CN104053773A

CN104053773A - 基因打靶载体及其利用方法

Info

Publication number: CN104053773A
Application number: CN201280066047.7A
Authority: CN
Inventors: 足立典隆
Original assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM
Current assignee: PUBLIC UNIVERSITY CORP YOKOHAM; Yokohama City University
Priority date: 2011-12-13
Filing date: 2012-12-12
Publication date: 2014-09-17
Also published as: JP6037290B2; EP2792744B1; EP2792744A4; WO2013089123A1; JPWO2013089123A1; US20140335621A1; EP2792744A1; US9303272B2

Abstract

本发明提供使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体。基因打靶载体，其具有与目标部位的5’上游区域相同的DNA和与目标部位的3’下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5'上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5'上游也附加有剪接受体部位。

Description

基因打靶载体及其利用方法

【技术领域】

本发明涉及基因打靶载体及其利用方法。

【背景技术】

利用细胞所具备的同源重组能力，仅破坏基因组上的特定的基因、甚至可与人为地导入的DNA片段置换(非专利文献1、2)。将其称为基因打靶。此方法不仅一直在各种基因功能解析中发挥绝大的威力，也被期待为理想的基因治疗法或品种改良法(非专利文献3)。但是，一般在高等动植物细胞中的基因打靶的效率极其低，期望改良法的开发。使用在标志物基因中不具有启动子的外显子截留型的打靶载体，则知随机插入体的出现频度降低，可预期基因打靶效率的升高(非专利文献4、5)。但是，由于由向非目标基因中的随机插入也可发生标志物基因的表达，需求旨在进一步效率化的改良法的开发。

【现有技术文献】

【非专利文献】

非专利文献1：Capecchi，MR(1989)Altering the genome byhomologous recombination.Science244：1288-1292

非专利文献2：Vasquez KM，Marburger K，Intody Z，et al.(2001)Manipulating the mammalian genome by homologous recombination.Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：8403-8410

非专利文献3：Yanez RJ，Porter AC(1998)Therapeutic genetargeting.Gene Ther5：149-159

非专利文献4：Bunz F，Dutriaux A，Lengauer C，et al.(1998)Requirement for p53及p21to Sustain G2Arrest After DNA Damage.Science282：1497-1501

非专利文献5：Adachi N，So S，Iiizumi S，et al.(2006)The humanpre-B cell line Nalm-6is highly proficient in gene targeting byhomologous recombination.DNA Cell Biol.25：19-24

【发明内容】

【发明要解决的技术课题】

本发明旨在提供使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体。

另外，本发明旨在提供利用使高效率的基因打靶成为可能的基因打靶载体，制作基因敲除细胞的方法。

【解决课题的技术方案】

基因打靶的效率极其低的问题的最大的原因在于高频度地发生了向细胞导入的打靶载体插入基因组上的随机的位置的反应(随机插入)。但是，因为可期待使用无启动子型的打靶载体来升高打靶效率，只要可简便迅速地制作这样的载体、特别是外显子截留型的打靶载体，则应可预期一定的技术革新。

本申请发明人开发了，在基因打靶载体(例如，外显子截留型的打靶载体)中，通过将IRES序列或2A序列等的使双顺反子性表达成为可能的DNA序列在选择标志物的5’上游上附加来升高基因打靶效率的技术(特愿2011-118564、2011年5月27日申请)。

但是，在特愿2011-118564的基因打靶载体中，由于不仅在正确打靶的克隆中，在发生向非目标基因中的随机插入的克隆中也发生筛选中使用的标志物基因(阳性选择标志物基因)的表达，阴性选择的效果说不上充分(图4A，B)。

本申请发明人通过向在特愿2011-118564的基因打靶载体中的目标部位的5’相同区域的上游附加具有剪接受体序列的自杀基因等的阴性选择标志物，通过使在引起随机插入的克隆的阳性选择标志物基因的表达不发生而成功地再升高基因打靶效率，从而完成本发明(图5)。再有，在本发明中认为，即使不向基因打靶载体附加成为阴性选择标志物的基因，通过向目标部位的5’相同区域的上游附加剪接受体序列，得到同样的效果(即，不发生在引起随机插入的克隆的筛选中使用的标志物基因的表达)。将本发明的方法命名为外显子截留阳性/阴性选择法(ExTraPNS法)。

本发明的要点如下。

(1)基因打靶载体，其具有与目标部位的5’上游区域相同的DNA和与目标部位的3’下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5’上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游也附加有剪接受体部位。

(2)(1)所述的载体，其中阳性选择标志物附加有多聚A序列，但不附加有启动子。

(3)(1)或(2)所述的载体，其中与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游上附加的剪接受体部位的3’下游附加有多聚A序列。

(4)(3)所述的载体，其中与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游上附加的剪接受体部位和其3’下游上附加的多聚A序列之间导入有阴性选择标志物。

(5)(1)～(4)之任一项所述的载体，其中再导入有线性化部位。

(6)制作基因敲除细胞的方法，其包括使用(1)～(5)之任一项所述的基因打靶载体，向细胞导入基因变异。

【发明效果】

由本发明，可相比以往更高效率进行基因打靶。本发明的方法，特别是在使用外显子截留型打靶载体的基因打靶中有效。本发明在基础生物学领域、医疗领域、农畜产领域中的基因敲除/敲入的广泛使用化－效率化中有效。

本说明书包含作为本申请的优先权的基础的日本国专利申请、特愿2011-272072的说明书及/或附图中记载的内容。

【附图说明】

【图1】打靶载体的结构。(A)一般取代型打靶载体的结构。将打靶载体导入细胞内，在选择药剂存在下实施集落形成，则得到目标部位与药剂抗性基因重组的同源重组体，和在染色体上的随机的位置上插入打靶载体的非同源重组体，后者占压倒性的多数。即，由于同源重组体及非同源重组体均具有药剂抗性基因，仅此药剂筛选难以取得同源重组体。但是，如果在任何的臂之外侧附加DT-A等的自杀基因，则非同源重组体由整合到染色体上的自杀基因的表达杀灭。图中的椭圆表示细胞，其中的棒状四边形表示染色体。染色体中的深灰色的区域表示目标部位、染色体及打靶载体中的浅灰色的区域表示相同区域。另外，被打靶载体的臂所夹的区域表示药剂抗性基因，黑色四边形的区域表示DT-A。(B)无启动子型打靶载体的结构之一例。与取代型打靶载体不同，作为阳性选择标志物使用的基因中不具有独自的启动子。因此，理论上、仅在发生由同源重组的打靶时，使用染色体上的目标基因的启动子，从而开启标志物基因的表达。

【图2】利用多位点入口技术的打靶载体制作的概略。将在两端具有attB序列的5’-臂和3’-臂PCR扩增之后，由BP重组反应制作5’-进入克隆(entry clone)和3’-进入克隆(A)。使用得到的2个的进入克隆，和向pENTR IRES-Hyg、pDEST R4-R3附加阴性选择用的盒SA-IRES-DTA-polyA的质粒，由LR重组制作打靶载体(B)。Hyg表示潮霉素抗性基因、DTA表示白喉毒素A片段基因、Km^r表示卡那霉素抗性基因、Amp^r表示氨苄西林抗性基因。

【图3】用于臂扩增的PCR的概略和引物序列。以被attB序列所夹的方式将各臂用PCR扩增。引物序列中的加下划线部自示各att序列，N自示模板特异性序列、框围住的部分自示I-SceI的识别序列。模板特异性序列优选25nt左右的长度。

【图4】由特愿2011-118564的外显子截留型打靶载体的基因打靶。(A)一般取代型的外显子截留型打靶载体的结构。在5’-臂和3’-臂之间具有阳性选择标志物。阳性选择标志物不具有独自的启动子，代之以在5’上游具有剪接受体部位、及，使双顺反子性表达成为可能的DNA序列。在3’下游附加有多聚A附加信号。(B)由特愿2011-118564的外显子截留型打靶载体的基因打靶的问题。不仅是通过由同源重组的打靶向目标基因中插入的克隆(图上)、在发生向非目标基因中的随机插入的克隆(图下)中也可发生阳性选择标志物基因的表达。特别是，向表达水平高的基因中插入的克隆，相比向目标基因中插入的克隆，可获得更强的药剂抗性。因此，仅由外显子截留，阴性选择的效果说不上充分。

【图5】由新开发的、使用具有阴性选择用的盒的外显子截留型打靶载体的ExTraPNS法的基因打靶(以使用图6之上段所示的载体时为例)。由于5’相同区域的上游附加有具有剪接受体序列的自杀基因，在引起随机插入的克隆中发生阳性选择标志物基因的表达的可能性大幅地减少。在发生由同源重组的打靶时，不发生阴性选择用的盒的插入。因此，预期基因打靶效率的升高。再有，即使不附加成为阴性选择标志物的基因，只要向5’臂的上游附加剪接受体序列(图6之下段所示的载体)，就可期待同样的效果。

【图6】具有可在由ExTraPNS法的基因打靶中使用的阴性选择用的盒的外显子截留型打靶载体的结构的例。代替上段所示的自杀基因，附加荧光蛋白质基因(在这里是GFP基因)也可(中段)。另外，仅简单在5’臂的上游附加剪接受体序列也可(下段)。

【实施方式】

以下，更详细地说明本发明的实施方式。

基因打靶是利用同源重组结构，向染色体上的任意的位置导入变异的技术。但是，高等生物中的同源重组频度低，一般而言，相比导入细胞内的打靶载体插入目标部位的频度，向不同的部位随机地插入的频度高100倍以上。从而，为了可有效筛选、取得同源重组体，有对打靶载体实施处理的必要。最常使用的取代型打靶载体具有与目标部位(要缺失的区域)的5’上游区域及3’下游区域相同的DNA片段(以下，有时各称为“5’臂”及“3’臂”)夹阳性选择标志物(在图1中是药剂抗性基因)的结构(图1A)。作为阳性选择标志物，可例示：Hyg(潮霉素抗性基因)、Puro(嘌呤霉素抗性基因)、β-geo(β半乳糖苷酶基因和新霉素抗性基因的融合基因)等的药剂抗性基因、GFP基因等的荧光蛋白质基因、萤光素酶基因等。由于发生同源重组，则目标部位与阳性选择标志物置换，可以其作为指标筛选重组体。但是，由非同源重组随机地插入也发生标志物基因的表达。因此，作为用于除去非同源重组体的处理，一般向打靶载体中的臂之外侧附加阴性选择用的基因。作为阴性选择用的基因，可例示HSV-TK、DT-A等的自杀基因等。作为别的方法，有使用不具有启动子的药剂抗性基因(阳性选择标志物)的无启动子法(也包括“外显子截留法”)(图1B)。在此方法中，发生同源重组，则开启阳性选择标志物基因的表达。但是，通过由非同源重组的随机插入，也有开启阳性选择标志物基因的表达的可能性。本发明中设计了用于减少由后者的反应的重组体的方法(ExTraPNS法)。

在本说明书中，以利用多位点入口技术(Multisite Gatewaytechnology)(Iiizumi，S，Nomura，Y，So，S，et al.(2006)Simpleone-week method to construct gene-targeting vectors：application toproduction of human knockout cell lines.Biotechniques41：311-316)的取代型打靶载体的制作法为例进行说明(图2)。

具体而言，首先通过将在两端具有attB4序列和attB1序列的5’臂(对应于与本发明中的“目标部位的5’上游区域相同的DNA片段”)和两端具有pDONR P4-P1R及attB2序列和attB3序列的3’臂(对应于与本发明中的“目标部位的3’下游区域相同的DNA片段”)在pDONR P2R-P3间进行BP重组，分别制作5’进入克隆及3’进入克隆。(5’臂和3’臂由基因组PCR扩增、取得。)

5'臂扩增用的反向引物可设计在目标基因的外显子上。由此，在目标基因上，在5'臂中可含使从上游的外显子向(插入)阳性选择标志物基因(的外显子)的天然的剪接成为可能的SA部位(剪接受体位点)。SA部位不限于目标基因的剪接受体序列(SA序列)，也可使用其他SA部位。

也可向3'臂扩增用的反向引物(或者5'臂扩增用的正向引物)附加用于载体直链化的限制性内切酶位点(例如，I-SceI)(图3)。由此，可省略用于确定直链化中使用的限制性内切酶的定位实验。

接下来，在此两种进入克隆，与向在attL1序列和attL2序列之间导入有潮霉素抗性基因的pENTR IRES-Hyg、pDEST R4-R3(Invitrogen)附加阴性选择用的盒(在这里是SA-IRES-DTA-多聚A)的质粒的四者间进行LR重组。用仅此2步骤完成外显子截留型的取代型打靶载体(图2)。

在潮霉素抗性基因(也可为其他选择用标志物)的5'上游附加使双顺反子性表达成为可能的DNA序列(例如，IRES序列(内部核糖体进入位点；mRNA内部的核糖体进入位点；脑心肌炎病毒(EMCV)来源的等)、2A肽序列(2A“自身切割”肽；Thosea asigna病毒(TaV)来源的等)、IRES2等)。由于在选择用标志物的5'上游存在使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，所以发生基因打靶，则依赖于目标基因的启动子而发生选择用标志物的基因表达。

潮霉素抗性基因优选被lox71和loxP所夹。由此，基因打靶之后，由Cre的瞬时表达，可从基因组中除去选择用标志物。但是，用于标志物除去的方法不限于此。即，也可利用其他lox序列或FRT序列等的位点特异性重组酶的目标序列。

另外，也可向进入克隆pENTR IRES-Hyg导入剪接受体部位。通过导入剪接受体部位，可在内含子中设定5'臂扩增用的反向引物(外显子中无)。

在5'臂的上游上附加SA-IRES-DTA-多聚A的盒，则由于相比阳性选择标志物的SA，上游会更存在别的(即，DTA的)SA，所以发生随机插入的克隆获得药剂抗性的概率大幅地减少(图5)。也可代替DTA基因而使用其他自杀基因(例如，HSV-TK)、荧光蛋白质标志物等的其他基因(例如，GFP基因、DsRed基因)。或者，也可什么基因(或IRES)都不插入而仅附加SA-polyA的盒(图6)。

在向阴性选择用的盒放入如DTA基因一样的自杀基因或如GFP基因一样的荧光蛋白质基因等的阴性选择标志物时，可附加IRES、2A肽序列等的使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，但在不向阴性选择用的盒放入基因或cDNA时，也可不附加使双顺反子性表达成为可能的DNA序列。

以上、打靶载体的制作(具体而言是将5'臂和选择用标志物和3'臂连结的步骤)以利用Invitrogen公司的多位点入口系统时为例进行说明，但连结方法不限于此方法。即，由其他分子生物学方法的制作或利用(例如利用限制性内切酶或连接酶的一般方法或In-FusionPCR克隆等)也是可能的。作为不利用进入克隆(即Gateway的系统)而成为用于用通常的方法制作打靶载体的基础的载体，优选使用含选择用标志物，用于整合与目标部位的5’上游区域相同的DNA片段和与目标部位的3’下游区域相同的DNA片段的部位、及，整合线性化部位的载体。

通过使用本发明的基因打靶载体，向细胞导入基因变异，可制作基因敲除细胞。基因敲除细胞可用公知的方法(例如，Adachi，N，So，S，Iiizumi，S，et al.(2006)The human pre-B cell line Nalm-6ishighly proficient in gene targeting by homologous recombination.DNA Cell Biol.25：19-24；Adachi，N，Nishijima，H，Shibahara，K(2008)Gene targeting using the human Nalm-6pre-B cell line.BioScience Trends.2：169-180；Toyoda，E，Kagaya，S，Cowell，IG，et al.(2008)NK314，a topoisomerase II inhibitor that specificallytargets theαisoform.J.Biol.Chem.283：23711-23720)制作。简单地说明，则用限制性内切酶将打靶载体直链化之后，由电穿孔法等的基因导入法导入细胞，培养细胞，形成集落。接下来，利用适宜标志物，选择导入了基因变异的细胞。为了得到同源地导入基因变异的细胞(同源破坏株)，代替选择用标志物而进行第2基因打靶即可。另外，通过将表达位点特异性重组酶的载体(例如，作为表达Cre重组酶的载体的质粒pBS185)导入细胞，可除去选择用标志物。在除去选择用标志物的细胞中可导入别的变异。作为适宜于基因打靶的细胞，可例示人Nalm-6细胞、鸡DT40细胞、小鼠ES细胞等，但不限于这些。索性由本发明，用一般人细胞株基因打靶也变得容易。以下详述使用人纤维肉瘤来源癌细胞株HT1080(可由人类科学振兴财团研究资源银行得到；http://www.jhsf.or.jp/cgi-bin/HSRRB/C_ViewDetail.cgi？jcrb＝IFO50354)的实验的说明。本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【实施例1】

【材料及方法】

【打靶载体的构建】

【准备的材料】

1.ExTaq^TM聚合酶(宝生物)

2.PCR引物：以HPRT基因的扩增为例。

5'臂扩增用

(1)HPRT5'Fw，5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG-3’(SEQ ID NO:1)；

(2)HPRT5'Rv(设定在外显子上)，5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT-3’(SEQ ID NO:2)；

3'臂用

(3)HPRT3'Fw，5’-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC-3’(SEQ ID NO:3)；

(4)HPRT3'Rv(附加成为线性化部位的I-SceI位点)，5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC-3’(SEQ ID NO:4)

3.MultiSite Gateway(注册商标)三片段载体构建试剂盒(Invitrogen)

4.整合药剂抗性基因的进入克隆(pENTR IRES-Hyg)

pENTR IRES-Hyg是将pENTR loxP质粒(Iiizumi，S，Nomura，Y，So，S，et al.(2006)Simple one-week method to constructgene-targeting vectors：application to production of human knockoutcell lines.Biotechniques41：311-316)用NotI消化之后，依次附加lox71，IRES，Hyg，pA，loxP而制作。lox71和loxP使用合成接头DNA附加。IRES和pA来源于pIRES载体(宝生物；http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp？unitid＝U100004407)。Hyg来源于pENTR lox-Hyg(Iiizumi，S，Nomura，Y，So，S，et al.(2006)Simple one-week method to construct gene-targetingvectors：application to production of human knockout cell lines.Biotechniques41：311-316)。

5.目标载体(pDEST R4-R3)(Invitrogen)

6.目标载体(pDEST R4-R3SA-IRES-DTA-pA)

pDEST R4-R3SA-IRES-DTA-pA根据以下的顺序制作。

1.使用引物DTA-Sal Fw(5'-GTCGACATGGATCCTGATGATGTTGTTGAT-3')(SEQ ID NO:7)和DTA-Not Rv(GCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTA)(SEQ ID NO:8)进行PCR，将得到的DTA基因片段亚克隆进pIRES载体(Clontech，Cat.No.631605)的NotI位点。使用KOD-Plus-DNA聚合酶(TOYOBO)，在下述的条件下进行PCR。

2.将pSAβgeo质粒(Friedrich，G.&Soriano P.Genes Dev.5,1513-1523,1991)用BamHI消化，使用Klenow片段将末端平滑化之后，将含SA部位(来源于腺病毒2型主要晚期转录物剪接受体)的约200bp的片段附加到在上述1.制作的载体的IRES序列的上游(XhoI位点；由Klenow片段平滑末端化)。

3.将在上述2.制作的质粒用BglII和PvuI消化，平滑末端化之后，将含SA-IRES-DTA-pA的DNA片段附加到pDEST R4-R3质粒(Invitrogen)的AflIII位点(由Klenow片段平滑末端化)。

7.含有抗生物质的LB琼脂培养基：含50μg/ml卡那霉素或50μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基

【流程】

1.以人基因组DNA作为模板，在下述的条件下进行PCR，取得被att序列所夹的HPRT基因组片段。在5’臂的扩增使用引物(1)和(2)，在3’臂的扩增使用引物(3)和(4)。

【表1】

2.将PCR产物用市售的试剂盒纯化，定量。

3.由BP重组反应制作5’-进入克隆及3’-进入克隆(图2A)。将下述的样品在0.5ml管内混合。

pDONR P4-P1R或pDONR P2R-P350fmol

用PCR扩增的5’-臂或3’-臂50fmol

全量8μl(用TE溶液调整)

4.向上述反应液4μl加1μl的BP克隆酶II酶混合物，充分混合。

5.于25℃温育4～5小时。

6.加1μl的2μg/μl蛋白酶K，充分混合。

7.于37℃温育10分钟。

8.将5μl的反应液与50μl的大肠杆菌感受态细胞混和，进行转化。恢复培养后，将重组体接种于含50μg/ml卡那霉素的LB琼脂培养基中。

9.单离5～10个卡那霉素抗性集落，用碱SDS法提取质粒DNA。由琼脂糖凝胶电泳，选2～3个被预计为目的质粒的克隆。将这些候选质粒用适当的限制性内切酶消化之后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认是目的质粒。

10.将得到的5’、3’各进入克隆用市售的试剂盒纯化，定量。

11.由LR重组反应制作打靶载体(pHPRT-IRES-Hyg)(图2B)。将各样品如下在0.5ml管内混合。

pDEST R4-R3或pDEST R4-R3SA-IRES-DTA-pA20fmol

5’-进入克隆10fmol

3’-进入克隆10fmol

pENTR IRES-Hyg10fmol

全量8μl(用TE溶液调整)

12.向上述反应液4μl加1μl的LR克隆酶正酶混合物，充分混合。

13.于25℃温育16小时。

14.加1μl的2μg/μl蛋白酶K，充分混合。

15.于37℃温育10分钟。

16.将5μl的反应液与50μl的大肠杆菌感受态细胞混和，进行转化。恢复培养后，将重组体接种于含50μg/ml氨苄西林的LB琼脂培养基中。

17.单离5～10个氨苄西林抗性集落，用碱SDS法提取质粒DNA。由琼脂糖凝胶电泳，选2～3个被预计为目的质粒的克隆。将这些候选质粒用适当的限制性内切酶消化之后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认是目的质粒(即打靶载体)。

18.将打靶载体用试剂盒纯化，定量。

【打靶载体的直链化】

【准备的材料】

1.限制性内切酶I-SceI、10x I-SceI反应缓冲液、10mg/ml BSA(New England Biolabs)

2.3M醋酸钠：将醋酸钠40.81g溶解于纯水80ml之后，用醋酸将pH调至5.2，使全量为100ml

3.TE溶液：10mMTris盐酸缓冲液(pH8.0)、0.1mM EDTA(pH8.0)(4℃保存)

【流程】

1.将打靶载体用限制性内切酶I-SceI消化。将各试剂如下混合，于37℃温育4小时以上。

打靶载体50μg

10x I-SceI缓冲液40μl

100x BSA(10mg/ml)4μl

I-SceI15单位

全量400μl(用灭菌水调整)

2.加40μl的3M醋酸钠和0.9ml的乙醇，充分混合。

3.以15,000rpm离心5分钟。

4.用0.5ml的70％乙醇清洗3次。

5.第3次离心后，在洁净台内使用经灭菌的芯片除去上清，风干。

6.加TE溶液，溶解DNA(至DNA浓度成2～4μg/μl)。

7.于65℃温育15分钟。

【由电穿孔法的基因导入及集落形成】

【准备的材料】

1.增殖培养基：向ES培养基(日水制药)中加10％小牛血清(HyClone)而制成。于37℃水浴中保温。

2.直链化的打靶载体

3.细胞系统Nucleofector(注册商标)试剂盒T(Lonza)

4.选择药剂(100mg/ml潮霉素B)：将1g的潮霉素B溶解于纯水10ml，过滤灭菌而制成(4℃保存)

【流程】

1.在50ml离心管中回收在对数增殖期的人HT1080细胞(2×10⁶个以上)。

2.以1,100rpm离心5分钟，小心地除去上清。

3.向细胞块加100μl溶液T，对细胞数进行计数。

4.将2×10⁶个的细胞和直链化的打靶载体2μg混合，用溶液T使成为100μl之后，移到专用的比色杯中。

5.将比色杯设置到电穿孔装置(Nucleofector II，Lonza)上。

6.运行程序L-005。

7.将全量立即移到装有4ml增殖培养基的60mm皿中。

8.将各1ml上述细胞液移到装有9ml增殖培养基的90mm皿(×4个)中。

9.于37℃培养48小时。

10.胰蛋白酶处理之后，以1,100rpm离心5分钟，回收细胞。

11.悬浮于适量的增殖培养基中，对细胞数进行计数。

12.接种于90mm皿(增殖培养基9ml)，至2～4×10⁵细胞/皿。

13.于37℃培养24小时之后，加25～40μl的选择药剂(100mg/ml潮霉素)。

14.于37℃培养2周，实施集落形成。

【集落的单离和靶克隆的筛选】

【准备的材料】

1.选择培养基(含有潮霉素B的培养基)：向增殖培养基加潮霉素B至成0.25～0.4mg/ml

2.0.1％胰蛋白酶液：0.1％胰蛋白酶/0.02％EDTA/PBS^-

3.溶解缓冲液：20mMTris盐酸缓冲液(pH8.0)、250mM氯化钠、1％SDS

4.10mg/ml蛋白酶K：将100mg的蛋白酶K溶解于纯水10ml，过滤灭菌而成(-20℃保存)

5.饱和NaCl溶液

6.ExTaq^TM聚合酶

7.PCR引物(基因打靶确认用；Iiizumi et al.Nucleic Acids Res.2008Nov；36(19):6333-6342.)

HPRT-F,5'-TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG-3'(SEQ ID NO:5)

HPRT-R,5'-TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3'(SEQ ID NO:6)

【流程】

1.向24孔板中各分注1.5ml选择培养基，0.75ml增殖培养基。

2.用0.1％胰蛋白酶液处理之后，一边轻轻移液器吸吐，一边移到装有1.5ml选择培养基的孔(基因组提取用)中。

3.从移入细胞的24孔板取出0.25ml细胞液，移到装入0.75ml增殖培养基的孔(继代用)中。

4.于37℃培养2～3天。

5.除去基因组提取用24孔板的各培养液之后，加250μl的溶解缓冲液和1μl的10mg/ml蛋白酶K，一边充分移液器吸吐一边移到1.5ml管中。

6.于37℃温育一晚(或者于55℃温育1小时)。

7.加80μl的饱和NaCl溶液，充分混合。

8.再加250μl的2-丙醇，充分混合。

9.以15,000rpm、于4℃进行15分钟离心。

10.除去沉淀，用0.5ml的70％乙醇清洗。

11.将沉淀溶解于30～100μl的TE溶液。

12.以制备的基因组DNA作为模板，使用引物HPRT-F和HPRT-R，在下述的反应条件下进行PCR，筛选靶克隆。

【表2】

作为药剂抗性基因，代替潮霉素抗性基因而使用嘌呤霉素抗性基因或eGFP基因和嘌呤霉素抗性基因的融合基因，重复上述的操作，制作打靶载体。

另外，作为使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，代替IRES序列而使用IRES2序列或2A肽序列，重复上述的操作，制作打靶载体。

对于用PCR筛选被判断为阳性的克隆，由DNA印迹解析确认发生正确的同源重组反应。

【结果】

下表总结了使用人HT1080细胞进行的基因打靶的结果。在“有阴性(负)选择(DT-A)”中使用在5'臂的上游上附加SA-IRES-DTA-pA盒的打靶载体。

【表3】

由以上的结果得知，使用外显子截留型的打靶载体，向其中导入阴性选择用的盒，则伴随随机插入频度显著的降低而以高效率进行基因打靶。

将本说明书中引用的全部的刊物、专利及专利申请直接作为参考并入本说明书中。

【工业实用性】

本发明在基础生物学领域、医疗领域、农畜产领域中的基因敲除或基因捕获的广泛使用化－效率化中有效。

【序列表说明】

SEQ ID NO:1示以人HPRT基因作为目标的5’臂扩增用的正向引物的DNA序列。

5’-GGGGACAACTTTGTATAGAAAAGTTGCACATCACAGGTACCATATCAGTG-3’

【加下划线部是attB4序列的】

SEQ ID NO:2示以人HPRT基因作为目标的5’臂扩增用的反向引物的DNA序列。

5’-GGGGACTGCTTTTTTGTACAAACTTGCACATCTCGAGCAAGACGTTCAGT-3’

【加下划线部是attB1序列的】

SEQ ID NO:3示以人HPRT基因作为目标的3’臂扩增用的正向引物的DNA序列。

5’-GGGGACAGCTTTCTTGTACAAAGTGGCCTGCAGGATCACATTGTAGCCCTCTGTGTGC-3’

【加下划线部是attB2序列的】

SEQ ID NO:4示以人HPRT基因作为目标的3’臂扩增用的反向引物的DNA序列。

5’-GGGGACAACTTTGTATAATAAAGTTGCTATATTACCCTGTTATCCCTAGCGTAACTCAGGGTAGAAATGCTACTTCAGGC-3’

【加下划线部是attB3序列的】

SEQ ID NO:5示基因打靶确认用的PCR引物(HPRT-F)的DNA序列。

HPRT-F,5'-TGAGGGCAAAGGATGTGTTACGTG-3'

SEQ ID NO:6示基因打靶确认用的PCR引物(HPRT-R)的DNA序列。

HPRT-R,5'-TTGATGTAATCCAGCAGGTCAGCA-3'

SEQ ID NO:7示引物DTA-Sal Fw(5'-GTCGACATGGATCCTGATGATGTTGTTGAT-3')的DNA序列。

SEQ ID NO:8示引物DTA-Not Rv(GCGGCCGCTTAGAGCTTTAAATCTCTGTAGGTA)的DNA序列。

Claims

1.基因打靶载体，其具有与目标部位的5’上游区域相同的DNA和与目标部位的3’下游区域相同的DNA夹阳性选择标志物的结构，其中上述阳性选择标志物的5’上游附加有剪接受体部位和使双顺反子性表达成为可能的DNA序列，再者，上述与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游也附加有剪接受体部位。

2.权利要求1所述的载体，其中阳性选择标志物附加有多聚A序列，但不附加有启动子。

3.权利要求1或2所述的载体，其中与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游上附加的剪接受体部位的3’下游附加有多聚A序列。

4.权利要求3所述的载体，其中与目标部位的5’上游区域相同的DNA的5’上游上附加的剪接受体部位和其3’下游上附加的多聚A序列之间导入有阴性选择标志物。

5.权利要求1～4之任一项所述的载体，其中再导入有线性化部位。

6.制作基因敲除细胞的方法，其包括使用权利要求1～5之任一项所述的基因打靶载体，向细胞导入基因变异。