CN104651400B - 一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用，该方法利用在Loxl3基因关键外显子两端添加Cre重组酶靶向序列loxP位点，构建条件性基因敲除载体，转染胚胎干细胞(ES细胞)，再进行显微注射制作可用于条件型基因敲除的floxed小鼠，再与相应组织特异性的Cre小鼠交配，可获得能在特定组织敲除Loxl3基因的小鼠。该方法制得小鼠作为腭裂疾病发病研究的模型鼠，有利于详细阐明Loxl3基因在组织中的功能以及对胚胎发育调控的机理中的作用。同时该小鼠还可以作为研究Loxl3基因功能的动物模型，具有重要的应用价值。

Description

一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用

技术领域

本发明涉及一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

自从人类基因组计划完成以后，生命科学研究进入了后基因组时代，而后基因组时代的核心工作是研究基因的功能。目前，研究基因功能最有效的方法是基因打靶(基因敲除和基因敲入)技术。基因打靶技术是近年来在生命科学研究领域发展起来的一项新技术，它是在胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)技术和同源重组技术的基础上发展起来的，可以定向操作和改变基因，然后通过观察和分析被改变基因动物的表型来获得基因功能的信息。基因打靶技术还有另外一种重要用途——制作人类疾病的动物模型。

现有研究显示，人类很多疾病是由于基因突变引起的，基因打靶技术可以精确操纵动物染色体上的基因，从而制作出具有同人类疾病完全一样病症的动物模型，这对于查清人类疾病的致病机理，特别是在寻找治疗人类疾病的特效药物方面有非常重要的实践意义。

美国北卡洛莱娜大学Oliver Smithies由于两项科学贡献而获得了2007年Nobel生理学医学奖，一是把基因打靶所需的同源重组技术首先应用在哺乳动物细胞中，二是使用基因打靶技术制作了一些人类疾病的动物模型。他在诺贝尔颁奖大会上演讲的题目就是“让我们制作更多的人类疾病动物模型”。

腭裂(Cleft Palate,CP)是在新生儿中较为常见的先天性颅面部发育畸形，全世界范围内新生儿发病率为1/700，而在我国新生儿中的发病率为1.82‰，中国是目前世界上唇腭裂患者数量最多的国家之一。腭裂的病因极其复杂，对腭裂的发病原因及其发病机制仍不清楚。因而，目前迫切需要提供一种可用于腭裂发病机制研究的小鼠模型。LOXL3(lysyl oxidase-like3)是赖氨酰氧化酶家族成员之一。赖氨酰氧化酶是一种细胞外铜依赖氨基酸氧化酶。在人和多种动物中，赖氨酰氧化酶能将胶原和弹性蛋白中特定赖氨酸的ε-氨基氧化脱氨从而使二者交联，而这两者又是主要的细胞外基质结构蛋白。胶原蛋白是参与腭的发育的重要蛋白，而且已有研究表明抑制胶原的交联将导致腭裂的形成。小鼠Loxl3基因定位在6号染色体上。目前，有关小鼠Loxl3基因的敲除还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法与应用。

本发明的技术方案如下：

一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法，出生后纯合敲除小鼠表现腭裂症状，包括如下步骤：

构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，

线性化重组载体并转染胚胎干细胞，

筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆，

将筛选出的发生同源重组的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚，

将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠，

嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠，

将该杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配，获得双杂合的小鼠，

雌性和雄性双杂合小鼠互交，从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠。

根据本发明优选的，所述的构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，步骤如下：

(1)提取含有loxl3基因的细菌人工染色体(BAC)；

(2)PCR扩增六段同源重组片段，所述的引物序列分别为：

同源重组片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；

R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；

同源重组片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；

R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；

同源重组片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；

R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；

同源重组片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCCAGAGCATCGCTCAC；

同源重组片段E：F：CCGCTCGAGCTGGACTAGCCCGGACATTAT；

R：GGAATTCCATTCGGATACCATTCACCTGC；

同源重组片段F：F：CGGGATCCACCAGCAAGCAGGAACTCAT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCTGTTTGTTTCTGTGCCAAGC；

(3)分别将同源重组片段A和同源重组片段B连入质粒pL253，同源重组片段C和同源重组片段D连入质粒pL452，同源重组片段E和同源重组片段F连入质粒pL451，分别制得重组质粒pL253+A+B、重组质粒pL452+C+D、重组质粒pL451+E+F；

(4)将含有loxl3基因的BAC转化入EL350菌株，然后通过第一次同源重组，将质粒pL253+A+B转化入含有BAC的EL350菌株，获得Retrieved质粒；再通过第二次同源重组，将重组质粒pL452+C+D和Retrieved质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+Neo+D+B片段的二次同源重组质粒；利用Cre-loxP系统去除Neo序列，获得去掉Neo的二次同源重组质粒；最后通过第三次同源重组，将重组质粒pL451+E+F和去掉Neo的二次同源重组质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+D+E+Neo+F+B片段的三次同源重组质粒，即为Loxl3条件性基因敲除的重组载体。

根据本发明优选的，所述的胚胎干细胞为129/S6来源的胚胎干细胞。

上述Loxl3基因条件性敲除的小鼠作为腭裂疾病发病研究的模型鼠的用途。

有益效果

本发明首次获得了具有先天性腭裂症状的小鼠模型。先天性腭裂的发病机制复杂，其发病机制目前尚未明确。制作稳定的腭裂动物模型对研究人类腭裂的形成原因、演变机制及预防具有重要意义。

附图说明

图1、重组质粒pL253+A+B、pL452+C+D和pL451+E+F的构建模式图；

图2、Loxl3条件性基因敲除载体质粒构建模式图；

图3、Loxl3纯合敲除小鼠表型为腭裂照片；

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

含有loxl3基因的BAC购自Source BioScience(名称：bMQ412o17)；

载体质粒pL253、pL452和pL451购自National Cancer Institute(NCI，http:// ncifrederick.cancer.gov/research/brb/productDataSheets/recombineering/ plasmid.aspx)；

ES细胞购自Merck millipore(目录号：CMTI-1)；

EL350菌株购自National Cancer Institute(NCI，http:// ncifrederick.cancer.gov/research/brb/productDataSheets/recombineering/ba cterialStrains.aspx)；

实施例1Loxl3条件性基因敲除载体的构建

该载体设计是将LOXL3基因的第2外显子(含有启动子序列)敲除，从而实现失活整个基因。首先从BAC中扩增6段同源重组片段(A、B、C、D、E和F)，分别连入pL253、pL452和pL451(图1)，通过一步retrieveing和两步同源重组，分别在LOXL3基因的第2外显子两侧引入两个loxP位点和Neo标记基因(两侧有两个FRT位点)构建LOXL3条件性基因敲除载体质粒(图2)；再将载体质粒线性化转染ES细胞，筛选同源重组的阳性ES克隆；最后利用显微注射技术将ES克隆注入C57BL/6小鼠囊胚，经过PCR筛选得到LOXL3条件性基因敲除小鼠。

1.含有loxl3基因的细菌人工染色体(BAC)的提取

使用Spin Miniprep Kit提取含有loxl3基因的BAC，具体步骤如下：

(1)将保种的含有loxl3基因的BAC在含有氯霉素(25μg/ml)的LB固体培养基划板，37℃培养箱中培养12h；挑取平板上的单克隆接种到含有氯霉素(25μg/ml)的LB液体培养基(5ml)的试管中，37℃摇床中200rpm振荡培养12～16h。

(2)将菌液转入1.5ml EP管中，10000rpm离心1min，弃上清收集菌体。

(3)向收集的菌体中加入250μl Plasmid Mini Kit I(购自QIAGEN公司)的试剂P1，将其悬浮；再向管中加入250μl试剂P2轻轻翻转倒置3～5次；向管中加入350μl试剂P3，轻轻翻转倒置3～5次，10000rpm离心10min；

(4)轻轻吸取上清(尽量不要吸取蛋白)，转入新的1.5ml EP管中，10000rpm离心4min；

(5)吸取上清转移入新的1.5ml EP管中，加入750μl异丙醇沉淀DNA，室温下静置10min，11000rpm离心10min，弃上清，收集DNA；

(6)加入1.0ml 70％乙醇清洗DNA，干燥后加入50μl Elution缓冲液溶解，4℃保存备用。

2.六段同源重组片段引物设计

根据实验设计方案，设计扩增六段同源重组片段(A、B、C、D、E和F片段)的引物，引物5.0引物设计软件设计结果见表1。

表1六段同源重组片段扩增引物设计

3.同源重组片段的PCR扩增

以BAC为模版，使用Taq DNA聚合酶扩增六段同源重组片段(A、B、C、D、E和F片段)。

反应体系(50μl)如下：

PCR扩增反应条件：Touchdown

*每个循环降1℃，68℃为首次反应温度；

4.PCR产物纯化

用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit纯化PCR产物(A-F片段)，步骤如下：

(1)将1体积的PCR产物和5倍体积的缓冲液CP混合，涡旋混匀，将混合物加入到HiBind DNA微型柱中，13000g室温离心1min；

(2)弃滤液，加入700μl的DNA Wash缓冲液，13000g室温离心1min；

(3)弃滤液，加入500μl的DNA Wash缓冲液，13000g室温离心1min；将HiBind DNA再用最大转速(≥13000g)离心2min彻底甩干柱中残液；

(4)将柱放至干净的1.5ml的EP管中，加入50μl的Elution缓冲液，室温静置2min，13000g室温离心1min，弃柱，将含有纯化后PCR产物的EP管4℃保存备用。

5.同源重组片段及相应载体质粒的酶切

将纯化后的六个片段(A-F)按表1所述酶切位点进行双酶切。相应的载体质粒pL253、pL452和pL451也用对应的酶切位点进行双酶切(如载体构建图1所示)。

酶切反应条件：37℃水浴2h

酶切反应体系：50μl

6.凝胶电泳及回收纯化酶切产物

(1)酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳120V，150mA，15min

(2)将酶切后的样品进行电泳，使用试剂盒Gel Extraction Kit从胶中回收纯化酶切产物，在紫外灯下切出含目的条带的胶放入1.5ml的EP管中，加3倍体积的缓冲液QG到1倍体积的胶中(即10mg的胶加100μl的缓冲液QG)；

(3)在50℃水浴锅中放置10min，为了加速溶解，每隔2～3min振荡一次，在胶完全溶解后，加入1倍体积的异丙醇到样品中混匀；

(4)将EP管中的样品转移到柱中，13000rpm室温离心1min；

(5)弃滤液，加入750μl缓冲液PE至柱中，13000rpm室温离心1min；

(6)弃滤液，13000rpm室温离心1min，将柱中的残留液体尽量去除干净；

(7)将柱放置到EP管中，加入50μl的缓冲液BE，静置2min，13000rpm室温离心1min，弃柱，将含有纯化后酶切产物的EP管4℃保存备用。

7.目的片段与载体质粒连接

分别将A和B片段连入质粒pL253，C和D片段连入质粒pL452，E和F片段连入质粒pL451。

连接体系(10μl)：

16℃连接过夜。

8.转化感受态细胞

分别将连接后的产物pL253+A+B，pL452+C+D和pL451+E+F转化DH5α感受态细胞：

(1)取50μl感受态细胞在冰上融化，加入5μl连接产物轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)42℃热激45s，之后迅速转移至冰上静置2min，该过程不要晃动离心管；

(3)加入500μl无抗性LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；

(4)5000rpm室温离心1min，弃上清并保留100μl，重新悬浮沉淀，然后涂布于含有氨苄(50μg/ml)抗性的固体LB培养基平板上，37℃培养16～20h。

9.细菌培养和质粒提取

(1)挑取平板上的单菌落，加入5ml含氨苄(50μg/ml)抗性液体LB培养基中，37℃，200rpm培养8～12h；

(2)质粒的提取，使用OMEGA公司E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I试剂盒提取质粒；取1ml培养好的菌液加入1.5ml EP管中，10000g离心1min，弃上清，收集菌体；

(3)向管中加入250μl Solution I涡旋悬浮沉淀，加入250μl Solution II，轻轻倒置3～5次，加入350μl Solution III轻轻倒置3～5次，13000g室温离心10min；

(4)轻轻吸取上清液(尽量不要吸入蛋白)加入HiBind Miniprep柱中，10000g室温离心1min；

(5)弃上清，加500μl缓冲液HB于柱中，10000g室温离心1min；

(6)弃上清，加700μl DNA Wash缓冲液于柱中，10000g室温离心1min；

(7)弃上清，13000g再离心2min，将柱中的残液去除干净；

(8)将柱置入一个新的1.5ml的EP管中，加入50μl Elution缓冲液，静置2min，13000g离心1min，弃柱，将含有质粒的EP管4℃保存备用。

10.重组质粒验证

将提取的重组质粒pL253+A+B、pL452+C+D和pL451+E+F分别利用双酶切方法进行验证是否连入A、B、C、D、E和F片段，所用内切酶见表1：

酶切反应条件：37℃水浴2h

酶切反应体系：10μl

11.BAC转化到EL350

(1)挑取保种的EL350的单克隆接种于5ml无抗性的LB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养16～18h；

(2)取1ml培养好的菌液再接种于20ml无抗性的LB液液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.48～0.6(约2h)；

(3)4℃，4000rpm离心5min收集菌体；

(4)用888μl冰水将菌体悬浮后，将悬浮液转入1.5ml EP管中，0～4℃，9000rpm离心30s；

(5)重复步骤(4)两次；

(6)用50μl冰水悬浮沉淀，转入预冷的电击杯，加入5μl含有loxl3的BAC混匀，电击(200Ω，2500V，4μs，25μF，0.2cm gap)；

(7)加入1ml无抗性的LB液体培养基，30℃，200rpm振荡培养1h，5000rpm，离心1min，弃上清并保留100μl，重新悬浮沉淀，然后涂布于氯霉素(25μg/ml)抗性的LB固体平板上，30℃，培养18～24h。

12.第一次同源重组Retrieving

1)重组质粒pL253+A+B线性化

将重组质粒pL253+A+B用BamHI酶切过夜，经琼脂糖凝胶回收纯化后，用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)做去磷酸化处理，步骤如下：

(1)酶切反应条件：37℃水浴12h

酶切反应体系：50μl

(2)将酶切产物纯化，纯化步骤同前；

(3)向纯化后的酶切产物中加入5μl CIAP 10×缓冲液，0.5μl CIAP，37℃温育30min；用琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化，电泳和回收步骤同前。

2)线性化的pL253+A+B转化到含BAC的EL350

(1)含BAC的EL350接种于5ml氯霉素(25μg/ml)抗性LB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养12～16h；

(2)将5ml菌液接种于含有100ml氯霉素(25μg/ml)抗性LB液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.48～0.6(约2h)；

(3)留20ml的菌液于恒温水浴摇床中42℃振荡水浴15min(快速升温激活重组酶)；

(4)取出立即放置冰上快速振摇5min(快速降温)，之后冰上放置5min；

(5)0℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；

(6)加入888μl冰水悬浮菌体沉淀，并将悬浮液转入1.5ml EP管中，4℃，9000rpm离心30s，弃上清；

(7)重复步骤(6)两次；

(8)用50μl冰水悬浮沉淀，加入5μl线性化的重组质粒pL253+A+B混匀，转入冷的电击杯，电击(200Ω，2500V，4ms，25μF，0.2cm gap)；

(9)立即加入1ml无抗性的LB液体培养基，30℃，200rpm振荡培养1h，5000rpm，离心1min，弃上清并保留100μl，重新悬浮沉淀，然后涂布含有氨苄(50μg/ml)抗性的固体LB培养平板上，30℃，培养18～24h。

3)Retrieved质粒酶切和测序验证

挑取单克隆培养和质粒提取步骤同前，得到Retrieved质粒(含有A+同源重组片段+B)。将提取后的质粒分别通过BamHI、EcoRI和SacI单酶切验证，再用AF引物测序验证Retrieved质粒是否发生同源重组。

13.第二次同源重组

1)重组质粒pL452+C+D的片段化处理

将重组质粒pL452+C+D用NotI、SalI和ScaI三种内切酶酶切过夜，经琼脂糖凝胶回收纯化后，并使用CIAP做去磷酸化处理，步骤如下：

(1)酶切反应条件：37℃水浴12h

酶切反应体系：50μl

(2)将酶切产物回收纯化，纯化步骤同前；

(3)向纯化后的酶切产物中加入5μl CIAP 10×缓冲液，0.5μl CIAP，37℃温育30min；用琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化，电泳和回收步骤同前。

2)将线性化的pL452+C+D和Retrieved质粒转化EL350

(1)含BAC的EL350接种于5ml氯霉素(25μg/ml)抗性LB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养12～16h；

(2)将5ml菌液接种于含有100ml氯霉素(25μg/ml)抗性LB液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养至OD600为0.48～0.6(约2h)；

(3)留20ml的菌液于恒温水浴摇床中42℃振荡水浴15min(快速升温激活重组酶)；

(4)取出立即放置冰上快速振摇5min(快速降温)，之后冰上放置5min；

(5)0℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；

(6)加入888μl冰水悬浮菌体沉淀，并将悬浮液转入1.5ml EP管中，4℃，9000rpm离心30s，弃上清；

(7)重复步骤(6)两次；

(8)用50μl冰水悬浮沉淀，加入8μl线性化的重组质粒pL452+C+D和5μl RetrievedPlasmid混匀，转入预冷的电击杯，电击(200Ω，2500V，4ms，25μF，0.2cm gap)；

其余步骤与线性化的pL253+A+B电击转入含BAC的EL350进行同源重组的步骤相同，最后涂布于氨苄(50μg/ml)和卡那(50μg/ml)抗性固体LB培养板上。

3)二次同源重组质粒酶切验证

挑取单克隆培养和质粒提取步骤同前，得到二次同源重组质粒(含有A+C+Neo+D+B片段)。将提取后的质粒分别通过BamHI和HindIII酶切验证。

14.利用Cre-loxP系统去除二次同源重组质粒中的Neo序列

1)阿拉伯糖诱导Cre表达，除去loxP之间的序列

(1)分别取1ml过夜培养的EL350接种至两个20ml无抗性LB液体培养基中，30℃，200rpm振荡培养至OD₆₀₀为0.38～0.4；

(2)0.2ml 10％L(+)阿拉伯糖加入培养基中至终浓度为0.1％，30℃，200rpm振荡培养1h；

(3)0℃，4000rpm离心8min，弃上清，收集菌体；

(4)加入888μl冰水悬浮菌体沉淀，并将悬浮液转入1.5ml EP管中，4℃，9000rpm离心30s，弃上清；

(5)重复步骤(4)两次；

(6)用50μl冰水悬浮沉淀，加入1ng的上面步骤提取的二次同源重组质粒转入预冷的电击杯，电击(200Ω，1750V，4ms，25μF，0.1cm gap)；

(7)立即加入1ml无抗性LB液体培养基，30℃，200rpm振荡培养1h，5000rpm，离心1min，弃上清并保留100μl，重新悬浮沉淀，分别涂布氨苄(50μg/ml)平板和卡那(50μg/ml)平板，培养过夜；

(8)如果卡那抗性板上没有长出菌落，挑取氨苄平板上单克隆菌落，接至液体LB培养基扩大培养。

2)酶切、测序验证

将扩大培养的菌液提取质粒，步骤同前，得到去除Neo的二次同源重组质粒，进行酶切验证。

15.第三次同源重组

1)pL451+E+F的片段化处理

将重组质粒pL451+E+F先用ApalI内切酶单酶切，酶切产物回收后，再用XhoI和NotI内切酶双酶切过夜，回收纯化后，使用CIAP做去磷酸化处理，步骤如下：

(1)酶切反应条件：37℃水浴2h；

单酶切反应体系：50μl

(2)酶切反应条件：37℃水浴12h；

双酶切反应体系：50μl

(3)酶切产物回收纯化步骤同前；

(4)向纯化后的酶切产物中加入5μl CIAP 10×缓冲液，0.5μl CIAP，37℃温育30min；用琼脂糖凝胶电泳检测回收纯化，电泳和回收步骤同前。得到线性化的pL451+E+F。

2)将线性化的pL451+E+F和去掉Neo的二次同源重组质粒转化EL350

(1)含BAC的EL350接种于5ml氯霉素(25μg/ml)抗性LB液体培养基中，30℃200rpm振荡培养12～16h；

(2)将5ml菌液接种于含有100ml氯霉素(25μg/ml)抗性LB液体培养基的三角瓶中，30℃，200rpm振荡培养至OD600为0.48～0.6(约2h)；

(3)留20ml的菌液于恒温水浴摇床中42℃振荡水浴15min(快速升温激活重组酶)；

(4)取出立即放置冰上快速振摇5min(快速降温)，之后冰上放置5min；

(5)0℃，4000rpm离心5min，弃上清，收集菌体；

(6)加入888μl冰水悬浮菌体沉淀，并将悬浮液转入1.5ml EP管中，4℃，9000rpm离心30s，弃上清；

(7)重复步骤(6)两次；

(8)用50μl冰水悬浮沉淀，加入5μl线性化的重组质粒pL451+E+F和5μl去掉Neo的二次同源重组质粒混匀，转入预冷的电击杯，电击(200Ω，2500V，4ms，25μF，0.2cm gap)；

其余步骤与线性化的PL253+A+B电击转入含BAC的EL350中进行同源重组的相同，最后涂布于氨苄(50μg/ml)和卡那(50μg/ml)抗性固体LB培养板上培养，得到三次同源重组质粒(含有A+C+D+E+Neo+F+B片段)。

3)三次重组质粒转化DH5α

(1)取50μl感受态细胞在冰浴中融化，加入5μl三次重组质粒轻轻混匀，冰上放置30min；

(2)42℃热激45s，之后迅速放置冰上静置2min，该过程不要晃动离心管；

(3)加入500μl无抗性的LB液体培养基，37℃，200rpm振荡培养1h；

(4)5000rpm室温离心1min，弃上清并保留100μl，重新悬浮沉淀，然后涂布于含有氨苄(50μg/ml)和卡那(50μg/ml)抗性的固体LB培养基平板上，37℃培养16～20h。

(5)酶切测序验证：

挑取单克隆培养和质粒提取步骤同前，得到的质粒即为loxl3条件性基因敲除载体质粒。

16.Loxl3条件性基因敲除载体质粒

将得到载体质粒通过HindIII、SpeI和AgeI三种酶单酶切和DR、EL和FR 3条引物测序来验证，验证成功后保存备用。

酶切反应条件：37℃水浴2h

单酶切反应体系：10μl

实施例2Loxl3条件性基因敲除载体的转染和筛选

1.Loxl3条件性基因敲除载体质粒大提

(1)将保种的含有载体质粒的菌株DH5α(北京全式金生物技术有限公司)接种在氨苄(50μg/ml)和卡那(50μg/ml)抗性固体培养基平板上，37℃培养12h，挑取单菌落接种至5ml LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养12～16h；

(2)取1ml菌液转接500ml LB液体培养基中，37℃，200rpm振荡培养12～16h；

(3)6000g，4℃离心10min，弃上清收集菌体；

(4)使用QIAGEN的大提试剂盒进行提取，向收集的菌体中加入4ml试剂P1，将其悬浮；

(5)向管中加入4ml试剂P2，轻轻翻转倒置4～6次，室温5min；向管中加入4ml预冷试剂P3，轻轻翻转倒置4～6次；

(6)将溶解物倒入QIAfilter Cartridge中，室温放置10min；

(7)将10mlQBT加入QIA-tip 100中，液体通过重力作用流出；

(8)将QIAfilter Cartridge的顶帽旋下，小心将活塞插入QIAfilter Cartridge中，过滤出的液体流至平衡好的QIA-tip中，QIA-tip液体通过重力作用流出；

(9)向QIA-tip加入30ml QC缓冲液清洗，两次；加入15mlQF洗脱缓冲液；

(10)向洗脱出的液体中加入10.5ml异丙醇混匀沉淀DNA，4℃，≥15000g，离心30min，小心弃掉上清；

(11)加入5.0ml 70％常温乙醇清洗DNA沉淀，≥15000g的转速离心10min，小心弃掉上清；空气种干燥5～10min，用适量TE缓冲液(pH8.0)溶解沉淀，测定浓度，于4℃保存备用。

2.载体质粒线性化

载体质粒用NotI单酶切线性化，酶切产物再进行纯化，步骤如下：

(1)用NotI酶切线性化：

酶切反应条件：37℃水浴酶切过夜

酶切反应体系：800μl

(2)酶切产物800μl分装2管后，各加入400μl氯仿/苯酚(1：1，现用现配)；颠倒混匀10min后，10000rpm，0℃离心10min，取上清(约400μl)；

(3)上清液中加入等体积氯仿/异戊醇(24：1)，颠倒混匀10min；10000rpm，0℃离心10min，取上清(约400μl)；

(4)上清液中加入1/10体积3M乙酸钠混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，可见絮状沉淀；10000rpm，0℃离心10min，弃上清；

(5)在沉淀中加入700μl 70％乙醇洗涤，10000rpm，0℃离心10min，弃上清；

(6)重复步骤(5)一次；

(7)空气中晾干，加入25μlTE溶解，测浓度，调整到1μg/μl备用。

3.线性化载体质粒电转化到ES细胞

(1)37℃水浴中快速溶解1管ES细胞，将细胞转移至干净的15ml管中。加入10ml ES细胞培养基，1000rpm(250g)离心7min，弃上清，再加入10ml ES细胞培养基重悬沉淀，分散到铺有饲养层细胞的细胞培养板上，37℃培养，每天更换新鲜培养基；

(2)当细胞铺满培养板面积的70-80％，更换培养基，至少2h后，5ml ESQ PBS洗两次，加入1.5ml胰蛋白酶(ESQ Trypsin)，37℃培养15min；

(3)加入ES细胞培养基重悬细胞，吹散细胞形成单细胞悬液，ES细胞转至干净15ml管中，1000rpm离心7min。吸弃上清，补加4ml ES细胞培养基；

(4)吸取1ml细胞悬液接至100mm饲养层细胞培养板上，37℃培养，ES细胞传代48h后即可用于电转，板上的ES细胞覆盖率应达到75-90％；

(5)用5ml ESQ PBS冲洗培养板2次，每板加入1.5ml ESQ Trypsin，37℃培养20min；

(6)消化后，加入1.5ml ES培养基重悬细胞，单细胞悬液转入15ml离心管中，轻轻吹打制作均一细胞悬液；

(7)1000rpm，离心7min收集细胞，加入ESQ PBS重悬细胞使细胞密度达到11×10⁶个/ml；

(8)将15-20μg线性化的载体质粒和0.9ml ES细胞悬液加入电转杯中，轻轻吸打混匀，电击(230V，500μF(电场强度575V/cm)，时间5.8-7.0ms)，迅速将电转杯放于冰上；

(9)将电转后的细胞加入15ml离心管中，用1ml ES培养基冲洗，补至8ml，轻轻吸打混匀，将细胞悬液加入培养板中，十字型晃板使细胞均匀分布。37℃至少培养24h才选择重组体。

4.阳性细胞克隆筛选和PCR鉴定

(1)电转后24h～36h之内，吸去板中培养基，再补10ml ES细胞培养基，加入20～30μl的ESQ G418(浓度为100mg/ml)；

(2)在开始的4d中每天更换选择培养基，之后隔天更换一次。约10～11d就可以清晰的看到细胞克隆，直径大约500μm；

(3)将板中的培养基吸弃，ESQ PBS洗两次，亚甲基兰染色；5min后倒掉染料，加入70％乙醇洗两次，将培养板倒置于吸水纸上干燥，对染色的克隆计数。

(4)将筛选出的未分化ES细胞克隆挑取至96孔板中，用ESQ Trypsin充分消化，取部分细胞至另外一个细胞板冻存，剩下的一板细胞进行粗提基因组DNA用PCR方法鉴定。

表2长PCR筛选引物设计

长PCR反应体系(20μl)如下：

PCR扩增反应条件：Touchdown

*每个循环降1℃，68℃为首次反应温度；

实施例3利用显微注射技术制作可用于条件性基因敲除的floxed小鼠

将筛选鉴定正确的ES细胞通过显微注射技术(步骤参见小鼠胚胎操作指南)注入C57BL/6小鼠的囊胚中，经注射的囊胚转移至假孕母鼠的子宫着床，生出嵌合体小鼠，嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配，产生出棕色和黑色后代小鼠。将其中的棕色小鼠剪尾提DNA，用前面所述长PCR扩增筛选出阳性小鼠，即为loxl3条件性基因敲除的floxed小鼠。鼠尾DNA提取步骤如下：

DNA提取步骤如下：

(1)剪取0.3-0.5cm长的鼠尾，放入一个EP管中。剪碎后，用生理盐水或者PBS漂洗，离心去掉血污。

(2)加入250ul Lysis缓冲液1(100mM Tris-HCl pH8.0，50mM EDTA pH8.0，100mMNaCl 0.1％SDS)。

(3)加入13ul 20mg/ml的蛋白酶K。

(4)在55℃水浴孵育至少4h以上(最好过夜处理)，直到组织完全解体(期间可摇晃几次)。

(5)加入1μl 25mg/mL的Trans的无DNase活性的RNaseA，放入37℃水浴30min。

(6)8000g离心10min，室温即可。取上清，移至新的EP管中。

(7)补无菌去离子水300μl体积，颠倒混匀(不要涡旋)。

(8)加等体积Tris饱和酚抽提，颠倒混匀，10000g离心15min取上清，室温即可。

(9)加等体积酚：氯仿：异戊醇(体积比25：24：1)抽提，待分层后10000g离心15min，室温即可。取水相转移至一个新的EP管中(不要吸到中间相及下层水相。)

(10)加等体积氯仿抽提，颠倒混匀后，10000g离心15min去除痕迹酚。

(11)转移上层水相至新的EP管中，加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)，及2.5倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，室温静置10min后，放入-20℃沉淀DNA 1h以上。

(12)12000g离心15min。弃上清，沉淀加入70％乙醇(现用现配)500ul洗涤，10000g离心10min，两次。

(13)室温干燥DNA沉淀5～10min(超净台内吹风)，避免DNA太干，难溶。

(14)加30-50ul TE缓冲液或去离子水，溶解DNA。可以在50℃水浴孵育10min，-20℃长期保存；使用分光光度计测OD值计算DNA量，以及A260/280测DNA质量。

实施例4具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠的获得及表型鉴定

将该floxed小鼠与全身性表达Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配。最初的后代由于Cre酶的镶嵌性而形成嵌合体后代，需要与C57BL/6J小鼠回交获得Loxl3^+/-杂合敲除小鼠，再将雌性和雄性Loxl3^+/-杂合敲除小鼠互交，即可从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠，结果如图3所示。PCR验证引物：

Loxl3-F：5'-TGCTGTCATTTCTCCTGTGC-3'；和

Loxl3-R：5'-ATTGAACCCAACCGTCATGT-3'；

PCR反应体系(20μl)如下：

PCR扩增反应条件：

Claims (3)

1.一种小鼠Loxl3基因条件性敲除的方法，其特征在于，出生后纯合敲除小鼠表现腭裂症状，包括如下步骤：

构建Loxl3条件性基因敲除的重组载体，步骤如下：

(1)提取含有loxl3基因的细菌人工染色体(BAC)；

(2)PCR扩增六段同源重组片段，所述的引物序列分别为：

同源重组片段A：F：GGACTAGTAGCAGCTTCAGCTTCAGACAC；

R：CGGGATCCTGGTCTCTGTCTCGGTGACTC；

同源重组片段B：F：CGGGATCCGGGCCTTGAAAGTTCAGAGTT；

R：GCTCTAGACACTAGCACCACGTTCTACCC；

同源重组片段C：F：ACGCGTCGACTCTAACTGCATGGGTCTTGCT；

R：GGAATTCCACCATAACCTTCCCTGGTTT；

同源重组片段D：F：CGGGATCCTTTGCAAAGGGAAAGGAGAGT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCCTAGTCCAGAGCATCGCTCAC；

同源重组片段E：F：CCGCTCGAGCTGGACTAGCCCGGACATTAT；

R：GGAATTCCATTCGGATACCATTCACCTGC；

同源重组片段F：F：CGGGATCCACCAGCAAGCAGGAACTCAT；

R：ATAAGAATGCGGCCGCTGTTTGTTTCTGTGCCAAGC；

(3)分别将同源重组片段A和同源重组片段B连入质粒pL253，同源重组片段C和同源重组片段D连入质粒pL452，同源重组片段E和同源重组片段F连入质粒pL451，分别制得重组质粒pL253+A+B、重组质粒pL452+C+D、重组质粒pL451+E+F；

(4)将含有loxl3基因的BAC转化入EL350菌株，然后通过第一次同源重组，将质粒pL253+A+B转化入含有BAC的EL350菌株，获得Retrieved质粒；再通过第二次同源重组，将重组质粒pL452+C+D和Retrieved质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+Neo+D+B片段的二次同源重组质粒；利用Cre-loxP系统去除Neo序列，获得去掉Neo的二次同源重组质粒；最后通过第三次同源重组，将重组质粒pL451+E+F和去掉Neo的二次同源重组质粒共转化入EL350菌株，获得含有A+C+D+E+Neo+F+B片段的三次同源重组质粒，即为Loxl3条件性基因敲除的重组载体；

线性化重组载体并转染胚胎干细胞；

筛选发生同源重组的胚胎干细胞克隆；

将筛选出的发生同源重组的胚胎干细胞克隆显微注入C57BL/6供体小鼠的囊胚；

将含有阳性胚胎干细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫，生产出嵌合体小鼠；

嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠回交生出杂合子小鼠；

将该杂合子小鼠与全身性表达Cre酶的EIIa-Cre小鼠交配，获得双杂合的小鼠；

雌性和雄性双杂合小鼠互交，从后代中获得具有腭裂表型的纯合基因敲除小鼠。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的胚胎干细胞为129/S6来源的胚胎干细胞。

3.利用权利要求1所述的方法获得的纯合基因敲除小鼠作为腭裂疾病发病研究的模型鼠的用途。