CN106318965B - 人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人工半合成染色体整合方法及含有完整合成染色体的微生物，该方法包括：(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点；(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。该方法能够有效地用于两条人工半合成染色体的整合。
Description
技术领域
本发明涉及人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物。
背景技术
酿酒酵母是一种重要的工业微生物，带有人工合成染色体的酿酒酵母菌株比野生菌株更具优势，在科学研究和工业生产上都具有重要意义。
酿酒酵母共16条染色体，总长度约为12mbp；其中最长的为IV号染色体，长度约为1.5mbp。Sc2.0项目是由美国纽约大学科学家Jef D.Beoke等人发起的旨在人工设计并从头合成酿酒酵母全基因组的国际合作项目。2011年Jef D.Beoke等人在Nature杂志上发表文章提出该项目计划，并合成了酿酒酵母IX号染色体右臂和VI号染色体左臂，进行了一系列方法测试，阐述了该计划的可行性。2014年，Jef D.Beoke实验室终于完成了酿酒酵母III号染色体的人工合成工作，合成染色体总长度约为273kbp。目前酵母染色体合成采用的是分段合成、从左到右逐段替换掉野生染色体序列的方式，每次替换的DNA序列长度约为30kbp(称为一个megachunk)。这种合成策略虽然可行，但是也带有一些明显的缺陷：比如单一方向合成，用时较长；如果前一段的合成序列替换失败，后续的所有合成片段都无法进行替换，风险较大等。
总之，目前的染色体合成方法仍有待改进。并且，在人工染色体合成中，染色体的整合是关键。然而，目前尚没有合适的染色体整合方法。
发明内容
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
目前染色体合成采用的是分段合成、从左到右逐段替换掉野生染色体序列的方式，如果能够将一条染色体分成2段或2段以上，分别进行替换，然后再将半合成的染色体整合成一条全合成的染色体，将大大提高酵母染色体合成的效率。染色体的长度越长，这种策略的优势就越明显。在这个策略中，染色体整合是关键，所以目前急需一种可行且高效的合成染色体整合方法。
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种可行且高效的人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种人工半合成染色体的整合方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，
其中，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点，
其中，所述预定酶切位点在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体上的位置被配置为适于在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间基于所述整合同源区发生同源重组；
(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。
发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效地将两条人工半合成染色体进行整合，并且步骤简单，需时短，可重复性好，结果准确可靠。
根据本发明的实施例，所述整合同源区为的长度大于1k。
根据本发明的实施例，所述预定酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位点的至少一种。从而，能够特异性识别所述预定酶切位点的预定酶可以为I-SceI酶、I-CeuI酶、PI-PspI酶或PI-SceI酶。根据本发明的一些具体示例，所述预定酶切位点为I-SceI酶切位点，所述预定酶为I-SceI。
根据本发明的实施例，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带第一抗性标记，所述第一抗性标记用于筛选在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。
根据本发明的实施例，所述第一抗性标记为选自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一种。根据本发明的另一些实施例，所述第一抗性标记为URA3。由此，在表达预定酶的菌株中进行酶切处理之后，通过FOA负筛选技术，可以筛选得到发生了酶切的菌株(如Ura-菌株)，从而可以进一步提高整合效率。
根据本发明的实施例，所述第二人工半合成染色体携带第二抗性标记，所述第二抗性标记用于筛选具有所述完整合成染色体的孢子。
根据本发明的实施例，所述第二抗性标记为选自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一种。根据本发明的另一些实施例，所述第二抗性标记为LEU2抗性标记。通过引入LEU2筛选标记，可以在进行同源重组后，通过影印SC-Leu培养基平板，直接筛选得到Leu-的孢子。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：
a.将携带第一人工半合成染色体的菌株和携带第二人工半合成染色体的菌株进行杂交，并挑选单克隆；以及
b.向所述单克隆导入所述预定酶的表达质粒，并诱导所述预定酶的表达，进行酶切处理，以便获得在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：
c.将经过酶切处理的菌液诱导产孢，并筛选孢子，即得完整合成染色体。
根据本发明的实施例，通过醋酸锂法导入所述预定酶的表达质粒。由此，效率高，整合位置准确，成本低廉。
根据本发明的实施例，利用半乳糖培养基诱导所述预定酶表达，进行酶切处理。由此，该预定酶表达率高，诱导效果好，有利于酶切处理的进行。
根据本发明的实施例，所述染色体为真核细胞，优选酵母细胞，更优选酿酒酵母细胞的染色体。也即本发明的方法适用于真核细胞，优选适用于酵母细胞，尤其适用于酿酒酵母细胞的合成染色体的整合。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种含有完整合成染色体的微生物。根据本发明的实施例，所述完整合成染色体是通过前面所述的人工半合成染色体的整合方法，由人工半合成染色体整合获得的。根据本发明的实施例，本发明的含有完整合成染色体的微生物，染色体完整、准确。
需要说明的是，根据本发明的实施例，本发明的方法具有下列优点的至少之一：
1、本发明在实现合成染色体整合的同时，通过引入I-SceI等预定酶切位点并将半合成染色体切成2段或多段，迫使合成染色体发生同源重组，用以提高整合效率；
2、通过FOA负筛选技术，可以筛选得到发生了酶切的菌株(如：Ura-菌株)，用以进一步提高整合效率；
3、通过引入LEU2等第二抗性标记，可以在随机孢子法筛选孢子步骤中，通过影印第二抗性标记培养基(如SC-Leu)平板，直接筛选得到孢子，用以在提高筛选效率的同时，还使得操作更简单，成本更低，避免了昂贵、操作复杂的四分体显微镜的使用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例，本发明的人工半合成染色体的整合方法的原理示意图；
图2显示了实施例1中，抗性基因PCR产物及抗性插入转化子鉴定结果；
图3显示了实施例1中，合成染色体整合PCR筛选结果；
图4显示了实施例1中，合成染色体整合PCR鉴定结果；以及
图5-图8分别显示了根据本发明一个实施例，预定酶切位点、第一抗性标记和第二抗性标记在半合成染色体上的四种位置关系。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种人工半合成染色体的整合方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，
其中，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点，
其中，所述预定酶切位点在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体上的位置被配置为适于在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间基于所述整合同源区发生同源重组；
(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。
发明人惊奇地发现，利用本发明的方法能够有效地将两条人工半合成染色体进行整合，并且步骤简单，需时短，可重复性好，结果准确可靠。
需要说明的是，所述预定酶的要求为：在整个酵母菌野生型基因组里都没有该预定酶的酶切位点。
另外，本发明所指的“完整合成染色体”是两条人工半合成染色体基于同源重组的方式而获得的，因此，“完整合成染色体”中的合成染色体长度是不受限制的。相对于一整条野生型染色体长度，“完整合成染色体”中的合成染色体的长度可以是一整条野生型染色体的长度(即完全合成一整条染色体)，也可以是1/100、1/90、1/80、1/70、1/60、1/50、1/40、1/30、1/20、1/10、1/5、1/2等条野生型染色体的长度(即只合成一整条染色体的其中一部分)。并且，该“完整合成染色体”是以孢子或菌株形式存在的，并不是以游离形式独立存在的。
根据本发明的实施例，所述整合同源区为的长度大于1k。
根据本发明的实施例，所述预定酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位点的至少一种。从而，能够特异性识别所述预定酶切位点的预定酶可以为I-SceI酶、I-CeuI酶、PI-PspI酶或PI-SceI酶。根据本发明的一些具体示例，所述预定酶切位点为I-SceI酶切位点，所述预定酶为I-SceI。由此，能够有效提高半合成染色体的整合效率。
根据本发明的实施例，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带第一抗性标记，所述第一抗性标记用于筛选在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。
根据本发明的实施例，所述第一抗性标记为选自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一种。根据本发明的另一些实施例，所述第一抗性标记为URA3。由此，在表达预定酶的菌株中进行酶切处理之后，通过FOA负筛选技术，可以筛选得到发生了酶切的菌株(如Ura-菌株)，从而可以进一步提高整合效率。
根据本发明的实施例，所述第二人工半合成染色体携带第二抗性标记，所述第二抗性标记用于筛选具有所述完整合成染色体的孢子。也即所述第二抗性标记用于区分孢子和二倍体细胞，从而能够更高效率地筛选出目的孢子。
其中，需要说明的是，第一抗性标记与第二抗性标记可以联合使用，也即第二人工半合成染色体同时携带第一抗性标记和第二抗性标记。根据本发明的实施例，当第二人工半合成染色体同时携带第一抗性标记和第二抗性标记时，在后续筛选具有完整合成染色体的孢子时，必须先基于第一抗性标记筛选菌株(包括产孢的以及不产孢的)，然后再基于第二抗性标记筛选孢子(如前所述，第二抗性标记是用于筛选产孢的菌株产生的孢子)，由此，通过联合使用两个抗性标记，大幅度地提高了筛选效率。
根据本发明的实施例，所述第二抗性标记为选自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一种。根据本发明的另一些实施例，所述第二抗性标记为LEU2抗性标记。通过引入LEU2筛选标记，可以在进行同源重组后，通过影印SC-Leu培养基平板，直接筛选得到Leu-的孢子。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：
a.将携带第一人工半合成染色体的菌株和携带第二人工半合成染色体的菌株进行杂交，并挑选单克隆；以及
b.向所述单克隆导入所述预定酶的表达质粒，并诱导所述预定酶的表达，进行酶切处理，以便获得在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。
根据本发明的实施例，步骤(2)进一步包括：
c.将经过酶切处理的菌液诱导产孢，并筛选孢子，即得完整合成染色体。
根据本发明的实施例，通过醋酸锂法导入所述预定酶的表达质粒。由此，效率高，整合位置准确，成本低廉。
根据本发明的实施例，利用半乳糖培养基诱导所述预定酶表达，进行酶切处理。由此，该预定酶表达率高，诱导效果好，有利于酶切处理的进行。
需要说明的是，通过引入I-SceI、I-CeuI、PI-PspI或PI-SceI酶切位点，并导入相应酶的表达质粒，诱导酶表达，能够有效地将人工半合成染色体切成2段，迫使半合成染色体发生同源重组，从而能够有效提高整合效率。
根据本发明的实施例，当所述第一抗性标记为URA3，所述第二抗性标记为LEU2时，通过以下步骤筛选孢子：
将经过酶切处理的菌液诱导产孢；
使用随机孢子法，通过FOA平板筛选得到发生酶切并整合的菌株；
经过影印SC-Leu平板将二倍体和孢子区分开来，筛选得到FOA+Leu-的孢子；以及
对筛选获得的FOA+Leu-的孢子进行PCR筛选和鉴定，以便获得具有完整合成染色体的孢子。
由此，能够有效地筛选并获得具有完整合成染色体的孢子。
根据本发明的实施例，所述染色体为真核细胞，优选酵母细胞，更优选酿酒酵母细胞的染色体。也即本发明的方法适用于真核细胞，优选适用于酵母细胞，尤其适用于酿酒酵母细胞的合成染色体的整合。
根据本发明的一些具体示例，所述第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体的合成染色体部分之间具有整合同源区，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点和第一抗性标记，所述第二人工半合成染色体还携带有第二抗性标记。并且，需要说明的是，所述预定酶切位点、第一抗性标记、第二抗性标记在半合成染色体上的位置不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，参照图5-图8，上述三种结构至少可以有图5-图8所示的四种位置关系。其中，图5的A、B两图中，着丝粒在第一人工半合成染色体的合成染色体部分，以及在第二人工半合成染色体的野生型部分；图6的A、B两图中，着丝粒在第一人工半合成染色体的野生型部分，以及在第二人工半合成染色体的合成染色体部分；图7的A、B两图中，着丝粒同时在第一以及第二人工半合成染色体的合成染色体部分；在图8中，着丝粒同时在第一以及第二人工半合成染色体野生型部分。
根据本发明的一些具体示例，本发明的人工半合成染色体的整合方法还可以包括以下步骤：
分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，所述第一人工半合成染色体包括合成染色体部分和野生型部分，所述第二人工半合成染色体包括野生型部分和合成染色体部分，其中，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，所述整合同源区分别位于所述第一人工半合成染色体的合成染色体部分下游和所述第二人工半合成染色体的合成染色体部分上游；
在第一人工半合成染色体的整合同源区下游引入预定酶切位点和第一抗性标记，并在所述第二人工半合成染色体的整合同源区上游引入所述预定酶切位点和第一抗性标记；
在第二人工半合成染色体的野生型部分的着丝粒上游插入第二抗性标记；
将携带第一人工半合成染色体的菌株和携带第二人工半合成染色体的菌株进行杂交，并挑选单克隆；
向所述单克隆导入能够特异性识别所述预定酶切位点的酶的表达质粒，并诱导能够特异性识别所述预定酶切位点的酶的表达，进行酶切处理；以及
将经过酶切处理的菌液诱导产孢，并筛选同时不具有第一抗性标记与第二抗性标记相应抗性的孢子，即得完整合成染色体。
由此，能够高效获得完整合成染色体。
需要说明的是，本发明的方法是一种高效的合成染色体整合方法。根据本发明的另一些实施例，本发明的方法还可以包括以下步骤：
在第一人工半合成染色体(SynL)和第二人工半合成染色体(SynR)之间设计同源区H。2条半合成染色体分别合成，合成过程中在SynL同源区下游和SynR同源区上游分别引入并保留I-SceI酶切位点(识别序列为TAGGGATAACAGGGTAAT，酿酒酵母染色体上不存在该酶切位点)和URA3抗性标记，或在替换结束后单独加入I-SceI和URA3；然后再在SynR的野生型部分的着丝粒上游插入LEU2抗性标记；最后将2个带有半合成染色体的菌株进行杂交，导入I-SceI内切酶的表达质粒，诱导I-SceI表达，将2条半合成染色体分别各切成2段，迫使2条半合成的染色体发生同源重组整合；将得到的菌液直接诱导产生孢子，使用随机孢子法，通过FOA平板筛选得到发生酶切并整合的菌株；再经过影印SC-Leu平板将二倍体和孢子区分开来，筛选得到FOA+Leu-的孢子；最后对孢子进行PCR筛选和鉴定，最终得到整合成功的、具有完整合成染色体的单倍体酵母菌株SynY(如图1所示)。
还需要说明的是，每一轮实验操作可以实现2段染色体的整合，如果染色体被分成多段，则需要进行多次整合。例如：染色体被分成4段合成，分别得到Syn1、Syn2、Syn3、Syn4，则需要2次整合，即：首先将Syn1、Syn2整合成Syn12，将Syn3、Syn4整合成Syn34；然后再将Syn12和Syn34再整合成Syn1234。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种含有完整合成染色体的微生物。根据本发明的实施例，所述完整合成染色体是通过前面所述的人工半合成染色体的整合方法，由人工半合成染色体整合获得的。根据本发明的实施例，本发明的含有完整合成染色体的微生物，染色体完整、准确。
根据本发明的实施例，所述微生物为工业生产用微生物，优选真菌，例如：霉菌(红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉)，酵母菌(啤酒酵母、假丝酵母、类酵母)，放线菌(链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属)，等等。根据本发明的一些具体示例，所述微生物为酵母。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例1：
本实施例以酿酒酵母II号染色体为例，构建半合成染色体整合菌株，并进行染色体整合。合成II号染色体总长度约为770kbp，两条人工半合成染色体SynA-R和SynR-Y的结构如图1所示，其构建方法以及半合成染色体菌株的获得方法可参见：申请号为201510008356.4的中国专利申请的实施例部分，在此将其全文并入本文。
具体地，第一人工半合成染色体为SynA-R(megachunk A-megachunk R为合成序列，megachunk S-megachunk Y为野生序列)，合成序列长约547kbp，megachunk R下游带有I-SceI酶切位点和URA3抗性标记；合成起始菌株为BY4741(该酵母菌株基因型为：MATahis3Δ1leu2Δ0 LYS2 met15Δ0 ura3Δ0)。第二人工半合成染色体为SynR-Y(megachunkA-megachunkQ为野生序列，megachunk R-megachunk Y为合成序列)，合成序列长约253kbp，megachunkR上游带有URA3抗性标记和I-SceI酶切位点；合成起始菌株为BY4742(该酵母菌株基因型为：MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 MET15 ura3Δ0)。同源区为megachunk R，长度约为30kbp。
具体步骤如下：
1.整合模型菌株构建
根据染色体整合设计要求，使用上述的半合成的酿酒酵母II号染色体SynA-R和SynR-Y构建待整合菌株。以URA3基因为模板，设计引物，并在引物末端引入30-40bp的同源区。其中，引物设计时，还需要考虑在SynA-R的megachunk R下游加入I-SceI酶切位点，在SynR-Y的megachunk R上游加入I-SceI酶切位点。然后进行PCR扩增，得到带有酵母染色体目标位置同源区以及I-SceI酶切位点的URA3抗性标记基因。由于在引物末端引入30-40bp的同源区，因此可以通过同源重组的方式将筛选标记插入到酵母染色体目标位置上。具体操作步骤如下。
1.1PCR获得插入片段
1.1.1PCR扩增
以URA3基因为模板，分别用引物A-R+URA+I-SceI-F、A-R+URA+I-SceI-R和R-Y+URA+I-SceI-F、R-Y+URA+I-SceI-R(序列如表1所示)进行PCR扩增，得到插入序列。PCR体系：Phusion DNA聚合酶0.2μL，5×HF缓冲液4μL，dNTPs 1.6μL，MgCl20.6μL，模板DNA 1μL，上述引物各1μL，ddH2O 10.6μL。PCR程序：98摄氏度30sec；98摄氏度10sec，55摄氏度30sec，72摄氏度1min，35个循环；72摄氏度5min。电泳检测PCR产物(PCR产物的结构中包含：URA3基因、I-SceI基因及同源区)，结果见图2A和2C。
1.1.2PCR产物纯化
使用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，用NanoDrop 2000测定纯化的PCR产物DNA浓度。
1.2酵母转化
使用醋酸锂法将扩增的抗性基因分别转化到带有半合成染色体酵母细胞中。挑半合成染色体菌株单克隆，接种至3mL YPD液体培养基中，30摄氏度200rpm摇培过夜；接1mL菌液至40mL YPD液体培养基中，30摄氏度200rpm摇培至OD600＝0.6-1.0，3000rpm离心5min收集菌体，分别用40mL无菌水和20mL 0.1mol/L醋酸锂洗涤沉淀一次，用1mL 0.1mol/L醋酸锂悬浮菌体；取100μL菌液，依次加入10μL PCR产物、25μL变性ssDNA、41μL 1mol/L醋酸锂、312μL 50％ PEG3350，涡旋混匀，30℃静置30min；加50μL二甲亚砜，涡旋混匀，42℃静置15min；3000rpm离心1.5min收集菌体，加1mL 5mmol/L CaCl2洗涤沉淀一次，用100μL 5mmol/LCaCl2悬浮沉淀，取适量菌液涂SC-Ura培养基平板，30摄氏度培养至长出单克隆。
1.3转化子PCR鉴定
使用玻璃珠法提取转化子的基因组DNA。挑转化子单克隆，接种至3mL YPD液体培养基中，30摄氏度200rpm摇培过夜，取1mL菌液，12000rpm离心收集菌体，依次加100μL裂解液、0.1g酸洗玻璃珠(0.5mm)、200μL PCI，涡旋仪最大转速振荡3min，补加100μL ddH2O，混匀，12000rpm离心5min，取150μL上层液体作为PCR模板。
分别使用设计的2对引物：(A-R+URA+I-SceI-VF与A-R+URA+I-SceI-VR)和(A-R+URA+I-SceI-VF与URA-R-1)，(R-Y+URA+I-SceI-VF与R-Y+URA+I-SceI-VR)和(R-Y+URA+I-SceI-VF与URA-R-1)对转化子进行PCR鉴定，确定抗性标记插入成功。其中，上述引物序列如表1所示。PCR反应体系：TAKARA Taq DNA聚合酶0.1μL，10×PCR缓冲液1.25μL，dNTPs 1μL，模板DNA 1μL，上述引物各0.5μL，ddH2O 8.15μL。PCR反应程序：94摄氏度5min；94摄氏度30sec，55摄氏度30sec，72摄氏度30sec，30个循环；72摄氏度5min。电泳检测PCR产物，结果见图2B和2D。得到的新菌株分别命名为SynA-R+URA和SynR-Y+URA。
2.合成染色体整合
2.1加入LEU2抗性标记
在SynR-Y+URA菌株的合成染色体端粒上游插入LEU2抗性标记(插入方法参考上述步骤1.1，其中所使用的引物为表1中的R-Y+LEU-F与R-Y+LEU-FR)。转化后同样通过PCR进行鉴定(转化以及鉴定方法参考上述步骤1.2与1.3，其中鉴定所使用的引物为表1中的R-Y+LEU-VF与R-Y+LEU-VR、R-Y+LEU-VF与LEU-R)，确定插入成功，结果见图2E和2F。得到的菌株命名为SynR-Y+URA+LEU。
2.2杂交
将半合成染色体模型菌株SynA-R+URA和SynR-Y+URA+LEU接种至同一管YPD液体培养基中，30摄氏度200rpm摇培过夜。取适量菌液涂SC-Lys-Met培养基平板，30摄氏度培养至长出单克隆。
2.3导入I-SceI表达载体
在杂交平板上挑单克隆，使用醋酸锂法将I-SceI表达质粒pRS413-I-SceI(由美国纽约大学Jef D.Boeke教授提供)导入上述合成染色体杂交菌株细胞中，涂SC-His培养基平板筛选单克隆。
2.4诱导酶切
在SC-His平板上挑单克隆，接种至3mL SC-His液体培养基中，30℃ 200rpm摇培过夜。取适量菌液接种至20mL SC-His(棉籽糖)培养基中，菌体终浓度为OD600＝0.1，30℃200rpm摇培至OD600＝0.4。8000rpm离心收集菌体，用20mL SC-His(半乳糖)培养基重新悬浮菌体，30℃ 200rpm摇培诱导2h。
2.5诱导产孢
取20μL诱导酶切菌液接种至3mL YPD液体培养基中，30℃ 200rpm摇培过夜。取1mL菌液涂SPOR培养基平板，室温培养1d，30℃培养至产孢率达到5％以上(约3-7d)。
2.6孢子筛选
采用随机孢子法。在产孢平板上刮取适量菌体，用25μL酵母细胞壁裂解酶Zymolyase20T(25mg/mL)悬浮菌体，37℃处理30min。加入500μL ddH2O，涡旋仪振荡混匀，取适量菌液涂SC+FOA培养基平板，30摄氏度下培养3d。将FOA筛选平板分别影印至SC-Leu和YPD培养基平板，30摄氏度培养1d。
2.7整合菌株鉴定
在YPD培养基上挑Leu-克隆(在SC-Leu培养基上不能生长的克隆)，用玻璃珠法提取基因组DNA，进行PCR鉴定。鉴定引物共25组，分别编号为A-Y，具体序列见表1中的Syn A-F/Syn A-R……Syn Y-F/Syn Y-R，以及WT A-F/WT A-R……WT Y-F/WT Y-R。每组鉴定引物均包括Syn(合成)和WT(野生)鉴定引物各一对。当一组鉴定引物中Syn引物有带，并且WT引物无带时，则认为该组引物鉴定正确，当25组鉴定引物均为正确带型时，则认为该菌株为整合成功的菌株。
2.7.1PCR筛选
首先选取引物组A和Y对挑取的克隆进行PCR筛选。PCR体系、程序同URA3抗性标记插入菌株鉴定，电泳检测PCR筛选结果。每2个泳道为一组鉴定引物，Syn型在前，WT型在后。引物组A和Y均为正确带型的克隆则为筛选得到的正确克隆。整合克隆1-17PCR筛选结果见图3(框中7、11、12、16、17号克隆为筛选得到的正确克隆)。
2.7.2PCR鉴定
将筛选得到的正确克隆再选取鉴定引物组B-X进行最终的PCR鉴定。23组引物均为正确带型的克隆为整合成功的菌株。整合菌株7、11、12、16、17号克隆的PCR鉴定结果见图4。从图中可以看出，12、17号克隆均为合成染色体整合成功的菌株。
此外，本实施例中采用的试剂配方如下：
裂解液：Tris-HCl pH 8.0 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，NaCl 0.1mol/L，Triton x-100 2％，SDS 1％。
PCI：Tris饱和酚250mL，三氯甲烷240mL，异戊醇10mL。
YPD培养基：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L；固体培养基加琼脂粉15g/L。
-5氨基酸混合粉末：腺嘌呤1.5g，丙氨酸6g，精氨酸6g，天冬氨酸6g，天冬酰胺6g，半胱氨酸6g，谷氨酸6g，谷氨酰胺6g，甘氨酸6g，异亮氨酸6g，苯丙氨酸6g，脯氨酸6g，丝氨酸6g，苏氨酸6g，色氨酸6g，酪氨酸6g，缬氨酸6g。
100×Ura：尿嘧啶2.24g/L。
50×Leu：亮氨酸13g/L。
100×Met：甲硫氨酸7.5g/L。
100×Lys：赖氨酸18.3g/L。
333×His：组氨酸21g/L。
SC-Ura培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His3mL/L，琼脂粉30g/L。
SC-Leu培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His3mL/L，琼脂粉30g/L。
SC-Lys-Met培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，333×His 3mL/L，琼脂粉30g/L。
SC+FOA培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L，333×His 3mL/L，5-氟乳清酸1g/L，琼脂粉30g/L。
SC-His培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys10mL/L；固体培养基加琼脂粉30g/L。
SC-His(棉籽糖)培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，葡萄糖1g/L，棉籽糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met 10mL/L，100×Lys 10mL/L。
SC-His(半乳糖)培养基：-5氨基酸混合粉末2g/L，酵母基础氮源(不含氨基酸、硫酸铵)1.7g/L，硫酸铵5g/L，半乳糖20g/L，100×Ura 10mL/L，50×Leu 20mL/L，100×Met10mL/L，100×Lys 10mL/L。
SPOR培养基：醋酸钾10g/L，酵母粉1.25g/L，葡萄糖1g/L，琼脂粉15g/L。
各引物序列如表1所示：
表1
实施例2含有人工合成染色体微生物的获得
按照以下步骤获得含有人工合成染色体的微生物：
(1)参照专利申请CN 201510008356.4所述的合成人工半合成染色体的方法，合成第一/二人工半合成染色体；
(2)参照实施例1中所述的人工半合成染色的整合方法，将步骤(1)中的第一/二人工半合成染色体进行同源重组，以便获得含有完整人工合成染色体的微生物。
其中，本实施例适用的微生物为工业生产用微生物，例如真菌：霉菌(红曲霉、青霉、木霉、根霉、毛霉)，酵母菌(啤酒酵母、假丝酵母、类酵母)，放线菌(链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属)，等等。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (17)
1.一种人工半合成染色体的整合方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)分别提供第一人工半合成染色体和第二人工半合成染色体，
其中，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均包括合成染色体部分和野生型部分，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间具有整合同源区，
所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带预定酶切位点，
其中，所述预定酶切位点在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体上的位置被配置为适于在所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体之间基于所述整合同源区发生同源重组；
(2)将所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体在表达预定酶的菌株中进行同源重组，以便获得完整合成染色体，其中，所述预定酶能够特异性识别所述预定酶切位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述整合同源区为的长度大于1k。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定酶切位点为选自I-SceI、I-CeuI、PI-PspI和PI-SceI酶切位点的至少一种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预定酶切位点为I-SceI酶切位点。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一人工半合成染色体和所述第二人工半合成染色体均携带第一抗性标记，所述第一抗性标记用于筛选在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一抗性标记为选自URA3、URA5、LYS2、LYS5和CAN1的至少一种。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第一抗性标记为URA3。
8.根据权利要求1、5或6任一项所述的方法，其特征在于，所述第二人工半合成染色体携带第二抗性标记，所述第二抗性标记用于筛选具有所述完整合成染色体的孢子。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二抗性标记为选自LEU2、URA3、URA5、LYS2、LYS5、HIS3、HIS4、MET4、MET13、MET15、ADE2、ADE8、MAL、GAL2、TRP1和HOM3的至少一种。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二抗性标记为LEU2抗性标记。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：
a.将携带第一人工半合成染色体的菌株和携带第二人工半合成染色体的菌株进行杂交，并挑选单克隆；以及
b.向所述单克隆导入所述预定酶的表达质粒，并诱导所述预定酶的表达，进行酶切处理，以便获得在所述预定酶切位点发生酶切与重组后具有所述完整合成染色体的菌株。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，步骤(2)进一步包括：
c.将经过酶切处理的菌液诱导产孢，并筛选孢子，即得完整合成染色体。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过醋酸锂法导入所述预定酶的表达质粒。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，利用半乳糖培养基诱导所述预定酶的表达，进行酶切处理。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色体为真核细胞的染色体。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色体为酵母细胞的染色体。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述染色体为酿酒酵母细胞的染色体。
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