CN103352050A - 利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。通过成功构建含有人类UBC启动子的eGFP标记基因和真核筛选抗性neo基因的BAC载体，并且载体两端有Loxp元件，为转染细胞后的标记和抗性去除做准备。此外，电转染BAC-Tol2-eGFP载体，转染效率达到了1%-6%，最高可到达10%，为大型哺乳动物BAC的使用和操作提供了一套完整的实验路线和方法。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。
背景技术
细菌人工染色体（BAC）常用来克隆约150kb-300kb大小的DNA片段。由于BAC较大（最大可达300kb），所含5’和3’调控区长，调控元件完全，可以有效的防止一般表达载体基因组整合后出现的位置效应，尤其对启动子及调控序列不十分清楚的高效特异表达基因，优势更为明显，因此BAC也是研究者比较理想的高效特异表达载体。但缺点是BAC较大，分子操作困难，转染细胞效率低。目前BAC大多都是用显微注射的方法进行，这种方法需要单个细胞注射，不适合大量转染，而且操作麻烦，技术要求高。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法。
为了实现本发明目的，本发明的一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法，利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。
具体地，前述方法包括以下步骤：
1）LoxP-eGFP-neo载体的构建：a）用xho和sal双酶切从pPB-eGFP-neo质粒（购自Wellcome Trust Sanger）上切下带有一个Loxp位点和eGFP真核表达调控元件的完整序列，并连接到用xho酶切的PGL3-contro（购自PROMEGA，E1741）载体上，构建成PGL3-loxp-eGFP载体；b）用Bgl和Kpn双酶切PGL3-loxp-eGFP质粒，切下带有Bgl和Kpn粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经Bgl和Kpn双酶切的7zf-mcs上（在PROMEGA公司的pGEM-7zf载体基础上对其克隆位点进行改变，得到7zf-mcs载体），构建成7zf-loxp-eGFP载体；c）用Bgl和not双酶切7zf-loxp-EGFP载体，切下带有Bgl和not粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经BamH和not双酶切的质粒Loxp-F3-neo-F3的骨架上，构建成LoxP-eGFP-neo载体，其全序列如SEQ ID No.1所示。
2）进行第一次重组，即pCC1BAC-Tol2载体的构建：d）将pABRG重组质粒电击转入分别含有3个BAC克隆（编号分别为706H15、169D05和572K17）的电击感受态中，并进一步制备成含pABRG质粒及BAC克隆的电击感受态；e）设计同源臂引物，PCR扩增Tol2转座元件（SEQ ID No.5），电转，进行同源重组；f）鉴定出同源重组正确的阳性菌落，提取BAC，构建得到pCC1BAC-Tol2载体；将所述pCC1BAC-Tol2载体分别标记为706H15-Tol2、169D05-Tol2和572K17-Tol2载体，载体序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6和7所示。
3）进行第二次重组，即质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP的构建：g）设计同源臂，PCR扩增LoxP-eGFP-neo载体中的携带LoxP-eGFP-neo的序列；h）将扩增的PCR片段电击转入含有pCC1BAC-Tol2载体的电击感受态中，进行第二次同源重组；i）PCR和测序鉴定阳性菌落，提取BAC，构建得到质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP；将所述质粒分别标记为706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP，质粒序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8和9所示。
4）质粒pcDNA3.1-TP的构建：构建得到的质粒pcDNA3.1-TP的全序列如SEQID No.4所示。
5）细胞的转染：用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP、572K17-Tol2-eGFP以及质粒pcDNA3.1-TP共转染绒山羊成纤维细胞。
6）用Cre-LoxP重组酶系统去除遗传标记基因eGFP和抗性基因neo。
前述方法中，转染使用的绒山羊成纤维细胞汇合度为70-80%，细胞数目为0.5×106-1×106个。
步骤5）中用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP各5μg以及质粒pcDNA3.1-TP400ng，利用核转染技术转染绒山羊成纤维细胞。
具体来说，本发明主要是针对BAC操作困难的问题，从三个方面对其改进进行研究，以增加BAC的可操作性。
首先，采用同源重组的方法对BAC进行修饰；含有完整绒山羊基因KAP6.3、KAP8.1和BMP4基因及其上、下游调控元件的BAC，由于它们来自同一个BAC文库（该BAC文库购自于内蒙古农业大学），且均是采用pCC1BAC细菌骨架构建而成。该BAC文库是用酶切法将基因组切成不同大小的片段，然后筛选合适的片段克隆到原核细菌骨架中，形成一种可以在细菌中生长的携带有其他物种基因组大片段的菌种。因此本发明是在相同的细菌骨架上进行重组Tol2转座子、遗传标记基因（eGFP）和抗性筛选基因（neo）以及它们的真核调控元件，并设有不含有Tol2转座子系统的对照。所选用的重组方法是pABRG重组系统（Bird,A W,ErlerA,Fu J,et al.High-efficiency counterselection recombineering for site-directedmutagenesis in bacterial artificial chromosomes[J].Nat Methods,2012,9(1):103-9），它是2012年在Red重组系统的基础上开发的一种新的重组体系，因其不含有α蛋白，因此可有效减少BAC自身的重组，保证BAC本身序列的完整性。重组后进行PCR鉴定和测序鉴定，证明已完成重组。
其次，用普通方法很难将BAC整合到基因组中，为了增加BAC转染绒山羊成纤维细胞后基因组的整合率，本发明选用经过哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子。这个转座子本身只含有Tol2转座作用的最小反向重复序列，它的转座酶基因被克隆至另一个载体pcDNA3.1-TP上，使得Tol2结构更加简单，使其可以具有克隆更大基因序列的能力，而且它的转座效率还不会降低。通过已有的文献报道，Tol2转座子在斑马鱼及其他如老鼠的整合效率对于BAC可达到5-20%，通过这种方法增加BAC整合到基因组的效力。由于在转染时需要有Tol2转座酶基因的表达质粒pcDNA3.1-TP和BAC共转染，所以转染后需要对pcDNA3.1-TP质粒是否整合到基因组上进行鉴定。鉴定的结果是，提取的四个六孔板细胞的基因组中并没有整合入该质粒。对Tol2转座子功能的鉴定结果是，提取的基因组上Tol2结构-反向重复序列之间的结构已丢失，证明Tol2转座子发挥了作用。
最后，由于BAC较大，普遍的转染方法是显微注射的方法，但是显微注射对设备和技术的要求很高，一般实验室很难达到要求，而且一次处理细胞数量不能太多。本发明采用Amaxa公司Nucleofector核转染技术进行BAC转染绒山羊成纤维细胞。这种方法直接转染细胞核，具有转染效率高，转染速度快，操作简单方便等优点。进一步地，在转染时对绒山羊成纤维细胞转染前后进行计数，细胞转染前的细胞数在0.5×105-1×106之间，电转染之后在5×102-1×103之间；转染时转染BAC质粒5μg和转座子Tol2的转座酶质粒pcDNA3.1-TP质粒400ng；并设对照试验，即转染不含有转座子Tol2元件的重组BAC质粒5μg和转座酶质粒pcDNA3.1-TP质粒400ng。计算转染效率，根据转染24小时后出现的荧光数，转染效率在1%-6%之间，最高可达到10%左右。
本发明通过对现有的BAC重组体系sw102、sw106、pkd46、pABRG进行了比较，发现pABRG体系的重组效果好，而且没有发现分子内重组；同时用优化的BAC特异的Tol2转座重组酶和细胞核转染技术，大大提高了BAC转染整合细胞的效率。另外，本发明构建的BAC重组载体具有真核细胞抗性neo和GFP绿色荧光筛选系统，以及能够消除neo抗性和GFP的Cre-LoxP重组酶处理系统。
附图说明
图1为本发明LoxP-eGFP-neo载体的构建流程示意图。
图2为本发明细胞基因组基因鉴定结果。
图3为本发明Tol2转座系统的工作原理图。
图4为本发明基因组转座系统Tol2基因PCR鉴定结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。以下实施例中使用的绒山羊成纤维细胞由内蒙古大学提供。
实施例1LoxP-eGFP-neo载体的构建
1、用xho和sal双酶切从pPB-eGFP-neo质粒（Wellcome Trust Sanger）上切下带有一个Loxp位点和eGFP（enhanced Green Fluorescent Protein，增强绿色荧光蛋白）真核表达的调控元件的完整序列，并连接到用xho酶切的PGL3-contro（购自PROMEGA，E1741）载体上，构建成PGL3-loxp-eGFP载体。
2、用Bgl和Kpn双酶切PGL3-loxp-eGFP质粒，切下带有Bgl和Kpn粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经Bgl和Kpn双酶切的7zf-mcs（在PROMEGA公司的pGEM-7zf载体基础上对其克隆位点进行改变，得到7zf-mcs载体）上，构建成7zf-loxp-eGFP载体。
3、用Bgl和not双酶切7zf-loxp-EGFP载体，切下带有Bgl和not粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经BamH和not双酶切的质粒Loxp-F3-neo-F3的骨架上，构建成LoxP-eGFP-neo载体。
LoxP-eGFP-neo载体（SEQ ID No.1）的构建流程如图1所示。
实施例2pCC1BAC-Tol2载体的构建
1、将3个鉴定正确的BAC克隆（编号分别为706H15，169D05，572K17）制备成电击感受态。
2、将pABRG重组质粒电击转入3个BAC（编号分别为706H15、169D05和572K17）的电击感受态中，并对其进行鉴定。
3、将上述鉴定正确的阳性克隆制备成BAC电击感受态。
4、设计同源臂引物，PCR扩增Tol2转座元件（SEQ ID No.5），将经过PCR扩增的片段回收。
5、将回收的PCR片段电击至BAC电击感受态中。
6、挑取单克隆对其进行PCR和测序鉴定，鉴定正确后保存菌种。
7、将鉴定正确的pCC1BAC-Tol2阳性克隆制备成电击感受态，以备再次重组用。
共有3个不同的BAC克隆号，将pCC1BAC-Tol2载体分别标记为706H15-Tol2、169D05-Tol2和572K17-Tol2载体，序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6和7所示。
构建成pCC1BAC-Tol2载体，其全序列如SEQ ID No.2所示。
实施例3质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP的构建
1、将上述鉴定正确的pCC1BAC-Tol2阳性克隆制备成含有重组质粒pABRG的电击感受态。
2、设计同源臂引物，PCR扩增LoxP-eGFP-neo载体中的携带LoxP-eGFP-neo的序列片段，将经过PCR扩增的片段回收。
3、将回收的PCR片段电击转入上述制备的含有重组质粒pABRG的pCC1BAC-Tol2的电击感受态中。
4、挑取阳性克隆对其进行跨片段PCR和测序鉴定，鉴定正确后保存菌种。
5、将坚定正确的阳性克隆菌种进行无内毒素提取，备用电转染。
同样，将载体分别标记为706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP载体，序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8和9所示。
构建成质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP，其全序列如SEQ ID No.3所示。
实施例4质粒pcDNA3.1-TP的构建
由上海生工生物工程公司完成，构建得到的质粒pcDNA3.1-TP的全序列如SEQ ID No.4所示。
实施例5绒山羊成纤维细胞的转染
电转染法是在高压情况下形成电脉冲并且在细胞膜上形成穿孔，于是在电激的瞬间形成了可逆的通道，从而促使外源DNA进入细胞内完成转染。Amaxa核转染技术是一种非病毒介导的转染方法，结合传统的电穿孔技术及对应的细胞特异性细胞核转染液，针对不同细胞类型调整优化电转参数（内存优化转染程序），可以把外源DNA直接导入传代细胞和原代细胞的细胞核中。与其他转染技术相比，Amaxa公司的Nucleofector核转染仪特别适用于转染原代细胞和其他较难转染的细胞系，如T细胞及PC-12细胞系等。采用Nucleofector核转染仪，可以在肿瘤研究、免疫学、组织工程学及心血管疾病研究领域中容易地获得大于90%的高效率基因转染率。
特点：转染效率高，大多数细胞系和原代细胞的转染率为50%-70%；某些原代细胞，如人表皮纤维原细胞转染效率超过90%；转染速度快，由于基因转染不依赖细胞分裂，在大多数细胞类型转染地基因2-4小时就能检测表达；操作简单方便等。
绒山羊成纤维细胞的培养及电转染（绒山羊成纤维细胞由内蒙古大学提供）
1、绒山羊成纤维细胞的培养基的配制，DMEM/F12（SH30023.01B)和血清购买至北京方程生物有限公司
2、复苏细胞及细胞培养
3、细胞电转染
A.清洗电转杯，将电转杯置于75%酒精中浸泡2小时，然后在紫外灯下照射后即可使用。
B.电穿孔前一天，以合适密度传代细胞，使细胞在转染前处于对数生长期。对于原代培养细胞，一般培养2-3天后，细胞单层融合度可以达到70-80%，即可开始试验。
C.PBS洗细胞2次后，胰酶消化细胞2min，待细胞变圆后，用完全培养基终止消化。
D.轻轻吹下细胞成单细胞悬液后，1000rpm室温离心5min。
E.完全弃去上清，根据细胞数量，加入100μL的电转缓冲液重悬细胞，并上下吹打均匀。
F.加入适量相应浓度的待转染核酸至相应的终浓度（质粒为20μg/mL，SiRNA的终浓度为100nM），上下吹打均匀。若以0.5mL计算，所需质粒为0.5×20=10μg。
G.将含有相应浓度核酸的细胞悬液转移入相应规格的电转杯中，按照预定条件设置参数，进行电击操作。（不同细胞电转前，需要进行预试验摸索电转的最佳条件，既要保证较高的转染效率，又要保证较高的细胞存活率。
H.电击完成后，将电转杯置于恒温培养箱中8-12min，以使核酸充分进入细胞。
I.将电击杯从恒温培养箱中取出，接种细胞悬液于预热的培养基中，上下吹打均匀后，置于培养箱中正常培养。
J.正常培养4h，待细胞贴壁后，给细胞换新鲜的完全培养基，以去除上层的死细胞。
K.培养24h后，即可进行细胞转染效率的检测或是进行细胞的发明处理。
进行转染时，转染BAC质粒（载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP、572K17-Tol2-eGFP）5μg和转座子Tol2的转座酶质粒pcDNA3.1-TP质粒400ng；并且设对照试验，即转染不含有转座子Tol2元件的重组BAC质粒5μg和转座酶质粒pcDNA3.1-TP质粒400ng。计算转染效率，本发明得到转染效率为1%-6%之间，最高可达到10%左右。
实施例6用Cre-LoxP重组酶系统去除遗传标记基因eGFP和抗性基因neo
在挑取单克隆后，对其进行遗传标记和抗性基因的去除，应用Cre-LoxP系统，在载体构建时本发明在遗传标记基因（eGFP）和抗性基因（neo）的两端插入有两个方向相同的LoxP位点，这样利用Cre-LoxP系统就可以将遗传标记基因和抗性基因去除掉。利用电转染的方法转染Cre酶质粒（转染约400ng）。由于是转染质粒，因此电转染所使用的转染程序是转染效率高且细胞损伤率低的转染程序，转染后在倒置显微镜下观察，其荧光基本消失。
细胞基因组基因鉴定（图2）。对经过Cre-LoxP系统处理后的细胞在6孔板上培养，进行基因组提取并做PCR鉴定。一方面鉴定转座子Tol2是否起到了作用，另一方面，验证携带有表达转座重组酶相应蛋白的质粒pCDNA3.1-TP是否也整合到基因组了。首先对提取的细胞基因组作相关的基因鉴定，分别是KAP8.1、KAP6.3和BMP4基因。M为Marker（100bp DNA Ladder），1、2为BAC706H15-Tol2-eGFP转染后的基因组细胞提取鉴定,鉴定的基因是KAP8.1大小是199bp，a1和b是未经过任何修饰的原BAC阳性对照，c为阴性对照。3为BAC169D05-Tol2-EGFP转染后的基因组细胞提取鉴定结果结果，鉴定的基因是KAP6.3，大小为314bp；4为572K17-Tol2-eGFP转染后的基因组细胞提取鉴定结果，鉴定的基因是BMP4，大小为306bp。然后，对基因组进行转座系统的鉴定，用PCR的方法利用同源臂引物进行鉴定,当电转染是把表达TP蛋白的质粒PCDNA3.1-TP同时转入细胞，pCDNA3.1-TP会表达TP蛋白，TP蛋白和转入的BAC质粒相互作用。如果Tol2的转座系统起到作用，其左右两端的L200和R150与绒山羊基因组结合，从而整合到基因组上，因此左右两端之间的原核抗性序列AMP将会被切除，当用PCR鉴定时表现出无条带。图3为Tol2转座系统的工作原理图。基因组转座系统Tol2基因PCR鉴定结果如图4所示，Marker为1kb DNA Ladder，其PCR片段大小为1576bp，其中1、2为706H15-Tol2-eGFP，3、4分别为169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP，5是构建好的BAC载体作为阳性对照，6-8分别是未经过修饰的BAC阴性对照，未经过处理的基因组对照以及水阴性对照。
第一次重组Tol2的同源臂引物序列为：
iTol-Homology-F1：5′-ACATGTCGTCGTAACCTGTAGAACGGAGTAACCTCGGTGTGCGGTTGTATCCCTGCTCGAGCCGGGCCCAAGTG-3′
iTol-Homology-R1：5′-TTAACGTGCCGGCACGGCCTGGGTAACCAGGTATTTTGTCCACATAACCGATTATGATCCTCTAGATCAGATCT-3′
第二次重组同源臂的引物序列为：
Neo-Homology-F2：
5′-ATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCACAGTGGGTACCGAGCTCTTACGCGT-3′
Neo-Homology-R2：
5′-TCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCTGTAAAACGACGGCCAGTGATAA-3′
综上，本发明主要针对BAC操作困难的问题，在三个方面对其改进进行研究，以增加BAC的可操作性。
首先，采用重组的方法对BAC进行修饰；含有完整绒山羊基因KAP6.3、KAP8.1和BMP4基因及其上、下游调控元件的BAC，由于它们来自同一个BAC文库，均是采用pCC1BAC细菌骨架构建的，因此本发明在相同的细菌骨架上进行重组Tol2转座序列、遗传标记基因（eGFP）和抗性筛选基因（neo）以及它们的真核调控元件。本发明所选用的重组方法是pABRG重组体系，它是2012年在Red重组系统的基础上研发的一种新的重组体系，因其不含有α蛋白，所以可以有效减少BAC自身的重组，保证BAC本身序列的完整性。重组后进行PCR鉴定和测序鉴定，证明已完成重组。
其次，由于用普通方法很难将BAC整合到基因组中，为了增加BAC转染绒山羊成纤维细胞后基因组的整合率，本发明选用经过哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子。该转座子本身只含有Tol2转座作用的最小反向重复序列，它的转座酶基因被克隆在另外一个载体pcDNA3.1-TP上，使得Tol2结构更加简单，使其具有克隆更大基因序列的能力，且它的转座效率不会降低。
最后，由于BAC较大，普遍的转染方法是显微注射的方法，但显微注射对设备和技术的要求很高，一般实验室很难达到要求，而且一次处理细胞数量有限。本发明采用Amaxa公司Nucleofector核转染技术进行BAC转染绒山羊成纤维细胞。这种方法直接转染细胞核，具有转染效率高，转染速度快，操作简单方便等优点。并且在转染时对绒山羊成纤维细胞转染前后进行计数，细胞转染前的细胞数在0.5×105-1×106之间，电转染之后在5×102-1×103之间；转染时转染BAC质粒5μg和转座子Tol2的转座酶质粒pcDNA3.1-TP质粒400ng；并且设对照试验，即转染不含有转座子Tol2元件的重组BAC质粒5μg和转座酶质粒pcDNA3.1-TP质粒400ng。计算转染效率，根据转染24小时后出现的荧光数，转染效率为1%-6%之间，最高可达到10%左右。
本发明成功构建了含有人类启动元件的eGFP标记基因和真核筛选抗性neo基因的BAC载体，并且载体两端有Loxp元件，为转染细胞后的标记和抗性去除做准备。此外，电转染BAC-Tol2-eGFP载体，转染效率达到了1%-6%，最高可到达10%，为大型哺乳动物BAC的使用和操作提供了一套完整的实验路线和方法。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种利用细菌人工染色体同源重组提高细胞转染效率的方法，其特征在于，利用pABRG重组质粒对含有目的基因的BAC进行同源重组，然后采用经哺乳动物密码子优化过的Tol2转座子将重组后的BAC通过核转染技术转染宿主细胞，使重组后的含有目的基因的BAC整合到宿主细胞的基因组中。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）LoxP-eGFP-neo载体的构建：a）用xho和sal双酶切从pPB-eGFP-neo质粒上切下带有一个Loxp位点和eGFP真核表达调控元件的完整序列，并连接到用xho酶切的PGL3-contro载体上，构建成PGL3-loxp-eGFP载体；b）用Bgl和Kpn双酶切PGL3-loxp-eGFP质粒，切下带有Bgl和Kpn粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经Bgl和Kpn双酶切的7zf-mcs上，构建成7zf-loxp-eGFP载体；c）用Bgl和not双酶切7zf-loxp-EGFP载体，切下带有Bgl和not粘性末端的Loxp-eGFP片段，并连接到经BamH和not双酶切的质粒Loxp-F3-neo-F3的骨架上，构建成LoxP-eGFP-neo载体，其全序列如SEQ ID No.1所示；
2）进行第一次重组，即pCC1BAC-Tol2载体的构建：d）将pABRG重组质粒转入分别含有3个BAC克隆的电击感受态中，所述含有3个BAC克隆的电击感受态编号分别为706H15、169D05和572K17，并进一步制备成含pABRG质粒及BAC克隆的电击感受态；e）设计同源臂引物，PCR扩增Tol2转座元件，电转，进行同源重组；f）鉴定出同源重组正确的阳性菌落，提取BAC，构建得到pCC1BAC-Tol2载体；将所述pCC1BAC-Tol2载体分别标记为706H15-Tol2、169D05-Tol2和572K17-Tol2载体，载体序列分别如SEQ ID No.2、SEQ ID No.6和7所示；
其中，Tol2转座元件的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；
3）进行第二次重组，即质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP的构建：g）设计同源臂，PCR扩增LoxP-eGFP-neo载体中携带LoxP-eGFP-neo的序列；h）将扩增的PCR片段转入含有pCC1BAC-Tol2载体的电击感受态中，进行第二次同源重组；i）PCR和测序鉴定阳性菌落，提取BAC，构建得到质粒pCC1BAC-Tol2-eGFP；将所述质粒分别标记为706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP，质粒序列分别如SEQ ID No.3、SEQ ID No.8和9所示；
4）质粒pcDNA3.1-TP的构建：构建得到的质粒pcDNA3.1-TP的全序列如SEQID No.4所示；
5）细胞的转染：用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP、572K17-Tol2-eGFP以及质粒pcDNA3.1-TP共转染绒山羊成纤维细胞；
6）用Cre-LoxP重组酶系统去除遗传标记基因eGFP和抗性基因neo。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，转染使用的绒山羊成纤维细胞汇合度为70-80%，细胞数目为0.5×106-1×106个。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5）中用载体706H15-Tol2-eGFP、169D05-Tol2-eGFP和572K17-Tol2-eGFP各5μg以及质粒pcDNA3.1-TP400ng，利用核转染技术转染绒山羊成纤维细胞。
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