CN103255168A - 构建体及其应用 - Google Patents
构建体及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103255168A CN103255168A CN2013101630865A CN201310163086A CN103255168A CN 103255168 A CN103255168 A CN 103255168A CN 2013101630865 A CN2013101630865 A CN 2013101630865A CN 201310163086 A CN201310163086 A CN 201310163086A CN 103255168 A CN103255168 A CN 103255168A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- animal
- construct
- nucleic acid
- cell
- acid molecule
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 65
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims abstract description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 48
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 43
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 24
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 7
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 7
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 claims description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 4
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 claims description 3
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 2
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 2
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 2
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 abstract description 13
- 101150088952 IGF1 gene Proteins 0.000 abstract description 13
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 abstract description 13
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 12
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 abstract description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 abstract description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 abstract 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 29
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 23
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 23
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 9
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 5
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 4
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 4
- 102100020948 Growth hormone receptor Human genes 0.000 description 3
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 2
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 2
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 2
- 108010068542 Somatotropin Receptors Proteins 0.000 description 2
- -1 Streptomycin sulphates Chemical class 0.000 description 2
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 2
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N fluorescin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1C1C2=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C21 MURGITYSBWUQTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 2
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Natural products CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- OSPPCTISGYJYNK-IXFLFMHQSA-N CC1C=C2[C@@H]3[C@@]45C(CCC67)C6C7C4C5C2[C@H]13 Chemical compound CC1C=C2[C@@H]3[C@@]45C(CCC67)C6C7C4C5C2[C@H]13 OSPPCTISGYJYNK-IXFLFMHQSA-N 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010047357 Luminescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006830 Luminescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 208000025174 PANDAS Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000021155 Paediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infection Diseases 0.000 description 1
- 240000000220 Panda oleosa Species 0.000 description 1
- 235000016496 Panda oleosa Nutrition 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 101100452304 Sus scrofa IGF1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000003328 fibroblastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000007102 metabolic function Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 210000000607 neurosecretory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008288 physiological mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
- 239000009654 wuzhi Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了构建体及其应用。其中，构建体包含：第一核酸分子，该第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；以及第二核酸分子，该第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。借助该构建体，能够将与IGF1基因2号外显子两侧翼内含子序列同源的SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列引入到动物细胞中，进而，能够通过同源重组实现对动物细胞中的IGF1基因敲除，从而能够有效地干扰动物生长轴通路，进一步，可以抑制动物的生长，使得动物的体型比野生型动物小。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域。具体地，本发明涉及构建体及其应用。更具体地，本发明涉及构建体、制备转基因动物细胞的方法、转基因动物细胞或其培养物、制备非人转基因动物的方法以及非人转基因动物或其后代。
背景技术
目前市面上的宠物猪主要是巴马香猪、贵州小香猪、五指山老鼠猪等，这些猪的成年体重约35-45kg，体型较大，不能满足宠物市场的需要。此外，一些外貌漂亮的地方猪，如荣昌猪又名熊猫猪，成年体重为90kg，同样不适合作为宠物猪。此外，猪与人类相比，在遗传水平、生理机理、代谢功能及器官大小等方面都极为相近，是良好的实验动物模型。
然而，目前的猪品种并不能满足生活和科研的需要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出这样一种方案，利用该方案能够有效地获得小型化动物，例如与野生型相比，体型较小的猪。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含：第一核酸分子，该第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；以及第二核酸分子，该第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，借助该构建体，能够将与IGF1基因2号外显子两侧翼内含子序列同源的SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列引入到动物细胞中，进而，能够通过SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列的同源重组实现对动物细胞中的IGF1基因敲除，从而能够有效地干扰动物生长轴通路，进一步，可以抑制动物的生长，使得动物的体型比野生型动物小。
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：使用前面所述的本发明的构建体转化宿主细胞；以及分离转基因动物细胞。利用该方法，能够有效地制备IGF1基因敲除的转基因动物细胞，从而可以获得用于筛选能够治疗侏儒症的药物的细胞模型，或者进一步利用该转基因动物细胞或其培养物，可以有效地获得体型比野生型动物小的动物。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞或其培养物。根据本发明的实施例，该转基因动物细胞是通过前面所述的本发明的制备转基因动物细胞的方法获得的。由此，该动物细胞或其培养物的IGF1基因被敲除，可以作为细胞模型用于筛选能够治疗侏儒症的药物，另外，利用该转基因动物细胞或其培养物，可以有效地获得体型比野生型动物小的动物。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备非人转基因动物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：提取动物细胞的细胞核；将该细胞核引入该动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞；以及将该融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得该非人转基因动物，其中，该动物细胞为前面所述的本发明的转基因动物细胞。利用该方法，能够有效地获得非人小型化动物，从而该动物可以适合作为宠物，或者作为筛选治疗侏儒症药物等科学研究的动物模型。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明实施例1中获得的IGF1同源长短臂扩增片段电泳图；
图2显示了本发明实施例1中制备的构建体pGT-LA-neo-SA（其同源短臂为IGF1-SA6）的载体结构示意图；
图3显示了本发明实施例1中获得的G418阳性的转基因胎猪成纤维细胞株的初步鉴定结果图；
图4显示了本发明实施例1中，初步鉴定为阳性的108、254和291细胞系的二次短臂扩增鉴定结果图；
图5显示了本发明实施例1中，二次短臂扩增鉴定为阳性的254细胞系的长短臂扩增鉴定结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。术语“第一”、“第二”等仅用于方便描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
通常，动物例如人、猪和小鼠等的生长是由生长轴来调控的。生长轴是动物体内从下丘脑——垂体——靶器官的一系列激素及其受体所组成的神经内分泌系统，由生长激素释放因子（GRF）、生长激素（GH）和胰岛素样生长因子（IGF）构成。下丘脑根据机体需要分泌生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone，GHRH)和生长抑素(somatostatin，SS)，以双重作用于垂体，控制生长激素的分泌；生长激素经血液循环至肝脏，与细胞膜表面的生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)结合，启动细胞内的信号转导机制，促进胰岛素样生长因子(insulin-like growthfactors，IGFs)的表达；IGFs再通过血液循环到达机体的局部组织，促进组织细胞的生长和分化。
本发明的发明人发现，通过IGF1打靶载体的转导，能够有效实现受试动物细胞中的IGF1基因敲除，从而能够抑制IGF1的表达，进而能够有效地干扰动物生长轴通路，以便抑制动物的生长，使得动物的体型比野生型动物小。
由此，本发明提出了下述方案，利用该方案能够有效地获得小型化动物，例如与野生型相比，体型较小的猪。
构建体
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种构建体。根据本发明的实施例，该构建体包含：第一核酸分子和第二核酸分子。其中，该第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，借助该构建体，能够将与IGF1基因2号外显子两侧翼内含子序列同源的SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列引入到动物细胞中，进而，能够通过SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列的同源重组实现对动物细胞中的IGF1基因敲除，从而能够有效地干扰动物生长轴通路，进一步，可以抑制动物的生长，使得动物的体型比野生型动物小，并且该转基因动物的其他生理功能不会受影响，转基因动物的存活率高。从而，获得的小型化动物可以作为研究对象，也可以作为宠物。
根据本发明的一个实施例，第一核酸分子和第二核酸分子作为同源重组的同源臂，其中第一核酸分子的序列长度可以为6-10k，为同源长臂，第二核酸分子的序列长度可以为3-5k，为同源短臂。即与传统的同源臂相比，本发明的构建体中同源臂的片段较大。发明人发现，利用携带上述较长的同源臂的构建体转化动物细胞，能够显著提高打靶效率。根据本发明的一个具体示例，本发明的构建体中，作为同源长臂的第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列：
GTATCATGCAGTGCCCTAACCACCTTCTCCCTCCCCGACTTCTTCTCCTCCTGTGTTCAATCTGTCGCTGACTCTGGATATTGCTTCCCTGCAGTAATGGCCAAGGGCTGTCTCTGCTGCTGTGGAGGCTGCCTTCCAAGAGTTCACTCCCTGATTTAGGCCCGATGCCTCTCCTTACAGGGCCTCCACCTCCCGACATGCTCCCTTCAGACATGCCAGACTGCCCTGGCAGCCGTCACCCCTTCACCTGCCATCCTGACCATGTCACACCCACCCCTGGGAAAGTCTCCAGATGCACCCTGAGCAAAACACAGAGGCCTGAGTGAGGAGACTGACAGGGAGCAGGGCCCCTGGGAACACAGGGCAGGTGCCAAGTTGCAAAGAAAAGAGAAATGATAGACTTTAGAGTGAAACTAAAAATAAAGAGAATGTGTTTTAATACCCCTTTGGCTGATTCATCTTTCTGTGGCACCAGAAAGAGGGGCGTTACCCTCTATTCATGAATGCCTTATGTTTTGCCCACAAGGCCTCTCTTCCCACATCTGAAAGAGTAAGCGGACAATAACAGTGTAAGTATAGGAGATAATGCTGGGGGCATGGCTACAATCTCCACGTTGGTGCCGGACTCAGCTTACAATTTCCGTCACCATCTTTCTCAAAAAATGAGATAACTCAGGTCCACATACGCGATTCCTCAACATCCTTTCTTATTCTTTCTCTTGTTTTGTCTGTTTTCATCTCACTCAGGCGTGGGTCCAAGATGGAGTAGTGATTAAGTGGGCCTGGTGACACTGTATACTTGGTGGCTGCTTTTTTCCAGAATGTGGTTGGCAGGAAAGGGAGCCTTAGTTTTCAGTCATTCCAGAGAGGGAACTAAACTCTAATTCTTAGCCTACCATGAACTCTGTATAATATGAGCTCTTGCTCTAAAGTTCCTCAGTGAGTAAAAAGAATGTCAATAGCTGTCAATAGCAGATGAGAAGAAACAGAGAAGGAAGAGAAAAAAAAGAGGCAAGAAATACATATGCTGGCTGAAAGTGATTCGGAAATCACTTCTGACCATGTATTTTGCCCACACCCCTCCCATGCCTTGCAGCATTGTTTTGAAATAAGTGAATAGAAGAACCAATTATTTGAGCCAGTGGATTACTGGGGAGAAATAAAAGGTAAAAAGAGTTCAAGATAAGCCCATATAACTTGTGTGACTTGCCTGGAGCATCCATTCTCACAGAATGCCTATTCCAGATTAAAACTATTCAGGACAGTCTATACAACATAAGGTTTGGATATTCTTTCAAAGGAGCACATGTTCATTTATTTTAAAAGAGAACAGTCCTCCTTTCCTCCCTTATCTAGAAAGGCCATCTTTTCAACCAACCCTTGAAAAGGATAGGTTTTTAAGAGGAAGAGAGGAGGAGGATACCTGCCCCACTGGTCTTGTTAGCCAACTCACCCCCATAATCATTATAATTATAAGAGCTTACATTTATTTAGAGTTTACTGCATACCAGACATTGTGCAAAACACTGTACATACATCCTCACCTAATCTGCACAACAGTCTTGGGAGATACTCATATCAGGTCCACTTTATGTAAGGATCTGAGTCTTAGGAGACTGGCTGCCTTGCCCCAGGTGAAGAGTGAATATGTAGCAGATCTGAGATCTATCTGACTCCAAAACCTGTACTTTTAGCCACTGTACATCTTGCCTCCTTCGCTGGTATGACAGATGTCACAGGCAGATCATACTCCAATCCTGCAGTATGTTCTAAATATTCGAAACTATACAGCTTGAAAATGGTAGCTAACTTATACAGCAGGCCCGACAGAAATAATTCAAACATAAAAATGACCTCCTGGCATTTGATTATCTTTTACCTTAGACATTGATAAACCAAACCATTCCCTTAGGACAACATTTCTGTCCAGCAAAGCATTTCTCTTGCCAAAGTATAATTTTGTTGGCTACATCTATCTCCTCCAAGCCCTGGAATCAAACCTAAGCTAGTATATTGTGCTGACCCGGCAAGACGCTTGCCCTCCAGGGCATTGTATCAGGCTAAAGTAATACATCACGTTGCTTCCCACTCTGTCTGCCGATTTCTCCAAAGAGCCCTAAAACAGTAATGTTTCTTCTCTGAATCTCTAGTTTTCTTGCCTGTAGGCCTTGTGCTTTAGTTCCCTGGCCTTCGGGACAGAGGCAGATGGAAAAGCACTAGTTTTATACCTGCCCTTGAGCCAGGGCTTCTAAAAGAAAGACGGATTTGAAGAAAAGGGCAGCTCCACCGAGCTCTGCTTCATTCCTTTTAGACCCAGAGATACACAAACACTGACTTGACTGGGTAATGGAAAGACTTTGGTCTTTTGAGCTATGGGGATTTAGTAGCTCAGAAAGAGTTGTCGAGAGGTGGGGGTGGTAGCAGGTCAAATAGGGCCACGATTCCTAGAAAAGATGACCTCGTCCAATTGAGAAGTAGTGGGACCAGCAAACACTGGCAATTAAAATTTAACACAGGCCAAAGTAAAATCAATGCCCAAATTTGATAGGTTTTCAAGAAAAGTTTATGACATGCAGTTCATAGAAAAGAGGACATTTTCTCAGTGTTCATTTTTGCAGATGCCAAAGGCCAACCCTACTTGGAAAAACCTTCAGCAGAAAAGCAGAAATGTGCAGAGTCCACTAGCCACATATAAGGCCAGCAATAGGCATATATTTTGGGGGAAATTATTCAAAAAGAATCCTAATTTCAAACTGTTTCAACAATAGCTTTTGGCACCGATGGTCAGGTAATTAATTCCCCAATACGTGTTTTAGTCTGTATGTGTACATACCCTTCTTATTCTAAATACATAATGATGTGGGTGATCTTACAGTAGTGAAGGCATCTTTCTACACCTTTACTAAGCACATAACTCCATATATATCAGTACTTTTTTAAAAAATTTTTATTTATTTTATAATTACTCATTGAATTTTATAGTTGTATGCTGATCATCACAACCAATTCTATAGCATTTCCATCCCAAGCCCCCAGTGAACCCCCGCCCCCAGCCCCCAACCTGTCTCATTTGGAAAACATGTTTTTCAAAGTCTGTGAGTCAGTATAGGTTCTGCAAAGAAGTTCATCGTATCCTTTTTTTAGATTCCACATGTCAGTTACTTGTTTTAATTCAAGTGTGACTTCGACAGAATTTTTTTTAAGGCAAAATATTGCTTCATCAAATGGCTTTAAGTTAAATGCAAATCCAATAAATTAAGGAAATATCAACCATTCAAGGCACTACATTTGGAGTCTATGCAATCAATATTCCTATCATAACTTTCCTTATGTAAGGAATTCATGAAAGGCGTCCAGTTTTCCACATAAAGGAAAGACCGAGAATTGATTCTCACATTTCCAAAGATGAAATCAGCAGTTAAAATGCTAAAATAGAGACAAATTTAAGGCGACTCACATTTTATCCAACTTTCCTACTAGCATCCCACACAAAATTATGTCAACTGAATGAATTTTTATTAGATAAGGTGGTCCATGGAGCATTGTTGCCTAAGAAACAAATCATTCTGGGTTATTCTAAATTGTCAACATGTCTGGAGGTTTTGGATAGATAGTGTAGGAAACCAAACTGTCTGGCTTCTATAGATATTGACTGATACTTGATAGTGTGATGAATCCTTAATCAAAGATAAATGCAAATTCATTTTTTTGTTAATAATCCAGCTGTATTTTCTATCAGACACATAATCATGACTTTTTAAAAAATATCCCAGGAAATACAACTTGAACTGTCTTCTTTTTCCCTGCTTTCAAAACACAAGCAACTCCAGAACCTCCCTCTGTTAGCAATTTCTAGAGAATAGTTTTATTCCTTGGAACCCAAAGAGTAACAAATGTATGTCTTCAGAACTGGATATTTCTCTATTGGCAAATGCTTGCATTTTTCATTATTTAAATTCTAATTCTTCAAATCCATGTCTTCTCATTCTAACTATAGAGTTAAAATAATCAAGGAATGCTTTCTCAATAAGCAAGAGGGGATGTTTCAAAGGAAATTAAAGTTGAGTACAAAGTCCCAACTGCATTTCCAGAAATCTATAAGAAATACAAGCTTATGCAGCACCAGTGAAAGTAGTACCATTTTAACTGGTGATGAACAACAAGAGCTCTTTGCTCCAGAAGTGATGACCCCAGTTAAATCTCAATATTACACCTTCTCCTTCAGAGACGGAGGAAAGCAAGTTGCTTGCATCCATTGCAGATTGTGAGATTCAGCTAATTGGCATGGTTTTGATGATACCATGATTCTGCCCCAAACTCTTGTAACTAGCAAGTTTGCCCTGAAGATTATTGAATTACTCCACGGACCATGCATTATTTAAAGGGAAGTGCTATTATTATAGAAGCCAGCTGTTTAATCATTGGAATTCTGTCTGTTGGCCAACTTTCAAGATAGAGCAGTGCACTGGGACAGCACTTTATGTCTACTCTCGAGGACTCAAGGCTTAGGTTAGGTGGCAGCCAACTTATCTGCTAAGCTGTCTTTGGTTTACATGATCTGGAACAAACCTACTGAAAAATAAATACGTAAATATATCAATTTCCAATGTCAAGACTTTGTCAGCAAAGAAAATCCTGTGAATTCTCTCTCTCTCTCTCGCTCTTTTTTTTGTAGGGCTGCACCCGAAGCATATGGAGGTTCCCAGGCTAGGGGTCGAATCAGAGCTGCAGCTGCTGGCCTACACCACAGCCACAGCTCAGGATCTGAGCCACGTCTGCAACCTTTACCACAATTACCAGTGCATGGCAATGCCAGATCCTTGACCCACTGAGTGAGGCCAGGGATAGAACCCGAAACCTCTGGATTCTAGTCAGGTTTGTTTCCACTGAGCCACAATGGAAACTCTGAAAATTCTGTGAAATTCTATACATGCTTGATCACTATAACCATTGAGTGAGTATATGGATACTTCACAATGCTAGTATGGCAGAACTCTGGGAGCATACCCAATTTTAGAAAGGACTATCCCGGTCACCTGTCTTCTGTTATAATATTTTGTAAAGAAAAATGTTTTGAGCATCTTGGGGAACTCAAATGATAGAGAGAAAACAAATTTTAACCTTCTAAATTTGGACTTCTTTCTTGAATACAGTGTAAATGACTTCCAATCATACTGAATATTTGGTTGGGAGCTTTCTCCTCCACTTCTTTACTTAGTGCAGAATATTCGGAATAGGAAGACTATAGTAGTTAGACACTGTGCTCAATACAGGACTATGCTCTTAGGATCTCTGACAGGTGTTCATGCAGTCTTTCTTTAACTGCTTCCAGCAATGGGAAGTGCATTACCTTTATAAGCAGTCCCATTTTTAACACATTTGAGTTCAAATTGTTAGACGTATTTTTTCTTGTATATTAATCCAGCATTTATTTCACCTTCCAATTCTGGAGCTCACTGGAGCATAATTACTTAGTGCCTAATGAGGAGTTTTTTTTAAAGGCAAGGATGGAACAATTCATTCCATCTCATTTAAAAATTACTCATAATGACAAGAGTGGCAATTTAGACATCATTAAAATCTTTATTTTCCTCAAAATTGATACTGGAGCAAATAATGTTACTGCTTTCCTAGTAAACCACATTGTATTAGGCTCCTAGTTTTAGCCCACAGCAACAAATATCTTTATTTTGATTCAAGAAAAATAAGAAACACGAGGCATCGAAGATAAAGGGCAAAACTTTGACCCTCAACTCTGGCCTCTCAGTTGGTGAGAAATGATTTTTTAATTAAATATCTTAATGTAGAACCAGAAATCAAGTCTATAAGACACTTCAAAGGATCAATTAAACTTTAAAAGTCAAGATAAACACTTGTTATATTCATGTACTTTCAATGAAGTACAATTAGTCCATTGCAGACATTATAAATAGACAAAGAAAAACATCTCTCTAGGATTGTGGTAGCTACAGATTACTGGTAGTTACATTTATGGCAAAATCCAAGTCTGTAGTATTTCAACAATATTTTTTAAAAAACAGATATAGACATAAGGTAAACTTTCTTTATAGAGCATTACAGAAAAGTCCTAAATTTCTCTGATCCTAAATTCACTGATCTATGAACTTACAAAAGCACAGCTATTTTTTTAGACTGAGTTATATCAAACTCTGAGTGCATCTAAGAGGTGACAAAACAGATGCCTGGTGTGTGATATTATTTTTTGCTAGGTTGATGATTACTTTCTATCTCACAAGAGGAAACAGACCCATGGTGATTTTCATGGCTGTTGACTGTCACCAAGAAGGAAATATGCAATATATACAACGTTTAATACTATTCTGAGATGAATATTACTTTCTTCCTCCAGTAGCAGGCAAGGAGTTCCAGAAACGAGGGGTCTCAGAAGGAAGATTACTTTAGAGATGCTTGAAACGGAAACACTTTAGAGAGGCTGGAACCACAAAGCCTGTATCCTTCTCCATCTTCAACCCATAGGAATGAACTTGGAAATTAGTTGTTTCTAAATTAGCCAAGTTTGAAAGTTTCTGGAACCACTTCCTACCACCTTGCCTCCAAACTTCAAATTACTTATTCTATAGTCAACATATGGATCTCAGTTATGTCCCATTAAGAAACTTATCATTTCAGCAATGTACAATCATTACCTAACAGCGGATGATGGGGACAGTTACCTCAAAGTAGACTCAGTCCCGTTCCCCTCTCTCCCAACCCCAAGAGAAAACCAAAGTGTATCAGCTGGCTGACCTCTTTGACCTCTTGAACTAGCCACTTAGCAAAAAGTATGTAAAAGTCCTTTGTGGATTTGAGAGAACCATGTAAGCCCATTTGTGTCTCTAATTTATAGTTCCAGGAAAAGATTATAAAAACAAAAAAACAAAAAACATTGTTTACATTGCCCAAGGGACCAGATGAGTCCTGGCTTGCCAGGGCCTGGCTGACGGAGAAGAAACAGTCTTCTGCACTAATTGATCCTCCGACAGCAAGTGAAAGTACTGCTGAGGCTCCAACTGGGGCCAGCTGCCTGGTCCCTTCCAAACCCCTCAACCATGAGGCACCCACGGGGTTTGCTCTGAGCAAAAGCAATGCACCCCAGCCAAAGAGACCACACTTGAACCTTTCCTAAGTTTCTACCCCCAGCTGCCCTAAGAATGACAATAAACCTGCCTTACAGGGAGGAAGCATCCCCAGATCCCTGTGCCAAGCATCAGGAAAACATTTGGATTCCTAGAGGATGCCATGAATGTCTGGCCCCTTGATCCAAGAGGCAGCCAAACTAGTTTGGTTGCAGGCCATGACTGTGGGTCTCAACCAGGGAGCTCAAAGTATACACAGGGATTTTGACTTTCAAAACTCCATCCTGAAGTATATTGTCCTTATTACGCAAATGTTAAGATTTTTTATTTAAAATATAATGCTATCTTCTGTATCAGGAATTAAGACTGAATATATGTCACATTGGTTAACTGGATCCTTCTGGGCCAATGGTTCACAAATTTTCTTCCATGAAGCCTAGACAGCAGTGGAGAAAATTCAGGCCTTCCACCTACCTCCCAAGGGAGGAAAGGGAGACAGAGGAAGTCGAGATCTCATCCCCTGCCCTTTCCAGGCCCAGAGCAGTCTCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCTTTATGTATTGGTATATAAGCAAGATTTGGTCTAACAAAAGCTCTGTTATGACAAAAAGTTTACCAAGAATTCAGGTACATTTTAAGTTCCATGTAAACTTGTTGTGTCCCCTTTTAATTCTAGAGCCAGAAAAAGTATGTCCAAATCAAAACAAGACAAAATAGAATCAAACTAAAACCTACTTGCCAAGTAAAGAGGTCTGATTTGCAAATATCAGAAGAAATTTGACCCATGGTGTTTTCTCTGGGCAATGAAAATCAAATAGAAAGATGGACATTTAGTTCATTCTGTCTCAGTCTAGTGGTTATTCCCTGAGAAAACAGAACTGAACGGCTCTGGTCACTTTAGCG（SEQ ID NO：1），
作为同源短臂的第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列：
GAAAATGGAGGAGAGAAGGACTAAGACAGAGGCAAGGAGGATGAGAGAGAAGCAGACAGCGAGAAAGAAAAGTGGGATATGCTATAGAGGAAATGAAGAAAAGTAGGCCCGCTGGGGCTAGAGAATGCTTGTGACAAAAAGAGGAAAAGTAACCTGTTGTAGGAGGTGGCTAATGAACATGCAGAAATGGAAAAGAAAACTGTAATGCCCAAGAAAGTCCAAAGAAAGACAGTGGCAAGAATGAAAAAAGAACAAAATTATGAAAGAGGCAAATAAAACAATATCCCCCCCAACACAAAAACACAAAAACAAGTGAAAAAAATTAAAATAAAAATCAAGGCTTTTATATGCATTTTAAAATTTTGTGTGAATTGTAGAAGAATTCCCTGTCAATGCACATCCAAAGTTAATTAGCCCCAAATTCTCAGCAAGACTGAACCGTGTCATAAAATCCCCCAGATTTCCTTTCCTGCAGTGTCACTGGAGACTGCATTTCCTAGTCAAGTTCAGGCCAAAGGGCACCCAGTATTTGCTTAAAGGCCTGTGAGGCCTGAGAGCTTACCTACAAGGGGAGGTCACTGAACCTTTTTAGGGTTTTCTGCATTTTGGAATCAGATATAAAATATATATTAGTGTGCTAGGGCTGCCATAATAAAGTACCACAGACTAGGTGGCTTACACAACAGAAATTTATTTATTTTCACACATTTCTGGGGGATGGAAGTCCAAGATCAAGGTTTGGCAGGGTCCGTTCCTTCTGGGAGCTCTGAGGGAAGTACCTGTTTCAGTCCGTCTCCTTGACTTGTGCCCAAATTCCCTCTTCTTATAGGACACTTGTCATATTAGATTAGGACCCATCATAACGACCTTATTTTCACCAAAATATCTGTATATAGACCCTATTGTCTAATAAATAGTCATACTTTTAGGTACCAAGGTTTAGGACTTCAACATAAACTGGGGGTGGGGGTAGGGTGCAAATTAAGCTCAAAACCAAAGACTTCTGATGTCTGACTACTGCCTTGTGATTTTATCACCTATAAATCACCCTCTCTCTCTGTGTCTGTCTGTCTGTCTGCCTGTCTCACACACAAACACTCCCCTAGATTTTTAGCTCTGAAATCCTATGAGTTTCTATTCTATGGAAATACCAGGGCCTTGTTGTATTAGAGTTGTAAGAGTACTCAAATCATTTGCTTCAATCCCTTCATTTTAAAGATAACAGTGAGATCCAGGAATGGGTAAAGATGGTTTGGGTTCTAAGCCACCCTCCTTCTGGCCTGCAAAGAAGAGCATATAATCAACATGGACTAAGAAAGAAGGAAAAGATGGGGCAGAAATGGCCACATGAAGTCTCCCACTAATTTAATATTTTTTCACCAGAAGGCAGAGAGTAAATGAGAGCAAAGTCACTGAATTTCCCCAACGGCAAAGAAAAGATAAGTTGAATCACAGATTTGAGTCTTAGAGATTTTCTCCTTCAGCTTCCTTGATTTAAATGGTAGGGTTAGAGTCTTCACAATGAAAAAGGGAAAAAAACATCAGGATCATTCAAATTGTGAATTATAAGGGATGAGAGAGGGTGCAAGAGAGGAGAGCTCAGCCAAGCAAATAATGACACTTGGCATAAGAAGATGGCTAACCCAAGAAGTGAAACGTTTCATCCAAGTAGCTACTTTGAAGAAGTCATGGTATAGAGGAACATACTTTCTATCTGGTCTTTCATGCCCCAGTCATGCTTTCTACTTCAGGATCATCCTTCCTCCTTGGTTCACTGAAATCCCAGAATATATAATACATGAATATCCCCAAAGCTCAAGCCAGGTGGAAAAGGTCCAGTTACAAGTATGTGAATATGCCAAGTGGGAGCCAACGCACTGCTGCTGTGGTTACAAAGTGGCTGCAAAGAGTGTTCGATTTTCAGAACAGACAAAAGCAAGGCTGCTGCCTGAACCCATCTGGCCAGCCACCTTATTTGGAGATGCTCAGCTCTCCTGATGATACATCCATACTTTGGGACCTTCCTCAGGCATAAGCCAATATGTATTGTATCTACCATCTGAGAGTAATCTGCAAACAGAGATGGCTTTTCAAGGGACCACAGTTTGGCAGAAGAAGTAACAGTGTGTATCCTATGGAAATATTTCTTAGAGGATTATCTCTTACCTTTTTCATTCATGACTGATTCGATGTCAGTTATAACACAGAGCTTTGGATAAATTACAGTTATACCCAATGATGAACTTCCTTCAGGAAAAAAGGCAAAGACTTTAAAAAAAACTTACTTCCTTTTGCAATGGGCTTATCAACTCTGAAGAAATCATCTTGAATGCCTACATCTGATTTCTGAATAATATGAGTTAAGTAAACAGGAAGACTCTATTATTGTCTTTATATCGCCTCCTGTCTAGTATCAATACTAAGCACCTAGTAATATTTGGCATATAATGATGGATTAGAGGATGGATGGGCAACTTAATGATATAGGGAGGGAATAGTGGTAGAGAAATAGACCATAAACATAAGTACCACTGCTGAGATGAAATGATTCCTCTTGTTCTTGCCTAAGACAGTGAGGTAACTGCAAAGTGAAAAAGTGAAGGCACAGGAGCTATGCTTGTATGAGCCTTGCATGTTTGGAATTTCCTGTTCTAGCCAAAAGTGAAATTATTCAAGATCTACTACTAAAGGTGGCACCCGGCTGAGTACTTTATAGTGAATATTATGTACCTATGTGTACCCTCAATTCTTTCTTGAAGAAGGCAGAATATTAATCATCACTTAAAATTCCACTTTTTCAAGTCTTTCTTTTAGGGAGAATTGATGATTGTGGGTAAAACTAACAGGAATATGTAAAGTGTTGAAAACCTTTTTTTTAATTGAGCACCTATAATGTGCAAATCACTATACGAGGCATGAAGGAGAACTATAAAGACTGGAGAGGCAATAAAACACAGTGGTTAAGAGTACATAATCTAGAGTCAGACTACCTGGGTTCAAATCCTGGCTATCTCACTTAACAACTGAATGGCCTTGGTGAAATCATGTAATTCACCTGTGCCTCAGTTTCCTCATCTGTCAAATGAAGTAATAATTTAATATACCTAATAGAATTGTGAAGATTCATTGAGGTTATGTGTGGGTGCATACATATATATATATATATTTTAGTGTTTAAAATTGTGCCTGCATGAAAAAAAATGCTCAACATCATTGATAATTAGAGAAATGCAAATCAAAACTACAATGAGGTACCACCTCACATCAGTCAGAATGGCTATCATTAAAAAGTTTACAAGCAATAAATTCTGGAGAGGGTGTGGAGAAAAGGAAACCCTCCTACAAAATTGGTGGGAGGGTAAATTGGCACAACCATTATGGAAAATAGTATGGAGGTTCCTCAGAAAATTTAAGATAGAGTTACCATGTGATCCAGCAATCCCATTCCTGTGCATACATCCAGGAAAAAAAAACAAACTATAATTCAAAAAAGACATGCACCCCTATGTTCATAGAACAACTATGAACAATAGCCAAGATATGGAAGCAACCTAAATGTCCATCAACAGATGAATGGATAAAGAAGACGTGGTAAATATACACAATAGAATACTACTCAGCCATAAAAAAGAATGAATTTCACAGCAATGTGGATGCAATAGAGATTTTCATACTAAGTGAAGTAAGTCAGAAAGAGAAAGACAAATATCATATAATATCATTTACATGTGGAATCTAAAATATGACACAAATTAACCTATCTTTGAAACAGAAACAGACTCGCAGACATAAAGAAC（SEQ ID NO：2）。
由此，利用该构建体能够高效地转化制备IGF1基因敲除的动物细胞。
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，使目的核酸序列整合到宿主细胞的基因组上，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒（Cosmid）、病毒的至少一种。根据本发明的具体示例，构建体呈质粒的形式。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
根据本发明的实施例，构建体中还可以包含其他的元件，从而为构建体赋予额外的有益效果。根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包含启动子序列。在本发明中所使用的术语“启动子”指的是这样一种核酸序列，其能够指导与其可操纵地连接的核酸分子的转录。在本发明中所使用的术语“可操纵地”指的是核酸表达控制序列例如启动子、信号序列、增强子等与目标核酸序列之间的功能连接，其中当合适的分子例如转录活化分子与表达控制序列结合时，表达控制序列影响着对应于目标核酸序列的核酸的转录和/或翻译。由此，可以直接通过构建体在动物细胞中引入特定的启动子，并且该启动子可以用于启动第一核酸分子和/或第二核酸分子的转录和表达，由此，可以提高所获得的重组细胞中第一核酸分子和第二核酸分子的表达效率。
根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括第三核酸分子，该第三核酸分子为筛选标记基因。在本发明中所使用的术语“筛选标记基因”指的是这样的一种基因，其编码的产物能够赋予连同载体接受该基因的细胞一种特殊的性质，该特殊的性质使得接受该基因的细胞与未接受该基因的细胞很容易被区分开。由此，便于筛选接受构建体的动物细胞。根据本发明的实施例，筛选标记基因的类型不受特别限制，根据本发明的一些具体示例，所述筛选标记基因为药物抗性基因。由此，容易地通过接受外源构建体的重组细胞的抗药性来进行筛选，例如在培养基中添加杀菌剂，则相应连同载体接受并表达杀菌剂抗性基因的细胞将在培养基上能够存活下来。根据本发明的具体示例，该筛选标记基因可以为选自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和嘌呤霉素抗性基因的至少一种，优选新霉素抗性基因。由此，能够进一步提高筛选接受外源构建体的重组细胞的效率。
根据本发明的一个实施例，构建体可以进一步包括编码报告蛋白的序列。在本发明中所使用的术语“报告蛋白”是指这样的一种蛋白质，其在表达后，能够产生可以直接或者间接检测的信号，进而能够反映构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。根据本发明的实施例，报告蛋白的种类并不受特别限制，只要其具有可检测的活性即可。根据本发明的实施例，报告蛋白可以是一种能够产生光学信号的蛋白质例如发光蛋白或者荧光蛋白例如绿色荧光蛋白等。由此，可以根据常规的方法，对所述报告蛋白进行监测。例如可以采用：比色法、荧光法、生物发光法、化学发光法、酶联免疫法(ELISA)及原位染色法对报告蛋白进行检测。从而，通过上述方法，就能够便捷高效地确定构建体所携带的外源核酸序列是否已经在细胞中被成功表达。
上面对根据本发明实施例的构建体进行了描述。当然，本领域技术人员能够理解的，构建体还可以包含其他常规的元件以促进构建体被转入宿主细胞中并且整合到宿主细胞的基因组上，正常发挥功能，例如复制起点、多克隆位点等。在此对这些元件不再赘述。
转基因细胞、动物及其制备方法
根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种制备转基因动物细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：使用前面所述的本发明的构建体转化宿主细胞；以及分离转基因动物细胞。利用该方法，能够有效地制备IGF1基因敲除的转基因动物细胞，从而可以获得用于筛选治疗侏儒症药物等科学研究的细胞模型，或者进一步利用该转基因动物细胞或其培养物，可以有效地获得体型比野生型动物小的动物。
根据本发明的实施例，本发明的制备转基因动物细胞的方法，所适用的动物并不受特别限制，即宿主细胞的来源不受特别限制。根据本发明的一些实施例，该宿主细胞可以来源于哺乳动物，优选猪，更优选巴马猪。
根据本发明的实施例，使用本发明的构建体转化宿主细胞的方法不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，可以通过脂质体法进行所述转化。根据本发明的一些示例，可以通过核转仪进行所述转化。由此，可以提高将构建体引入宿主细胞中的效率，并且可以方便地筛选目的核酸序列与宿主细胞的染色体成功地发生整合的转基因细胞，进一步能够提高制备转基因动物细胞的效率。需要说明的是，在本文中所使用的术语“转化”与“转染”是可以互换使用的，均是指将外源核酸序列引入宿主细胞中的操作。
根据本发明的一个实施例，在使用本发明的构建体转化宿主细胞之后，分离转基因动物细胞之前，可以进一步包括：利用本发明的构建体对经过转化的细胞进行转化。由此，宿主细胞中基因敲除效果更好，可以获得IGF1双等位基因均被敲除的转基因动物细胞。
在分离转基因动物细胞后，可以通过PCR和southern blot方法验证转基因动物细胞的基因组中是否含有目的核酸序列。当然也可以通过分析目的核酸序列表达蛋白的酶活性来验证。但从效率角度来考虑，优选通过PCR方法验证，因而，根据本发明的实施例，还可以进一步包括通过PCR方法验证转基因动物细胞的基因组中是否含有所述目的核酸序列的步骤。
此外，在将上述制备转基因动物细胞的方法应用于动物例如猪的体细胞时，所得到的转基因细胞，可以通过手工克隆的方法应用于制备转基因动物。由此，能够有效地获得体型比野生型小的转基因动物。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种转基因动物细胞或其培养物。根据本发明的实施例，该转基因动物细胞是通过前面所述的本发明的制备转基因动物细胞的方法获得的。由此，该动物细胞或其培养物的IGF1基因被敲除，可以作为细胞模型用于筛选治疗侏儒症药物等科学研究，另外，利用该转基因动物细胞或其培养物，可以有效地获得体型比野生型动物小的动物。这里所使用的术语“培养物”指的是，将转基因动物细胞在适于生长的条件下进行培养，所得到的细胞衍生物，这些细胞衍生物具有与原始的转基因动物细胞相同的基因组。
根据本发明的实施例，本发明的转基因动物细胞可以来源于哺乳动物，优选猪，更优选巴马猪。
根据本发明的再一方面，本发明还提供了一种制备非人转基因动物的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：
首先，提取动物细胞的细胞核。本领域技术人员可以理解，能够采用任何已知的方法提取单细胞的细胞核，例如通过显微操作人工提取。根据本发明的实施例，所采用的动物细胞为前面所得到的本发明的转基因动物细胞，即所述动物细胞的IGF1基因被敲除。由此，可以有效地获得体型比野生型动物小的动物，并且不会影响转基因动物的其他生理功能，进而提高转基因动物的存活率。
接下来，将上述提取获得的细胞核引入动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞。根据本发明的实施例，无核卵母细胞的来源并不受特别限制。根据本发明的一个实施例，该无核卵母细胞是通过手工克隆方法去除卵子中的遗传物质而获得的。由此，可以提高获得无核卵母细胞的效率，并且能够提高接受外源细胞核的效率。
最后，将上述融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得非人转基因动物。本领域技术人员可以理解，能够采用常规的方法，从卵母细胞获得动物个体，例如首先将卵母细胞培养获得囊胚，进一步将囊胚植入母体中进行发育，获得动物个体。因而，这里所使用的术语“培养”应作广义理解，其涵盖了从卵母细胞获得动物个体过程中所经历的各种为细胞/细胞集合体提供能量的操作。在本文中所使用的术语“适宜的条件”指的是任何能够实现“培养”的各种操作的条件。利用该方法，能够有效地获得小型化动物，从而该动物可以适合作为宠物，或者作为筛选治疗侏儒症药物等科学研究的动物模型。
需要说明的是，在本发明的制备非人转基因动物的方法中，所采用的动物细胞为前面所得到的转基因动物细胞，其可以来源于哺乳动物，优选猪，因而，通过该方法制备获得的非人转基因动物可以为哺乳动物，优选猪，更优选巴马猪。
需要说明的是，本发明的构建体及其用途，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化的工作才完成的。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
实施例1
本实施例，根据本发明的制备转基因动物细胞的方法，按照以下步骤，制备IGF1基因敲除的转基因猪细胞：
1、培养原代巴马胎猪成纤维细胞
1）取妊娠33天的巴马猪，处死后取含胎儿的子宫，包扎，2小时内运往实验室。
2）于超净工作台上取出母猪子宫内的胎儿(不要破坏羊膜)置于含有200IU/mL青霉素和200μg/mL链霉素（10x双抗）的PBS液中，漂洗2-3遍。
3）然后，用灭菌眼科剪剪破羊膜使胎儿(体长5～6cm)流出，放入含100U/mL青霉素和100μg／mL链霉素(1x双抗)的PBS液中。用眼科剪剪去胎儿头、内脏、四肢，先后用含10x双抗和1x双抗的PBS液将剩余组织漂洗2～3遍，再用无Ca2＋、Mg2＋的PBS溶液冲洗多遍，放入无菌玻璃平皿中待用。
4）在直径60mm的玻璃平皿中用眼科剪将该剩余组织剪碎成1mm3大小的组织块，将组织块移入组织培养瓶的底壁上，用吸管将组织块均匀地铺开，轻轻翻转培养瓶使有组织块的一面在上，加入5mL细胞培养液，放入37℃、5％CO2、100％湿度恒温培养箱中培养。
5）培养瓶放入培养箱中6～8h后（待组织块完全贴于瓶底），再慢慢翻转培养瓶让组织块浸没于含10％FBS（胎牛血清）的DMEM培养液中，置于培养箱中培养。每隔2～3d换一次培养液，观察时注意轻拿轻放，防止组织块上浮漂动。
2、制备打靶载体（即本发明的构建体）
1）连接抗性标记
首先，以实验室保存的pGT载体为骨架载体，将作为抗性标记的Neo基因（即新霉素抗性标记基因）连接至pGT载体，具体步骤为：
设计多克隆位点（MCS）引物。该MCS包括AscI,NheI,MluI,PacI,EcoRV,ClaI,BstBI,Sal,XbaI酶切位点，MCS引物具体序列信息如下：
pGT-MCS-1：
CGCGCCGCTAGCACGCGTTAATTAAGATATCATCGATTCGAAGTCGACT（SEQ IDNO：3）；
pGT-MCS-2：
CTAGAGTCGACTTCGAATCGATGATATCTTAATTAACGCGTGCTAGCGG（SEQ IDNO：4）。
利用上述MCS引物，94℃变性10min，室温退化1h，获得MCS。接着，用AscI和XbaI双酶切pGT载体，回收后，连接MCS，获得pGT-MCS质粒。然后，用PacI和ClaI双酶切pGT-MCS质粒和14-2质粒（本实验室保存），并经琼脂糖凝胶电泳后，分别回收2912bp的neo表达盒和11807bp的pGT-MCS，用T4连接酶连接目的片段和载体片段，获得载体pGT-neo质粒。
2）扩增、连接同源臂
根据NCBI上已知的猪的IGF1基因组序列，用primer5设计同源重组长短臂引物，其中长臂（long arm，以下简称LA）设在IGF1的2号外显子上游，短臂（short arm，以下简称SA）设在2号外显子下游，长短臂之间的距离为3000bp。然后以巴马猪基因组为模板，用IGF1-LA-F3M和IGF1-LA-R3M引物扩增8026bp的LA3长臂，用IGF1-SA-F6M和IGF1-SA-R6M引物扩增获得3797bp的SA6（短臂）片段。其中，图1显示了IGF1同源长短臂扩增片段的电泳图。如图1所示，LA3为同源长臂，IGF1-SA2和IGF1-SA6为同源短臂。
其中，上述各引物序列如下：
IGF1-LA-F3M：GGCGCGCCGTATCATGCAGTGCCCTAACCACC（SEQ ID NO：5）；
IGF1-LA-R3M：CGACGCGTCGCTAAAGTGACCAGAGCCGTTCAG（SEQ ID NO：6）；
IGF1-SA-F6M：CCATCGATGAAAATGGAGGAGAGAAGGACTAAG（SEQ ID NO：7）；
IGF1-SA-R6M：GCGTCGACTGTTCTTTATGTCTGCGAGTCT（SEQ ID NO：8）。
扩增长短臂的PCR反应体系均为：
| 组分 | 质量/体积 |
| DNA | 50ng |
| dNTP | 1.6μl |
| FP（上游引物） | 0.4μl |
| RP（下游引物） | 0.4μl |
| 5x phusion缓冲液 | 4μl |
| phusion | 0.1μl |
| 补H2O至总体积 | 20μl |
PCR反应条件为：
由此，获得同源重组的长短臂。
然后，将上述长短臂扩增片段分别连接到pEASY-Blunt载体（商业载体，购买于transgen公司）。接着，用ClaI和SalI双酶切上述获得的载体pGT-neo质粒，以及pEASY-SA6质粒，回收7453bp和3797bp，用T4DNA连接酶连接目的片段和载体片段，得到pGT-neo-SA6重组质粒。再用AscI/MluI酶切pGT-neo-SA6和pEASY-LA3，回收11252bp和8026bp片段。用T4DNA连接酶连接目的片段和载体片段，得到pGT-LA-neo-SA打靶载体，即本发明的构建体。
3、利用pGT-LA-neo-SA打靶载体敲除巴马猪IGF1基因
将上述构建获得的载体pGT-LA-Neo-SA经SalI线性化后，通过核转仪将其转入通过上述方法培养获得的第三代胎猪成纤维细胞系。具体地：将1×105细胞与4μg线性化的pGT-LA-Neo-SA载体混合，转移到核转杯，选择核转仪的U-23程序完成核转染。
核转24h后，将各经过转化的细胞分到10个96孔板中；核转48h后，向各孔均添加500μg/ml的G418进行筛选。一周后，出现阳性克隆，将该阳性克隆传代到48孔板，并换成200μg/ml的G418继续筛选。扩大培养到24孔板并一传二，一部分提DNA进行细胞鉴定，一部分进行冻存。
其中细胞鉴定依次分为初步扩增鉴定、初步鉴定为阳性的克隆进行二次短臂扩增鉴定，以及二次短臂扩增鉴定为阳性进行克隆的长短臂扩增鉴定。其中，初步扩增鉴定采用一对短臂PCR鉴定引物（即pGT-SA-L4/R4）进行；二次短臂扩增鉴定采用两对短臂PCR鉴定引物（即pGT-SA-L4/R4、pGT-SA-L5/R5）进行；长短臂扩增鉴定采用4对长臂PCR鉴定引物（即pGT-LA-L4/R4、pGT-SA-L5/R5、pGT-SA-L6/R6、pGT-SA-L7/R7）和上述两对短臂PCR鉴定引物进行。其中，上述各短臂PCR鉴定引物为：
pGT-SA-L4:GGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGT（SEQ ID NO：9）；
pGT-SA-R4:TCTGGAAGTTTAGAGGCCGCTGAA（SEQ ID NO：10）；
pGT-SA-L5:GAACAAGATGGATTGCACGCAGGT（SEQ ID NO：11）；
pGT-SA-R5:CGGCAGTAATAGAGGAAGTTAAA（SEQ ID NO：12）。
各长臂PCR鉴定引物为：
pGT-LA-L4:GTCCTCTGGGCAGATGTTAGGT（SEQ ID NO：13）；
pGT-LA-R4:CCATATTGGCTGCAGGTCGAAA（SEQ ID NO：14）；
pGT-LA-L5:ATTAATGGGCTCGATGATTGTT（SEQ ID NO：15）；
pGT-LA-R5:GGGTTCCGGATCCACTAGTTCT（SEQ ID NO：16）；
pGT-LA-L6:AGCCCTTAAAGTTTCTTAGTCA（SEQ ID NO：17）；
pGT-LA-R6:GAAGAGTTTGTCCTCAACCG（SEQ ID NO：18）；
pGT-LA-L7:AAAGAAAGGATGTTCGGATGAG（SEQ ID NO：19）；
pGT-LA-R7:CATTTGTCACGTCCTGCACGAC（SEQ ID NO：20）。各PCR鉴定的反应体系为：
| 组分 | 质量/体积 |
| DNA | 20-50 ng |
| dNTP | 1.6 μl |
| FP（上游引物） | 0.3 μl |
| RP（下游引物） | 0.3 μl |
| 5x phusion缓冲液 | 3 μl |
| phusion | 0.1 μl |
| 补H2O至总体积 | 15 μl |
各PCR鉴定的反应条件为：98℃30s；35×（98℃/10s，66℃/15s，72℃/5min）；72℃10min，16℃2min。
图3-图5显示了本实施例的细胞鉴定结果。其中，图3显示了G418阳性的转基因胎猪成纤维细胞的初步鉴定结果图。由图3可知，本实施例筛选获得3个阳性克隆，分别为108、254和291细胞系。图4显示了初步鉴定为阳性的108、254和291细胞系的二次短臂扩增鉴定结果图，该图表明，254为确认的阳性细胞系。图5显示了二次短臂扩增鉴定为阳性的254细胞系的长短臂扩增鉴定结果图。如图5所示，其中，1表示pGT-LA-L4/R4扩增长臂的条带，2表示pGT-LA-L5/R5扩增长臂的条带，3表示pGT-LA-L6/R6扩增长臂的条带，4表示pGT-LA-L7/R7扩增长臂的条带，5表示pGT-SA-L4/R4扩增短臂的条带，6表示pGT-SA-L5/R5扩增短臂的条带，该图再次证明了254为确定的阳性细胞系。
此外，经各PCR扩增鉴定后，均切胶回收短臂鉴定的扩增片段，进行测序并与IGF1基因组序列及载体序列进行比对分析，结果表明，254细胞系为阳性细胞系，同源重组打靶成功。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
Claims (9)
1.一种构建体，其特征在于，包含：
第一核酸分子，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；以及
第二核酸分子，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1的构建体，所述构建体进一步包括第三核酸分子，所述第三核酸分子为筛选标记基因，优选地所述筛选标记基因为药物抗性基因，更优选地所述药物抗性基因为新霉素抗性基因。
3.根据权利要求1所的构建体，所述构建体呈选自质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒以及病毒的至少一种的形式。
4.一种制备转基因动物细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
使用权利要求1-3任一项所述的构建体转化宿主细胞；以及
分离转基因动物细胞，
任选地，所述宿主细胞来源于哺乳动物，优选猪，更优选巴马猪。
5.一种转基因动物细胞或其培养物，其中所述转基因动物细胞是通过权利要求4所述的方法获得的，
任选地，所述转基因动物细胞来源于哺乳动物，更优选巴马猪。
6.一种制备非人转基因动物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
提取动物细胞的细胞核；
将所述细胞核引入所述动物的无核卵母细胞中，以便获得融合卵母细胞；以及
将所述融合卵母细胞在适宜的条件下进行培养，以便获得所述非人转基因动物，
其中，
所述动物细胞为权利要求5所述的转基因动物细胞。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述无核卵母细胞是通过手工克隆方法去除卵子中的遗传物质而获得的。
8.一种非人转基因动物或其后代，其中所述非人转基因动物是根据权利要求6或7所述的方法获得的。
9.根据权利要求8所述的非人转基因动物或其后代，所述转基因动物为哺乳动物，优选猪，更优选巴马猪。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310163086.5A CN103255168B (zh) | 2013-05-06 | 2013-05-06 | 构建体及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310163086.5A CN103255168B (zh) | 2013-05-06 | 2013-05-06 | 构建体及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103255168A true CN103255168A (zh) | 2013-08-21 |
| CN103255168B CN103255168B (zh) | 2015-07-01 |
Family
ID=48959378
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310163086.5A Active CN103255168B (zh) | 2013-05-06 | 2013-05-06 | 构建体及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103255168B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106318965A (zh) * | 2015-06-26 | 2017-01-11 | 深圳华大基因研究院 | 人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物 |
| CN113278625A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-08-20 | 新疆农垦科学院 | 用于培育特异igf1转基因绵羊的基因序列及其鉴定引物和鉴定方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR3056991B1 (fr) * | 2016-10-03 | 2020-11-27 | C A L Laboratoire De Biologie Veterinaire | Methode et kit de detection, de discrimination et identification d'especes de borrelies presentes dans un echantillon d'origine humaine ou animale |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031629A1 (en) * | 2001-10-09 | 2003-04-17 | Copyrat Pty Ltd | Methods of preparing a targeting vector and uses thereof |
| CN1970749A (zh) * | 2005-11-25 | 2007-05-30 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法 |
| CN101955961A (zh) * | 2009-07-03 | 2011-01-26 | 北京济福霖生物技术有限公司 | 一种基因敲除打靶载体及其应用 |
-
2013
- 2013-05-06 CN CN201310163086.5A patent/CN103255168B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003031629A1 (en) * | 2001-10-09 | 2003-04-17 | Copyrat Pty Ltd | Methods of preparing a targeting vector and uses thereof |
| CN1970749A (zh) * | 2005-11-25 | 2007-05-30 | 上海杰隆生物工程股份有限公司 | 一种制备朊蛋白基因敲除家畜的方法 |
| CN101955961A (zh) * | 2009-07-03 | 2011-01-26 | 北京济福霖生物技术有限公司 | 一种基因敲除打靶载体及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| LIU JP.等: "Mice carring mull mutations of the gene encoding IGF-I and type-II IGF recptor.", 《CELL》, vol. 75, no. 1, 31 December 1993 (1993-12-31), pages 1 * |
| SHULMAN M.J.等: "Homologous recombination in hybridomacells: dependence on time and fragment length.", 《MOL CELL BIOL》, 31 December 1992 (1992-12-31), pages 2919 - 2923 * |
| 吴岚晓: "人胰岛素样生长因子1基因的克隆、表达及产物纯化与检定", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》, 15 June 2002 (2002-06-15), pages 059 - 97 * |
| 贲晓明等: "IGF轴与胎儿生长调节", 《中国当代儿科杂志》, vol. 2, no. 3, 30 June 2000 (2000-06-30), pages 237 - 240 * |
| 黄敏: "基因敲除技术及其应用", 《广东轻工职业技术学院学报》, vol. 8, no. 4, 31 December 2009 (2009-12-31), pages 11 - 14 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106318965A (zh) * | 2015-06-26 | 2017-01-11 | 深圳华大基因研究院 | 人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物 |
| CN106318965B (zh) * | 2015-06-26 | 2019-05-07 | 深圳华大生命科学研究院 | 人工半合成染色体的整合方法及含有完整合成染色体的微生物 |
| CN113278625A (zh) * | 2021-03-12 | 2021-08-20 | 新疆农垦科学院 | 用于培育特异igf1转基因绵羊的基因序列及其鉴定引物和鉴定方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103255168B (zh) | 2015-07-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wagner et al. | Tsg101 is essential for cell growth, proliferation, and cell survival of embryonic and adult tissues | |
| Yamaji et al. | Development of mammary luminal progenitor cells is controlled by the transcription factor STAT5A | |
| Mélet et al. | Generation of a novel Fli-1 protein by gene targeting leads to a defect in thymus development and a delay in Friend virus-induced erythroleukemia | |
| KR20200097760A (ko) | 유전자 편집을 위한 cpf1-관련 방법 및 조성물 | |
| Van Roeyen et al. | Induction of progressive glomerulonephritis by podocyte-specific overexpression of platelet-derived growth factor-D | |
| US20200045945A1 (en) | Swine Comprising Modified CD163 and Associated Methods | |
| CN109943564B (zh) | Amh基因定点敲入2A-Cre的杂合子小鼠模型构建方法及其应用 | |
| CN112057611B (zh) | 非洲猪瘟病毒e120r蛋白作为免疫抑制剂的应用及免疫抑制位点敲除毒株的构建 | |
| CN101760473B (zh) | 一种定点删除转基因细胞中的外源基因的方法 | |
| Carvalho et al. | Production of transgenic cattle by somatic cell nuclear transfer (SCNT) with the human granulocyte colony-stimulation factor (hG-CSF) | |
| Li et al. | HMEJ-mediated site-specific integration of a myostatin inhibitor increases skeletal muscle mass in porcine | |
| CN103255168A (zh) | 构建体及其应用 | |
| JP2019507610A (ja) | ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓゲノム編集に基づく、Ｆｅｌ ｄ１ノックアウト並びに関連組成物及び方法 | |
| JP5075641B2 (ja) | 遺伝子改変動物およびその用途 | |
| Li et al. | Ectopic expression of FGF5s induces wool growth in Chinese merino sheep | |
| CN107988257B (zh) | 基于供体细胞dna甲基化水平的修饰提高山羊克隆效率的载体、细胞及方法 | |
| CN102747102A (zh) | 一种hsa乳腺特异性表达载体及其构建的重组细胞 | |
| CN103484497A (zh) | 利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法 | |
| CN114107176A (zh) | 一种稳定表达非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞系及其构建方法和应用 | |
| Liu et al. | In vivo exon replacement in the mouse Atp7b gene by the Cas9 system | |
| CN102807993A (zh) | 一种骨骼肌特异性的靶向Myostatin基因的miRNA表达载体及重组细胞 | |
| CN101519664B (zh) | 一种重组腺病毒载体制备转基因动物的方法 | |
| CN102558343A (zh) | 突变型生长激素受体及其应用 | |
| CN103145824B (zh) | 一种突变型隐色素基因1和突变型隐色素基因1的转基因猪 | |
| CN102660552B (zh) | 一种牛白细胞介素32γ亚型的分子克隆/稳转细胞系的建立及其方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 518083 Yantian District, Yantian District, Shenzhen, Guangdong. Patentee after: BGI SHENZHEN Address before: 518083 comprehensive building, Beishan Industrial Zone, Yantian District, Shenzhen, Guangdong Patentee before: BGI SHENZHEN |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Polynucleotide constructs and uses thereof Effective date of registration: 20180917 Granted publication date: 20150701 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shenzhen branch Pledgor: BGI SHENZHEN Registration number: 2018440020059 |
|
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20200410 Granted publication date: 20150701 Pledgee: China Minsheng Banking Corp Shenzhen branch Pledgor: BGI SHENZHEN Registration number: 2018440020059 |
|
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20211223 Address after: 518083 8th floor, building 11, Beishan Industrial Zone, 146 Beishan Road, Yangang community, Yantian street, Yantian District, Shenzhen, Guangdong Patentee after: BGI SHENZHEN Co.,Ltd. Address before: 518083 Yantian District, Yantian District, Shenzhen, Guangdong. Patentee before: BGI SHENZHEN |
|
| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20230605 Address after: No.7 Pengfei Road, Dapeng Office, Dapeng New Area, Shenzhen City, Guangdong Province, 518000 Patentee after: Shenzhen Huada Sansheng Garden Technology Co.,Ltd. Address before: 518083 8th floor, building 11, Beishan Industrial Zone, 146 Beishan Road, Yangang community, Yantian street, Yantian District, Shenzhen, Guangdong Patentee before: BGI SHENZHEN Co.,Ltd. |
|
| TR01 | Transfer of patent right |