CN109112159A

CN109112159A - 基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞

Info

Publication number: CN109112159A
Application number: CN201811039181.3A
Authority: CN
Inventors: 张涌; 康健; 权富生; 谢晓刚; 葛陆星; 董翔宸; 王丰瑜; 孙洪政; 韩成全
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-09-06
Filing date: 2018-09-06
Publication date: 2019-01-01

Abstract

本发明公开了一种基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞，本发明利用电穿孔的方法将靶向MSTN基因的Cas9真核表达载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现对鲁西黄牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶，获得MSTN位点定点敲入FABP4基因和MSTN基因点突变的牛胎儿成纤维细胞。通过Junction PCR筛选和验证获得了打靶的阳性克隆细胞。以该阳性克隆细胞为供核细胞移入去核的牛卵母细胞中，可获得转基因克隆胚胎，为快速、高效研制优质转基因肉牛新品种提供坚实基础。

Description

基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞

技术领域

本发明属于转基因克隆动物技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞。

背景技术

肌肉生长抑制素(myostatin，MSTN)又称生长分化因子8(growthdifferentiation factor 8，GDF-8)，是转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)超家族的成员。MSTN是骨骼肌生长发育的负调控因子，抑制其活性会导致肌肉过度生长和提高胴体瘦肉率。MSTN基因失活是引起肉牛产生双肌表型的分子原因，例如，比利时蓝牛和皮埃蒙特牛。与野生型小鼠相比，MSTN基因纯合突变小鼠的体重增加30％以上，并且其肌肉纤维具有更大的横截面(肥大)以及更多数量的肌纤维(增生)。以上研究结果表明，MSTN基因可以作为促进家畜肌肉生长以及改善肉品质的理想靶标。

脂肪型脂肪酸结合蛋白(adipose fatty acid-binding protein，FABP4)，又称A-FABP、aP2，属于低分子细胞内脂质结合蛋白超家族成员，在长链脂肪酸的摄取、转运以及能量代谢和炎症反应中起着重要的调控作用。FABP4在成熟脂肪细胞中高度表达，约占脂肪细胞内可溶蛋白的6％。已有研究表明，FABP4与脂质代谢紊乱、糖尿病和肥胖相关。在脂肪细胞分化过程中，FABP4的表达量会升高，并且其活性受长链脂肪酸、氧化型低密度脂蛋白、过氧化物酶体增殖激活受体γ以及胰岛素调控。FABP4作为一种脂质蛋白伴侣，对长链脂肪酸具有高亲和力，促进其在细胞内的溶解和转运。因此，FABP4影响脂肪酸的摄取、转运、酯化和β-氧化，调节体内能量平衡和脂质信号转导。FABP4不仅能够将脂肪酸携带至脂滴储存，或线粒体和过氧化物酶体中进行氧化反应，还能将脂肪酸转运至内质网和细胞核以调控转录、脂质介导的信号转导以及调节酶活性和生物膜的合成。

研究证明MSTN对骨骼肌的生长发育具有负调控作用，该基因的功能缺失能够引起肉用动物的“双肌”表型。但是，具有“双肌”表型的动物肌内脂肪含量较低，严重影响肉的品质。FABP4对脂肪酸有高度的亲和性，参与长链脂肪酸在脂肪细胞中的转运。国内外研究表明，FABP4是影响牛肉嫩度和肌内脂肪含量的候选基因之一，与牛肉品质密切相关。

鲁西黄牛作为我国优良的地方品种，产肉性能良好，前躯发育良好，但是后躯发育较差。目前利用基因编辑技术生产优良性状转基因家畜，多是针对单一基因进行编辑，例如，MSTN基因敲除牛、β-乳球蛋白基因敲除牛、fat-1转基因牛等，为获得优质肉用家畜品种，仍需要探索快速、高效的育种方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，该打靶载体上克隆有重组基因P2A-FABP4-PolyA，并克隆有作为同源臂的sgRNA靶点上游和下游的同源序列，其中靶点上游同源序列引入G938A点突变(参考GenBank：AF019761.1)，该点突变可以使MSTN蛋白功能丧失；所述的重组基因P2A-FABP4-PolyA包括FABP4基因CDS区(参考GenBank：NM_174314.2)，FABP4基因CDS区的上游连接P2A，在下游连接PolyA。P2A-FABP4-PolyA进行同源重组所需的Cas9真核表达载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA表达框，sgRNA靶点位于牛基因组2号染色体MSTN基因3’UTR序列。

优选的，所述的sgRNA靶点的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9所示。

优选的，所述的重组基因P2A-FABP4-PolyA中，P2A的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，FABP4基因CDS区的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，PolyA的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示。

优选的，所述的同源臂包括分别位于重组基因P2A-FABP4-PolyA上游、下游的上游同源臂(即上游同源序列)、下游同源臂(即下游同源序列)，上游同源臂在MSTN基因上的同源序列的末端位于MSTN基因的终止密码子之前的一个碱基，重组基因P2A-FABP4-PolyA与下游同源臂之间还设有一对同向的Loxp，Loxp之间设有筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA。

优选的，所述上游同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游同源臂的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示。

优选的，所述的Cas9真核表达载体为pSpCas9-sgRNA，是通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上连接上述sgRNA靶点的核苷酸序列而构建。

优选的，所述的打靶载体为pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE，是通过在上述上游同源臂中引入G938A点突变并将该上游同源臂通过P2A与FABP4基因CDS区的上游连接，将上述下游同源臂连接至打靶骨架载体T-Vector pMD19并在该下游同源臂上游插入LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP，以及将PolyA插入到打靶骨架载体中第一个Loxp的上游后再插入连接有FABP4基因CDS区的上游同源臂至该PolyA的上游而构建。

一种Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的重组细胞，通过上述Cas9真核表达载体和打靶载体共转染到宿主细胞(例如，牛胎儿成纤维细胞)中，将目的基因FABP4(CDS区)定点整合到宿主细胞基因组的2号染色体MSTN基因终止密码子TGA序列之前，并在宿主细胞MSTN基因第三外显子上引入G938A点突变。

优选的，所述的共转染是将上述Cas9真核表达载体和打靶载体电转染到宿主细胞中，电转染参数设置如下：电压为510V、脉冲时间为2ms、电击次数为2次。

上述Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的重组细胞作为构建转基因克隆胚胎的核供体细胞的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明构建的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，可以同时对两个基因进行编辑，而且可以通过Cas9-sgRNA复合物(例如，Cas9真核表达载体)在MSTN基因特定位点(靶点)进行双链断裂，借助同源重组末端修复来实现目标基因的定点整合，提高了转基因效率，因而有利于缩短肉用家畜育种时间。

进一步的，本发明中筛选出的脱靶效应相对较低的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11四个靶点(SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8、SEQ.ID.NO.9)，在后续的同源末端重组修复过程中均能介导目标基因的定点整合，特别是sgRNA1(SEQ.ID.NO.1)距离TGA位置最近，结合同源臂设计，更有利于实现精确的同源重组。从而使本发明构建的打靶载体，能够通过基因打靶技术使FABP4基因(CDS区)和MSTN基因点突变定点整合到牛的MSTN基因位点，实现了对于两个基因的精确编辑。

进一步的，通过在筛选基因表达框EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA两侧引入一对同向的Loxp序列，既可以提高阳性克隆细胞的筛选效率，又能在阳性克隆细胞获得后去除筛选标记，从而提高体细胞核移植的克隆效率。

本发明通过在MSTN基因位点引入突变并定点整合FABP4基因(CDS区)构建转基因细胞系(重组细胞系)，可以作为生产转基因克隆胚胎的核移植供体细胞，为抑制MSTN的功能发挥，同时实现FABP4在骨骼肌细胞中的表达，进而为快速、高效研制优质转基因肉用家畜(例如，肉牛)新品种提供坚实基础。

附图说明

图1为鲁西黄牛MSTN基因打靶位置示意图。

图2为sgRNA靶点对应的潜在脱靶位点统计图。

图3为Cas9蛋白在4个筛选后sgRNA靶点的切割效率检测电泳图；其中：M为DNAmaker，con为对照组，对照来源于未插入sgRNA的Cas9真核表达载体转染的牛胎儿成纤维细胞(BFFs)，泳道1、2、9、11对应sgRNA1、sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11。

图4为定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体的结构示意图。

图5为定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体部分元件扩增结果电泳图；其中：M1、M2、M3、M4、M5、M6为DNA maker，泳道1为5’arm-1扩增结果，泳道2为5’arm-2-P2A扩增结果，泳道3为5’arm-P2A扩增结果，泳道4为FABP4(CDS)扩增结果，泳道5为5’arm-P2A-FABP4扩增结果，泳道6为PolyA扩增结果，泳道7为LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP(Selectable element，SE)扩增结果，泳道8为3’arm扩增结果。

图6为定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体的酶切鉴定结果；其中：M1、M2、M3、M4为DNA maker，泳道1为质粒p3’arm-19T单酶切，泳道2为质粒pSE-3’arm-19T双酶切，泳道3为质粒pPolyA-SE-3’arm-19T双酶切，泳道4为质粒p5’arm-P2A-FABP4-PolyA-SE-3’arm-19T(即pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE)双酶切鉴定。

图7为定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体打靶策略示意图。

图8为Cas9真核表达载体和打靶载体pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE共转染BFFs细胞示意图；其中：A为40倍物镜下明场细胞生长图片，B为40倍物镜下暗场细胞生长图片。

图9为Puro筛选获得的单克隆细胞株示意图；其中：A为40倍物镜下明场单克隆细胞生长图片，B为40倍物镜下暗场单克隆细胞生长图片。

图10为部分单克隆细胞5’junction PCR(上)和3’junction PCR(下)结果电泳图。

图11为Sanger测序确定外源基因的精准插入的示意图。

图12为利用体细胞核移植技术生产的转基因克隆胚胎；其中：A为明场克隆胚胎图片，B为暗场克隆胚胎图片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。

本发明首先构建了靶向MSTN基因的Cas9真核表达载体pSpCas9-sgRNA和定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE，然后利用电穿孔的方法将Cas9真核表达载体pSpCas9-sgRNA和打靶载体pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE共转染到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，经Puro筛选获得克隆细胞，通过Junction PCR筛选和验证获得了精确打靶的阳性克隆细胞。最后，以该阳性克隆细胞为供核细胞移入去核的牛卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎。

(一)试剂和溶液配制

1、试剂

限制性内切酶购自NEB公司，PrimeSTAR HS DNA Polymerase、PrimeSTAR GXLDNAPolymerase、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、T-Vector pMD19、DNA Ligation Kit Ver.2.1购自Takara公司，Gibco胎牛血清、DMEM/F-12细胞培养基、Opti-MEM细胞培养基、3000Transfection Reagent购自T hermofisher thermofisher公司，Trypsin、Puromycin购自Sigma公司，凝胶回收试剂盒、细胞培养皿、细胞培养板购自Corning公司，SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司，无内毒素质粒小提试剂盒购自Omega公司，血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒、DH5a感受态细胞购自天根生化科技有限公司。G1.5、G2.5胚胎培养液购自Vitrolife公司。

2、自行配制溶液

细胞电转液：称取KCl 0.8946g，K₂HPO₄ 0.1742g，CaCl₂·2H₂O 0.0022g，以及MgCl₂·6H₂O 0.1016g，加入超纯水溶解后定容至100mL，调节pH值至7.4，0.22μm滤膜过滤除菌后，置于4℃保存。

电融合液：D-山梨醇0.25mol/L，醋酸钙0.1mmol/L，醋酸镁0.5mmol/L，Hepes0.5mmol/L，以及BSA 1mg/mL。

卵母细胞成熟培养液(oocyte maturation medium，OM液)：以M199为母液，添加FBS(10％，V/V)，HMG(0.075U/mL)，17β-E₂(1mg/mL)，EGF(20ng/mL)，bFGF(10ng/mL)，及ITS(1％，V/V)。

mSOF(modified synthetic oviductal fluid)：称取NaCl 0.6294g，KCl0.0534g，KH₂PO₄ 0.0162g，CaCl₂·2H₂O 0.0251g，MgCl₂·6H₂O 0.0100g，NaHCO₃·0.2106g，丙酮酸钠0.0033g，乳酸钠28.24μL，必需氨基酸(50×)2mL，非必需氨基酸(100×)1mL，谷氨酰胺0.0146g，BSA 0.8g，加入90mL去离子水中，调pH值至7.3，定容至100mL。

自行配制溶液中组分均购自Sigma。

(二)转基因克隆胚胎制备

1、Cas9真核表达载体的构建

1.1 MSTN基因sgRNA靶点的设计及筛选

为了实现FABP4基因在牛的骨骼肌细胞中特异性转录和表达，同时在MSTN基因第三外显子上引入G938A(GenBank：AF019761.1)点突变，将FABP4基因CDS区(参考GenBank：NM_174314.2)定点插入到牛MSTN基因第三外显子终止密码子TGA之前，MSTN基因与FABP4基因CDS区之间用P2A连接，借助内源性的MSTN基因启动子实现FABP4基因的特异性表达，同时引入的点突变致使MSTN蛋白功能丧失(Mcpherron A C,Lee S J.Double muscling incattle due to mutations in the myostatin gene.Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America,1997,94(23):12457-12461.)。因此，选择牛MSTN基因终止密码子TGA下游409bp序列作为打靶区域(见图1)。

借助公开网站ZiFiT(http://zifit.partners.org/ZiFiT/)设计sgRNA靶点，共输出22个靶点，其中正向链对应12个，反向链10个。利用在线软件Cas-OFFinder(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，分别以错配数≤5和错配数≤3作为约束条件，统计每一个sgRNA靶点在牛基因组内对应的潜在脱靶位点的个数。对所有的sgRNA靶点序列及其对应的脱靶位点统计结果进行分析后，绘制双坐标轴的柱状图(图2)，以反映该段区域所对应脱靶位点的整体情况。其中左侧纵坐标轴对应的数据错配数限制为5，右侧纵坐标轴对应的数据错配数限制为3。理想的sgRNA靶点所对应的潜在脱靶位点应当尽量少，以减少Cas9蛋白在基因组其它位置发生切割的可能性。本发明选取了“种子区内不包含错配”这种最容易发生脱靶的条件来对所有的脱靶位点进行分类，无论以错配数≤5、错配数≤3还是seed-region长度梯度为筛选条件，理想的sgRNA靶点应包含尽量少的潜在脱靶位点。结合上述初步筛选结果，本发明从全部的22个可能的sgRNA靶点中挑选出最理想的4个靶点进行后续的Cas9真核表达载体(pSpCas9-sgRNA)构建工作及进一步的切割效率检测。这4个sgRNA靶点编号为sgRNA1、sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11，具体序列信息如下(设计完成时间为2015年9月)：

sgRNA1：5’-GATCGCTGTGGGTGTTCATG-3’

sgRNA2：5’-GTGTTCATGAGGTCTATATT-3’

sgRNA9：5’-ACTGTGAAATTATGTACCAC-3’

sgRNA11：5’-AAGTGACTGTAGCATACTCT-3’

1.2Cas9真核表达载体的构建及切割活性检测

用BbsI酶切pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体(Addgene)，得线性化的载体，将sgRNA靶点sgRNA1、sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11分别连接至线性化的载体，从而构建四种Cas9真核表达载体，编号分别为pSpCas9-sgRNA1、pSpCas9-sgRNA2、pSpCas9-sgRNA9、pSpCas9-sgRNA11。

将四种Cas9真核表达载体分别转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，以PX458空载体(指pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458))作为对照，转染72小时后消化细胞并提取基因组。以提取的细胞基因组为模板，PCR扩增一段包含sgRNA靶点的DNA序列并进行T7EI酶切。扩增引物如下：

T7EI-F：5’-TTAGAAGTCAAGGTAACAGACACAC-3’

T7EI-R：5’-AGCCTATTGTATTAGCACCATTG-3’

具体操作参照Surveyor nuclease assay试剂盒说明书，酶切产物进行电泳检测，检测结果见图3。Cas9真核表达载体对sgRNA1、sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11这四个靶点均具有一定的切割作用，但四个靶点与MSTN基因终止密码子TGA的位置关系存在差异，最终选择sgRNA1这个靶点进行后续试验。

2、定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE的构建

2.1打靶载体各元件的克隆

定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体包含5’arm(同源左臂LA,上游同源臂)、3’arm(同源右臂RA,下游同源臂)、LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP筛选标记、FABP4基因CDS区，其中FABP4基因CDS区与MSTN基因第三外显子(删除终止密码子TGA)之间以P2A连接(图4)，筛选标记通过第二个LoxP(筛选标记PolyA下游LoxP)与MSTN基因终止密码子TGA之后的序列连接(或者可以将连接位置继续向下游移动若干碱基)。

所用到的引物如下(设计完成时间为2015年11月)：

5’arm-F1：5’-CCGGAATTCCTCAGACTTTTCCATATAAAAGG-3’

FABP4-F：5’-TGGAGGAGAACCCTGGACCTATGTGTGATGCATTTGTAGG-3’

FABP4-R：5’-ACGCGTCGACTTATGCTCTCTCATAAACTCTGG-3’

PolyA-F：5’-ACGCGTCGACACCGGATCTAGATAACTGATC-3’

PolyA-R：5’-GGACTAGTTAAGATACATTGATGAGTTTG-3’

SE-F：5’-GAGCACTAGTATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATTGCGTTATCCCCTGATTCTGT-3’

SE-R：5’-TACCATCGATATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCGCTTACAATTTACGCGTTAAG-3’

3’arm-F：5’-CCGGAATTCCGGACGCGTCGACGTCGGCCATAGCGGCCGCGGAAGGACTAGTCCAATTCCATCGATGGTCTATATTTGGTTCATAGCTTC-3’

3’arm-R：5’-AAGGAAAAAAGCGGCCGCAGCCATCATGAATCCATAAGTG-3’

其中，下划线部分的碱基为酶切位点；方框内的碱基为上游同源臂引入的点突变；斜体并加粗部分的碱基为P2A。

将培养的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞(2016年1月，陕西省西安市采集)消化后收集并提取基因组，以提取的基因组为模板，分别用5’arm-F1/5’arm-R1、5’arm-F2/5’arm-R2、3’arm-F/3’arm-R三对引物进行PCR扩增，得到5’arm-1、5’arm-2-P2A、3’arm条带，大小分别为966bp、265bp、1173bp(图5)。

以5’arm-1和5’arm-2-P2A为模板，用引物5’arm-F1/5’arm-R2进行融合PCR反应，这一步是将MSTN基因G938A点突变引入5’arm中(设计带有G938A点突变的搭桥引物，通过融合PCR将点突变引入到上游同源臂中)，得到5’arm-P2A条带，大小为1211bp(图5)。

将分离的鲁西黄牛脂肪组织(2016年1月，陕西省西安市采集)研磨后，加入Trizol裂解并提取总RNA。对提取的总RNA进行反转录后得到cDNA。以获得的cDNA为模板，用FABP4-F/FABP4-R引物进行PCR扩增，得到FABP4的CDS条带，大小为399bp(图5)。

以5’arm-P2A和FABP4的CDS为模板，用引物5’arm-F1/FABP4-R进行融合PCR反应，得到5’arm-P2A-FABP4条带，大小为1610bp(图5)。

以pTP-hTERT质粒(黄惠,胡广东,康健,等.一种通用型piggyBac转座子诱导细胞永生化载体的构建及其基本功能验证.生物工程学报,2014,30(8):1182-1192.)为模板，分别用PolyA-F/PolyA-R、SE-F/SE-R两对引物进行PCR扩增，得到PolyA和LoxP-EF1α-EGFP-P2A-Puro-PolyA-LoxP(Selectable element，SE)条带，大小分别为245bp、3130bp(图5)。

2.2打靶载体各元件的组装及打靶载体的酶切鉴定

以T-Vector pMD19(Takara公司)为骨架，将扩增得到的3’arm元件进行T-A克隆连接至骨架载体，得到p3’arm-19T载体，同时按顺序引入EcoR I—Sal I—Spe I—Cla I—Not I五个酶切位点。对构建的p3’arm-19T载体进行Not I单酶切鉴定，得到一条大小为3.86kb的条带(图6)，将酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将扩增得到的SE元件，连接至经Spe I和Cla I双酶切后的线性化p3’arm-19T载体，得到pSE-3’arm-19T载体。对构建的pSE-3’arm-19T载体进行Spe I和Cla I双酶切鉴定，得到两条大小为3.86kb和3.13kb的条带(图6)，将酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将扩增得到的PolyA元件，连接至经Sal I和Spe I双酶切后的线性化pSE-3’arm-19T载体，得到pPolyA-SE-3’arm-19T载体。对构建的pPolyA-SE-3’arm-19T载体进行Sal I和Spe I双酶切鉴定，得到两条大小为6.99kb和245bp的条带(图6)，将酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

将扩增得到的5’arm-P2A-FABP4元件，连接至经EcoR I和Sal I双酶切后的线性化pPolyA-SE-3’arm-19T载体，得到p5’arm-P2A-FABP4-PolyA-SE-3’arm-19T载体(即pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE)。对构建的pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE载体进行EcoR I和Sal I双酶切鉴定，得到两条大小为7.24kb和1.61kp的条带(图6)，将酶切鉴定正确的质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

3.通过共转染pSpCas9-sgRNA和pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE构建核移植供体细胞系

参见图7，本发明利用电穿孔的方法将靶向MSTN基因的Cas9真核表达载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现对鲁西黄牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶，获得MSTN位点定点敲入FABP4基因(CDS区)和MSTN基因点突变的牛胎儿成纤维细胞。

3.1鲁西黄牛胎儿成纤维细胞的培养

将液氮罐中冻存的鲁西黄牛胎儿成纤维细胞(原代)解冻至60mm细胞培养皿中进行培养。待细胞生长至90％融合度时，进行传代培养。选取第3至5代的细胞进行后续的转染实验。

3.2阳性单克隆细胞的筛选

1)Cas9真核表达载体pSpCas9-sgRNA和打靶载体pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE电转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞。电转染具体方法：当细胞生长至90％融合度时，胰酶消化并收集细胞，用无血清的Opti-MEM细胞培养液洗涤2次。用800μL电转液重悬细胞，将pSpCas9-sgRNA和pLR-P2A-FABP4-PolyA-SE各10μg加入细胞悬液并混合均匀，然后转移至电转杯中，静置10min。将电转杯置于电转仪中，进行电击反应，具体电转染参数：电压：510V；脉冲时间：2ms；电击次数2次。电击完成后，静置15min，将细胞悬液重悬置于60mm细胞培养皿中培养，待细胞贴壁后更换新鲜细胞培养液。

2)转染48h后，在荧光显微镜下观察细胞的生长情况(见图8)。胰酶消化并收集细胞，将细胞均匀接种到4个100mm细胞培养皿中。待细胞贴壁后，向细胞培养液中加入终浓度为1.5μg/mL的嘌呤霉素进行药物筛选，每隔3d进行一次换液。筛选9d后，未整合打靶载体的细胞全部死亡，整合打靶载体的细胞形成单克隆细胞团，并在显微镜下观察单克隆细胞的绿色荧光表达情况(见图9)。待单克隆细胞生长至团块直径3mm以上，挑取单克隆细胞并编号，接种于48孔板中进行扩大培养，每个单克隆细胞团取部分细胞用于Junction PCR鉴定。

3.3Junction PCR鉴定插入基因的定点整合

将用于Junction PCR鉴定的单克隆细胞提取基因组DNA(裂解法)，以基因组DNA为模板，用PrimeSTAR GXL DNA Polymerase进行Junction PCR扩增，Junction PCR鉴定引物序列如下：

5’junction-F：5’-TCTTCTGGCTTATCTATGCTTG-3’

5’junction-R：5’-GAGTTTTCTCTTTATGGTGGTTG-3’

3’junction-F：5’-GAATCTAGGTGGTCAATCAACC-3’

3’junction-R：5’-ACTGTTGTCTTTCAAAAAAGGTG-3’

其中，5’-junction上游引物匹配同源左臂LA上游基因组序列，下游引物匹配打靶载体FABP4基因序列；3’-junction上游引物匹配打靶载体Puro基因表达框，下游引物匹配同源右臂RA下游基因组序列。5’-junction PCR扩增结果为1990bp，3’-junction PCR扩增结果为1860bp(图10)，只有同时通过了5’-junction PCR和3’-junction PCR鉴定的克隆才会继续扩大培养。

对上述5’-junction PCR和3’-junction PCR产物进行凝胶回收，得到的产物进行T-A克隆后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过测序结果确定打靶载体在鲁西黄牛胎儿成纤维细胞基因组的精准插入，结果如图11所示。

本发明中筛选出的脱靶效应相对较低的sgRNA1、sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11四个靶点，在后续的同源末端重组修复过程中均能介导目标基因的定点整合，但是在整合位点碱基序列的精确度方面存在差异。其中，利用sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11这三个靶点进行细胞筛选实验，虽然筛选出的单克隆细胞经过5’-junction PCR和3’-junction PCR鉴定结果正确，但是经Sanger测序发现部分单克隆细胞中重组基因P2A-FABP4-PolyA插入到了MSTN基因终止密码子TGA之后，导致不能进行FABP4蛋白的翻译。这种现象的出现，可能是因为sgRNA2、sgRNA9、sgRNA11这三个靶点产生的基因组DNA断裂发生在MSTN基因终止密码子TGA之后，虽然上游同源臂中已删除MSTN基因终止密码子TGA，但是在同源末端重组修复过程中仍保留了断裂处的TGA序列。而利用sgRNA1这个靶点进行细胞筛选实验，筛选出的单克隆细胞经5’-junction PCR和3’-junction PCR鉴定结果正确，同时Sanger测序结果显示所有单克隆细胞中重组基因P2A-FABP4-PolyA均插入到了MSTN基因终止密码子TGA之前，与预期目标相一致。因此，利用sgRNA1靶点进行细胞打靶试验，筛选出精确整合的重组细胞的阳性率更高。

4、以鉴定正确的单克隆细胞为核移植供体细胞构建转基因克隆胚胎

4.1卵母细胞的收集和体外成熟

从西安市屠宰场采集牛卵巢(2016年10月采集)，放置于装有无菌生理盐水的保温瓶中，温度维持在20～25℃，4h内运回实验室。用一次性注射器抽取3～8mm直径卵泡的卵泡液，在体视显微镜下用捡卵针挑出形态完整、胞质均一的卵丘卵母细胞复合体进行体外培养。在卵母细胞培养平皿中培养20h后，用0.2％的透明质酸酶去除卵丘细胞，以排放出第一极体作为判断卵母细胞成熟的标志，挑选成熟卵母细胞进行后续体细胞核移植试验。

4.2转基因克隆胚胎的构建

采用体细胞核移植技术将鉴定正确的核移植供体细胞注入去核的成熟卵母细胞中。核移植操作前，用7.5mg/mL的细胞松弛素B重悬供体细胞，然后将供体细胞和成熟卵母细胞置于同一35mm细胞培养皿的不同微滴中。先用固定针固定好卵母细胞后，再用去核针吸去极体以及周围约1/5胞质，然后用去核针吸取单个供体细胞注入去核卵母细胞的透明带和胞膜中间。待核质复合体恢复片刻后，将其置于电融合液中平衡3min，用微电极进行电融合反应，电融合条件为35V，10μs，2次。电融合后2h观察融合情况。

4.3转基因克隆胚胎的激活及体外培养

电融合2h后的克隆胚胎，先置于5μM的离子霉素中处理4min，再转移至OM中洗涤5min，然后转移至1.9mM的6-DMAP中处理3～5h，最后用mSOF洗涤干净后转移至胚胎培养液G1.5中培养。待第3天，将用矿物油覆盖的胚胎培养液G2.5在培养箱中平衡2h，然后将克隆胚胎转移至胚胎培养液G2.5中继续培养，培养密度为每个胚胎/5μL。第7天，在显微镜下观察克隆囊胚的发育情况(见图12)，挑选正常发育的克隆囊胚进行后续胚胎移植。

鲁西黄牛作为我国优良的地方品种，产肉性能良好，前躯发育良好，但是后躯发育较差。因此运用本发明的基因工程技术，使得定点敲入的FABP4基因(CDS区)利用MSTN基因的内源性启动子在牛的骨骼肌细胞中特异性转录和表达，同时点突变导致MSTN蛋白功能丧失，即在抑制MSTN的功能发挥的同时，实现FABP4在骨骼肌细胞中的表达，为获得优质肉用家畜品种提供了一种快速高效的育种方法。

<110> 西北农林科技大学

<120> 基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变打靶载体及重组细胞

<160> 27

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA1

<400> 1

gatcgctgtg ggtgttcatg 20

<210> 2

<211> 66

<212> DNA

<213> P2A

<400> 2

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 3

<211> 399

<212> DNA

<213> FABP4 CDS

<400> 3

atgtgtgatg catttgtagg tacctggaaa cttgtctcca gtgaaaactt tgatgattac 60

atgaaagaag tgggcgtggg ctttgctacc aggaaagtgg ctggcatggc caaacccact 120

ttgatcatca gtttgaatgg gggtgtggtc accattaaat cagaaagcac ctttaaaaat 180

actgagattt ccttcaaatt gggccaggaa tttgatgaaa tcactccaga tgacaggaaa 240

gtcaagagca tcgtaaactt agatgaaggt gctctggtac aagtacaaaa ctgggatgga 300

aaatcaacca ccataaagag aaaactcatg gatgataaga tggtgctgga atgtgtcatg 360

aatggtgtca ctgccaccag agtttatgag agagcataa 399

<210> 4

<211> 245

<212> DNA

<213> PolyA

<400> 4

accggatcta gataactgat cataatcagc cataccacat ttgtagaggt tttacttgct 60

ttaaaaaacc tcccacacct ccccctgaac ctgaaacata aaatgaatgc aattgttgtt 120

gttaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc 180

acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta 240

tctta 245

<210> 5

<211> 1145

<212> DNA

<213> 同源左臂

<400> 5

gaattcctca gacttttcca tataaaagga aaaatgtctc aaattcatga aaagattggt 60

acaggaggag gattagcaaa ttgtagttta aatatctgaa tggaaacact ttttagtgaa 120

agaataaagg gaatatcatt gtatcttctt ctgagtctgt gcctctctct cttggagtta 180

gtctttccaa ccctatatac ttaccactat cttcatccct ctaccttcct ttttcccatt 240

acatctgtgc agtactgggt ggcaactatt gtgtttcggt gttaatatcc aagtttccct 300

gaataagacc aagtgaatgg aggatgaatc agtataccta tccctccagg agtcatcaga 360

catatttggc caccatattt aatcaataag caggaagaca taagctagcc ttgtccctct 420

tctttccccc ctgctccttt ctcttctctt ccccctctcc ctttactgtc atccatcagt 480

attttcagag catctattat gtgtcaggca ttcagatact caaaccgagg aaaacaagaa 540

taaacaagac aaagatctga ccacagagga atccctatgg ctactgtaga cttttgagcc 600

ataaaggaag aatcaagcct agtgtaaatg aaaattcctt aatgctgtgc cttttaaaaa 660

gaaatgtgac ataagcaaaa tgattagttt ctttctttaa taatgagtcc ttgaggtagg 720

agagtgtttt gggatctatt attaactctt ctttcctttc catacagact ccttttttag 780

aagtcaaggt aacagacaca ccaaaaagat ctaggagaga ttttgggctt gattgtgatg 840

aacactccac agaatctcga tgctgtcgtt accctctaac tgtggatttt gaagcttttg 900

gatgggattg gattattgca cctaaaagat ataaggccaa ttactgctct ggagaatatg 960

aatttgtatt tttgcaaaag tatcctcata cccatcttgt gcaccaagca aaccccagag 1020

gttcagccgg cccctgctgt actcctacaa agatgtctcc aattaatatg ctatatttta 1080

atggcgaagg acaaataata tacgggaaga ttccagccat ggtagtagat cgctgtgggt 1140

gttca 1145

<210> 6

<211> 1173

<212> DNA

<213> 同源右臂

<400> 6

ggtctatatt tggttcatag cttcctaaaa catggaaggt cttcccctca acaattttga 60

aactgtgaaa ttatgtacca caggctataa gcctagagta tgctacagtc acttaagcac 120

aagctacagt atatgagcta aaaagagaga atatatgcta tggttggcat ttaaccatca 180

aaacaaatcg tataataaaa cgttttatga tttccagagt ttttgaacta ggagatcaaa 240

ttccatttat gttcaaatat atcacaacac atgcaggtga atgaaagcaa ttctccttgt 300

cttctggtga attaaaggag tatgctttaa aatctatttc tttacagttt cacttaatat 360

ttacagaaaa atctatatgt agtattggta aaatgcagta ttgttatata ccattatttg 420

aaacatcctt aaacacttga atttatattg tatgatagca tacttggtaa gatgagattc 480

cacaaaatag ggatggcaca ccgtacgcaa gttaccattc ctatactgat tgatacagta 540

cattaacagt ttttgccaat ggtgctaata caataggctg aatggctgat gttatcaggt 600

ttatcaagca aaaaacgttc aggaaagtaa taagtttctc ctttcttcag gtgcattttc 660

acactcctcc ctatgggcaa tggatgttct ataaagaaag aaaactcatt ttcctagagg 720

tctacattca attctgtagc atacttggag aagctgcatt gaaaaggcag tcaaaaagta 780

ttcattttgg tcaaaatttc aaaattatag cctgcctttg caatactgca gcttttagga 840

tgaaataatg gaaatgactg attctatcaa tattgtataa aaagattttg aaatagttgc 900

atttatataa tatgtataca atattgtttt gtaaataaat gtctcctttt ttatttactt 960

tggtatattt ttacagtaag gacatttcaa attaagtatt aaggcacaaa gacatgtcat 1020

gtaggacata aaagcaaatg cttatatttc ggagcaaatt agttgattaa atagtggtct 1080

taaaactcca tatgctaatg gttagatggt tatattacaa tcattttata tttttttaca 1140

ttattagcat tcacttatgg attcatgatg gct 1173

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA2

<400> 7

gtgttcatga ggtctatatt 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA9

<400> 8

actgtgaaat tatgtaccac 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> sgRNA11

<400> 9

aagtgactgt agcatactct 20

<210> 10

<211> 32

<212> DNA

<213> 5’arm-F1

<400> 10

ccggaattcc tcagactttt ccatataaaa gg 32

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 5’arm-R1

<400> 11

caaattcata ttctccagag c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 5’arm-F2

<400> 12

gctctggaga atatgaattt g 21

<210> 13

<211> 84

<212> DNA

<213> 5’arm-R2

<400> 13

aggtccaggg ttctcctcca cgtctccagc ctgcttcagc aggctgaagt 60

tagtagctcc gcttcctgaa cacccacagc gatc 84

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> FABP4-F

<400> 14

tggaggagaa ccctggacct atgtgtgatg catttgtagg 40

<210> 15

<211> 33

<212> DNA

<213> FABP4-R

<400> 15

acgcgtcgac ttatgctctc tcataaactc tgg 33

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> PolyA-F

<400> 16

acgcgtcgac accggatcta gataactgat c 31

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> PolyA-R

<400> 17

ggactagtta agatacattg atgagtttg 29

<210> 18

<211> 65

<212> DNA

<213> SE-F

<400> 18

gagcactagt ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttattgcgtt atcccctgat 60

tctgt 65

<210> 19

<211> 66

<212> DNA

<213> SE-R

<400> 19

taccatcgat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatcgctta caatttacgc 60

gttaag 66

<210> 20

<211> 90

<212> DNA

<213> 3’arm-F

<400> 20

ccggaattcc ggacgcgtcg acgtcggcca tagcggccgc ggaaggacta gtccaattcc 60

atcgatggtc tatatttggt tcatagcttc 90

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 3’arm-R

<400> 21

aaggaaaaaa gcggccgcag ccatcatgaa tccataagtg 40

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 5’ junction-F

<400> 22

tcttctggct tatctatgct tg 22

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 5’ junction-R

<400> 23

gagttttctc tttatggtgg ttg 23

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 3’ junction-F

<400> 24

gaatctaggt ggtcaatcaa cc 22

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 3’ junction-R

<400> 25

actgttgtct ttcaaaaaag gtg 23

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> T7EI-F

<400> 26

ttagaagtca aggtaacaga cacac 25

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> T7EI-R

<400> 27

agcctattgt attagcacca ttg 23

Claims

1.一种基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括用于通过同源重组定点整合至MSTN基因的启动子与终止密码子序列之间的重组基因P2A-FABP4-PolyA，以及作为同源臂的sgRNA靶点上游和下游同源序列，其中，sgRNA靶点上游同源序列引入有可以使MSTN蛋白功能丧失的点突变；所述的重组基因P2A-FABP4-PolyA包括依次排列于的P2A、FABP4基因CDS区和PolyA。

2.如权利要求1所述的基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，其特征在于：所述的sgRNA靶点位于牛基因组2号染色体MSTN基因3’UTR序列。

3.如权利要求1所述的基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，其特征在于：所述的同源臂包括分别位于重组基因P2A-FABP4-PolyA上游和下游的上游同源臂和下游同源臂，上游同源臂在MSTN基因上的同源序列的末端位于MSTN基因的终止密码子之前的一个碱基，重组基因P2A-FABP4-PolyA与下游同源臂之间设置有一对同向的Loxp，该对Loxp之间设置有筛选基因表达框；所述的筛选基因表达框包括依次排列的EF1α启动子、EGFP基因、P2A、嘌呤霉素抗性基因Puro和PolyA。

4.如权利要求1所述的基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，其特征在于：所述的重组基因P2A-FABP4-PolyA中，P2A的序列如SEQ.ID.NO.2所示，FABP4基因CDS区的序列如SEQ.ID.NO.3所示，PolyA的序列如SEQ.ID.NO.4所示；sgRNA靶点的序列如SEQ.ID.NO.1、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9所示。

5.如权利要求4所述的基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，其特征在于：所述的上游同源臂的序列如SEQ.ID.NO.5所示，下游同源臂的序列如SEQ.ID.NO.6所示。

6.如权利要求1所述的基于Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的打靶载体，其特征在于：所述的打靶载体是通过将sgRNA靶点上游同源序列、重组基因P2A-FABP4-PolyA以及sgRNA靶点下游同源序列插入到打靶骨架载体T-Vector pMD19而构建的，在sgRNA靶点上游同源序列中引入有点突变，该点突变为MSTN基因的G938A。

7.一种Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的重组细胞，其特征在于：该重组细胞是在MSTN基因启动子与终止密码子序列之间定点整合有FABP4基因CDS区的牛胎儿成纤维细胞，所述的MSTN基因的第三外显子上引入有点突变，该点突变为MSTN基因的G938A。

8.一种Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的重组细胞，其特征在于：该重组细胞是通过将Cas9真核表达载体和打靶载体共转染宿主细胞而构建的；所述的Cas9真核表达载体包括Cas9蛋白表达框和sgRNA，sgRNA靶点位于MSTN基因3’UTR序列；所述的打靶载体包括用于通过同源重组定点整合至MSTN基因的启动子与终止密码子序列之间的重组基因P2A-FABP4-PolyA，以及作为同源臂的sgRNA靶点上游和下游同源序列，其中，sgRNA靶点上游同源序列引入有可以使MSTN蛋白功能丧失的点突变；所述的重组基因P2A-FABP4-PolyA包括依次排列的P2A、FABP4基因CDS区和PolyA。

9.根据权利要求8所述的Cas9介导的定点整合FABP4基因和MSTN基因点突变的重组细胞，其特征在于：所述的Cas9真核表达载体是通过在pSpCas9(BB)-2A-GFP(PX458)载体上构建sgRNA表达框而得到的。

10.如权利要求7或8所述的重组细胞作为构建转基因克隆胚胎的核供体细胞的应用。