CN103290045B - 利用锌指核酸酶敲除绵羊肌肉抑制素基因的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种锌指核酸酶定点删除绵羊肌肉抑制素基因的方法，其针对绵羊Myostatin基因外显子3设计了识别39bp的特异靶位点序列，并构建锌指核酸酶质粒，将该质粒转染绵羊成纤维细胞，获得可以定点删除95bp和113bp的双等位基因删除的单克隆细胞，表明锌指核酸酶定点删除Myostatin基因特异靶位点序列能够准确删除Myostatin基因外显子3并能准确分选出Myostatin基因被定点删除的细胞，证实了该序列的有效性，且获得删除的单克隆细胞无需抗生素筛选，兼顾了基因组靶向修饰和安全性两大优点，对培育无抗性标记基因、安全高效的转基因绵羊具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种锌指核酸酶定点删除绵羊肌肉抑制素(Myostatin)基因特异靶位点序列的方法。
背景技术
动植物基因靶向遗传修饰对于基因功能的分析、疾病的治疗或发病机制的研究以及建立高经济价值的转基因动植物具有重要的意义。传统的动物基因靶向遗传修饰技术是基于胚胎干细胞(ES细胞)内的同源重组或者核移植。ES细胞建系有一定的难度，目前可以用于动物靶向遗传修饰的ES细胞系仅局限于大鼠及小鼠。此外，通过核移植进行动物靶向遗传修饰的成功率也很低，而且特异性也不高，因此目前这两种方法在动物靶向遗传修饰中的应用受到一定的限制。
锌指核酸酶(ZincFingerNucleases，ZFNs)是由锌指蛋白(即DNA识别域)和一个非特异性核酸内切酶-FokI共同构成的一类能在特异双链DNA上进行切割的嵌合分子。其中DNA识别域赋予特异性，在DNA特定位点结合，而非特异性核酸内切酶具有剪切功能，两者结合就可在DNA特定位点进行定点断裂。每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时(6-8bp)，两个单体ZFN相互作用产生酶切功能，从而达到DNA定点剪切的目的。在细胞中，ZFN能够在染色体上产生定向的DNA双链断裂，从而诱导目的基因的突变。锌指核酸酶(ZFN)技术相对于传统的通过ES细胞系或者核移植技术建立基因敲除动物的方法具有效率高、操作简单、耗时少、应用范围广等优势。已有的研究表明，ZFN技术可极大提高基因组靶向修饰的效率，快速有效地在细胞水平或个体水平上实现基因的定点敲除或插入突变，尤其为建立尚未获得ES细胞的转基因动物生产技术，提供了基因操作的可能性，与常规的自然突变个体育种技术相比，该技术能够缩短动物优良新品种的培育时间，为动物定点转基因提供了一种新的有效途径。
肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称GDF-8，属TGF-β超家族成员，是肌肉生长的一种负调控因子，它的活性的降低或丧失，会引起动物肌肉的过度发育，肌纤维直径变大和(或)数量的增加。研究表明，Myostatin基因突变会导致比利时蓝牛、皮尔蒙特牛和荷兰Texel绵羊等牛羊品种中存在一些肌肉肥大显性性状、产肉量明显增加的现象，从而进一步证明了它能够对肌肉生长起负调控作用，也为人们培育产肉量高的优良品种提供了新途径，即通过突变、缺失、敲除等基因打靶技术将该基因失活，为进一步研究其功能并为农业生产中的实际应用奠定扎实基础。
现有技术中，中国专利申请CN102296073A，CN102260711A虽然也公开的锌指核酸酶定点删除作用，但没有公开能够作用于绵羊肌肉抑制素基因的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种锌指核酸酶定点删除绵羊肌肉抑制素基因特异靶位点序列的方法，其根据绵羊肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入绵羊成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其特征在于，设计特异的锌指核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列为：
MSTN-ZFN-Set1：ATACCCATCTTGTGCACCaagcaaACCCCAAAGGTTCAG。
在本发明的一个优选实施方式中，其特征在于使用的表达载体为PZFN1/PZFN2-set1，其序列分别为：：SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。
在本发明的另一个优选实施方式中，通过脂质体转染方式将上述两个表达载体同时转染到绵羊成纤维细胞中，利用有限稀释法将细胞稀释培养到培养皿内，经过7-10天无药物筛选培养获得单细胞克隆。
在本发明的另一个优选实施方式中，所述的方法还包括提取单细胞基因组DNA，PCR检测肌肉抑制素基因发生敲除的细胞并将PCR产物测序比对，优选的，所述的PCR检测使用的引物为set1-Forward：5’-GTGTCAGGCATTCAGATATTC-3’；set1-Reverese：5’-GCTTGTGCTTAAGTGACTGTAGC-3’。
本发明首次利用锌指核酸酶(ZFNs)技术定点敲除绵羊肌肉抑制素基因。人工设计合成特异的ZFN，可以特异的识别39bp的DNA序列(绵羊肌肉抑制素基因)，这样的DNA序列在一个物种的基因组中是独一无二的，且该序列可成功删除绵羊成纤维细胞中的肌肉抑制素基因；通过NCBI数据库进行数据比对，该序列在目前已知绵羊基因组内具有唯一性，利用该ZFN可以介导绵羊肌肉抑制素基因的定点序列删除，达到该基因敲除的目的。此外，利用ZFNs介导的基因删除，得到一次转染获得两个等位基因都发生删除的细胞克隆，这在常规基因打靶过程中是难以实现的，省去了药物筛选过程，简化了生物安全评价过程，在一定程度上减轻了筛选药物给细胞带来的生存压力，对于后续的体细胞核移植和胚胎的发育质量起到了关键作用。
附图说明
图1单细胞克隆DNAPCR电泳结果；箭头所示为发生删除的样品。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
以下实施例中ZFNs设计由Sigma公司完成，引物合成和序列测定由上海生工完成，Taq酶、T4DNA连接酶、内切酶均购自NEB公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。
实施例1ZFN表达载体的构建及筛选
1、Myostatin基因定点删除锌指核酸酶的设计合成
根据NCBI网站中获得的绵羊Myostatin基因序列(DQ530260.1)，由Sigma公司完成ZFNs设计，通过生物信息学的方法，确定了特异靶位点序列为：
ATACCCATCTTGTGCACCaagcaaACCCCAAAGGTTCAG；中间部分序列(aagcaa)为FokI内切核酸酶切割位点，也即ZFN特异敲除的靶位点序列。对应的表达载体为PZFN1/PZFN2-set1。
2、ZFN的筛选
在绵羊成纤维细胞系中检测上述表达载体能否在对应的细胞基因组DNA序列发挥切割作用。在ZFNs位点两侧设计引物，set1-Forward：5’-GTGTCAGGCATTCAGATATTC-3’；set1-Reverese：5’-GCTTGTGCTTAAGTGACTGTAGC-3’。
用脂质体法同时将两对表达载体转染至绵羊成纤维细胞，24孔板转染DNA量为1.5μg/每孔，转染48小时后提取总细胞基因组；进行细胞PCR产物回收纯化，纯化产物测序。如果ZFNs发挥切割作用，细胞会启动自身修复机制，在切割位点会出现小片段的删除或者插入，PCR产物测序结果峰图为杂合峰图，即该ZFNs可用于后续基因敲除。结果表明，ZFNs：MSTN-set1在绵羊成纤维细胞中进行了定点删除。
实施例2单细胞克隆的获得以及基因敲除克隆的鉴定
1、锌指核酸酶介导MSTN基因删除细胞系的建立
(1)绵羊原代成纤维细胞的分离培养
采集2只体格健壮、生长发育良好、刚出生的陶赛特公羊耳组织，立即置于含有3％双抗的D-Hanks液中，带回实验室超净台处理。在35mm培养皿中，加入3％双抗D-Hanks冲洗8-10次，剔除脂肪、结缔组织，用眼科剪剪碎组织块，加入100μL血清润湿组织块，用弯头镊子将组织块(大约2-3mm)均匀贴在瓶壁上，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。次日，向培养瓶内加入少量含20％胎牛血清的培养基(4-5mL)，静置于37℃、5％CO2培养箱中培养。以后3-4天换一次液，7天内不要轻易动瓶，保持培养瓶静止。7天后观察，有扁平梭形成纤维细胞游出，待汇合度达70％-80％时，进行传代培养。选取生长旺盛、形态好的1株细胞做后续的稳定转化单克隆筛选实验，其余细胞冻存。
(2)锌指核酸酶质粒转染绵羊成纤维细胞
待培养的成纤维细胞汇合度达到90％时用0.05％胰蛋白酶-EDTA消化传代，取约2×105个细胞铺入24孔培养板中，37℃、5％CO2培养箱培养，待细胞汇合度达到70％-80％时，按照说明书要求，用Lipofectamine2000脂质体分别将锌指核酸酶质粒set1(PZFN1和PZFN2)、pEGFP空载质粒(对照)转染至绵羊成纤维细胞，48h后观察荧光或用流式细胞仪检测GFP阳性细胞的比例，确定转染效果。
(3)有限稀释法获得绵羊成纤维细胞单克隆
利用有限稀释法将细胞稀释培养到培养皿内，经过7-10天无药物筛选培养获得单细胞克隆，通过大规模测序确定单细胞克隆的基因删除情况以及删除类型，建立MSTN缺失失活细胞系，将用于下一步体细胞克隆转基因绵羊生产。
1)转染后的绵羊成纤维细胞在24孔板培养24-48小时后，0.05％胰蛋白酶消化细胞，一部分细胞提取混合细胞基因组DNA，PCR产物连接到T载体上送测序，用于后续删除类型分析工作；另取部分细胞计数，按照每500个细胞/10cm平皿密度将细胞接种于10cm培养皿中，补充含有10％FBS的DMEM培养基10毫升，在含有5％CO2的37℃细胞培养箱中培养7-10天后观察，直至细胞单克隆生成，挑取细胞紧实、立体感好的细胞克隆点。
2)倒弃培养基，用蘸有胰酶的滤纸罩在克隆点上约5分钟后，移至每孔含有300微升培养基的48孔培养板内，标号后置于CO2培养箱扩大培养2-4天后细胞铺满整个孔，消化细胞，取出1/10的细胞进行细胞PCR，用于鉴定细胞单克隆是否发生基因敲除；剩余细胞接种于24孔板，用于后续阳性克隆的细胞冻存。
2、基因敲除单细胞克隆的鉴定
单细胞克隆分子的鉴定采用测序技术，能够准确判定基因的DNA序列。具体的操作方法：单细胞克隆在48孔板铺满孔后，消化细胞，提取细胞DNA，进行PCR扩增。PCR产物回收纯化，分成两部分检测，一部分直接进行PCR产物测序工作。若该克隆发生了基因敲除，则PCR产物测序峰图呈现在切割位点后双峰的结果。针对含有特异双峰结果的细胞克隆，将另一部分PCR产物进行TA克隆，精确定位基因敲除位点以及详细的序列信息。通过序列比对分析，发现MSTN-ZFN-Set1在绵羊成纤维细胞中，能高效的对该位点进行删除，经统计，在单细胞克隆中基因敲除的效率在1-2％之间，而且，在一次转染过程中，可获得双等位基因的删除，最长的删除片段为113bp，最短的删除片段也有95bp。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (4)
1.一种锌指核酸酶定点删除绵羊肌肉抑制素基因的方法，其根据绵羊肌肉抑制素基因序列，设计ZFNs特异位点表达载体并转入绵羊成纤维细胞中，获得肌肉抑制素基因敲除的细胞，其特征在于，设计特异的锌指核酸酶ZFNs，其作用的DNA序列为：
MSTN-ZFN-Setl：ATACCCATCTTGTGCACCaagcaaACCCCAAAGGTTCAG。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于使用的表达载体为PZFN1-setl或PZFN2-setl，其序列分别为：SEQIDNO.1或SEQIDNO.2。
3.根据权利要求2所述的方法，其包括通过脂质体转染方式将上述两个表达载体同时转染到绵羊成纤维细胞中，利用有限稀释法将细胞稀释培养到培养皿内，经过7-10天无药物筛选培养获得单细胞克隆。
4.根据权利要求3所述的方法，所述的方法还包括提取单细胞基因组DNA，PCR检测肌肉抑制素基因发生敲除的细胞并将PCR产物测序比对；优选的，所述的PCR检测使用的引物为setl-Forward：5’-GTGTCAGGCATTCAGATATTC-3’；setl-Reverese：5’-GCTTGTGCTTAAGTGACTGTAGC-3’。
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