロニーが出現し、計149個(5EF−1由来82個、21EF−36由来67個)のコロニーを単離して、以後の解析を行った。
(5−3)PCR解析
hEPO−14AΔqF−HACベクター上からNeo耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるため、pLN1−EPOFベクター上及び相同組換え領域上にプライマーを設計し(図68)PCR増幅により確認した。オリゴヌクレオチドプライマー配列を以下に示す:
TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃4.5分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃4.5分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃4.5分を25サイクル、伸長72℃10分で行った。Neo耐性遺伝子ユニット除去がされている場合は、プライマーSVpANp1及びAL39 54169Fにより約0.4kbpの増幅が予想される。その結果、上記(5−2)で得たBsd耐性CHO雑種細胞から計66株(5EF−1由来34株、21EF−36由来32株)において予想される増幅が確認された。以上より、上記のBsd耐性CHO雑種細胞計66株がNeo耐性遺伝子ユニット除去されていることが確認された。
(5−4)サザンブロット解析
hEPO−14AΔqF−HACベクター上からNeo耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図69に示す。塩基配列から予想されるEcoRI消化による制限酵素断片長は、Neo耐性遺伝子ユニットが除去されhEPO発現ユニットのみの場合3.8kb、Neo耐性遺伝子ユニット及びhEPO発現ユニット両方を含む場合6.6kbである。上記実施例23(5−2)で得た候補CHO雑種細胞66株(5EF−1由来34株、21EF−2由来32株)から、合計36株(5EF−1由来18株、2EF−2由来18株)において予測されるサイズのバンドを検出した。以上より、上記CHO雑種細胞36株において、Neo耐性遺伝子ユニット除去を確認した。Neo耐性遺伝子ユニットが除去されたhEPO−14AΔqF−HACベクターを以下hEPO−14AΔqΔneo−HACベクターと称する。
(5−5)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(5−3)で得た候補CHO雑種細胞のうち5EF−1由来の8株について解析した。その結果、計2株(5EF1Δ38、5EF1Δ63)において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−14AΔqΔneo−HACベクターを検出した。代表的なFISH像及びhEPO−14AΔqΔneo−HACベクターの核型をそれぞれ図70A及びBに示す。
以上(5−1)から(5−5)の実験から、得られた上記CHO雑種細胞2株は、hEPO−14AΔqΔneo−HACベクターを保持する正常核型のCHO雑種細胞であることを確認した。
(6)Neo耐性遺伝子ユニット除去hEPO−14AΔqΔneo−HACベクターのCHO細胞でのhEPO遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記実施例23(5)において単離したhEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するCHO雑種細胞2株(5EF1Δ38、5EF1Δ63)を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え2日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を表8に示す。
実施例19
Neo耐性遺伝子ユニット除去hEPO−14AΔqΔneoHACベクターのヒト正常繊維芽細胞でのhEPO遺伝子発現
(1)hEPO−14AΔqΔneoHACベクター移入ヒト正常繊維芽細胞の作製
(1−1)ミクロセル法によるhEPO−14AΔqHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1への移入
染色体供与細胞として、実施例18で得られたhEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するCHO雑種細胞株5EF1Δ38及び5EF1Δ63を用いた。染色体受容細胞としては、ヒト正常繊維芽細胞HFL−1(理化学研究所細胞材料開発室より入手、登録番号RCB0521)を用いた。方法は、実施例5(1−1)に従った。約2〜4週間の選択培養を行い、出現したブラストサイジン耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。6回の微小核細胞融合(5EF1Δ38で2回、5EF1Δ63で4回)から56個の薬剤耐性コロニー(5EF1Δ38から8クローン、5EF1Δ63から48クローン)を得た。上記コロニーのうち、染色体供与細胞として5EF1Δ38及び5EF1Δ63を用いて得た細胞をそれぞれ以下tΔ38H細胞及びtΔ63H細胞と称する。
(1−2)PCR解析
hEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するか否かを実施例3(1−2)のプライマーSVpANp1及びNeo Rp2を用いて、ヒト染色体をSTSマーカーD2S1334のプライマーを用いてKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従いPCR増幅により確認した。また、染色体供与CHO細胞の混入の有無をCHO furin遺伝子特異的プライマーfurin3’subF及びfurinEx6−28Rを用いてPCR増幅により確認した。設計したプライマー配列を以下に示す:
反応条件は、94℃5分の後、変性94℃20秒、アニーリング/伸長68℃3分間を32サイクル行った。hEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するHFL−1細胞で染色体供与CHO細胞の混入が無い場合に、プライマーSVpANp1及びNeo Rp2により約1.0kbpの増幅、D2S1334プライマーにより約0.6kbpの増幅、furin3’subF及びfurinEx6−28Rによる増幅なし、が予想される。その結果、上記(1−1)で得たブラストサイジンン耐性株56株から計39株(tΔ38H4株、tΔ63H35株)において予想される予測されるサイズのバンドを確認した。
以上より、上記のブラストサイジンン耐性株39株がhEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するHFL−1細胞であることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−14AΔqΔneoHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、上記のブラストサイジンン耐性株39株のうち31株(tΔ38H;3株、tΔ63H;28株)についてサザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。代表的な結果を図71に示す。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。その結果、上記(1−2)で得たhEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するブラストサイジンン耐性株28株(tΔ38H;3株、tΔ63H;25株)予測されるサイズのバンドを確認した。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト14番及び22番染色体特異的αサテライトDNAプローブ(Q−biogene,フナコシ)を用いて行った。上記(1−3)で得たブラストサイジン耐性株のうち8株について解析した結果、計8株が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて、宿主細胞由来の1対のヒト14番及び22番染色体セントロメア領域の4箇所と1コピーの14AΔqΔneoHACベクター由来の1箇所にシグナルが検出された。その結果を図72A及びBに示す。
以上(1−1)から(1−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性株8株はhEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持する正常核型のHFL−1細胞であることが確かめられた。
(2)Neo耐性遺伝子ユニット除去hEPO−14AΔqΔneoHACベクターのHFL−1細胞でのhEPO遺伝子発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)で長期継代培養したhEPO−14AΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞29株(tΔ38H4株、tΔ63H28株)を、約104細胞にて20%FBSを含むDMEM培地1mlをいれたコラーゲン−Iコート24穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図21の「14AΔneo−HAC」の項目に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するHFL−1細胞29株(tΔ38H3株、tΔ63H26株)おいてhEPOの発現を確認した。
実施例20
hEPO−14AΔqΔneoHACベクターのヒト正常繊維芽細胞での長期EPO発現解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−14AΔqΔneoHACベクターのヒト正常繊維芽細胞HFL−1における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例23で得たhEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するHFL−1細胞11株(tΔ38H3株、tΔ63H8株)を使用した。非選択培養液は20%FBSを含むDMEM培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン3μg/mlを添加した。hEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するHFL−1細胞株は1〜3×105細胞をコラーゲン−IコートしたT−25フラスコ(ファルコン)に播種し、細胞密度が90%飽和程度まで培養し、再び1〜3×105細胞を播種し10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。また、5継代前後及び10継代後に細胞を回収し、hEPO遺伝子発現解析及びFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記(1)で長期継代培養したhEPO−14AΔqHACベクターを保持するHFL−1細胞9株を、約104細胞にて20%FBSを含むDMEM培地1mlをいれたコラーゲン−Iコート24穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後7日間培養し、新しい培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収及び細胞数を計数した。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。2連で行った実験結果の平均値を図43の「14AΔneo」の項目に示す。
以上の結果から、上記hEPO−14AΔqΔneoHACベクターを保持するHFL−1細胞8株において長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。
以上の実験により、hEPO−14AΔqΔneoHACベクターは、長期継代培養後のHFL−1細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例21
Neo耐性遺伝子ユニット除去14NΔqHACベクターの構築
(1)14NΔqHACクローニング部位へのFRT配列の導入
(1−1)FRT配列導入用ベクターGnpSF1−FRTの構築
実施例18で構築したt1pSF1−FRTベクターをScaI−EcoRV消化しFRT配列を含む7.4kbのDNA断片へ、実施例6で構築したpSF1(G+n1)ベクターをScaI−BglII−EcoRV消化して得たScaI−BglII 7.0kbとBglII−EcoRV 0.55kbのDNA断片を導入してFRT配列を含むGnpSFI−FRTベクターを作製した。概略を図73に示す。最終的なGnpSF1−FRTコンストラクトのサイズは約15.0kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図34Aに示した。
(1−2)14NΔqHAC保持DT40細胞へのGnpSFI(FRT)ベクター導入
GnpSF1(FRT)コンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した14NΔqHACを保持するDT40雑種細胞にエレクトロポレーションにより導入した。方法は、実施例1(2−2)に従って行った。2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。G4n6Δp25では、2回のトランスフェクションから合計240個の薬剤耐性コロニーを単離して、以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列(図34A中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)の存在を解析した。方法は、実施例7(4−3)に従って行った。
得られたブラストサイジン耐性DT40細胞、G4n6Δp25sF 96株のうち52株が、配列から予想されるサイズ(5’genome約5kb及び3’genome約2kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。5’及び3’側の2箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例1(2−4)の方法に従って解析した。代表的な結果を図74に示す。
塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析では相同組換え体で19.8kb、野生型(非組換え体)で7.6kb、3’genome側解析では相同組換え体で19.8kb、野生型(非組換え体)で8.8kbである。ブラストサイジン耐性候補、G4n6Δp25sF 18株のうち16株の相同組換え体を確認した。
以上の(1−1)〜(1−4)の実験により、相同組換えによりクローニング部位にFRT配列が挿入された14NΔqF−HACベクターを保持するDT40雑種細胞G4n6Δp25sF 16株を取得した。
実施例22
Neo耐性遺伝子ユニット除去14gNΔqHACベクターの構築
(1)14gNΔqHACクローニング部位へのFRT配列の導入
(1−1)FRT配列導入用ベクターgnpSF−FRTの構築
実施例18で構築したt1pSF1−FRTベクターをScaI−EcoRV消化しFRT配列を含む7.4kbのDNA断片へ、実施例6で構築したpSF1(g+n1)ベクターをScaI及びHindIII及びEcoRV消化して得たScaI−HindIII 5.4kbとHindIII−EcoRV 0.45kbのDNA断片を導入してFRT配列を含むgnpSFI−FRTベクターを作製した。概略を図75に示す。最終的なgnpSF1−FRTコンストラクトのサイズは約13.3kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図34Bに示した。
(1−2)14NΔqHAC保持DT40細胞へのgnpSF(FRT)ベクター導入
gnpSF1(FRT)コンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した14NΔqHACを保持するDT40雑種細胞にエレクトロポレーションにより導入した。方法は、実施例1(2−2)に従って行った。2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。g5n7Δc3では、2回のトランスフェクションから合計116個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’及び3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列(図34B中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)の存在を解析した。方法は、実施例7(4−3)に従って行った。
得られたブラストサイジン耐性DT40細胞、g5n7Δc3sF 116株のうち54株が、配列から予想されるサイズ(5’genome約5kb及び3’genome約2kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。5’及び3’側の2箇所の相同組換え標的配列の存在を実施例1(2−4)の方法に従って解析した。代表的な結果を図76に示す。
塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析では相同組換え体で11.8kb、野生型(非組換え体)で4.6kb、3’genome側解析では相同組換え体で15.6kb、野生型(非組換え体)で8.8kbである。ブラストサイジン耐性候補、g5n7Δc3sF 36株のうち4株の相同組換え体を確認した。
以上の(1−1)〜(1−4)の実験により、相同組換えによりクローニング部位にFRT配列が挿入された14NΔqF−HACベクターを保持するDT40雑種細胞g5n7Δc3sF 4株を取得した。
実施例23
ヒト21番染色体長腕遠位の削除による21HAC(21AΔqHAC)ベクターの作製
(1)HACベクターにおけるヒト21番染色体の長腕近位へのクローニング部位(HPRT再構築型)の導入
(1−1)loxP及び5’HPRT配列挿入用kkベクターの構築
ヒト21番染色体の長腕近位にloxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV901(Lexicon genetics)を用いた。loxP挿入部位であるヒト21番染色体近位のDNA配列はGenBankデータベースより得た(AP001657)。相同組換えの2つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
MC1−TK配列を、V830(Lexicon genetics)からRsrII(NEB)により切り出し、V901プラスミドの制限酵素HindIIIの認識部位にクローニングした(V901T−1)。次にヒト21番染色体を保持するマウスA9雑種細胞(A9<21−2>、Shinoharaら,Hum Mol Genet,10:1163,2001年)を培養し、細胞からPuregene DNA Isolation kit(Gentra System社)を用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をPCR法により増幅した。反応条件は95℃2分の後、変性95℃15秒、アニーリング68℃4分を30サイクル行った。配列番号110−111で増幅したDNA断片(相同領域1)を制限酵素EcoRI(ニッポンジーン)とBglII(ニッポンジーン)で、配列番号112−113で増幅したDNA断片(相同領域2)をXhoII(プロメガ)で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、V901プラスミドのEcoRIとBamHIないしBglIIサイトにクローニングした。さらにV901プラスミドのAscIとKpnIサイトにAscIとKpnIにより切り出した5’HPRT−loxP−ハイグロマイシン(hygromysin)をクローニングした。5’HPRT−loxP−ハイグロマイシンはV820(Lexicon genetics)のXbaIサイトにオリゴ合成したloxP配列とPGKハイグロマイシン(hygro)配列(Lyons I博士から分与)をクローニングすることで作製した。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは13.5kbである(kkベクターとする)。ターゲティングベクター、標的配列および相同組換えにより生じる染色体アレルを図78に示す。
(1−2)ヒト21番染色体を保持するDT40細胞へのkkベクター導入
ヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞は、同染色体を保持する上記A9<21−2>細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるDT40はJapanese Collection of Research Bioresources(JCRB)に登録番号JCRB2221として登録されており、入手可能である。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約1×108個のA9<21−2>細胞からミクロセルを調製した。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が〜80%飽和程度まで培養したA9<21−2>細胞をコルセミド(0.075μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む培養液(20% ウシ胎仔血清;FBS,0.8mg/ml G418,DMEM)中で48時間培養して微小核を誘導した。本実施例において、DMEMはニッスイ製薬製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温(34℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃,8000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルはDMEM6mlに再懸濁した。DT40細胞は、10%FBS、1%CS,0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液にて培養後、DMEMで2回洗浄し、1×107個をDMEM5mlに再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温,1500rpm,5分間遠心し、これにDT40細胞懸濁液を重層後、室温,1500rpm,5分間遠心し上清を取り除いた。ポリエチレングリコール(PEG)1:1.4溶液(Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133−143,1997年)で90秒間融合処理した。融合細胞を60mlの10%FBS、1%ニワトリ血清(ChS),0.1mM 2−メルカプトエタノール(ME)を含むRPMI1640培養液(インビトロジェン製)に懸濁し、96穴プレートの6枚に播いて24時間培養した後、1.5mg/mlのG418を含む培地で約2週間選択培養した。2回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。PCR解析によりヒト21番染色体上に存在する領域CBR,APP,TTC3,PCP4の存在を確認し、更にヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析により1コピーのヒト21番染色体を保持するクローンDT40(21−2−3)を確認し取得した。
次にkkベクターを制限酵素NotI(Takara)消化により線状化し、長腕遠位を削除したヒト21番染色体を保持するを保持するDT40雑種細胞に導入した。1×107個のDT40(21−2−3)細胞を0.5mlのRPMI培地に懸濁し、30μg DNA存在下で室温10分間静置した後、ジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに550Vで印加、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温10分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、10%FBS、1%ChS,0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液に懸濁し、96穴プレート(ファルコン)20枚に播種した。24時間後に終濃度1.5mg/mlとなるようハイグロマイシンB(Hygromycin B、WAKO)を加え、2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。20回のトランスフェクションで得た合計237個のコロニーを単離し増殖させ、以後の解析を行った(クローン名:DT40(kk))。
(1−3)PCR解析
組換え体を選別するためハイグロマイシン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’および3’側の2標的配列の存在を以下のプライマーを用いてPCR法により検出した。そのプライマーの位置は図78に示した。その配列を以下に示す。
TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は以下のとおり行った。5’genome解析(配列番号114−115);94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃10分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃5分を25サイクル、伸長72℃10分。3’genome解析(配列番号116−117);94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃6分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃7分を30サイクル、伸長72℃10分。PCR反応液にはMgSO4(終濃度0.5mM)で添加した。部位特異的に組換えが起こったクローンでのみ、5’側では4.5kbのバンドが検出され、3’側では6.5kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40およびDT40(21−2−3)ではバンドは検出されなかった。その頻度は237クローン中46個で組換え頻度は約20%であった。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト21番染色体を保持するA9<21−2>細胞のゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅し、単離、精製した。相同組換えの標的配列の外側に5’probe−1(配列番号118−119)および3’probe−10(配列番号120−121)の2種類のプローブを設定した(図78)。
1次スクリーニングで得たうちの12株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素SphI(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析においては相同組換え体で6.1kb、3’genome側解析においては相同組換え体で6.0kb、野生型(非組換え体)では5’genome側解析および3’genome側解析ともに11.5kbである。解析した12株の全てにおいて相同組換え体を確認した。
(1−5)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。上記(1−4)で組換えを確認したクローンのうち6クローンをヒトcot−1DNAおよびハイグロマイシン(kkベクターより切出して調製)をプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト21番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にハイグロマイシン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の(1−1)〜(1−5)により相同組換えによりヒト21番染色体近位AP001657に5’−HPRT−loxP−hygro−TKを挿入することが確認できた。
(2)テロメアトランケーションによるヒト21番染色体長腕削除
(2−1)テロメアトランケーション用ベクターpTELhisD−21qの構築
ヒト21番染色体の長腕遠位を削除するためのテロメアトランケーションベクター(ターゲティングベクター)は、pTELhisD(Kuroiwaら,Nature Biotech.(USA),第18巻,p.1086−1090,2000年)を用いた。GenBankデータベースより得たヒト21番染色体長腕遠位の塩基配列(登録番号AP001657)から、テロメアトランケーションベクター挿入の標的配列を設計した。これをPCR増幅するための、プライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
ヒト21番染色体を保持するマウスA9雑種細胞(A9<21−2>、Shinoharaら,Hum Mol Genet,10:1163,2001年)を培養し、細胞からPuregene DNA Isolation kit(Gentra System社)を用いてゲノムDNAを抽出した。このゲノムDNAを鋳型とし、上記のプライマーを用いて組換えの標的配列をPCR法により増幅した。鋳型として約0.1μgのゲノムDNAを使用し、Innisら(PCR実験マニュアル,HBJ出版局,1991)に従い、サーマルサイクラーはGeneAmp9700(Applied Biosystems社)を使用してPCRを行った。TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃10分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃10分を25サイクル、伸長72℃10分で行った。7.0kbの増幅産物を制限酵素BamHI(ロシュ)で消化して、突出末端をもつDNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。これをpTELhisDプラスミドのBamHIサイトにクローニングした。最終的なpTELhisD−21qコンストラクトのサイズは約14.4kbである。テロメアトランケーションベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図79に示した。
(2−2)ヒト21番染色体保持DT40細胞へのテロメアトランケーションベクター導入
pTELhisD−21qコンストラクトを制限酵素SrfI消化により線状化DNAとし、実施例23(1)で作製した長腕近位にloxPを導入したヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞に導入した。1×107個のDT40(kk139)細胞を0.5mlのRPMI培地に懸濁し、30μg DNA存在下で室温10分間静置した後、ジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに550Vで印加、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温10分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、10%FBS、1%ChS,0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液に懸濁し、96穴プレート(ファルコン)20枚に播種した。24時間後に終濃度0.5μg/mlとなるようヒスチジノール(L−Histidinol dihydrochloride,シグマ)を加え、2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。5回のトランスフェクションから合計105の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(2−3)PCR解析
ヒスチジノール耐性株ゲノムDNAを鋳型としてヒト21番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在をPCR法により確認した。ゲノム領域プライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
約0.1μgのゲノムDNAを鋳型として、上記4種のゲノム領域についてPCR増幅(Innisら,前記)を行った。TaqポリメラーゼはEx Taq(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃5分の後、変性94℃15秒、アニーリング60℃30秒、伸長72℃30秒を35サイクル行った。テロメアトランケーションにより長腕遠位が削除された場合、上記4種のプライマーでは検出されないことが予想される。次に上記プライマーで検出されなかった10クローンについて以下のプライマーを用いて部位特異的相同組換えが起こっているかを確認した。そのプライマーの位置を図79に示す。配列は以下のとおりである。
10クローンのうち部位特異的に組換えが起こった2クローンでのみ7.5kbのバンドが検出された。ネガティブコントロールのDT40、DT40(21−2−3)ではバンドは検出されなかった。
(2−4)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)およびFITC標識したhisD断片(pTELhisDベクターより切出して調製)をプローブに用いて行った。その結果、観察した分裂像のほとんどにおいて短縮したヒト21番染色体およびCot1で染まった短縮したヒト21番染色体長腕端に2個のFITCシグナルが検出された。宿主であるDT40細胞の染色体との相対的な大きさから、ヒト21番染色体が短縮したことを確認した。
以上より、得られたヒスチジノール耐性の2株がヒト21番染色体を長腕削除
(3)21AΔqHAC長腕近位へのクローニング部位(neo再構築型)の導入
(3−1)loxP及び3’neo及びFRT配列挿入用pSF1(FRT)−Cベクターの構築
実施例23(2)で作製したヒト人工染色体(HAC)にloxP及び3’neo及びFRT配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例18(1)で作製したt1pSF1(FRT)を用いた。loxP及び3’neo及びFRT配列挿入部位であるヒト21番染色体長腕近位の塩基配列はGenBankデータベースより得た(登録番号AP001657)。相同組換えの2つの標的配列増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
ヒト21番染色体を保持するA9<21−2>細胞から抽出したグノムDNAを鋳型として2つの標的配列をPCRにより増幅した。配列番号134−135で増幅した約3.4kbのDNA断片(相同領域1)をPacIおよびNheI(ロシュ)で消化し、配列番号136−137で増幅した約2.8kbのDNA断片(相同領域2)を制限酵素SalIおよびSrfI(ロシュ)で消化し、突出末端をもつDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。次に制限酵素消化した相同領域1のDNA断片とNheIおよびScaIで消化したt1pSF1(FRT)プラスミド(実施例18(1)で作製)と実施例1(2−1)で作製したpSF1▲3▼をScaIおよびPacIで消化した3つのDNA断片を3フラグメントライゲーションした。このベクターをSalIおよびSrfIにより消化し、制限酵素消化した相同領域2をクローニングし、pSF1(FRT)−Cとした。最終的なpSF1(FRT)−Cコンストラクトのサイズは約12.6kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図80および図81に示した。
(3−2)21AΔqHAC保持DT40細胞へのpSF1(FRT)−Cベクター導入
pSF1(FRT)−Cコンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した21AΔqHACを保持するDT40雑種細胞に導入した。1×107個のDT40(kkq79)細胞を0.5mlのRPMI培地に懸濁し、30μg DNA存在下で室温10分間静置した後、ジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量25μFのコンデンサに550Vで印加、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。室温10分間静置した後、エレクトロポレーションした細胞を、10%FBS、1%ChS,0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液に懸濁し、96穴プレート(ファルコン)20枚に播種した。24時間後に終濃度8μg/mlとなるようブラストサイジン(Blasticidin S Hydrochloride、フナコシ)を加え、2〜3週間後には耐性コロニーが出現した。4回のトランスフェクションから合計51個の薬剤耐性コロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(3−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’および3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。2つの標的配列(図81中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図81中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
配列番号138−116(5’genome)、配列番号139−114(3’genome)の組み合わせでPCRを行った。
TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は以下のとおり行った。94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃6分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃7分を30サイクル、伸長72℃10分。PCR反応液にはMgSO4(終濃度0.5mM)で添加した。
得られたブラストサイジン耐性DT40細胞51株のうち23株が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約6.7kb及び3’genome約6.1kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(3−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。プローブは実施例1(1−4)で用いた5’probe−1および3’probe−10を用いた。
1次スクリーニングで得たうちの6株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素SphI(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’genome側解析においては相同組換え体で7.8kb、DT40(kkq79)(非組換え体)で6.1kb、3’genome側解析においては相同組換え体で9.5kb、DT40(kkq79)(非組換え体)で6.0kbである。解析した6株全てにおいて相同組換え体を確認した。
(3−5)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。上記(3−4)で組換えを確認した6クローンをヒトcot−1DNAおよびブラストサイジン(pCMV/Bsdベクターより切出して調製)をプローブにしてFISH解析を行ったところ、ヒト21番染色体は全てのクローンで宿主染色体に転座することなく、長腕近位にブラストサイジン由来のシグナルが検出されたことから部位特異的に組換えが起こったことが確かめられた。
以上の(3−1)〜(3−5)の実験により、相同組換えによりクローニング部位(loxP配列)及び3’neo及びFRT配列が挿入された21AΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞6株(DT40(21qAHAC)−2,13,16,29,39,51)を取得した。
(4)CHO細胞への21AΔqHACベクター移入
(4−1)ミクロセル法による21AΔqHACベクターのCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例23(3)で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位(loxP及び3’neo及びFRT配列)が挿入された21AΔqHACベクターを保持するDT40雑種細胞(DT40(21qAHAC)−2,39,51)を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(登録番号JCRB9018)を用いた。
はじめに約109個のDT40雑種細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したDT40雑種細胞をコルセミド(0.05μg/ml,インビトロジェン)を含む培養液(10%FBS,1%ChS,0.1mM 2−メルカプトエタノール,RPMI1640)中で13〜18時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清DMEMに再懸濁し、予めポリL−リジンでコーティングした25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に藩種した。37℃1時間静置し細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器にフラスコを挿入し、34℃、8,000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した後、5mlのDMEMに懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温,1500rpm,5分間遠心し、これにDMEMで2回洗浄後5mlのDMEMに懸濁した約107個のCHO−K1細胞を重層後、室温,1500rpm,5分間遠心し上清を取り除いた。45%ポリエチレングリコール1500(PEG1500、ロシュ)10%DMSO(シグマ)を含むDMEM溶液で120秒間融合処理した。120mlの10%FBSを含むF12培地(インビトロジェン)に懸濁し、48穴プレート(ファルコン)5枚に播種し、24〜36時間後にブラストサイジン(8μg/ml)を含む選択培地(10%FBS,F12)で培養した。約2週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。3回の微小核細胞融合から計16株(DT40(21qAHAC)−2由来8株,DT40(21qAHAC)−39由来3株,DT40(21qAHAC)−51由来5株)のブラストサイジン耐性CHO株を得た。
(4−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’および3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出した。方法は、上記実施例1(3−3)に従って行った。得られたブラストサイジン耐性CHO細胞16株のうち11株が、塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約6.7kb及び3’genome約6.1kb)の増幅産物を与えることを確認した。
(4−3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。ブラストサイジン耐性CHO株のうち10株について解析した結果、計3株(CHO(21qA−HAC)−5,6,17)が、正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーの21AΔqHACベクターが検出された。
以上(4−1)から(4−3)の実験から、得られたブラストサイジン耐性CHO株3株が21AΔqHACベクターを保持することを確認した。
実施例24
21AΔqHACベクターのCHO細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
21AΔqHACベクターのCHO細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例1に記載したCHO細胞株3株(CHO(21qA−HAC)−5,6,17)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれにブラストサイジン8μg/mlを添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収しFISH用染色体標本を作製した。
(2)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。その結果を表9に示す。
実施例2で示した図13より、WO2004/031385パンフレットで開示した21δqhacのCHO細胞におけるHAC保持率(%)は、培養開始時では、「薬剤選択あり」の場合で86%、7週倍用語では、「薬剤選択なし」の場合は66.0%、「薬剤選択あり」の場合は86.0%である。したがって、本願発明の21番染色体由来の新規HACベクター21Aδqhacは、長期培養においてもほぼ脱落が見られず、従来のHACベクターに比べ顕著に安定なHACベクターであることがわかった。
以上の(1)及び(2)の実験により、21Aδqhacベクターは、CHO細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例25
Hepo−21AδqhacベクターのCHO雑種細胞でのhepo遺伝子発現解析
(1)hepo−21Aδqhacベクターの構築
(1−1)21Aδqhacベクターへのhepo遺伝子の導入
実施例23で構築した21Aδqhacベクターへhepo遺伝子発現ユニットを挿入する。Loxp配列を含むhepo発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxp配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。概略を図77に示す。
実施例1で作製した21Aδqhacベクターを保持するCHO雑種細胞(CHO(21qa−HAC)−5,6)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。Loxp配列を含むhepo発現プラスミドpln1−EPO(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)10μgとCre酵素発現ベクターpbs185(ライフテック)10μgの存在下でジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%FBS添加したF12培地(インビトロジェン製)を含む48穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)5枚に播種した。2日後に0.8g/mlのG418(GENETICIN、インビトロジェン)を含む培地と置き換えた。2〜3週間後にはG418耐性コロニーが出現し、計48個(CHO(21qa−HAC)−5由来20個、CHO(21qa−HAC)−6由来28個)のコロニーを単離して増殖させ、以後の解析を行った。
(1−2)PCR解析
Hepo遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、21Aδqhacベクター上のloxp配列部位に挿入されたか否かを、loxp配列部位を挟むようにpln1−EPOベクター上及び21Aδqhacベクター上に設計したプライマーsvpanp1およびNeo Rp2によって、また挿入されたhepo遺伝子を、プラスミドベクターpbs226上のM13RVおよびNeo Rp2プライマーによって、PCR増幅により確認した。プライマー配列およびPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。組換え挿入体の場合は、プライマーsvpanp1およびNeo Rp2により約1.0kbp5プライマーM13RVおよびNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。その結果、上記(1−1)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち計40株において予想される増幅を確認した。以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞40株がloxp配列へのhepo遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることを確認した。
(1−3)サザンブロット解析
Hepo−21Aδqhacベクターにおいてhepo発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。塩基配列から予想されるxbai消化による制限酵素断片長は、hepo発現ユニットを含む5.5kbである(図14)。上記(1−2)で得たG418耐性候補CHO雑種細胞のうちの6株について解析を行った結果、合計3株(CHO(21qahace−13,14,37)において予測されるサイズのバンドを確認した。
(2)21Aδqhacベクターへ挿入されたhepo遺伝子の発現
Hepo遺伝子の発現を培養上清中に産生されるhepoタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。
上記実施例103(1−3)において単離したhepo−21Aδqhacベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞6株を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種した。コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え2日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収および細胞数を計数した。Hepo ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量した。
以上の結果から、上記hEPO−21AΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞6株全てにおいてhEPOの発現を確認した。
(3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−3)で得たG418耐性CHO雑種細胞のうち6株について解析した。その結果、計5株において観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−21AΔqHACベクターを検出した。
以上(1)の実験から、得られたG418耐性5株は、hEPO−21AΔqHACベクターを保持する正常核型のCHO細胞であることを確認した。
実施例26
hEPO−21AΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
hEPO−21AΔqHACベクターのCHO細胞における安定性を確認するために、非選択条件下および選択条件下(対照群)で長期継代培養を行った。実施例25で得たCHO雑種細胞2株(CHO(21qA−HACE)−13,14)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれに0.8g/mlのG418を添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収し、hEPO遺伝子の発現およびFISH解析を行った。
(2)長期継代培養後のhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量した。上記(1)で長期継代培養したhEPO−21AΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞2株について、実施例3(2)の方法に従って行った。その結果、上記hEPO−21AΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞2株全てにおいて長期継代培養後もhEPOの発現を確認した。
(3)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数およびHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記2株についてその結果を表10に示す。
以上の(1)から(3)の実験により、hEPO−21AΔqHACベクターは、長期継代培養後のCHO細胞において、非選択培養条件で安定に保持されること、細胞あたりのコピー数が維持されること、hEPO遺伝子の発現が維持されること、が明らかとなった。
実施例27
Neo耐性遺伝子ユニット除去hEPO−21AΔqΔneo−HACベクターの構築
21AΔq−HACベクター上及びpLN1/EPOFプラスミド(実施例18(3)にて作製)上のhEPO発現ユニット下流にはFRT配列が挿入されている。hEPO−21AΔq−HACベクター上からFRT/FLPe部位特異的組換えシステムによりNeo耐性遺伝子発現ユニットを除去する。その概略を図82に示す。
(1)hEPO−21AΔq−HACベクターからのNeo耐性遺伝子ユニット除去
(1−1)FLPeによるNeo耐性遺伝子ユニット除去
上記実施例25で作製したhEPO−21AΔqF−HACベクターを保持するCHO細胞中で実施例18(5−1)で作製したFLPe組換え酵素を一過性に発現させることでFRT配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体からNeo耐性遺伝子ユニットを切出し除去する。組換え挿入体の選別は、Neo耐性遺伝子ユニットの欠失を指標とした。
hEPO−21AΔq−HACベクターを保持するCHO細胞(CHO(21qA−HACE)−13及びCHO(21qA−HACE)−14)をトリプシン処理し、5×106細胞を0.8mlのハンクス平衡塩溶液(HBSS)に懸濁した。20〜100μgのFLPe酵素発現ベクターpOG44FLPe存在下でジーンパルサーII(バイオラッド)を用いてエレクトロポレーションを行った。容量500μFのコンデンサに450Vで印加し、電極間距離4mmのエレクトロポレーションセルを用いて放電した。エレクトロポレーションした細胞を10%FBSを添加したF12培地(インビトロジェン製)を含む96穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)8枚(1 cell/wellで4枚、0.1 cell/wellで4枚)に播種した。2〜3週間後ブラストサイジン耐性コロニーが出現し、計120個(CHO(21qA−HACE)−13由来60個、CHO(21qA−HACE)−14由来60個)のコロニーを単離し、同じクローンを24wellプレート2連にまき、一方はブラストサイジンで、一方はG418とブラストサイジンで培養した。G418を加えたwellで死滅したクローンはneo遺伝子が欠失していると考えられる。G418で死滅したクローンは120個中12クローン(CHO(21qA−HACE)−13由来3個、CHO(21qA−HACE)−14由来9個)であった。このクローンを用いて、以後の解析を行った。
(1−2)PCR解析
hEPO−21AΔq−HACベクター上からNeo耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるため、pLN1−EPOFベクター上及び21AΔqHACベクター上に設計したプライマーSVpANp1およびNeo Rp2によって、また挿入されたhEPO遺伝子を、プラスミドベクターpBS226上のM13RVおよびNeo Rp2プライマーによって確認した。プライマー配列およびPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。Neoカセットを含む組換え挿入体の場合は、プライマーSVpANp1およびNeo Rp2により約1.0kbp、プライマーM13RVおよびNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。一方、Neo耐性遺伝子ユニットが除去されていれば、上記2種類のプライマーでは増幅産物はみられない。その結果、上記(1−1)で得たG418非耐性CHO雑種細胞計12株のうち計10株において予想される増幅産物がみられないことを確認した。以上より、上記のBsd耐性かつG418非耐性CHO雑種細胞計10株がNeo耐性遺伝子ユニット除去されていることが確認された。
(1−3)サザンブロット解析
hEPO−21AΔq−HACベクター上からNeo耐性遺伝子ユニット除去されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行なった。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。塩基配列から予想されるEcoRI消化による制限酵素断片長は、Neo耐性遺伝子ユニットが除去されhEPO発現ユニットのみの場合4.9kb、Neo耐性遺伝子ユニット及びhEPO発現ユニット両方を含む場合7.6kbである。上記実施例27(1−1)で得た候補CHO雑種細胞12株(CHO(21qA−HACE)−13由来3株、CHO(21qA−HACE)−14由来9株)から、合計10株(CHO(21qA−HACE)−13由来2株、CHO(21qA−HACE)−14由来8株)において予測されるサイズのバンドを検出した。以上より、上記CHO雑種細胞10株において、Neo耐性遺伝子ユニット除去を確認した。Neo耐性遺伝子ユニットが除去されたhEPO−21AΔqF−HACベクターを以下hEPO−21AΔqΔneo−HACベクターと称する。
(1−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(5−3)で得た候補CHO雑種細胞のうち10株について解析した。その結果、計4株(CHO(21qAHACEΔ)−4,8,10,11)において、観察した分裂像のほとんどにおいて正常核型かつCot1で染まった1コピーのhEPO−21AΔqΔneo−HACベクターを検出した。
以上(1−1)から(1−4)の実験から、得られた上記CHO雑種細胞4株は、hEPO−21AΔqΔneo−HACベクターを保持する正常核型のCHO雑種細胞であることを確認した。
実施例28
Cre−loxPを用いてヒト21番染色体長腕遠位を削除した21HAC(21NΔqHAC)ベクターの構築
HACベクターがテロメア配列及びヒト21番染色体末端の短いサブテロメアは配列(約8kb)を含有するように、長腕遠位及び近位にloxP配列を相同組換えにより挿入し、Creによる部位特異的組換え反応により2箇所のloxP配列間の領域を切出し削除して長腕遠位欠失人工染色体(21NΔqHAC)ベクターを構築する。
(1)部位特異的組換え反応によるヒト21番染色体長腕削除
(1−1)ヒト21番染色体長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用ベクターNTの構築
loxP配列を挿入するための基本プラスミドにはV901(Lexicon genetics)を用いた。V830(Lexicon genetics)からRsrII(NEB)によりMC1−TK配列を切り出したのちV901プラスミドの制限酵素BamHIの認識部位にクローニングした(クローン名:V901T−2)。LoxP挿入部位であるヒト21番染色体遠位の塩基配列はGenBankデータベースより得た(NT_011515)。相同組み換えの2つの標的配列の増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
ヒト21番染色体を保持するA9<21−2>細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型にして標的配列をPCRにより増幅した。上記のプライマーを用いて、TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、反応条件は95℃2分の後、変性95℃15秒、アニーリング68℃4分を30サイクル行った。それぞれを制限酵素EcoRI(ニッポンジーン)ないしHindIII(ニッポンジーン)で消化して、アガロースゲルにより分離し精製後、V901T−2プラスミドのEcoRIないしHindIIIサイトにクローニングした。さらにV901T−2プラスミドのAscIとKpnIサイトにAscIとKpnIにより切り出した3’HPRT−loxP−BSをクローニングした。3’HPRT−loxP−BSはV820(Lexicon genetics)のXbaIサイトにオリゴ合成したloxP配列とCMV−BS配列(インビトロジェン)をクローニングすることで作製した。最終的なloxP挿入コンストラクトのサイズは13kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組み換えにより生じる染色体アレルを図83に示した。
(1−2)長腕近位loxP挿入済みヒト21番染色体を保持するDT40細胞への長腕遠位テロメア側loxP配列挿入用NTベクター導入
実施例1(1−2)の方法に従い、NTコンストラクトを制限酵素NotI消化により線状化DNAとし、実施例23(1)で作製した長腕近位loxP挿入済みヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞DT40(kk139)に導入した。ブラストサイジン(終濃度8ug/ml)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。2回のトランスフェクションから合計12個のブラストサイジン耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(1−3)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’および3’側の2標的配列の存在を実施例6(1−1)の方法に従い、PCR法により検出した。2つの標的配列(図83中、それぞれ5’genome及び3’genomeで示す)に対し、これらを夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図83に矢印で示した。その配列を以下に示す:
PCRは配列番号138−145(3’genome)、配列番号139−144(5’genome)の組み合わせで行った。
上記ブラストサイジン耐性12株のうち5株において5’および3’側の2標的配列の存在を確認した。
(1−4)サザンブロット解析
相同組換え体を選別するためのスクリーニングとしてサザンブロット解析を行った。相同組換えの3’側の標的配列内側にプローブを設定した(図83)。プローブは以下に示すオリゴヌクレオチドプライマー対を用い、ヒト21番染色体を保持するA9<21−2>細胞ゲノムDNAを鋳型としてPCRにより増幅、単離、精製した(3’probe−6とする)。
1次スクリーニングで得た5株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素KpnI(ロシュ)によりにより消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、相同組換え体で7.6kb、野生型(非組換え体)で23kbであり、候補5株から合計2株(DT40(kkNT)−7,11)の相同組換え体を確認した。これらの2クローンを用いて次のステップ(3)へ進めた。
(2)長腕近位および遠位へloxPを導入したヒト21番染色体のCHO細胞への移入
(2−1)ミクロセル法による改変ヒト21番染色体のCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例28(1)で得られた、長腕近位および遠位へloxPを導入したヒト21番染色体を保持するDT40雑種細胞(DT40(kkNT)−7,11)を用いた。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO hprt欠損細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンクより入手、登録番号JCRB0218)を用いた。
はじめに約109個のDT40雑種細胞からミクロセルを調製した。細胞密度が60〜70%飽和程度まで培養したDT40雑種細胞をコルセミド(0.05μg/ml,インビトロジェン)を含む培養液(10%FBS,1%ChS,0.1mM 2−メルカプトエタノール,RPMI1640)中で13〜18時間培養して微小核を誘導した。遠心分離により細胞を回収して無血清DMEMに再懸濁し、予めポリL−リジンでコーティングした25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に藩種した。37℃1時間静置し細胞が付着したのち培養液を除去し、予め保温(37℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、遠心容器にフラスコを挿入し、34℃、8,000rpm、1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した後、5mlのDMEMに懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温,1500rpm,5分間遠心し、これにDMEMで2回洗浄後5mlのDMEMに懸濁した約107個のCHOhprt−/−細胞を重層後、室温,1500rpm,5分間遠心し上清を取り除いた。45%ポリエチレングリコール1500(PEG1500、ロシュ)10%DMSO(シグマ)を含むDMEM溶液で120秒間融合処理した。120mlの10%FBSを含むF12培地(インビトロジェン)に懸濁し、48穴プレート(ファルコン)5枚に播種し、24〜36時間後にブラストサイジン(8μg/ml)を含む選択培地(10%FBS,F12)で培養した。約2週間の選択培養の後、出現した薬剤耐性のコロニーを単離し、以後の解析を行った。2回の微小核細胞融合から計10株(DT40(kkNT)−7由来5株,DT40(kkNT)−11由来5株)のブラストサイジン耐性CHOhprt−/−株を得た。
(2−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性株ゲノムDNAを鋳型としてヒト21番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在を実施例23(1−3)および実施例28(1−3)記載のPCR法により確認した。解析した10クローン全てにおいて増幅産物が確認できた。
(2−3)蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(2−2)で取得したうちの6クローンについて解析した結果、全てにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいてCot1で染まった1コピーのシグナルを検出した。
(3)Cre−loxP部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(3−1)長腕遠位及び近位へloxP配列挿入したヒト21番染色体保持CHO雑種細胞へのCre発現ベクターの導入
実施例1(1−2)の方法に従い、Cre発現ベクターpCAGGS−Creを実施例28(2)で取得したCHO(kkNT)−1及びCHO(kkNT)−5及びCHO(kkNT)−6細胞に導入した。HAT(SIGMA,終濃度1x)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
3回のトランスフェクションから合計12個のHAT耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(3−2)PCR解析
HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として2つのloxP配列間の欠失をPCR法により確認した。長腕遠位欠失後に残ったloxP配列を夾んで染色体上とターゲティングベクター上にそれぞれオリゴヌクレオチドプライマー対を設計した。その位置は図84中に矢印で示した。その配列を以下に示す:
TAQポリメラーゼはEX TAQ(宝酒造)を用い、反応条件は、94℃1分の後、変性94℃15秒、アニーリング60℃30秒、伸長72℃1分を35サイクルで行った。LOXP配列間の欠失により長腕遠位が削除された場合、約350Bの増幅が予測される。また配列番号148−145、配列番号114−149、配列番号114−145の組み合わせでは5.7KB,6.3KB,12KBの増幅が予測される。TAQポリメラーゼはLA TAQ(宝酒造)を用い、反応条件は以下のとおり行った。配列番号148−145、配列番号114−149の解析;94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃10分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃6分を25サイクル、伸長72℃10分。配列番号114−145の解析;94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃6分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃10分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃6分を30サイクル、伸長72℃10分。PCR反応液にはMGSO4(終濃度0.5MM)で添加した。
その結果、上記HAT耐性12株のうち6株において上記組み合わせのプライマーでの予測される増幅産物を確認した。
(3−3)サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行った。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図84に示した。相同組換えの5’側プローブは実施例1(1−4)記載の5’PROBE−1を3’側プローブは実施例28(1−4)記載の3’PROBE−6を用いた。
1次スクリーニング(PCR)で得た候補6クローンからゲノムDNA約5MGを制限酵素KPNI(ロシュ)により消化し、AUSUBELら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行った。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出した。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で16.5kb、組換え前のクローンで12kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で16.5kb、組換え前のクローンで7.6kbである。その結果、6株全てにおいて長腕遠位欠失体を確認した。
(3−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(3−3)で取得した6クローンについて解析した結果、4クローンにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて長腕遠位を削除したヒト21番染色体断片がCot1で染まっており、1コピーのシグナルを検出した。
以上(3−1)から(3−4)の実験から、得られたHAT耐性CHO雑種細胞は、テロメアおよびサブテロメアを残して長腕遠位を削除したヒト21番染色体断片(21NΔqHAC)を保持することを確認した。
実施例29
21NΔqHACベクターのCHO雑種細胞での長期安定性解析
(1)非選択培養条件下での長期継代培養
21NΔqHACベクターのCHO雑種細胞における安定性を確認するために、非選択条件下で長期継代培養を行った。実施例28に記載した21NΔqHACベクターを保持するCHO細胞株2株(CHO(21qN−HAC)17,18)を使用した。非選択培養液は10%FBSを含むF12培地であり、選択培養液はこれに1xHATを添加した。CHO細胞株は5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、細胞密度が80〜90%飽和程度まで培養した細胞を計数して再び5.0×105細胞を10cm径ディッシュに播種し、10継代まで行った。継代毎に細胞数を計数して集団倍加数を算出した。CHO細胞株は10継代後にそれぞれ細胞を回収しFISH用染色体標本を作製した。
(2)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。細胞集団倍加数およびHAC保持率は2連で行った結果の平均値を算出した。上記2株についてその結果を表11に示す。
以上の(1)及び(2)の実験により、21NΔqHACベクターは、CHO細胞において非選択培養条件で安定に保持されること、また細胞あたりのコピー数は維持されていることが明らかとなった。
実施例30
hEPO−21NΔqHACベクターのCHO雑種細胞でのhEPO遺伝子発現解析
(1)21NΔqHAC長腕近位へのクローニング部位の導入
(1−1)loxP及び3’neo及びFRT配列挿入用pSF1(FRT)−Dベクターの構築
ヒト人工染色体(21NΔqHAC)にloxP及び3’neo及びFRT配列を挿入するための基本プラスミドには、実施例18(1)で作製したt1pSF1(FRT)を用いた。loxP及び3’neo及びFRT配列挿入部位であるヒト21番染色体長腕近位の塩基配列はGenBankデータベースより得た(登録番号NT_011515)。相同組換えの2つの標的配列増幅に用いたプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
ヒト21番染色体を保持するA9<21−2>細胞から抽出したゲノムDNAを鋳型として2つの標的配列をPCRにより増幅した。配列番号134−135で増幅した約3.4kbのDNA断片(相同領域1)をPacIおよびNheI(ロシュ)で消化し、配列番号150−151で増幅した約2.0kbのDNA断片(相同領域4)を制限酵素SalIおよびSrfI(ロシュ)で消化し、突出末端をもつDNA断片をそれぞれアガロースゲル電気泳動により分離し、精製した。次に制限酵素消化した相同領域1のDNA断片とNheIおよびScaIで消化したt1pSF1(FRT)プラスミド(実施例18(1)で作製)と実施例1(2−1)で作製したpSF1▲3▼をScaIおよびPacIで消化したの3つのDNA断片を3フラグメントライゲーションした。このベクターをSalIおよびSrfIにより消化し、制限酵素消化した相同領域4をクローニングし、pSF1(FRT)−Dとした。最終的なpSF1(FRT)−Dコンストラクトのサイズは約11.8kbである。ターゲティングベクター、標的配列、及び相同組換えにより生じる染色体アレルを図85および図86に示した。
(1−2)長腕近位および遠位へloxPを導入したヒト21番染色体のhprt欠損DT40細胞への移入
長腕近位および遠位へloxPを導入したヒト21番染色体を保持するhprt欠損DT40雑種細胞は、同染色体を保持する実施例28(2)で作製したCHO(kkNT)6細胞を染色体供与細胞としてミクロセル法により調製した。染色体受容細胞であるhprt欠損DT40はDT4032株(Fukagawa et al.Nucleic Acids Research,1996)を用いた。以下に調製法の概略を記す。
はじめに約1×108個のCHO(kkNT)6細胞からミクロセルを調製した。25cm2遠心用フラスコ(ヌンク)12本に細胞密度が〜80%飽和程度まで培養したCHO(kkNT)6細胞をコルセミド(0.1μg/ml,デメコルシン,和光純薬)を含む焙養液(20%ウシ胎仔血清;FBS,0.8mg/ml G418,F12)中で72時間培養して微小核を誘導した。本実施例において、DMEMはニッスイ製薬製のものを用いた。培地を除いた後、予め保温(34℃)しておいたサイトカラシンB(DMEM中に10μg/ml,シグマ)溶液を遠心用フラスコに満たし、34℃,8000rpm,1時間の遠心を行った。ミクロセルを無血清培地(DMEM)に懸濁して回収し、ポアサイズ8μm、5μm、3μmのフィルター(ワットマン)を装着したSWINNEX−25(ミリポア)を用いて濾過精製した。精製したミクロセルはDMEM6mlに再懸濁した。DT4032細胞は、10%FBS、1%CS,0.1mM 2−MEを含むRPMI1640培養液にて培養後、DMEMで2回洗浄し、1×107個をDMEM5mlに再懸濁した。ミクロセル懸濁液を室温,1500rpm,5分間遠心し、これにDT4032細胞懸濁液を重層後、室温,1500rpm,5分間遠心し上清を取り除いた。ポリエチレングリコール(PEG)1:1.4溶液(Tomizukaら,Nature Genet.(USA),第16巻,p.133−143,1997年)で90秒間融合処理した。融合細胞を60mlの10%FBS、1%ニワトリ血清(ChS),0.1mM 2−メルカプトエタノール(ME)を含むRPMI1640培養液(インビトロジェン製)に懸濁し、96穴プレートの6枚に播いて24時間培養した後、1mg/mlのG418を含む培地で約2週間選択培養した。2回のミクロセル融合実験から出現した薬剤耐性のコロニーを単離した。G418耐性株ゲノムDNAを鋳型としてヒト21番染色体上に存在する遺伝子のゲノム領域の存在を実施例28(2−2)記載のPCR法により確認し、更にヒト特異的プローブCot1(ギブコBRL)を用いた蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)解析により1コピーのヒト21番染色体を保持するクローンDT4032(KKNT)8,9を確認し取得した。
(1−3)Cre−loxP部位特異的組換え反応による長腕遠位の削除
(1−3−1)長腕遠位及び近位へloxP配列挿入したヒト21番染色体保持DT4032雑種細胞へのCre発現ベクターの導入
実施例1(1−2)の方法に従い、Cre発現ベクターpCAGGS−Creを実施例30(1−2)で取得したDT4032(kkNT)−8及びDT4032(kkNT)−9細胞に導入した。HAT(SIGMA,終濃度1x)で選択培養を行い、2〜3週間後には薬剤耐性コロニーが出現した。
4回のトランスフェクションから合計43個のHAT耐性コロニーを単離して増殖させ以後の解析を行った。
(1−3−2)PCR解析
HAT耐性株のゲノムDNAを鋳型として2つのloxP配列間の欠失を実施例30(3−2)と同様にPCR法により確認した。
その結果、上記HAT耐性43株のうち40株において上記組み合わせのプライマーでの予測される増幅産物を確認した。
(1−3−3)サザンブロット解析
1次スクリーニング(PCR)で得た候補のうちの25クローンからゲノムDNAを抽出し実施例30(3−3)と同様にサザンブロット解析を行った。その結果、25クローン中5株おいて長腕遠位欠失体を確認した。
(1−3−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行った。上記(1−3−3)で取得した5クローンについて解析した結果、4クローンにおいて正常核型かつ観察した分裂像のほとんどにおいて長腕遠位を削除したヒト21番染色体断片がCot1で染まっており、1コピーのシグナルを検出した。
以上(1−3−1)から(1−3−4)の実験から、得られたHAT耐性DT4032雑種細胞は、テロメアおよびサブテロメアを残して長腕遠位を削除したヒト21番染色体断片(21NΔqHAC)を保持することを確認した。
(1−4)21NΔqHAC保持DT4032細胞へのpSF1(FRT)−Dベクター導入
pSF1(FRT)−Dコンストラクトを制限酵素SrfI(ロシュ)消化により線状化し、長腕遠位を削除した21NΔqHACを保持するDT4032雑種細胞3種(DT4032(kkNTC)15,17,22)にそれぞれ導入した。方法は、実施例1(2−2)に従って行った。2〜3週間後にはブラストサイジン耐性コロニーが出現した。DT4032(kkNTC)15では、各2回のトランスフェクションから合計125個の薬剤耐性コロニーを、DT4032(kkNTC)17では、各2回のトランスフェクションから合計110個の薬剤耐性コロニーを、またDT4032(kkNTC)22では各2回のトランスフェクションから合計124個の薬剤耐性コロニーを単離し、以後の解析を行った。
(1−5)PCR解析
上記ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’および3’側の2標的配列の存在を配列番号114−139のプライマーセットおよび配列番号145−138のプライマーセットを用いたPCR法により検出できる。その位置は図86中に矢印で示す。TaqポリメラーゼはLA Taq(宝酒造)を用い、PCR反応液にはMgSO4(終濃度0.5mM)で添加した。反応条件は94℃1分の後、変性98℃5秒、アニーリング/伸長72℃8分を3サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長70℃8分を2サイクル、変性98℃5秒、アニーリング/伸長68℃8分を30サイクル、伸長72℃10分で行うことができる。
(1−6)サザンブロット解析
長腕遠位欠失体を構造確認及び選別するためにサザンブロット解析を行うことができる。長腕遠位欠失により生じる標的配列、染色体アレル及びプローブの位置を図86に示す。相同組換えの5’側プローブは実施例23(1−4)記載の5’probe−1を3’側プローブは実施例28(1−4)記載の3’probe−6を用いる。
1次スクリーニング(PCR)で得た株から抽出したゲノムDNA約5μgを制限酵素KpnI(ロシュ)により消化し、Ausubelら(Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,1994)に記された方法でサザンブロット解析を行うことができる。32Pにより標識したプローブがハイブリダイズしたシグナルを、イメージアナライザーTyphoon9210(モレキュラーダイナミクス)により検出できる。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で11kb、組換え前のクローンで16.5kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で6.2kb、組換え前のクローンで16.5kbである。
以上の(1−1)〜(1−6)の実験により、相同組換えによりクローニング部位(loxP及び3’neo及びFRT配列)が挿入された21NΔqHACベクターを保持するDT4032雑種細胞を取得できる。
(2)CHO細胞への21NΔqHACベクター移入
(2−1)ミクロセル法による21NΔqHACベクターのCHO細胞への移入
染色体供与細胞として、上記実施例30(2)で得られた、長腕遠位を削除してクローニング部位(loxP及び3’neo及びFRT配列)が挿入された21NΔqHACベクターを保持するDT4032雑種細胞をそれぞれ用いる。染色体受容細胞としてはチャイニーズハムスター由来細胞株CHO−K1(登録番号JCRB9018)を用いる。方法は、実施例1(3−1)に従って行うことができる
(2−2)PCR解析
ブラストサイジン耐性株のゲノムDNAを鋳型として5’および3’側の2標的配列の存在をPCR法により検出できる。方法は、実施例30(1−5)に従う。塩基配列から予想されるサイズ(5’genome約7.5kb及び3’genome約5.3kb)の増幅産物を与えることを確認できる。
(2−3)サザンブロット解析
移入した21NΔqHACベクターの構造を確認するためサザンブロット解析を実施例30(1−6)と同様に行うことが出来る。塩基配列から予想される制限酵素断片長は、5’側標的配列では相同組換え体で11kb、組換え前のクローンで16.5kbであり、3’側標的配列では相同組換え体で6.2kb、組換え前のクローンで16.5kbである。(2−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行うことができる
以上(2−1)から(2−4)の実験から、得られたブラストサイジン耐性CHO株は21NΔqHACベクターを保持することを確認できる。
(3)hEPO−21NΔqHACベクターの構築
(3−1)21NΔqHACベクターへのhEPO遺伝子の導入
実施例30(2)で構築した21NΔqHACベクターへhEPO遺伝子発現ユニットを挿入する。loxP配列を含むhEPO発現プラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応により人工染色体に挿入する。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得(プロモーター分断型のneo耐性遺伝子発現ユニットの再構成)を指標とした。実施例30(2)で作製した21NΔqHACベクターを保持するCHO雑種細胞を用いて、実施例3(1−1)と同様にしてhEPO遺伝子発現ユニットの挿入を行った。2〜3週間後にはG418耐性のコロニーを単離して増殖させることができる。
(3−2)PCR解析
hEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体の選別は、21NΔqHACベクター上のloxP配列部位に挿入されたか否かを、loxP配列部位を挟むようにpLN1−EPOベクター上及び14NΔqHACベクター上に設計したプライマーSVpANp1およびNeo Rp2によって、また挿入されたhEPO遺伝子を、プラスミドベクターpBS226上のM13RVおよびNeo Rp2プライマーによって、PCR増幅により確認できる。プライマー配列およびPCRはKakedaらの方法(Kakedaら、Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従う。組換え挿入体の場合は、プライマーSVpANp1およびNeo Rp2により約1.0kbp、プライマーM13RVおよびNeo Rp2により約2.7kbpの増幅が予想される。以上より、上記のG418耐性CHO雑種細胞がloxP配列へのhEPO遺伝子発現ユニット組換え挿入体であることが確認できる。
(3−3)サザンブロット解析
hEPO−21NΔqHACベクターにおいてhEPO発現ユニット構造が正しく保持されているか否かを調べるために、サザンブロット解析を行うことができる。方法は、Kakedaら(Gene Therapy;12:852−856,2005年)に従った。塩基配列から予想されるXbaI消化による制限酵素断片長は、hEPO発現ユニットを含む5.5kbである。(3−4)FISH解析
FISH解析は、松原ら(FISH実験プロトコール,秀潤社,1994)に記された方法に従い、ヒト特異的Cot1(インビトロジェン)をプローブに用いて行うことができる。以上(3−1)から(3−4)の実験から得られた上記のG418耐性CHO雑種細胞**株は、hEPO−21NΔqHACベクターを保持する正常核型のCHO細胞であることを確認できる。
(4)21NΔqHACベクターへ挿入されたhEPO遺伝子の発現
hEPO遺伝子の発現は、培養上清中に産生されるhEPOタンパク質を酵素結合免疫吸着検定法(ELISA法)により定量できる。
上記(3)において単離したhEPO−21NΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞を、約105細胞を10%FBS添加した0.8mg/mlのG418を含むF12培地2mlをいれた12穴組織培養用プラスチックシャーレ(ファルコン)に播種し、コンフレント到達後、10%FBSを添加したF12培地2mlに置き換え2日間培養し、10%FBSを添加したF12培地1mlに置き換えさらに24時間培養した後、上清を回収および細胞数を計数できる。hEPO ELISAキット(Quantikine IVD Human EPO Immunoassay,R&Dシステム)により、培養上清中のhEPOを定量できる上記hEPO−21NΔqHACベクターを保持するG418耐性CHO雑種細胞においてhEPOの発現を確認できる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
配列番号110〜117:プライマー
配列番号118〜121:プローブ
配列番号122〜177:プライマー
配列番号178〜179:リンカー
[配列表]
Claims (61)
- 長腕遠位及び/又は短腕遠位が削除されたヒト染色体断片であって、
(i)ヒト染色体由来のセントロメア、
(ii)テロメア配列、
(iii)サブテロメア配列、並びに
(iv)外来DNA
を含むヒト染色体断片を含むことを特徴とするヒト人工染色体(HAC)ベクター。 - テロメア配列及びサブテロメア配列が哺乳動物染色体の長腕又は短腕由来である、請求項1記載のHACベクター。
- テロメア配列及びサブテロメア配列がヒト染色体の長腕又は短腕由来である、請求項1記載のHACベクター。
- サブテロメア配列がヒト染色体の長腕由来である、請求項1記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片が、ヒト染色体から長腕遠位が削除された部位に、該ヒト染色体と同じ又は異なるヒト染色体の長腕由来のサブテロメア配列を含む、請求項1記載のHACベクター。
- テロメア配列及びサブテロメア配列がヒト14番染色体の14q32領域内の部位から14q−tel領域までの配列である、請求項1記載のHACベクター。
- テロメア配列及びサブテロメア配列がヒト21番染色体の21q22.3領域内の部位から21q−tel領域までの配列である、請求項1記載のHACベクター。
- サブテロメア配列が約1〜500kbである、請求項1記載のHACベクター。
- サブテロメア配列が約5〜60kbである、請求項8記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片が約19Mb以下のサイズである、請求項1記載のHACベクター。
- 外来DNAが、タンパク質をコードする外来DNAである、請求項1記載のHACベクター。
- 外来DNAが、前記ヒト染色体断片において前記長腕遠位又は短腕遠位の削除位置より近位の部位に挿入される、請求項1記載のHACベクター。
- 外来DNAがテロメア配列から1〜500kbの領域に挿入された請求項1記載のHACベクター
- ヒト染色体断片が、ヒト14番染色体断片又はヒト21番染色体断片である、請求項1に記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片が、ヒト染色体の長腕遠位が削除されておりかつ長腕近位及び短腕を含む、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片が、ヒト染色体の短腕遠位が削除されておりかつ短腕近位を含む、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片が、ヒト染色体の長腕遠位及び短腕遠位がともに削除されておりかつ長腕近位及び短腕近位を含む、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片の長腕遠位がヒト染色体長腕のq11領域内又はq11領域からq12領域内で削除されている、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片がヒト14番染色体断片であり、かつ、ヒト14番染色体断片の長腕遠位がヒト14番染色体のAL391156において又はAL391156よりも近位の位置において削除されている、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片がヒト21番染色体断片であり、かつ、ヒト21番染色体断片の長腕遠位がヒト21番染色体のAP001657において又はAP001657よりも近位の位置において削除されている、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片の短腕遠位がヒト染色体短腕のp11領域内又はp11領域からp12領域内で削除されている、請求項1又は14記載のHACベクター。
- ヒト染色体断片が、
(iv)少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位
をさらに含む、請求項1記載のHACベクター。 - ヒト染色体断片が少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を含む、請求項22記載のHACベクター。
- 部位特異的組換え酵素の認識部位が、ヒト染色体断片の長腕近位及び/又は短腕近位に挿入されている、請求項22又は23記載のHACベクター。
- 部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、請求項22又は23記載のHACベクター。
- 部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である、請求項22又は23記載のHACベクター。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のHACベクターを有する細胞。
- ヒト人工染色体(HAC)ベクターの作製方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;並びに
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップを含む、上記作製方法。 - ステップ(b)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位の削除を部位特異的組換え酵素を用いて行うものである、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)及び(c)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位をテロメア配列との置換により削除して、該ヒト染色体又はヒト染色体断片にテロメア配列を付加する、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)及び(c)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位における少なくとも2箇所を切断することにより、該長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加する、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)〜(d)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位における少なくとも2箇所を切断することにより、該長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除し、かつ削除された長腕及び/又は短腕の部位に該ヒト染色体又はヒト番染色体断片由来のテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する、請求項28記載の方法。
- テロメア配列及びサブテロメア配列がヒト14番染色体の14q32領域内の部位から14q−tel領域までの配列である、請求項28記載の方法。
- テロメア配列及びサブテロメア配列がヒト21番染色体の21q22.3領域内の部位から21q−tel領域までの配列である、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位を長腕q11領域内又はq11領域からq12領域内で削除する、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片がヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片であり、かつヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の長腕遠位をヒト14番染色体のAL391156において又はAL391156よりも近位の位置において削除する、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)〜(d)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片がヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片であり、かつヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の14q11領域において長腕遠位を削除して、削除された長腕遠位の部位に該ヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の14q32領域内の部位から14q−tel領域までのテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片がヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片であり、かつヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の長腕遠位をヒト21番染色体のAP001657において又はAP001657よりも近位の位置において削除する、請求項28記載の方法。
- ステップ(b)〜(d)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片がヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片であり、かつヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の21q11領域において長腕遠位を削除して、削除された長腕遠位の部位に該ヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の21q22.3領域内の部位から21q−tel領域までのテロメア配列及びサブテロメア配列を付加する、請求項28記載の方法。
- (e)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ
をさらに含む、請求項28記載の方法。 - ステップ(e)において、部位特異的組換え酵素がCre酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がloxP配列である、請求項40記載の方法。
- ステップ(e)において、部位特異的組換え酵素がFLPe酵素であり、部位特異的組換え酵素の認識部位がFRT配列である、請求項40記載の方法。
- ステップ(e)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片がヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片であり、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト14番染色体又はヒト14番染色体断片の長腕のAL391156に又はAL391156における削除位置よりも近位の位置に挿入する、請求項40記載の方法。
- ステップ(e)において、ヒト染色体又はヒト染色体断片がヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片であり、かつ部位特異的組換え酵素の認識部位をヒト21番染色体又はヒト21番染色体断片の長腕のAP001657に又はAP001657における削除位置よりも近位の位置に挿入する、請求項40記載の方法。
- 請求項28〜44のいずれか1項に記載の方法により得られる、請求項1記載のヒト人工染色体(HAC)ベクター。
- 請求項45記載のHACベクターを保持する細胞。
- 外来DNAを含むヒト人工染色体(HAC)ベクターの作製方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ
(e)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも1つの部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;並びに
(f)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ
を含む、上記方法。 - 外来DNAを含むヒト人工染色体ベクター(HAC)の作製方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列又はテロメア配列及びサブテロメア配列を付加するステップ;
(d)ヒト染色体又はヒト染色体断片に少なくとも2種類の部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(e)部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片に外来DNAを挿入するステップ;並びに
(f)ステップ(e)で用いたものとは異なる種類の部位特異的組換え酵素の存在下にてヒト染色体又はヒト染色体断片上の薬剤耐性遺伝子を除去するステップ
を含む、上記方法。 - ヒト染色体がヒト14番染色体又はヒト21番染色体である、請求項47又は48記載の方法。
- 薬剤耐性遺伝子がネオマイシン耐性遺伝子である、請求項48記載の方法。
- 請求項47又は48記載の方法により得られる、請求項1記載の外来DNAを含むHACベクター。
- 請求項51記載の外来DNAを含むHACベクターを保持する細胞。
- ヒト細胞である、請求項27又は52記載の細胞。
- ヒト細胞がヒト体細胞である請求項53記載の細胞。
- チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞である、請求項27又は52記載の細胞。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のHACベクター、又は請求項47又は48記載の方法により得られる外来DNAを含むHACベクターを保持する細胞を含む医薬組成物。
- 外来DNAが、エリスロポイエチン(EPO)、トロンボポイエチン(TPO)、血液凝固因子、フォンヴィルブランド因子(vWF)、ジストロフィン、ドーパミン合成酵素、インスリン、インスリン様増殖因子(IGF)、インスリン様増殖因子結合タンパク質(IGFBP)、抗体、テロメラーゼ、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子、免疫グロブリン、成長ホルモン、インターロイキン2、インターロイキン3、インターロイキン4、インターロイキン5、インターロイキン6、インターロイキン7、インターロイキン8、インターロイキン9、インターロイキン10、インターロイキン11、インターロイキン12、インターロイキン15、CD40リガンド、インターフェロン、アデノシンデアミナーゼ、α―1アンチトリプシン、オルニチントランスカルバミラーゼ、プリンヌクレオチドホスホリラーゼ、成長抑制因子(GIF)、腫瘍壊死因子(TNF)、白血病阻害因子(LIF)、オンコスタチンM、Flt3リガンド(Flt3L)、ストローマ由来因子(SDF)、幹細胞増殖因子(SCF)、繊維芽細胞増殖因子(FGF)、上皮増殖因子(EGF)、血管形成誘導因子(VEGF)、アンジオポイエチン、神経成長因子(NGF)、骨形成因子(BMP)、アクチビン、トランスフォーミング増殖因子(TGF)、ウイント(Wnt)アールスポンジン(Rspondin)、モノクロナール抗体、オリゴクローナル抗体、及びポリクローナル抗体からなる群より選択される少なくとも1つのタンパク質をコードするものである、請求項56記載の医薬組成物。
- タンパク質の製造方法であって、以下のステップ:
(a)ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞を得るステップ;
(b)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片の長腕遠位及び/又は短腕遠位を削除するステップ;
(c)削除される長腕及び/又は短腕の部位にテロメア配列を付加するステップ;
(d)削除される長腕及び/又は短腕の部位にサブテロメア配列を付加するステップ;
(e)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片に部位特異的組換え酵素の認識部位を挿入するステップ;
(f)部位特異的組換え酵素の発現下にて上記ヒト染色体又はヒト染色体断片にタンパク質をコードする外来DNAを挿入するステップ;
(g)上記ヒト染色体又はヒト染色体断片を保持する供与細胞からミクロセルを調製するステップ;
(h)上記ミクロセルと受容細胞とを融合するステップ;
(i)融合した受容細胞を培地中で培養するステップ;並びに
(j)得られる培養物から上記タンパク質を採取するステップ
を含む、上記方法。 - ヒト染色体がヒト14番染色体又はヒト21番染色体である、請求項58記載の方法。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のHACベクターを有する非ヒト動物。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のHACベクターを用いて所望の疾患を治療する方法。
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