CN108239620A

CN108239620A - IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN108239620A
Application number: CN201611216435.5A
Authority: CN
Inventors: 冯磊; 恽君雯; 吴培培; 陈丽; 侯继波
Original assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Jiangsu Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-12-26
Filing date: 2016-12-26
Publication date: 2018-07-03
Anticipated expiration: 2036-12-26
Also published as: CN108239620B

Abstract

本发明涉及IFN‑β1编码基因缺失的MDCK细胞株及其构建方法和应用，属于生物技术及兽用生物制品工程技术领域。该名称为MDCK‑Sus‑KO‑IFN‑β1的细胞株于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.13288，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明通过敲除MDCK细胞中的IFN‑β1编码基因，从而去除细胞的天然免疫信号分子，可以显著提高禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖效率。该细胞株可以用于禽流感病毒增殖细胞克隆。

Description

IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株及其构建方法和应用，属于生物技术及兽用生物制品工程技术领域。

背景技术

犬肾（MDCK）细胞是目前用于禽流感病毒增殖的主要的宿主细胞。各大研究机构以及兽用疫苗生产企业都在进行该细胞增殖禽流感病毒的种细胞筛选、细胞悬浮培养、病毒增殖工艺等研究。

在研究中我们发现，当禽流感病毒在MDCK细胞中的连续传代时，其增殖效率呈现出逐渐下降的趋势。甚至在连续增殖到某一代次时，禽流感病毒的增殖效率会出现断崖式下降。造成这一情况发生的原因目前尚不明确。但有研究表明，子代禽流感病毒粒子的增殖效率下降与子代病毒粒子中缺陷型病毒粒子（interferon interfering particles）占比的逐渐增加有关。而这种缺陷型病毒粒子的生成又与宿主细胞I型干扰素介导的宿主细胞天然免疫拮抗病毒增殖有关。

有关文献表明，I型干扰素中的干扰素β1在禽流感病毒感染MDCK细胞的过程中可以诱发细胞产生天然免疫拮抗病毒增殖的信号通路，在病毒吸附、转运、逆转录、复制以及芽殖等多个过程对病毒的增殖进行干扰。同时释放到胞外的干扰素β1可通过细胞膜上的干扰素识别受体，激活未被禽流感病毒感染正常细胞的天然免疫系统，使得禽流感病毒在细胞间的传播受到抑制。

因此，敲除MDCK细胞的干扰素β1基因编码片段，去除细胞的天然免疫信号分子，对提高禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖效率是有益的。

目前尚没有发现有关干扰素β1与提高禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖效率相关的文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株，从而去除MDCK细胞的天然免疫信号分子，提高禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖效率。

本发明中所公开的IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株，其名称为MDCK-Sus-KO-IFN-β1，该细胞株于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.13288，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

同时，本发明还进一步的公开了这一IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株的构建方法，该方法是基于CRISPR-Cas9系统来敲除MDCK细胞中IFN-β1编码基因。其可以进一步描述为，该方法是利用CRISPR-Cas9系统，在悬浮培养条件下完成了悬浮基因转染以及基因敲除过程，并通过FACS分选出转染后可能出现目的基因敲除的MDCK细胞单克隆，进而通过PCR扩增目的片段及测序，确定若干敲除了IFN-β1编码基因的MDCK细胞克隆，最终通过病毒增殖效率以及细胞生长速率比较筛选，得到一株可以用于禽流感病毒增殖的MDCK细胞株，命名为MDCK-Sus-KO-IFN-β1。

更为具体地，本发明还公开了这一方法包括以下步骤：

1）犬的干扰素β1基因位于犬11号染色体，其ORF为561个核苷酸，编码186个氨基酸。在本发明中我们根据犬IFN-β1编码基因片段中符合“N（N…NN）₁₈NNGG”（N代表任意一种脱氧核糖核苷酸）排列顺序的基因片段，并考虑序列的特异性以及可能的编辑脱靶效率选取了2条靶序列，分别为序列1 GCTCATGGCAAGAGCCATGGTGG（SEQ ID NO.1）和序列2GATAATCTGTAAGTATATTAAGG（SEQ ID NO.2）。根据这两条靶序列我们进一步构建可识别序列1和序列2的gRNA体内转录载体pUC-gRNA1和pUC-gRNA2。

2）根据犬的蛋白质翻译密码子偏好性，优化Cas9蛋白翻译密码子，同时在Cas9基因的ORF两端各加入1条SV40病毒的NLS序列，确保Cas9蛋白在表达后其N端和C端均含有SV40的NLS序列。优化后的Cas9的核酸编码序列如SEQ ID NO.3所示。克隆优化后的Cas9编码序列至真核表达载体中，获得Cas9表达载体pCas9-IRES-GFP。该载体含有GPF编码基因，与Cas9蛋白在双顺反子内利用内部核糖体插入位点启动GFP的表达，用于识别转染后Cas9表达与否以及FACS的筛选荧光标记。

3）单细胞悬浮生长的MDCK-Sus细胞以1×10⁶cells/ml接种15ml悬浮培养体系培养过夜。准备pCas9-IRES-GFP、pUC-gRNA1和pUC-gRNA2（各1ug）用于悬浮转染。转染24小时后经FACS流式分选出具有绿色荧光的单细胞克隆铺于96孔板，使每个孔中只有一个细胞克隆。

4）待单细胞克隆在96孔板中生长扩增后，进行复板操作。一部分细胞进行基因组DNA抽提及PCR扩增目的基因序列，另一部分细胞用于细胞扩增建系保种。对PCR产物测序后，从FACS筛选出的细胞克隆中挑选出IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞克隆。

5）测定IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞克隆的生长速率，挑选生长快速的5株细胞克隆用于H9亚型禽流感病毒的增殖效率比较。

6）H9亚型禽流感病毒接种于5株备选IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞克隆，比较病毒连续传代增殖后的HA效价，挑选病毒增殖效率最高的细胞克隆为最终MDCK-Sus-KO-IFN-β1细胞克隆。

在这个过程中，我们所公开的靶DNA序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2在CRISPR-Cas9系统敲除MDCK细胞中IFN-β1编码基因的用途，以及优化的Cas9的核酸编码序列SEQ IDNO.3均属于本发明的保护范围。

最后，我们进一步公开了本发明所获得的IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株在禽流感病毒培养及增殖中的应用。

本发明通过敲除MDCK细胞中的IFN-β1编码基因，从而去除细胞的天然免疫信号分子，可以显著提高禽流感病毒在MDCK细胞中的增殖效率。该细胞株可以用于禽流感病毒增殖细胞克隆。

附图说明

图1为PCR鉴定结果

M：核酸Marker 1～19：MDCK单细胞克隆，C：MDCK-Sus对照

图2为 PCR产物测序及blast结果

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面我们结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1 构建gRNA表达载体

1、设计DNA oligo引物

分析犬IFN-β1的基因序列（GeneID：481558），按照符合“N（N…NN）₁₈NNGG”（N代表任意一种脱氧核糖核苷酸）排列顺序的基因片段，并考虑序列的特异性以及可能的编辑脱靶效率，选取GCTCATGGCAAGAGCCATGGTGG为靶序列1，GATAATCTGTAAGTATATTAAGG为靶序列2。针对这两条靶序列，设计两对DNA oligo引物用于gRNA表达载体的构建，序列如下：

靶序列1F：CACCGGCTCATGGCAAGAGCCATGG

靶序列1R：AAACGCCATGGCTCTTGCCATGAGC

靶序列2F：CACCGGATAATCTGTAAGTATATTA

靶序列2R：AAACGTAATATACTTACAGATTATC

2、构建gRNA表达载体

对2对靶序列引物分别进行退火处理，产生具有粘性末端的2条DNA双链。采用限制性内切酶BbsI（购自NEL生物技术公司）处理gRNA表达载体骨架（内含U6启动子、RNA scaffold、polyA signal sequence），产生与引物退火产物相同的粘性末端。经T4 DNA连接酶（购自TAKARA生物技术公司）作用，获得pUC-gRNA1和pUC-gRNA2这两个gRNA表达载体用于后续转染实验。

实施例2 构建pCas9-IRES-GFP

1、合成适用于MDCK细胞基因组编辑的Cas9蛋白编码DNA序列

根据犬的蛋白质翻译密码子偏好性，优化Cas9蛋白翻译密码子，同时在Cas9基因的ORF两端各加入1条SV40病毒的NLS序列，确保Cas9蛋白在表达后其N端和C端均含有SV40的NLS序列。Cas9的核酸编码序列如SEQ ID NO.3所示。化学合成该序列，用于载体构建。

2、构建pCas9-IRES-GFP

以NheI和XhoI（购自TAKARA生物技术公司）酶切处理Cas9的核酸编码序列以及表达载体pCMV-MCS-IRES-GFP，经T4 DNA连接酶（购自TAKARA生物技术公司）作用，获得Cas9的最终表达载体pCas9-IRES-GFP用于后续转染实验。

实施例3 悬浮转染及MDCK-Sus-KO-IFN-β1细胞株的筛选确定

1、阳离子聚合物介导的悬浮细胞转染

接种初始细胞密度为1×10⁶cells/ml的MDCK-Sus细胞株（由江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心自行驯化扩增建系，该细胞株可单细胞悬浮培养。具体方法参考：冯磊、吴培培、褚轩、王伟峰、陈丽、侯继波，MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增值上的初步应用，浙江农业学报，2015，27（6）：913-920。）于50mlTPP培养管中，悬浮培养过夜后用于质粒转染。转染前培养基更换为Opti-MEM培养基（购自Invitrogen公司）孵育10分钟。以10ml细胞悬液为一个转染单位，将100ulPEI试剂（购自Sigma公司）加入至1ml的Opti-MEM中混匀，将1~10ug的pUC-gRNA1、pUC-gRNA2以及pCas9-IRES-GFP质粒载体加入至1ml的Opti-MEM中混匀，室温下孵育5分钟。孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴加入的方式混匀，在室温下孵育15分钟，形成PEI-DNA转染复合物。采用逐滴加入的方式将上述2ml转染复合物加入至10ml的MDCK-Sus细胞悬液中，于室温中孵育15分钟。孵育结束后将转染完毕的细胞放置于正常悬浮培养的摇床上，其余培养条件同正常培养，仅改变培养转速为55～120rpm。转染后8小时，以1000rpm离心10分钟，将含有剩余转染复合物的培养上清去除，更换成MDCK-Sus细胞株的正常悬浮培养培养基继续振荡悬浮培养。

2、筛选IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞克隆

转染后24小时的MDCK-Sus细胞株经离心回收以及PBS清洗后用于流式细胞仪细胞分选。分选前细胞经无菌600目筛网过滤后上流式细胞仪进行分选操作，按照每孔1个细胞克隆的标准分选出带有绿色荧光的细胞至96孔板。待每孔中细胞克隆生长，制作细胞克隆复板，用于细胞克隆的继续培养增殖以及细胞克隆的基因组提取鉴定。针对犬IFN-β1基因序列合成上下游引物如下：

F：ATGAAAGGGAGAACTGAAAGTGGG

R：GTCAAGCATCGTCCATTCCGAGAG

利用PCR扩增备选细胞克隆的IFN-β1基因序列。PCR程序为：步骤一：98℃30秒；步骤二：98℃15秒，60℃ 30秒，72℃ 20秒，35个循环；步骤三：72℃ 10分钟。MDCK-Sus细胞的扩增片段大小为767bp，备选克隆的扩增片段如图1所示。根据备选克隆的PCR扩增产物的条带大小，将克隆1的250bp左右条带、克隆3的250bp左右条带、克隆8的1000bp左右条带、克隆10的250bp左右条带、克隆13的250bp左右条带、克隆14的250bp左右条带、克隆15的1000bp左右条带、克隆16的250bp左右条带进行切胶回收并做PCR产物测序，与犬IFN- β1基因的编码序列进行比对分析。DNA测序及比对结果如图2所示，可见备选克隆中的IFN-β1基因编码序列在两个靶向切割位点处出现了大片段的缺失或者大片段的随机插入，说明对MDCK-Sus细胞进行IFN-β1基因序列的编辑改造是有效的。

3、备选克隆的生长曲线比较

扩增上述8个细胞克隆，待细胞生长扩增稳定后，进行细胞生长曲线的测定。以相同细胞初始浓度3×10⁵cells/ml接种于50mlTPP培养管中，在37℃，5%CO₂以及180rpm的培养环境下进行悬浮培养，每天取样检测细胞密度，结果如表1所示。

表1 不同细胞克隆的生长效率比较

结果表明，细胞克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16的细胞生长速率相对较快，以这5株细胞克隆进行禽流感病毒的增殖比较试验。

4、备选克隆的禽流感病毒增殖比较试验及MDCK-Sus-KO-IFN- β1细胞株的确定

细胞克隆1、克隆3、克隆10、克隆14、克隆16在50mlTPP培养管中经悬浮培养达到1.5～2.0×10⁶cells/ml时进行禽流感病毒的接毒增殖实验，以MOI为0.5的比例接入H9亚型禽流感病毒JS02株（江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心自行分离鉴定及保藏毒种。具体方法及相关信息参考：冯磊、吴培培、褚轩、王伟峰、陈丽、侯继波，MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增值上的初步应用，浙江农业学报，2015，27（6）：913-920。）。接毒后第3天检测病毒增殖效率，以HA效价表征。在这5个细胞克隆中分别连续传代该禽流感病毒30代，记录每代次病毒的增殖效价，如表2所示。

表2 不同细胞克隆对H9亚型禽流感病毒JS02株的连续增殖比较

结果表明，细胞克隆1表现出最好的病毒增殖效果，H9亚型禽流感病毒JS02株在该细胞克隆中获得连续增殖的能力，HA效价逐步升高并维持在最高的增殖水平，与该病毒在SPF鸡胚中的增殖效价基本一致。

根据细胞生长及禽流感病毒增殖情况，确定克隆1为MDCK-Sus-KO-IFN-β1最终定型细胞株，建库冻存。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株及其构建方法和应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gctcatggca agagccatgg tgg 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gataatctgt aagtatatta agg 23

<210> 3

<211> 4203

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggctccta aaaagaaacg aaaggtcgga atacatgggg tgccggcggc ggataaaaag 60

tactctatcg gccttgatat aggaacaaac agtgttgggt gggctgtcat taccgacgaa 120

tataaggttc ctagcaagaa attcaaggtc ctggggaaca cggaccgcca cagcataaaa 180

aagaacctga ttggtgcgct cctttttgac tctggagaga ctgcggaagc aacgcgattg 240

aagaggacag cgagaaggag gtatacccga aggaagaacc gaatatgcta cctgcaagag 300

atcttttcta atgaaatggc caaagttgac gattccttct tccacagact tgaggaatct 360

tttttggttg aggaggacaa gaagcatgaa cgccatccta tttttggaaa tattgtggac 420

gaggtcgcgt atcacgagaa atatcctacc atttaccacc ttagaaagaa actcgttgac 480

agcactgata aggcggacct tagacttata tatctcgccc tcgctcatat gatcaaattc 540

cgcggacact ttctgatcga gggggatctc aatccagata atagcgacgt tgacaaattg 600

ttcatccagt tggtccaaac ctacaaccaa ctctttgagg aaaatcctat aaacgcctct 660

ggcgtcgatg ctaaggccat actctccgcc aggctcagca agtcaaggcg cctggagaac 720

ctgatcgcgc agcttccggg cgagaaaaaa aatggactgt tcggaaactt gattgctctc 780

agcttgggac tcacaccgaa tttcaaatct aatttcgatc tggctgagga tgctaaactc 840

cagcttagta aagacactta cgatgatgac cttgataatc ttcttgctca gattggtgac 900

cagtatgctg acttgttctt ggccgcgaag aatctgagcg acgccattct tctttcagat 960

attttgcgcg tgaatacgga gatcaccaaa gcacccttgt ctgcctccat gattaagcgg 1020

tacgacgagc accatcaaga tcttactttg ctcaaagcac ttgtccgcca gcagctccca 1080

gagaaataca aagaaatttt ctttgatcaa tcaaagaatg gttatgcagg atatattgac 1140

ggcggggctt ctcaagagga attttacaaa tttattaagc ctatattgga gaagatggac 1200

gggacagaag aattgctggt taaactcaat cgagaggatc tgttgagaaa gcagaggaca 1260

ttcgataatg ggtccattcc ccaccagatc catctcggcg agttgcatgc aattctgcgc 1320

aggcaagagg acttttaccc gttccttaag gacaatcgag agaagataga aaagattctt 1380

acctttagaa tcccttacta cgtgggaccg ctggcacgcg gtaacagcag gttcgcatgg 1440

atgacgcgca aatcagaaga aactattacg ccgtggaact tcgaggaagt ggtggataag 1500

ggtgcgtctg cgcaaagttt catcgagcga atgacaaatt tcgacaagaa cttgcctaac 1560

gaaaaagtct tgcccaagca ctccctcctg tatgaatatt tcaccgttta caatgaactg 1620

acgaaagtga aatacgtcac cgaaggtatg cgaaaaccgg ctttcctcag cggtgaacaa 1680

aagaaagcaa tcgttgatct tctcttcaag actaacagaa aggtcacagt gaagcagttg 1740

aaagaagatt acttcaagaa aatcgaatgt tttgatagtg tggagatcag cggcgtcgaa 1800

gatcgattca acgcatctct tggtacgtac catgacctcc tcaaaattat caaggataaa 1860

gatttcctcg acaatgagga aaacgaggac atcctggagg atatagtgct cacattgacg 1920

ttgttcgagg atcgagaaat gattgaagaa cggttgaaga cctacgctca cctttttgat 1980

gataaggtta tgaaacaatt gaaacgcaga cggtatacgg gttggggacg gttgtctagg 2040

aaactgataa acggcattcg agacaaacaa agtgggaaaa cgatcctgga ctttctgaag 2100

tcagacggct ttgcaaaccg aaacttcatg cagcttattc acgatgactc tctcacattc 2160

aaagaggaca tacagaaagc ccaggttagt gggcaggggg actccctcca cgaacatata 2220

gcgaatctcg ccgggagtcc cgctatcaaa aaaggtatcc ttcagacggt gaaggttgtg 2280

gacgaactcg tgaaggttat gggtcggcac aagccagaaa atatcgttat agaaatggct 2340

agggaaaatc agaccactca aaaaggccaa aagaactcaa gagagcggat gaagcgaatt 2400

gaggagggca taaaggagct gggaagtcag atcctcaaag aacatccagt tgagaacact 2460

caactgcaaa atgagaagtt gtacctctac tatttgcaaa atggccggga catgtatgtt 2520

gatcaggaat tggacataaa ccgccttagt gactatgatg tggatcacat tgtcccacag 2580

tcttttctca aggatgactc catagacaat aaggtcttga cacggtctga caagaaccgg 2640

ggtaagtccg ataacgttcc aagtgaggag gttgttaaaa agatgaaaaa ctattggcga 2700

caattgctga acgcaaaact gattacccaa cgaaagtttg acaacctcac taaagctgaa 2760

agaggagggc tgtcagagct tgacaaggct gggtttatta agagacagct ggtggaaaca 2820

agacagatta caaagcatgt ggcccaaatc ctggactccc gaatgaatac aaaatacgac 2880

gaaaatgaca aattgattag agaggttaag gtgattacgc ttaagtctaa gcttgtgagc 2940

gactttagga aggacttcca gttctataaa gttagggaaa ttaacaatta tcatcatgcg 3000

catgatgctt atcttaatgc agtggtcgga actgcactta tcaagaagta ccctaagttg 3060

gagtccgaat tcgtctatgg agactacaaa gtctatgatg tgaggaagat gatagccaaa 3120

tccgagcaag agatcggcaa ggcaacagct aagtatttct tctattctaa catcatgaat 3180

tttttcaaaa ccgagatcac tttggcgaac ggtgaaatcc gcaagcgacc actcatagaa 3240

acaaacggtg agaccggcga gattgtctgg gataagggaa gggacttcgc cactgtgcgg 3300

aaggttttgt ccatgccaca ggttaacata gttaaaaaga cagaggttca gactggtggt 3360

ttctccaaag agagcatact tccgaagcgg aatagcgaca aactgattgc tagaaaaaaa 3420

gattgggacc caaaaaagta tgggggtttc gattctccaa ccgtggccta ttctgtgctt 3480

gtcgtcgcaa aggtggaaaa aggaaagtca aagaaactga agagcgttaa ggagttgctt 3540

ggtataacga tcatggagag gagcagtttc gaaaaaaacc cgatagactt tcttgaagcg 3600

aaggggtaca aggaggttaa gaaggacctg atcataaaac tcccgaaata ttccttgttt 3660

gaattggaaa acgggcgcaa gaggatgctt gctagtgcag gagaattgca aaaaggcaat 3720

gaactggcgt tgccctcaaa atacgttaat tttctgtacc tggctagtca ctatgaaaaa 3780

ctcaagggtt ccccggaaga caacgaacag aagcaactct ttgttgaaca acacaagcac 3840

tacctcgacg agataatcga acagatttca gagtttagca agcgcgtcat cttggcagac 3900

gcaaatctgg ataaagtgct ttctgcctat aataagcatc gcgacaaacc gattagggaa 3960

caggcagaaa atatcattca ccttttcaca ctcaccaatc tgggagcgcc cgcggcgttt 4020

aagtacttcg atacgacgat agataggaaa agatatacaa gtacgaagga agtgctcgac 4080

gcgaccctga tacaccaaag tataacgggg ttgtacgaaa ctagaataga cctgagccag 4140

ttgggagggg ataaaagacc agcggccact aaaaaagctg gtcaagcgaa gaaaaagaaa 4200

taa 4203

Claims

1. IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株，其特征在于，该名称为MDCK-Sus-KO-IFN-β1的细胞株于2016年11月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称为CGMCC），保藏编号为CGMCC NO.13288，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2. 权利要求1所述的IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株的构建方法，其特征在于：该方法是基于CRISPR-Cas9系统来敲除MDCK细胞中IFN-β1编码基因，从而构建IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株，其中靶序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：针对MDCK细胞优化Cas9蛋白翻译密码子，优化后的Cas9的核酸编码序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述的IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株在禽流感病毒培养及增殖中的应用。

5.权利要求1所述的IFN-β1编码基因缺失的MDCK细胞株在禽流感病毒的悬浮培养及增殖中的应用。