CN101955961A

CN101955961A - 一种基因敲除打靶载体及其应用

Info

Publication number: CN101955961A
Application number: CN2009100881643A
Authority: CN
Inventors: 王少华; 丁方荣; 李松; 戴蕴平; 李宁
Original assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: BEIJING JIFULIN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2029-07-03
Also published as: CN101955961B

Abstract

本发明涉及一种基因敲除打靶载体，包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，该重组酶识别序列的另一端分别与被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相连，所述两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。所述打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆，得到的阳性克隆富集效率高，细胞筛选方法简单，不需大量人力物力，极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成本。

Description

一种基因敲除打靶载体及其应用

技术领域

本发明涉及一种基因敲除打靶载体及其应用，具体地说，涉及一种无启动子的同时带有正、负筛选基因的基因敲除打靶载体及其应用。

背景技术

2000年第一例体细胞基因打靶克隆羊诞生之后，体细胞基因打靶结合核移植技术被广泛应用于对大动物基因组进行定点修饰。基因打靶基于的原理是DNA分子间的同源重组。在大动物体细胞中，同源重组的概率非常低，表现在细胞转染后经过药物筛选获得的随机整合的细胞远远多于同源重组的细胞，往往需要筛选大量的细胞才能获得基因打靶的细胞。尽管之前的研究采用很多筛选方法，比如正负筛选、无启动子筛选等用来排除随机整合的细胞，但这种富集基因打靶事件的效率一般在0.41％-11％(Kuroiwa等，2004；Takahagi，2005；Shen，2007)。通常需要从上百个细胞克隆点中筛选出几个发生了基因打靶的细胞克隆，极大地增加了后续细胞冻存和鉴定的工作。

PRNP基因编码朊蛋白。结构异常的朊蛋白是疯牛病和羊瘙痒病的致病蛋白。理论上讲，敲除了PRNP基因的牛羊将不再被疯牛病或瘙痒病传染。目前，对牛羊的PRNP基因的敲除已经有3个课题组获得成功，他们使用的载体及细胞筛选方法富集基因打靶的效率分别为10.3％(55/533，Denning等，2001)、0.6％(1/163，Yu等，2006)、4.9％(10/204，Zhu，2008)、6.4％(13/203，Kuroiwa，2004)、5.2％(17/327，Kuroiwa，2004)，也就是说，他们需要从上百个细胞中筛选出几个发生了PRNP基因打靶的细胞，很容易丢失阳性细胞。

本发明利用构建的无启动子打靶载体和负筛选基因简单高效的获得了PRNP基因敲除细胞，富集效率为100％(2/2)和60％(3/5)。本研究的最大优点是细胞筛选方法简单，不需大量人力物力，以及极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成本。

发明内容

本发明的目的在于克服现有的富集基因打靶细胞效率低而存在的缺陷，提供一种基因敲除打靶载体，所要解决的技术问题是通过基因敲除打靶载体转染细胞，提高富集基因打靶细胞效率，从而简化基因打靶细胞的筛选与鉴定工作，大大降低了基因打靶的成本。

本发明的目的及解决其技术问题是采用以下的技术方案来实现的。依据本发明提供的一种基因敲除打靶载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相连，所述两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。

本发明的目的及解决其技术问题还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

前述的基因敲除打靶载体，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶(neo)、潮霉素B磷酸转移酶(hph)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)或嘌呤霉素乙酰转移酶(puro)的基因。

前述的基因敲除打靶载体，所述负筛选基因为胸腺去氧核苷(DTA)，或者编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶(gpt)、胸腺嘧啶激酶(tk)、白喉毒素(DT)或单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(HSV-tk)的基因。

前述的基因敲除打靶载体，所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列或FLP酶识别序列。

前述的基因敲除打靶载体，所述同源臂为牛PRNP基因的序列。

前述的基因敲除打靶载体，其为LoxPneo-PRNP KO或LoxPhyg-PRNP KO。

所述打靶载体在胞内定点敲除基因中的应用。

一种提高基因打靶细胞富集率的方法，使用前述的打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆，使阳性克隆得到富集。

一种敲除牛PRNP基因的方法，其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO之一的打靶载体转染细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选，再用另一个打靶载体转染细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选。

前述的敲除牛PRNP基因的方法，其使用打靶载体LoxPneo-PRNPKO转染牛成纤维细胞，在含有G418的细胞培养基上筛选得到阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定；用LoxPhyg-PRNP KO转染PRNP基因一个等位基因发生敲除的牛成纤维细胞，并用含潮霉素B的细胞培养基筛选阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

(1)本发明首次将无启动子打靶载体与正、负筛选基因结合使用，因此，能够极大地排除随机整合的细胞，提高打靶细胞富集效率；

(2)在构建基因敲除打靶载体时，本发明首次在无启动子的正筛选基因两侧引入LoxP序列，以方便后续的标记基因的删除；

(3)经基因敲除打靶载体转染后的细胞，富集基因打靶细胞效率高，细胞筛选方法简单，不需大量人力物力，极大地方便了后续的细胞冻存和鉴定，大大降低了基因打靶的成本。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

图1为本发明较佳实施例PRNP基因无启动子打靶载体构建流程图。

图2为本发明较佳实施例pMD19-T-5’同源臂质粒酶切鉴定图，M，1kb DNA marker；1，质粒对照；2，Not I单酶切，5kb；3，Not I和BsiW I双酶切，2.7kb+2.3kb；4，5’同源臂PCR产物对照，2.3kb。

图3为本发明较佳实施例pGEM-T-3’同源臂质粒酶切鉴定图，M，1kb DNA marker；1，质粒对照；2，Nhe I和Sal I双酶切，7.1kb+3.0kb；3，Nhe I单酶切，10.1kb。

图4为本发明较佳实施例LoxPhyg-PRNP KO质粒酶切鉴定图，1，15kb DNA marker；2，Nhe I单酶切，15,472bp；3，Sac II酶切，12.3kb+3.1kb；4，Not I和Sal I双酶切，10.9kb+4.5kb；5，Not I和Nhe I双酶切，11.5kb+3.9kb；6，质粒对照；7，1kb DNA marker。

图5为本发明较佳实施例LoxPneo-PRNP KO质粒酶切鉴定图，1，15kb DNA marker；2，Sac II单酶切，15,113bp；3，Not I和NheI双酶切，11.5kb+3.5kb；4，Not I和Sal I双酶切，10.6kb+4.5kb；5，Nhe I和Sal I双酶切，8.1kb+7.0kb；6，质粒对照；7，1kb DNA marker。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 PRNP基因无启动子打靶载体的构建

PRNP基因无启动子打靶载体的构建过程请参阅图1。

在本实施例中，取牛胎儿皮肤组织剪碎成1mm³左右的小块，DMEM/F12清洗两遍后分批植块于含1mL DMEM/F12+10％FBS的25cm²的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10％FBS至6mL，于37℃、5％CO₂培养箱培养6～7天，每2天换液1次，待细胞生长汇合后，以0.25％胰蛋白酶消化传代2～3次，分批以DMEM/F12+20％FBS+10％DMSO冻存，获得牛胎儿成纤维细胞。

以牛胎儿成纤维细胞的基因组为模板，分别扩增5’同源臂和3’同源臂。

5’同源臂的引物为，LoxP-5F：5’-TTGC/GGCCGCTATAACACAG CCAGGCATTC AG-3’，下划线部分为Not I限制性内切酶识别位点；LoxP-5R：5’TCT C/GTACG ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAGTTAT GATGAC TTATCTGCAA AATAAAG-3’，下划线部分为BsiW I限制性内切酶识别位点，斜体部分是loxP序列。5’同源臂长度为2,323bp，从PRNP基因(Genbank No.AJ298878)的63,256bp到65,578bp处，包含了PRNP基因第三外显子上游2,313bp和第三外显子前10bp的序列(即第三外显子翻译起始位点ATG上游的序列)。

3’同源臂的引物为，LoxP-3F：5’-ATTG/CTAGCCCTCTTATACATTTTGGCAGTG-3’，下划线部分为Nhe I限制性内切酶识别位点；LoxP-3R：5’-TAT G/TCGAC GAAACAGTGGAAAGTG TCAGAC-3’，下划线部分为Sal I限制性内切酶识别位点。3’同源臂长度为7,074bp，从PRNP基因的66,020bp到73,093bp处，包含了PRNP基因第三外显子内452bp以后直到第三外显子下游3,434bp的序列。因此，经过基因敲除后，PRNP基因的第三外显子将会被删除442bp，此序列恰好是PRNP基因编码框的前442bp。

同源臂的PCR反应体系反应体系为：50μl反应体系，其中牛胎儿成纤维细胞基因组2μl(100ng/μl)，primer(20pmol/μl)各1μl，dNTP(10mM)8μl，5×LA PCR Buffer 5μl，LA Taq酶(Takara)0.5μl，用水补足50μl体系。反应条件如下：94℃ 1min，98℃ 10sec68℃ 24sec，30个循环，68℃ 10min，4℃保存。

将PCR扩增产物与pMD19-T载体(TaKaRa)或pGEM-T载体(Promega)进行连接、转化，挑取重组子，进行酶切和测序鉴定，请参阅图2和图3。测序结果表明该序列与已知序列的同源性达到99.9％，可以作为同源臂使用。

在牛中PRNP基因是位于13号染色体的单拷贝基因，因此，为了敲除PRNP基因的两个等位基因需要对成纤维细胞进行两轮打靶，这就需要使用两种不同的正筛选基因进行细胞筛选。本发明选择了新霉素基因和潮霉素B基因作为两种正筛选基因。

本发明利用PCR扩增的方法，分别从打靶载体骨架载体pPGKneoLoxP2PGKDTA(Clontech公司)和商业化载体pIREShyg3(Clontech公司)上扩增出neo-polyA序列和hyg-polyA序列。扩增neo-polyA序列的PCR引物为，LoxP-neoF：5’-TCT C/GTACGCCACCATGGG ATCG GCCATTGAACAAG-3’，下划线部分为BsiWI限制性内切酶识别位点，ATG为neo基因翻译起始位点；LoxP-neoR：5’-TAA G/CTAGC GGACCTAATAACTTCGTATAATGTATGCTATAC-3’，下划线部分为Nhe I限制性内切酶识别位点。PCR产物大小为1,216bp，包括完整的neo-polyA序列及其下游的loxP序列。

扩增hyg-polyA序列的PCR引物为，LoxP-hygF：5’TCTC/GTACGCCACCATGGA TAGATC CGGAAAGCCTG-3’，下划线部分为BsiWI限制性内切酶识别位点，ATG为hyg基因翻译起始位点；LoxP-hygR：5’-TAAG/CTAGC ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGA AG TTATCTAG AATGCAGTGAAAAAAATG-3’，下划线部分为Nhe I限制性内切酶识别位点，斜体部分是loxP序列。PCR产物大小为1,614bp，包括完整的hyg-polyA序列及通过PCR引物添加的loxP序列。

扩增neo-polyA序列和hyg-polyA序列的PCR反应体系为：50μl反应体系，其中质粒1μl(100ng/μl)，primer(20pmol/μl)各1μl，dNTP(10mM)6μl，5×LA PCR Buffer 5μl，LA Taq酶(Takara)0.3μl，用水补足50μl体系。反应条件如下：94℃ 5min，94℃ 20sec60℃ 30sec 72℃ 1min，35个循环，72℃ 7min，4℃保存。

将PCR扩增产物与Promega pGEM-T载体进行连接、转化，挑取在T载体多克隆位点处连接顺序为Not I-BsiW I-neo/hyg-polyA-NheI的重组子，进行酶切和测序鉴定。测序结果表明neo-polyA序列和hyg-polyA序列与载体上的相应序列完全一致，理论上说，打靶载体发生定点整合后，在PRNP基因启动子的作用下应该能够表达出抗性蛋白。连接方向正确的重组子称为pGEM-T-Neo/Hyg PA载体。

将pGEM-T-Neo/Hyg PA质粒和pMD19-T-5’同源臂质粒小量提取后，经过Not I和BsiW I酶切，分别回收线性化的pGEM-T-Neo/HygPA载体和5’同源臂，经过连接、转化后，挑取有5’同源臂插入的重组子，进行酶切和测序鉴定，连接正确的称为pGEM-T-Neo/HygPA-5’臂。

将pGEM-T-Neo/Hyg PA-5’臂载体和打靶载体骨架载体pPGKneoLoxP2PGKDTA小量提取后，经过Not I和Nhe I酶切，分别回收线性化的打靶载体骨架载体和Not I-5’同源臂-neo/hyg PA-NheI序列，经过连接、转化后，挑取有Not I-5’同源臂-neo/hyg PA-NheI序列插入的重组子，进行酶切和测序鉴定，连接正确的称为LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂。

将LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂质粒和pGEM-T-3’同源臂质粒小量提取后，经过Nhe I和Sal I酶切，分别回收线性化的LoxPneo/hygPGKDTA-5’臂载体和3’同源臂，经过连接、转化后，挑取有3’同源臂插入的重组子，进行酶切和测序鉴定，请参阅图4和图5，连接正确的称为LoxPneo/hyg-PRNP KO，大小分别为15,113bp和15,472bp。

实施例2 牛胎儿成纤维细胞转染及细胞筛选

本发明要对牛PRNP基因的两个等位基因进行敲除，对第一个等位基因敲除用的是脂质体细胞转染方法，对第二个等位基因进行敲除用的是Lonza公司的细胞核电转染法。

2.1牛PRNP第一个等位基因的敲除

接种牛胎儿成纤维细胞于6孔细胞培养板中，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养至70-80％汇合度时，按照说明书要求，用Lipofectamine 2000脂质体将经过Not I线性化的PRNP基因打靶载体LoxPneo-PRNP KO转入细胞中；

细胞转染48h后，胰酶消化法将细胞从6孔板中消化下来，每100mm细胞培养皿接4×105个细胞，并用G418浓度为600μg/mL的细胞培养基筛选细胞7-9d；

用细胞克隆环将具有G418抗性的细胞克隆点挑选出来接种到24孔细胞培养板中，待细胞培养至80％汇合，胰酶消化后，一部分液氮冻存，另一部分继续培养至长满6孔板的一孔，提取细胞基因组，采用PCR扩增的方法对细胞克隆点进行鉴定。得到的敲除细胞命名为ko-E细胞。

2.2牛PRNP第二个等位基因的敲除

将T75细胞培养瓶中培养至80％汇合的ko-E细胞用胰酶消化法消化下来，每1×107个细胞用1mL Lonza细胞核转液重悬，向细胞重悬液中加入80μg Not I线性化的LoxPhyg-PRNP-KO无启动子打靶载体，充分混匀后，每个电击杯中加入100μL细胞-载体混合液，按照NucleofectorTM细胞核电击仪程序T036电击；

电击结束后，每个电击杯中的细胞接种至一个60mm细胞培养皿中，用含有10％FBS的DMEM细胞培养基培养48h，胰酶消化法将60mm细胞培养皿中的细胞消化下来，每个60mm细胞培养皿中的细胞经过稀释后接种到6个100mm细胞培养皿中，并用潮霉素B终浓度为150μg/mL的细胞培养基筛选细胞7-9d；

用细胞克隆环将具有潮霉素B抗性的细胞克隆点挑选出来接种到24孔细胞培养板中待细胞培养至80％汇合，胰酶消化后，一部分液氮冻存，另一部分继续培养至长满6孔板的一孔，提取细胞基因组，采用PCR扩增的方法对细胞克隆点进行鉴定。

经过PCR鉴定，获得的2个具有G418抗性的细胞克隆点均为PRNP+/-细胞，LoxPneo-PRNP KO基因打靶载体富集基因打靶的效率为100％；获得的5个具有潮霉素B抗性的细胞克隆点其中有3个为PRNP-/-细胞，LoxPhyg-PRNP KO基因打靶载体富集基因打靶的效率为60％。

本发明与以往研究最大的不同是，通过提高基因打靶载体的富集效率从而简化了基因打靶的细胞筛选与鉴定工作。在本发明中，细胞经过打靶载体转染和药物筛选后，一个100mm细胞培养皿中最多可以获得2个细胞克隆点，很方便就可以把它挑取出来继续培养，之后的鉴定工作证明这几个细胞克隆点往往就是经过基因打靶的细胞，几乎100％排除了随机整合的细胞。此外，本发明构建的无启动子打靶载体上的真核抗性基因都是被loxP位点锚定的，可以通过Cre/loxP系统对其进行删除，这种策略在以往的无启动子打靶载体构建中很少有人报道。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献：

K.J.McCreath，J.Howcroft，K.H.S.Campbell，A.Colman，A.E.Schnieke & A.J.Kind，Production ofgene-targeted sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells，Nature，2000，405(29)：1066-1069C.Denning，S.Burl，A.Ainslie，J.Bracken，et al.Deletion of the α(1，3)galactosyl transferase(GGTA1)gene andthe prion protein(PrP)gene in sheep.Nature biotechnology，2001，19：559-562.

Guohua Yu，Jianquan Chen，et al.Functional disruption of the prion protein gene in cloned goats.Journal ofgeneral virology，2006，87：1019-1027.

Caihong Zhu，Bei Li，et al.Production of Prnp-/-goats by gene targeting in adult fibroblasts.2008，Transgenicresearch，

Yoshimi Kuroiwa，et al.Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulin-μand prion protein in cattle.Nature genetics，2004，36(7)：775-780.

序列表

<110>北京济普霖生物技术有限公司

<120>一种基因敲除打靶载体及其应用

<130>KHP09112684.1

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ttgcggccgc tataacacag ccaggcattc ag 32

<210>2

<211>66

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

tctcgtacga taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatgatgact tatctgcaaa 60

ataaag 66

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

attgctagcc ctcttataca ttttggcagt g 31

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tatgtcgacg aaacagtgga aagtgtcaga c 31

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tctcgtacgc caccatggga tcggccattg aacaag 36

<210>6

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

taagctagcg gacctaataa cttcgtataa tgtatgctat ac 42

<210>7

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

tctcgtacgc caccatggat agatccggaa agcctg 36

<210>8

<211>65

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

taagctagca taacttcgta taatgtatgc tatacgaagt tatctagaat gcagtgaaaa 60

aaatg 65

Claims

1.一种基因敲除打靶载体，其包括正筛选基因，在正筛选基因的两端具有重组酶识别序列，所述重组酶识别序列的另一端分别与被敲除基因的5’同源臂和3’同源臂相连，所述两同源臂的内部不具有启动正筛选基因表达的启动子，在所述同源臂的外侧还具有负筛选基因。

2.如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述正筛选基因为编码新霉素磷酸转移酶、潮霉素B磷酸转移酶、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶或嘌呤霉素乙酰转移酶的基因。

3.如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述负筛选基因为胸腺去氧核苷，或者编码次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、黄嘌呤/鸟嘌呤磷酸转移酶、胸腺嘧啶激酶、白喉毒素或单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶的基因。

4.如权利要求1～3任意一项所述的打靶载体，其特征在于，所述重组酶识别序列为Cre酶识别序列或FLP酶识别序列。

5.如权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述同源臂为牛PRNP基因的序列。

6.如权利要求5所述的打靶载体，其为LoxPneo-PRNP KO或LoxPhyg-PRNP KO。

7.权利要求1～6任意一项所述打靶载体在细胞内定点敲除基因中的应用。

8.一种提高基因打靶细胞富集效率的方法，其特征在于，使用权利要求1～6任意一项所述打靶载体转染细胞，通过含有与正筛选基因相应药物的培养基筛选阳性克隆，使阳性克隆得到富集。

9.一种敲除牛PRNP基因的方法，其包括使用LoxPneo-PRNP KO和LoxPhyg-PRNP KO之一的打靶载体转染细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选，再用另一个打靶载体转染细胞并用相应的药物筛选培养基进行筛选。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，使用打靶载体LoxPneo-PRNP KO转染牛成纤维细胞，在含有G418的细胞培养基上筛选得到阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定；用LoxPhyg-PRNP KO转染PRNP基因一个等位基因发生敲除的牛成纤维细胞，并用含潮霉素B的细胞培养基筛选阳性细胞克隆，并对阳性细胞克隆进行鉴定。