CN102094036A - 一种等位基因双敲除打靶载体系统及其构建方法 - Google Patents

Abstract

一种等位基因双敲除打靶载体系统及其构建方法，该系统由pGT-V1和pGT-V2两个互补载体组成，每个载体都包含两个同向的LoxP元件，其间分别含有正筛选标记基因Neo/GFP和Hyg/RFP，外侧含有一个负筛选标记基因TK。同时设计两个“8碱基”多克隆位点分布在两个LoxP元件与负筛选标记之间以供同源臂的插入。本发明构建的打靶载体系统将两个互补的打靶载体共转染受体细胞，经过药物和荧光双筛选标记的选择，一次性实现对靶基因两个等位基因的遗传修饰或敲除，并且可以通过转入Cre酶与LoxP元件相互作用去除整合到基因组上的筛选标记基因，能够缩短获得纯合敲除靶细胞的时间，提高转基因动物的安全性，为开展动物转基因研究提供有价值的技术平台。

Description

一种等位基因双敲除打靶载体系统及其构建方法

技术领域：基因工程

技术背景：

转基因动物的研究现在正是科学界的热点。通过转基因技术人们可以打破种间隔离获得具有优良性状的经济动物，可以通过生产生物反应器获得各种生物材料和药用蛋白，可以打破免疫排斥进行器官移植，可以建立各种人类疾病的动物模型以及分析研究特定基因功能。

然而现有的转基因技术仍然存在弊端，最大的问题就是外源基因的随机插入带来的位置效应，即外源基因随机插入到与细胞重要生命活动相关的基因内部引起其异常表达。另外，如果目的基因随机插入致使染色质产生高级结构，或者插入到异染色质区则该基因就会被沉默。因此，对基因的定时定点修饰成为提高转基因效率的关键因素。现在普遍使用的显微注射法，精子介导法，病毒载体法都不能满足这一要求，相比之下，基因打靶成为理想选择。

基因打靶是对染色体上特定基因进行定位修饰的生物工程技术。20世纪初期，Morgan等在果蝇中阐明了同源重组是产生交换的基础。基因打靶正是基于此原理，通过外源DNA与受体细胞染色体DNA同源序列之间的重组来改造基因组特定靶位点，包括基因敲除和基因敲入，由此改变生物的遗传特性。早在1978年，Hinnen等就在酵母中利用插入型打靶载体实组方法将一段外源质粒插入到人染色体β-globin位点上，从而最早在哺乳动物细胞中实现了同源重组。但是，真正使该技术得以推广应用和发展完善的却是小鼠胚胎干细胞技术。1981年Martin和Evans等成功建立了小鼠胚胎干细胞系(ES细胞)，1987年人们利用ES细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因敲除的动物模型。虽然大动物的ES细胞还没有被成功分离的报道，但是人们通过基因打靶结合体细胞核移植技术，已经成功研制出一系列转基因猪、牛、羊。

基因打靶的关键在于打靶载体的设计。常用的打靶载体有置换型和插入型，主要的区别在于二者的线性化位点不同。插入型载体的线性化位点在同源序列的内部，置换型载体的线性化位点在同源序列的外侧。由于插入型载体有可能发生恢复性同源重组回到野生基因型，相比而言，置换型载体更为广泛使用。为提高打靶载体的整合效率，优化后期筛选策略，置换型打靶载体的设计在不断被改进。1988年，Capecchi等运用“正负筛选”策略，将两个筛选标记基因Neo和TK连入打靶载体，其中靶细胞富集率比仅使用单一抗生素筛选提高3-10倍。传统的基因打靶用于将靶基因在细胞或者动物体中的活性完全剔除，容易导致胚胎早期死亡和发育缺陷。1994年，Gu等将Cre-LoxP系统与基因打靶技术相结合，获得第一只组织特异的基因敲除小鼠。2009年7月，美国威斯康辛医学院等多家单位的研究人员利用锌指核酸酶技术成功地创建了首个基因敲除大鼠。

现存的打靶载体各有其特点，大多数打靶载体在操作时都只能针对等位基因上的一条染色体进行打靶，要得到纯合子需要进行多重打靶来完成。1991年，Angela Cruz等人先构建NEO为抗性的第一打靶载体，电转染进入利什曼虫细胞LT252，筛选得到的阳性细胞后，再转入HYG为抗性的第二打靶载体，最终完成了DHFR-TS基因的双敲除。但是这种策略耗时长，且完成第一次敲除的细胞在筛选过程中可能出现缺失染色体的恢复突变。1992年Mortensen等提出用高浓度的抗生素筛选实现杂合中靶细胞纯合化的观点。但是这种方法周期长，高浓度抗生素压力下存活细胞极少，且如果单一拷贝基因敲除细胞对最大浓度抗生素产生抗性则该策略失效。再者细胞死亡很难确定是关键基因纯合敲除致死还是抗生素不耐受致死，影响实验结果的分析。由于小鼠的遗传发育特点，纯合的基因敲除小鼠可以通过嵌合体的途径得到，但在大动物，此过程周期很长，工作量很大。在大动物上实现基因双敲除的报道始见于2003年，美国PPLTherapeutics公司通过三轮连续基因敲除，首次完成了对猪1，3-半乳糖转移酶(GT)基因的完全敲除。日本杜协大学Sendai等人也经过四年时间通过先后两轮打靶，获得1，3-GT基因的双敲除牛胎儿成纤维细胞。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其解决了背景技术中存在打靶载体系统的构建缺陷和不足。

本发明的技术解决方案是：

一种等位基因双敲除打靶载体系统，其特殊之处在于：

该系统由pGT-V1和pGT-V2两个互补载体组成，每个载体都包含两个同向的LoxP元件，其间含有两个正筛选标记基因，外侧含有一个负筛选标记基因，即pGT-V1带有正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因(Neo)和绿色荧光蛋白基因(GFP)，pGT-V2带有正筛选标记潮霉素基因(Hyg)和红色荧光蛋白基因(RFP)，二者都含有负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(TK)。

上述pGT-V1和pGT-V2两个互补载体还包括两个“8碱基”多克隆位点，其分布在两个LoxP元件与负筛选标记之间以供同源臂的插入。

一种等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特殊之处在于，该方法包括：

1)构建中间载体pIRES-Neo-GFP

1.1)Nhe Ⅰ单酶切pEGFP-C1，Klenow补平后用Bgl Ⅱ单切，同时用EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ双酶切pIRES-neo，凝胶电泳回收EGFP片段及线性化的pIRES-Neo，16℃连接过夜；

1.2)次日挑取单克隆，分别用Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ酶切鉴定；

2)构建中间载体pIRES-Hyg-RED

2.1)BamHI单切pDsRed1-N1，Klenow补平后NotI单切；

2.2)EcoRV/NotI双酶切pIRES-Neo，电泳回收DsRed1片段和pIRES-Neo载体片段，在16℃下连接过夜，得到中间载体pIRES-Neo-RED；

2.3)然后用NotI、EcorI和BamHI双酶切该载体，Klenow补平后加入连接酶，16℃反应过夜，得到灭掉NotI、EcoRI、BamHI，三个位点的pIRES-Neo-RED；

2.4)通过PCR扩增HygromycinB基因，然后将其连接到pMD18-T载体上，得到pMD18T-HYG；

2.5)用XbaI/SmaI双酶切pIRES-Neo-RED，Bgl Ⅱ单酶切pMD18T-HYG后，用Klenow补平后乙醇沉淀，再用Spe1单切后电泳分离，胶回收HYG和pIRES-RED片段，在16℃下连接过夜；

2.6)次日挑取克隆后酶切鉴定，得到pIRES-Hyg-RED，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定；

3)构建中间载体pBS246/MCS/TK

3.1)将合成的小片段MCS1插入pBS246的EcoRI位点处；MCS2插入SpeI和NdeI位点间构建完成pBS246/MCS；用分别用ScaI和PsyI单酶切检测；

3.2)EcoRl单切pBS246/MCS，Klenow补平后，再用Notl单切，电泳回收；Notl，Swal，Asel三酶切pHSV-TK，电泳回收TK片段；16℃连接过夜；

3.3)次日挑取单克隆酶切鉴定后得到pBS246/MCS/TK；

4)构建打靶载体pGT-V1和pGT-V2

4.1)Xho Ⅰ单酶切pIRES-Neo-GFP和pIRES-Hyg-RED，Klenow补平后用NruⅠ单酶切，电泳回收含Neo-GFP和Hyg-RED片段；

4.2)BamH Ⅰ单切pBS246/tk，Klenow补平后去磷酸化，电泳回收该线性化载体后分别与Neo-GFP和Hyg-RED两片段在16℃连接过夜；

4.3)次日挑取单克隆，酶切鉴定后得到打靶载体pGT-V1和pGT-V2。

上述PCR扩增的引物是

以pCEP4为模板，设计引物Hyg-F：5’GAAGATCTTATGAAAAAGCCTGAACTCAC3’；Hyg-R：5’GACTAGTTTTATGAACAAACGACCCAAC3’。

上述多克隆位点小片段MCS1和MCS2，

其中MCS1：AATTCGCCCGGGCCCTCAGCAGCGCTGGCGCGCCGCTAAGCGGGTCCCGCTAGC；

MCS2：CTAGTTAATTAAGGCCGGCCGACTTAGTCCTGAGGACCGGTGTTTAAACCA。

本发明的系统的特点是：

1)两个载体携带相同的打靶长/短臂序列，共转染受体细胞，经同源重组使打靶片段同时插入到染色体的一对等位基因上；经双抗性和双荧光筛选，得到带抗药性和黄色荧光的中靶细胞。

2)对中靶细胞再用Cre酶处理和荧光负筛选，去除打靶后遗留的筛选标记，排除这些标记物对细胞核移植和克隆胚胎可能产生的不利影响。

本发明构建的打靶载体系统将两个互补的打靶载体共转染受体细胞，经过药物和荧光双筛选标记的选择，一次性实现对靶基因两个等位基因的遗传修饰或敲除。从而提高基因打靶的效率，缩短实验时间，并为开展动物转基因研究提供有价值的技术平台。

附图说明

图1为本发明打靶载体系统构成图；

图2为本发明构建方法流程图；

图3为酶切检测pIRES-Neo-GFP，其中1：Bgl Ⅱ酶切pIRES-Neo-GFP，得到1.9Kb和4Kb片段；2：Kpn Ⅰ酶切pIRES-Neo-GFP，得到1.5Kb和4.4Kb片段；M：Marker；

图4为酶切检测pIRES-Hyg-RED，其中1：pIRES-Hyg-RED；2：EcoRI单切pIRES-Hyg-RED，得到约6.2Kb带；3：EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pIRES-Hyg-RED，得到约1.1Kb和5.1Kb片段；M：marker；

图5为酶切检测pBS246/MCS，其中1：PsyI单切pBS246/MCS/TK，得到约2.7Kb带；3：Sca Ⅰ单酶切pBS246/MCS，得到约2.7Kb片段；M：marker；

图6为酶切检测pBS246/MCS/TK，其中1：pBS246/MCS/TK质粒；2：BlpI单切pBS246/MCS/TK，得到约4.8Kb带；3：Not Ⅰ单酶切pBS246/MCS/TK，得到约4.8Kb片段；M：marker；

图7为酶切检测pGT-V1，其中1：Sal Ⅰ单酶切pGT-V1，得到8046bp单一条带；2：Sma Ⅰ单切pGT-V1，得到5.5kb和2.5kb片段；M：marker；

图8为酶切检测pGT-V2，其中1：Sal Ⅰ单酶切pGT-V2得到8286bp单一片段；2：Bgl Ⅱ单切pGT-V2得到8286bp单一片段；M：marker；

图9为电转染C2C12细胞验证筛选标记基因功能(200X)(24h)，其中A、B：电转染pGT-V1(G组)；C、D：电转染pGT-V2(R组)；E、F：电转染pEGFP-C1(P组)；

图10为荧光显微镜及流式细胞仪检测验证Cre/LoxP系统，其中A：pGT-V1稳转C2C12细胞系；B：转染pBS185(24h)；C：流式细胞仪检测，(1)阴性对照组；(2)pGT-V1稳转C2C12细胞；(3)电转染pBS185一次；(4)电转染pBS185二次；

图11为共转染打靶载体pGT-V1和pGT-V2(200X)(24h)，其中A：明场下C2C12；B：观察绿色荧光；C：观察红色荧光；D：观察黄色荧光。

具体实施方式

材料及试剂

(1)菌株及细胞

DH5α(本实验室保存)，小鼠C2C12(本实验室分离)

(2)质粒

pIRES-neo(CLONTECH)、pEGFP-C1(CLONTECH)、pDsRed-N1(CLONTECH)、pBS246(GIBCO/BRL)、pBS185(GIBCO/BRL)、pCEP4(Invitrogen)、pORF-HSV1tk(Invivogen)、pMD20-T(TaKaRa)

(3)试剂

各种内切酶、T4连接酶、KLENOW、CIP等均购自MBI；G418(GIBCO)、丙氧鸟苷(GAC)(Sigma)、潮霉素(Roche)、DMEM干粉(高糖)(GIBCO)、胎牛血清(GIBCO)、DNA片段快速回收试剂盒(BioDev-tech)、小量质粒抽提试剂盒(Vigrous)

(4)引物及序列

方法步骤

1)构建中间载体pIRES-Neo-GFP

Nhe Ⅰ单酶切pEGFP-C1，Klenow补平后用Bgl Ⅱ单切，同时用EcoR Ⅴ和BamHⅠ双酶切pIRES-neo，凝胶电泳回收EGFP片段及线性化的pIRES-Neo，16℃连接过夜。次日挑取单克隆，分别用Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ酶切鉴定(图3)。

2)构建中间载体pIRES-Hyg-RED

BamHI单切pDsRed1-N1，Klenow补平后NotI单切；EcoRV/NotI双酶切pIRES-Neo，电泳回收DsRed1片段和pIRES-Neo载体片段，在16℃下连接过夜，得到中间载体pIRES-Neo-RED。然后用NotI、EcorI和BamHI双酶切该载体，Klenow补平后加入连接酶，16℃反应过夜，得到灭掉NotI、EcoRI、BamHI，三个位点的pIRES-Neo-RED。通过PCR扩增Hygromycin B基因，然后将其连接到pMD18-T载体上，得到pMD18T-HYG。其中PCR扩增的引物是：以pCEP4为模板，设计引物Hyg-F：5’GAAGATCTTATGAAAAAGCCTGAACTCAC3’；Hyg-R：5’GACTAGTTTTATGAACAAACGACCCAAC3’。

用XbaI/SmaI双酶切pIRES-Neo-RED，Bgl Ⅱ单酶切pMD18T-HYG后，用Klenow补平后乙醇沉淀，再用Spe1单切后电泳分离，胶回收HYG和pIRES-RED片段，在16℃下连接过夜。次日挑取克隆后酶切鉴定，得到pIRES-Hyg-RED，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定(图4)。

3)构建中间载体pBS246/MCS/TK

将合成的小片段MCS1插入pBS246的EcoRI位点处；MCS2插入SpeI和NdeI位点间构建完成pBS246/MCS。用分别用ScaI和PsyI单酶切检测(图5)。

多克隆位点小片段MCS1和MCS2，

其中MCS1：AATTCGCCCGGGCCCTCAGCAGCGCTGGCGCGCCGCTAAGCGGGTCCCGCTAGC；MCS2：CTAGTTAATTAAGGCCGGCCGACTTAGTCCTGAGGACCGGTGTTTAAACCA。

EcoRl单切pBS246/MCS，Klenow补平后，再用Notl单切，电泳回收。Notl，Swal，Asel三酶切pHSV-TK，电泳回收TK片段。16度连接过夜。次日挑取单克隆酶切鉴定后得到pBS246/MCS/TK(图6)。

4)构建打靶载体pGT-V1和pGT-V2

Xho Ⅰ单酶切pIRES-Neo-GFP和pIRES-Hyg-RED，Klenow补平后用Nru Ⅰ单酶切，电泳回收含Neo-GFP和Hyg-RED片段。BamH Ⅰ单切pBS246/tk，Klenow补平后去磷酸化，电泳回收该线性化载体后分别与Neo-GFP和Hyg-RED两片段在16℃连接过夜。次日挑取单克隆，酶切鉴定后得到打靶载体pGT-V1(图7)和pGT-V2(图8)。

电转染C2C12细胞检测功能元件

小鼠成肌细胞C2C12在含10％胎牛血清的H-DMEM培养基中培养，生长条件37℃、5％CO2饱和湿度。待细胞生长至80％汇合度时，用0.25％胰酶消化，离心收集后细胞计数，用电转缓冲液“cytosalt”将细胞浓度调整至6×10⁶cell/mL。取5个0.4cm电击杯，分别加入400μL细胞悬液，然后向前三个杯子中依次加入20μg Not Ⅰ线性化的打靶载体pGT-V1、pGT-V2和pEGP-C1，分别命名为G组(GFP)、R组(Red)和阳性对照P组。后两组加入同体积的水作为阴性对照组，分别命名为GN组和RN组，混匀，4℃冰箱放置5min后进行电击(BTXECM 2001)，电击杯内径为0.4cm，电转条件为320V，3ms，3次。电转后置于4℃冰箱5min，将细胞转移到60皿中进行培养。24h后荧光显微镜下观测，在GN和RN组均未检测到荧光的情况下，G组、R组和P组都检测到相应的荧光(图9)。

在G组和GN组加入800μg/mLG418，在R组和RN组加700μg/mL潮霉素，放入CO₂培养箱培养。每两天换次液，一周后阴性对照组全部杀死。挑取G组和R组抗性克隆至96孔板，在48孔板中扩大培养到70％汇合度时各挑选3个克隆加入4μM GAC，放入培养箱中培养，每2天换次液体，5天后细胞全部死亡。以上结果证明打靶载体pGT-V1中的GFP、NEO、TK元件工作正常，pGT-V2中的RED、HYG、TK元件工作正常。

由于LoxP元件位于中间载体PBS246-MCS-TK上，pGT-V1和pGT-V2都是由此构建而成，所以对于LoxP元件的功能验证就只检测G组克隆。将一组G418抗性克隆扩大培养到60皿，收细胞后先后两次电转染10μg pBS185，同时设立阴性对照组。用流式细胞仪定量检测，未转染的G组克隆有83.4％的细胞为EGFP阳性，而经过Cre酶处理一次的EGFP阳性细胞组，有61.2％的细胞为EGFP阳性，经过Cre酶处理第二次后，EGFP阳性细胞仅有40.1％。通过对EGFP的检测，证明pBS185瞬时表达的Cre酶能与稳定整合到基因组上的LoxP元件发生作用，从基因组上部分删除了EGFP基因，从而证明了载体上LoxP元件的有效性。参见图10。

共转染pGT-V1和pGT-V2

取400μL C2C12细胞悬液(6×10⁶cell/mL)，加入Not Ⅰ线性化的打靶载体pGT-V1和pGT-V2各12μg，按照320V，3ms，3次的条件进行电转染。24h后荧光显微镜下观测到发出黄色荧光的细胞，证明利用该系统能够实现一次性敲除靶基因的两个等位基因。参见图11。

Claims (5)

1.一种等位基因双敲除打靶载体系统，其特征在于：

该系统由pGT-V1和pGT-V2两个互补载体组成，每个载体都包含两个同向的LoxP元件，其间含有两个正筛选标记基因，外侧含有一个负筛选标记基因，即pGT-V1带有正筛选标记新霉素磷酸转移酶基因和绿色荧光蛋白基因，pGT-V2带有正筛选标记潮霉素基因和红色荧光蛋白基因，二者都含有负筛选标记单纯疱疹病毒胸苷激酶基因。

2.根据权利要求1所述等位基因双敲除打靶载体系统，其特征在于：所述pGT-V1和pGT-V2两个互补载体还包括两个“8碱基”多克隆位点，其分布在两个LoxP元件与负筛选标记之间以供同源臂的插入。

3.一种等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特征在于，该方法包括：

1)构建中间载体pIRES-Neo-GFP

1.1)Nhe Ⅰ单酶切pEGFP-C1，Klenow补平后用Bgl Ⅱ单切，同时用EcoR Ⅴ和BamH Ⅰ双酶切pIRES-neo，凝胶电泳回收EGFP片段及线性化的pIRES-Neo，16℃连接过夜；

1.2)次日挑取单克隆，分别用Bgl Ⅱ和Kpn Ⅰ酶切鉴定；

2)构建中间载体pIRES-Hyg-RED

2.1)BamHI单切pDsRed1-N1，Klenow补平后NotI单切；

2.2)EcoRV/NotI双酶切pIRES-Neo，电泳回收DsRed1片段和pIRES-Neo载体片段，在16℃下连接过夜，得到中间载体pIRES-Neo-RED；

2.3)然后用NotI、EcorI和BamHI双酶切该载体，Klenow补平后加入连接酶，16℃反应过夜，得到灭掉NotI、EcoRI、BamHI，三个位点的pIRES-Neo-RED；

2.4)通过PCR扩增HygromycinB基因，然后将其连接到pMD18-T载体上，得到pMD18T-HYG；

2.5)用XbaI/SmaI双酶切pIRES-Neo-RED，Bgl Ⅱ单酶切pMD18T-HYG后，用Klenow补平后乙醇沉淀，再用Spe1单切后电泳分离，胶回收HYG和pIRES-RED片段，在16℃下连接过夜；

2.6)次日挑取克隆后酶切鉴定，得到pIRES-Hyg-RED，EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切鉴定；

3)构建中间载体pBS246/MCS/TK

3.1)将合成的小片段MCS1插入pBS246的EcoRI位点处；MCS2插入SpeI和NdeI位点间构建完成pBS246/MCS；用分别用ScaI和PsyI单酶切检测；

3.2)EcoRl单切pBS246/MCS，Klenow补平后，再用Notl单切，电泳回收；Notl，Swal，Asel三酶切pHSV-TK，电泳回收TK片段；16℃连接过夜；

3.3)次日挑取单克隆酶切鉴定后得到pBS246/MCS/TK；

4)构建打靶载体pGT-V1和pGT-V2

4.1)Xho Ⅰ单酶切pIRES-Neo-GFP和pIRES-Hyg-RED，Klenow补平后用NruⅠ单酶切，电泳回收含Neo-GFP和Hyg-RED片段；

4.2)BamH Ⅰ单切pBS246/tk，Klenow补平后去磷酸化，电泳回收该线性化载体后分别与Neo-GFP和Hyg-RED两片段在16℃连接过夜；

4.3)次日挑取单克隆，酶切鉴定后得到打靶载体pGT-V1和pGT-V2。

4.根据权利要求2所述等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特征在于：所述PCR扩增的引物是

以pCEP4为模板，设计引物Hyg-F：5’GAAGATCTTATGAAAAAGCCTGAACTCAC3’；Hyg-R：5’GACTAGTTTTATGAACAAACGACCCAAC3’。

5.根据权利要求2所述等位基因双敲除打靶载体系统的构建方法，其特征在于：所述多克隆位点小片段MCS1和MCS2，

其中MCS1：AATTCGCCCGGGCCCTCAGCAGCGCTGGCGCGCCGCTAAGCGGGTCCCGCTAGC；

MCS2：CTAGTTAATTAAGGCCGGCCGACTTAGTCCTGAGGACCGGTGTTTAAACCA。

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