JP7184364B2 - ゲノム編集のための方法 - Google Patents

Description

本発明は、ゲノム編集のための新規方法に関する。より具体的には、本発明は、マイクロホモロジー媒介末端結合又は一本鎖アニーリングを使用する、選択マーカー遺伝子等の導入遺伝子の宿主ゲノムからの痕跡が残らない（ｓｃａｒｌｅｓｓ）切除方法に関する。本発明はまた、上記方法を使用する、そのゲノム中の標的化された領域中に変異を有する細胞及び該変異を持たない同質遺伝子細胞の作製等に関する。

機能ゲノム科学は、タンパク質活性又は遺伝子発現の制御に関与する変異を引き起こす又は復帰させるために、遺伝子ターゲティングに頼る。この方法論は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等のデザイナーヌクレアーゼ系の開発を通して、種を超えて非常に進展し（Kim and Kim, Nature reviews Genetics 15, 321-334, 2014; Sakuma and Woltjen, Dev Growth Differ 56, 2-13, 2014)、効率的かつ再現性のあるゲノム切断に加えて、プログラム可能なｓｇＲＮＡクローニングの単純性のため、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が先導的な役割を担っている。実験デザイン及びＤＮＡ切断機構における差異にもかかわらず、全ての設計されたヌクレアーゼは、標的化された二本鎖切断（ＤＳＢ）を発生させて細胞修復経路を誘導することによって機能する。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介したエラープローン修復が典型的には遺伝子破壊に十分である一方で、相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ：ＨＤＲ）は、標的化された二本鎖切断の修復においてドナーとして作用するカスタム鋳型ＤＮＡによって取って代わられ得、これによってより特異的な遺伝子編集が可能となる。これらの進歩は、ヒト遺伝学分野において、疾患モデル化のための特別な興味の対象であり、ここで、ヌクレアーゼを用いたヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）における遺伝子ターゲティングは、元の患者ｉＰＳＣ株を、同質遺伝子コントロールとして働くことを可能とする（Hockemeyer and Jaenisch, Cell stem cell 18, 573-586, 2016）。

ヌクレアーゼ技術における近年の進展は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）又はｉＳＰＣへの遺伝子ターゲティング効率をきちんと向上させたものの、患者の変異を模倣又は修正する単一ヌクレオチドバリエーションの定着は、濃縮及び選択のための頑強な手段なしでは難しいままであり、そのために抗生物質耐性マーカーの陽性選択が、遺伝子ターゲティングにおいて主要な要素として残っている（Capecchi, Nature reviews Genetics 6, 507-512, 2005）。そのうえ、陽性選択は、最小限の労力でクローン集団を産生するための方法を提供する。陽性選択を用いた従来の遺伝子ターゲティングによるゲノム編集では、抗生物質選択マーカーの痕跡を残さない切除は重要な工程であるが、それにも関わらず、現在の方法を使用することでは難しいままである。Ｃｒｅ－ｌｏｘＰ組換え等の方法（Davis et al., Nature protocols 3, 1550-1558, 2008）、及びより最近では、切除を生じやすい転移（Firth et al., Cell reports 12, 1385-1390, 2015）が、選択カセットの効用が使われた後に、それらを除去することが示されてきた。しかしながら、これらの方法は、残余リコンビナーゼ部位（Meier et al., FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 24, 1714-1724, 2010）、低頻度の切除、及びカセットの再組込みの可能性（Ye et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 111, 9591-9596, 2014）等の複雑な事態を伴う。したがって、痕跡が残らない切除を達成するための別の方法を探す必要がある。

内因性の細胞修復経路のレパートリー内において、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）及び一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）は、正当に評価されていないＤＳＢ修復のための機構である。ＭＭＥＪ及びＳＳＡは、ＤＳＢのいずれかの側に生じて末端結合を媒介する、それぞれ天然起源の、５～２５ｂｐのマイクロホモロジー（μＨ）又はそれより大きい（＞３０ｂｐ）ホモロジー、を利用するＫｕ非依存的な経路である（McVey and Lee, Trends in genetics : TIG 24, 529-538, 2008）。ＭＭＥＪの結果は、１コピーのμＨを保持する一方で、介在配列の再現可能な除去である。この理由のため、ＭＭＥＪは通常、精密な除去による遺伝情報の全体的な消失のために、変異原性であるとみなされている。

本発明において、発明者らは、ＭＭＥＪを使用することによって、高忠実度の切除という問題に取り組んだ。点変異が陽性選択カセットと並置される標準的なドナーベクターデザインを使用して、発明者らは、左及び右のホモロジーアームにおいて、単純なＰＣＲによって産生されたオーバーラップを介して、μＨが選択カセットに隣接するよう操作することに取り掛かった。遺伝子ターゲティングに対する陽性選択の後、発明者らは、カセットとμＨとの間に入れ子状態にされた、検証されかつ標準化されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プロトスペーサーを使用してＤＳＢを導入し、細胞を刺激して、ＭＭＥＪを利用してカセットを痕跡が残らないように切除させ、遺伝子座でのデザイナー点変異のみを残させた。その上、不完全なマイクロホモロジーを利用して、発明者らは、同一の実験から、同質遺伝子変異体及びコントロールのｉＰＳＣ株を産生することが可能であることを実証し、この分野におけるヌクレアーゼの影響及び細胞培養操作に対する現在の懸念に取り組んだ。最後に、発明者らは、この技術を利用して、高尿酸血症によって引き起こされる痛風を呈している患者において発見されたＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}の部分的な酵素欠損（Wilson et al., J Biol Chem 256, 10306-10312, 1981）のｉＰＳＣモデルを開発し、細胞代謝の手段を使用してｉＰＳＣクローン間の一貫した分子表現型を樹立した。我々はこの技術が、痕跡が残らないｉＰＳＣゲノム編集でさえも超えて、幅広い適用を持つことを期待する。我々はＭＭＥＪを実施例として使用したものの、ＳＳＡもまたＭＭＥＪと共通する遺伝的要件を共有し、適用可能である。

即ち、本発明は：
［１］痕跡が残らないゲノム配列を有する細胞を製造する方法であって、ゲノム内の標的化された領域中へと挿入された外因性核酸配列が完全に切除され、
ここで、該外因性核酸配列が、各末端における標的化された領域中のゲノム配列と相同な核酸配列と、二つの該相同な核酸配列間の１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位と、を含み、かつ該方法が：
（１）該配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を、該外因性核酸配列が挿入されるゲノム配列を有する宿主細胞中へと導入する工程；及び
（２）工程（１）で得られた細胞を培養する工程、を含み、
これによって、該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位における二本鎖切断、及びこれに続いて、その結果生じる該相同な核酸配列を含む切断末端間におけるマイクロホモロジー媒介末端結合又は一本鎖アニーリングが引き起こされて、該外因性核酸配列が標的化された領域から完全に切除されて痕跡が残らないよう復帰されたゲノム配列を有する細胞が産生される、
方法；
［２］該外因性核酸配列が、２つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含み、かつそのうちの２つがそれぞれ、該２つの相同な核酸配列に実質的に隣接し、外因性遺伝子が該２つの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位の間に挿入される、［１］記載の方法；
［３］該外因性遺伝子が、選択マーカー遺伝子である、［２］記載の方法；
［４］該相同な核酸配列のどちらか一方又は両方が、対応する内因性ゲノム配列中に変異を有する、［１］～［３］のいずれかに記載の方法；
［５］該相同な核酸配列の両方が同一の変異を有し、それによって該標的化された領域中に変異を持つゲノム配列を有する細胞が産生される、［４］記載の方法；
［６］該相同な核酸配列のどちらか一方が変異を有し、それによって該標的化された領域中に変異を持つゲノム配列を有する細胞と、該変異を持たない同質遺伝子細胞が同時に産生される、［４］記載の方法；
［７］該配列特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である、［１］～［６］のいずれかに記載の方法；
［８］該宿主細胞が、
該外因性核酸配列を含み、該外因性核酸配列の両末端に該相同な核酸配列と相同なゲノム配列の両末端にフランキングゲノム配列をそれぞれ含む核酸を細胞中に導入し、
それによって、相同組換えによって宿主ゲノムの標的化された領域内へ該外因性核酸配列が挿入される、
ことによって得られる、［１］～［７］のいずれかに記載の方法；
［９］該フランキングゲノム配列のどちらか一方又は両方が、対応する内因性ゲノム配列内に変異を有し、それによって該フランキングゲノム配列内に該変異を持つゲノム配列を有する細胞が産生される、［８］記載の方法；
［１０］該相同組換えが、各フランキングゲノム配列内の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位における配列特異的二本鎖切断によって媒介される、［８］又は［９］に記載の方法；
［１１］該配列特異的ヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓである、［１０］記載の方法；
［１２］該宿主細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である［１］～［１１］のいずれかに記載の方法；
［１３］該標的化された領域が、その部位における変異が疾患を引き起こす部位を含む、［１］～［１２］のいずれかに記載の方法；
［１４］（ａ）宿主ゲノム内の標的化された領域に相同な２つの核酸配列であって、該核酸配列のうちの１つの３’末端と、他方の核酸配列の５’末端とがオーバーラップする、２つの核酸配列；及び
（ｂ）該（ａ）の２つの核酸配列の間の１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位、
を含む、［８］～［１１］のいずれかに記載の方法における使用のための核酸；
［１５］該外因性核酸配列が、２つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含みかつそれらのうちの２つがそれぞれ、該（ａ）の２つの核酸配列に実質的に隣接して配置され、該２つの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位の間に外因性遺伝子が挿入されている、［１４］記載の核酸；
［１６］（ａ）［１４］又は［１５］の核酸;及び
（ｂ）（ａ）の核酸に含まれる該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識する１つ以上の種類の配列特異的ヌクレアーゼ、又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸、
を含む、［８］～［１１］のいずれかに記載の方法における使用のためのキット；
［１７］該配列特異的ヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓである、［１６］記載のキット；
等、を提供する。

本発明のカセット切除方法の適応性は、遺伝子又は細胞治療の適用における外来性の遺伝因子の除去、そしておそらく条件的な遺伝子操作においてですら、より幅広い適用を有し得る。

図１は、ＨＰＲＴ１遺伝子座のＴＡＬＥＮによる破壊は、ＭＭＥＪによって偏ることを示す。Ａ．スプライスジャンクションを含むエキソン３及び４のセグメント（オレンジ）、ＨＰＲＴ１_Ｂ ＮＣ又はＡｖｒ－ＴＡＬＥＮ標的化された領域（緑）、及びミスマッチ塩基（Ａ／Ｔ）を赤で示した予測されるμ５Ｗ３マイクロホモロジー（青）の詳細を示す、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子座の概略図。染色体における配置は、ヒトＧＲＣｈ３８を参照する。ＨＰＲＴコドンは、上部に番号をつけてある。１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣゲノムのシーケンストレースは、下部に示される。ＳＤ、スプライスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター。Ｂ．ＨＰＲＴ１＿Ｂ Ａｖｒ－ＴＡＬＥＮでの１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣの処置後の６－ＴＧ^Ｒクローンにおける修復の結果の概略。個々のクローン配列は、図５に表示されている。Ｃ．２つの最もよく観察される１７ｂｐの欠失である、Δ１７Ａ及びΔ１７Ｔの配列。Ｄ．ＭＭＥＪによるΔ１７Ａ又はΔ１７Ｔのいずれかの形成につながる分子修復現象の概略図。最終的な結果（Ａ又はＴ）にかかわらず、１７ｂｐの介在配列は同様に切除されることが認められる。μＨ、マイクロホモロジー（青）。 図２は、ヒト女性ｉＰＳＣクローンにおけるＮＣ－ＴＡＬＥＮ誘導性突然変異のスペクトルを示す。 ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＮＣ－ＴＡＬＥＮで処置し、ＳＮＬフィーダー上で６－ＴＧ選択によって濃縮した４０９Ｂ２（女性）ｉＰＳＣクローン由来のＨＰＲＴ１アレルの配列。ＳＮＬフィーダー条件下では、多くの女性ｉＰＳＣが、２つの活性Ｘ染色体を有し（Tomoda et al., Cell stem cell11, 91-99, 2012）、したがって、６－ＴＧ選択に抵抗するためには両ＨＰＲＴ１アレルの破壊が必要である（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）。標的化された領域のPCR増副産物をTAクローニングして、各形質転換由来の少なくとも８つの細菌コロニーをＰＣＲ増幅して、サンガーシーケンシングによって個々のアレルを決定した。クローンは数値順に、アレルはアルファベット順に標識してある。２つより多いアレルを持つｉＰＳＣクローンはおそらくモザイク集団を示す。大文字は、ＴＡＬＥＮ結合部位を表す（図１）。挿入された塩基は斜体で表される。欠失又は挿入サイズは、右に示される。ＲＥＦ、親４０９Ｂ２ ｉＰＳＣ基準ゲノム配列；ＮＯＲＭ、シーケンシングによって調査された領域に関して非変異のアレル。 図３は、最新のＴＡＬＥＮの構造が、ＨＰＲＴ１_Ｂの切断活性を向上させることを示す。Ａ.ザントモナス・オリゼ・パソバー（ＰｔｈＸｏ１）ベースのＴＡＬＥスキャフォールド（NC-TALEN, Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）、又は改変斑点細菌病菌（ＡｖｒＢｓ３）ベースの＋１３６／＋６３スキャフォールド（Avr-TALEN, Sakuma et al., Scientific reports 3, 3379, 2013）を使用して組み立てられたＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮの活性を比較するＳＳＡアッセイ。ＰｔｈＸｏ１ベースのＡＡＶＳ１ ＮＣ－ＴＡＬＥＮ（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）が、基準として含まれている。比率、測定されたＦｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の比率の計算値。Ｂ．ＨＰＲＴ１の破壊を示す、６－ＴＧ^Ｒコロニー形成によって測定された１３８３Ｄ６男性ｉＰＳ細胞におけるＴＡＬＥＮ活性。ヌクレアーゼの非存在下における自発的なコロニー形成は認められなかった。アッセイのために、１μｇの各ヌクレアーゼをエレクトロポレーションによって１×１０^６個の細胞内へと遺伝子導入し、次いで、５×１０^５個の細胞／６０ｍｍシャーレの密度でプレートに撒いた。ｉＰＳＣは、材料と方法において記載されているように選択されて染色された。Ｃ．陽性選択ドナープラスミド（図７Ａ）での同時導入にあたり、Ｐｕｒｏ^Ｒコロニー形成によって決定されたように、Ａｖｒ－ＴＡＬＥＮは、１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣにおいてより高いレベルの遺伝子ターゲティングを達成する。プロモーターのない２Ａ－ｐｕｒｏカセットを活性化させるためにはインフレームのジーントラップが必要であり、したがってオフターゲットの挿入又は無作為の組込みはまれである。ヌクレアーゼの非存在下における自発的なコロニー形成は認められなかった（図示せず）。アッセイのために、１μｇの各ヌクレアーゼ及び３μｇのドナーベクターをエレクトロポレーションによって１×１０^６個の細胞内へと遺伝子導入し、次いで、５×１０^５個の細胞／６０ｍｍシャーレの密度でプレートに撒いた。ｉＰＳＣは、材料と方法において記載されているように選択されて染色された。 図４は、ＨＰＲＴ１_Ｂ ＴＡＬＥＮで標的化された部位における挿入欠失形成のＴＩＤＥ解析を示す。Ａ．ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮによって標的化される遺伝子座を解析するために使用したゲノムＰＣＲアッセイの概略図。ＴＩＤＥ解析では、図示したとおり、切断点をスペーサーの初めに配置した（黒の矢印）。 図４は、ＨＰＲＴ１_Ｂ ＴＡＬＥＮで標的化された部位における挿入欠失形成のＴＩＤＥ解析を示す。Ｂ．元の１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣ、及びＴＡＬＥＮでの処置後の６－ＴＧ^Ｒ集団のシーケンストレースファイル。ＴＩＤＥ解析で使用された切断点の位置が示されている（黒の矢印）。多義性の（ａｍｂｉｇｕｏｕｓ）Ａ／Ｔ塩基が、予測された切断点の上流に認められる（赤の矢印）。Ｃ.オンラインＴＩＤＥソフトウェアによって決定された異常配列のプロット。矢印はＢと同様である。Ｄ.ＴＩＤＥによって予測されたとおりの混合６－ＴＧ^Ｒ ｉＰＳＣ集団における挿入欠失のスペクトル。挿入よりも欠失が多くみられ、１７ｂｐ欠失に対して明らかな偏りがある。パネルＣ及びＤのデータは、独立した実験をまたいで再現された（ｎ＝３）。 図４は、ＨＰＲＴ１_Ｂ ＴＡＬＥＮで標的化された部位における挿入欠失形成のＴＩＤＥ解析を示す。Ｅ.元のＨ１ ＥＳＣ、及びＴＡＬＥＮでの処置後の６－ＴＧ^Ｒ集団のシーケンストレースファイル。ＴＩＤＥ解析で使用された切断点の位置が示されている（黒の矢印）。多義性の塩基が、予測された切断点の上流に認められる（赤の矢印）。Ｆ.オンラインＴＩＤＥソフトウェアによって決定された異常配列のプロット。矢印はＥと同様である。Ｇ.ＴＩＤＥによって予測されたとおりの混合６－ＴＧ^Ｒ ＥＳＣ集団における挿入欠失のスペクトル。１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣと同様に、挿入よりも欠失が多くみられ、１７ｂｐ欠失に対して明らかな偏りがある。 図５は、ヒト男性ｉＰＳＣクローンにおけるＡｖｒ－ＴＡＬＥＮ誘導性変異のスペクトルを示す。ＨＰＲＴ１＿Ｂ Ａｖｒ－ＴＡＬＥＮで処置し、フィーダーを含まない条件下で６－ＴＧ選択によって濃縮した１３８３Ｄ６（男性）ｉＰＳＣクローン由来の一連の個々のクローンにおいて検出された、ＨＰＲＴ１アレル型の配列。標的化された部位のＰＣＲアンプリコンを、直接サンガーシーケンスにかけた。クローンは、番号順に標識されている。混合配列は、解析には含まなかった。大文字は、ＨＰＲＴ１_Ｂ Ａｖｒ－ＴＡＬＥＮ結合部位を表す。挿入された塩基は、斜体で示される。欠失又は挿入部位は、右に示す。図１Ｃ中に示されている４つの複合アレルのうち３つは、ミスセンス変異又は挿入塩基を持つΔ１７Ｔアレルであった（例示せず）。Δ１７を除き、最も一般的な欠失はΔ４６であり（１０％又は３／３０の欠失）、ここで欠失の境界は、予測された「ＧＡＴＴ」μＨに続くＴリッチな配列内配置されていた。ＲＥＦ、親１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣ基準ゲノム配列。 図６は、１３８３Ｄ６親及びＨＰＲＴ１ノックアウトｉＰＳＣクローンの薬剤感受性を示す。代表的なＨＰＲＴ１ノックアウトクローンｉＰＳＣ株の、６－ＴＧ又はＨＡＴ培地での３日間の処置後のクリスタルバイオレット染色。ＰＣＲによる遺伝子型決定及びシーケンシングによって特定されたとおり（図５）、耐性と感受性とは、ＨＰＲＴ１遺伝子座の状態と相関する。 図７は、設計されたマイクロホモロジーが、痕跡が残らないカセット切除を可能とし、点変異が定着したことを示す。Ａ．ＨＰＲＴ遺伝子座をサイレントに改変するのに使用したＭｈＡＸ技術の概略図。ドナーベクターのホモロジーアームを、陽性／陰性（＋／－）抗生物質選択カセット（グレー）に隣接する１１ｂｐの直列型のマイクロホモロジー（μＨ；青）を作り出すように、オーバーラップを持つよう設計した。相補的なプロトスペーサー配列（黒）は、μＨとカセットとの間に分岐した配向性で入れ子状態にした。プロトスペーサー配列と削除した部位の位置は、上に示した（緑）。この実施例において、μＨにおいて内因性のμ５Ｔ３（図１Ａ）が使用され、変異（赤）は右のホモロジーアーム内の特有の領域に配置されて、内因性のμ５Ａ３配列を破壊している。ＨＰＲＴ１_Ｂ Ａｖｒ－ＴＡＬＥＮ（図示せず）を使用して遺伝子ターゲティングを亢進させ、ピューロマイシンでの陽性選択は標的クローンを濃縮する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９での処置にあたり、隣接するＤＳＢが設計されたμＨの近位に作り出される。ＭＭＥＪによる修復が、カセットを痕跡が残らないよう切除し、３つのサイレント変異のみが残される（赤）。遺伝子ターゲティング及びスクリーニングは、図３に詳述される。 図７は、設計されたマイクロホモロジーが、痕跡が残らないカセット切除を可能とし、点変異が定着したことを示す。Ｂ．ｉＰＳＣコロニーのクリスタルバイオレット染色によって示される、ＨＰＲＴ遺伝子座の操作の間の薬剤耐性の逆転。ピューロマイシン耐性（ｐｕｒｏ）は、標的カセットの存在を示し、一方で６－ＴＧ及びＨＡＴ耐性はそれぞれ、ＨＰＲＴ酵素の欠損又は活性を示す。パネルＡに示される操作された変異は、意図されたとおりサイレントである。Ｃ．ＨＡＴによって選択されたクローンのサザンブロット解析は、検出可能なカセットの再組込みは起こらず（ＴＫプローブ、右）に、ＨＰＲＴ１遺伝子座が回復した（ＨＰＲＴ－Ｂプローブ、左）こと示す。元の１３８３Ｄ６及び親０１６－Ａ３標的化ｉＰＳＣクローンが、コントロールとして含まれている。Ｄ．ＨＡＴ選択圧があるか又はない場合のＭＭＥＪ率及び切除の忠実度を決定した。高品質の配列読み取りデータのみを、解析において考慮した。ＭＭＥＪ率は、（ＭＭＥＪ修復／解析されたサンプル数）として計算している。痕跡が残らない切除は、追加の塩基変異を一切持たないＭＭＥＪ修復事象をいう。「忠実度」は、（「痕跡が残らない切除」／「ＭＭＥＪ修復」）として計算されている。Ｅ．痕跡が残らないＭＭＥＪ（左）又は伝統的なＮＨＥＪ（右）を介したカセット切除後のｉＰＳＣクローンのシーケンストレースファイルであり、後者は、ＣＲＩＳＰＲ誘導性ＤＳＢによって形成されると予測される末端の直接融合の結果起こる。 図８は、サイレント点変異を定着させるための切除可能なカセットを用いたＨＰＲＴ遺伝子座の標的化を示す。Ａ．通常のＨＰＲＴアレルの一部を示す概略図。エキソンはグレーで示されている。オーバーラップするホモロジーアーム（ＨＡ－Ｌ／Ｒ）は、白で示されている。μＨ領域は青で示されている。黒の棒は、サザンブロットのプローブを示す。標的クローンをスクリーニングするために使用されるプライマーは赤で示されている。Ｂ．ＰＣＲ及びサザンブロットスクリーニングの戦略に関する詳細を含む、標的ＨＰＲＴアレルの概略図。プロモーターのない２Ａ－ｐｕｒｏ－ΔＴＫカセットを、ＨＰＲＴエキソン３のインフレームに挿入した。ｅＧＦＰ１のＣＲＩＳＰＲで標的化された領域は、緑で示されている。サイレント変異は、赤で強調されている。Ｃ．定着した変異を持つ、切除されたＨＰＲＴアレルの概略図。 図８は、サイレント点変異を定着させるための切除可能なカセットを用いたＨＰＲＴ遺伝子座の標的化を示す。Ｄ．ターゲティング後の遺伝子座とカセットとの接合部（グレー）を示す、クローン016-A3のサンガーシーケンス結果。隣接するμＨ（青）、ｅＧＦＰ１プロトスペーサー（緑）とその予測された切断部位（緑の矢印）、及びサイレント点変異（赤）が示されている。Ｅ．遺伝子ターゲティングに次ぐ、選択クローンのサザンブロットの結果。パネルＡ及びＢにおいて予測されたバンドサイズが、示されている。１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣが、コントロールとして含まれている。Ｆ．ｐＸ３３０ベースの ｓｇＲＮＡ発現ベクターで処置した０１６－Ａ３ ｉＰＳＣからのＨＡＴ^Ｒコロニー形成のクリスタルバイオレット染色であり、カセットの切除及びＨＰＲＴ遺伝子座の回復を示す。ＨＡＴＲコロニーは、ヌクレアーゼの非存在下又は非ターゲティングｓｇＲＮＡであるｅＧＦＰ２をコードするｐＸ３３０ベクターの遺伝子導入に次いでは、観察されなかった。 図９は、ｓｇＲＮＡの切断活性に関するスクリーニングを示す。Ａ．ｐＸ３３０ ｓｇＲＮＡ及びＣａｓ９発現ベクター（Ran et al., 2013）、並びにプラスミド切断アッセイで使用された、関連するｐＧＬ４－ＳＳＡ標的プラスミドの図表。３つのｅＧＦＰプロトスペーサー配列（Fu et al., 2013b）が示されている。Ｂ．ルシフェラーゼ発現によって決定されたＳＳＡの相対活性。 図９は、ｓｇＲＮＡの切断活性に関するスクリーニングを示す。Ｃ．ｉＰＳＣにおけるゲノム切断活性を評価するために、トランスジーン破壊アッセイが設計された。３１７－Ａ４ ｉＰＳＣは、ＡＡＶＳ１遺伝子座へ標的化された、構成的に発現するＣＡＧ：：ｅＧＦＰレポータートランスジーンについてヘテロ接合性である（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）。３つのｓｇＲＮＡの相対的な配置が示されている。ヌクレアーゼ処置６日後のＧＦＰ発現についての顕微鏡観察及びＦＡＣＳ解析が使用されて、３つのｓｇＲＮＡの活性が比較された。スケールバー、２００μｍ。 図１０は、不完全なマイクロホモロジーが、患者の変異を持つｉＰＳＣと、それらの同質遺伝子のコントロールｉＰＳＣを同時に作出することを示す。Ａ．ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}患者の変異と、同質遺伝子コントロールｉＰＳＣを作製するためのＭｈＡＸ技術の概略図。ドナーベクター及びカセットは本質的に、図７Ａ中で記載されているように操作されているが、いくつかの重要な差異があった。隣接する１３ｂｐのμＨはＳ１０４コドンが中心になるように配置され、患者の変異（Ｃ＞Ａ）が片側のみにある（片側性）か、又は両側にある（両側性）ように改変された。診断に役立つＡｆｌＩＩ制限部位を作り出すサイレントな点変異（Ｇ＞Ｔ）は、両側性に含まれている。陽性／陰性選択カセットは、ターゲティングと切除の工程をモニターするために、構成的ＣＡＧ：：ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを利用する。ＨＰＲＴ１＿Ｂ Ａｖｒ－ＴＡＬＥＮ（図示せず）が遺伝子ターゲティングの亢進に使用され、ピューロマイシン及びｍＣｈｅｒｒｙでの陽性選択が、標的クローンを濃縮する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９での処置にあたり、隣接するＤＳＢが、操作されたμＨの近位で生じる。ＭＭＥＪによる修復は、カセットを痕跡が残らないよう切除し、その結果として、操作された変異の２つの結果が生じ得る。切除されたクローンは、ｍＣｈｅｒｒｙ陰性である。Ｂ．ｉＰＳＣコロニーのクリスタルバイオレット染色によって示される、ＨＰＲＴ１遺伝子座の操作の間における６－ＴＧ及びＨＡＴに対する薬剤感受性の逆転は、サイレント変異を持つクローン（０３５－Ｃ１）のみにおいて起こる一方で、クローン０３５－Ｄ１２は両方の薬剤に対して感受性のままである。元の１３８３Ｄ６及び片側性親クローン０３３－Ｕ－４５が、コントロールとして含まれている。ｍＣｈｅｒｒｙに関するＦＡＣＳ解析が、右に示されている。Ｃ．片側性又は両側性の変異を持つクローンのＭＭＥＪ率及び切除の忠実度を、ＨＡＴ選択圧ありか又はなしの場合で決定した。計算は、図７Ｄに示すとおりである。 図１０は、不完全なマイクロホモロジーが、患者の変異を持つｉＰＳＣと、それらの同質遺伝子のコントロールｉＰＳＣを同時に作出することを示す。Ｄ．クローン０３３－Ｕ－４５からの痕跡が残らないＭＭＥＪカセット切除に次ぐ、サイレント変異のみ又はＭｕｎｉｃｈ変異を持つｉＰＳＣクローンのシーケンストレースファイル（片側性の変異）。両方の種類のクローンは、同一の実験から単離された。Ｅ．切除されたクローンのサザンブロット解析は、検出可能なカセットの再組込みをすることなく（ｍＣｈｅｒｒｙプローブ、下部）、ＨＰＲＴ１遺伝子座が回復されたこと（ＨＰＲＴ－Ｂプローブ、上部）を明らかにする。元の１３８３Ｄ６並びに親０３３－Ｕ－４５及び０３３－Ｂ－４３標的化ｉＰＳＣが、コントロールとして含まれている。アステリスク（＊）は、クローン０３５－Ｇ８における第二のバンドの検出を示し、薬剤選択は、モザイク現象を確証させた（データは示さず）。 図１１は、不完全なマイクロホモロジーを持つＭｈＡＸ選択マーカーでのＨＰＲＴ遺伝子座のターゲティングを示す。Ａ．通常のＨＰＲＴアレルの一部を示す概略図。エキソンは、グレーで示されている。オーバーラップするホモロジーアーム（ＨＡ－Ｌ／Ｒ）は、白色で示されている。μＨ領域は青で示されている。黒の棒は、サザンブロットのプローブを示す。標的クローンをスクリーニングするために使用されるプライマーは赤で示されている。Ｂ．ＰＣＲ及びサザンブロットスクリーニングの戦略に関する詳細を含む、標的ＨＰＲＴアレルの概略図。プロモーターのない２Ａ－ｐｕｒｏ－ΔＴＫ；ＣＡＧ：：ｍＣｈｅｒｒｙ選択マーカーを、ＨＰＲＴエキソン３のインフレームに挿入した。ＣＡＧ：：ｍＣｈｅｒｒｙは、ターゲティング及び切除の検出を向上させる。ＧＦＰ１のＣＲＩＳＰＲ標的化された領域は、緑で示されている。サイレント変異は、赤で強調されている。Ｃ．サイレントもしくはＭｕｎｉｃｈ変異が定着した（上部）、又はサイレント変異のみが定着した（下部）、切除に次ぐ２つの潜在的なＨＰＲＴアレルの概略図。サイレント変異によって作出されたＡｆｌＩＩ部位が示されている。 図１１は、不完全なマイクロホモロジーを持つＭｈＡＸ選択マーカーでのＨＰＲＴ遺伝子座のターゲティングを示す。Ｄ．片側性又は両側性のいずれか一方の変異μＨで各々標的化され、ｍＣｈｅｒｒｙ（上部）又はＨＰＲＴ（下部）のいずれか一方でプロービングされた９６個のｉＰＳクローンのサザンブロットの結果。ジーントラップ選択で環状プラスミドドナーを使用するときに最も一般的なバックグラウンドの供給源であるドナーベクターバックボーンの組込み（Oceguera et al.）の結果として現れる８．８ｋｂｐのバンドとともに、パネルＡ及びＢにおいて示された予測された６．８ｋｂｐ（正常）及び９．８ｋｂｐ（標的化された）のバンドサイズが示されている。選択されたクローン（０３３－Ｕ－４５及び０３３－Ｂ－４３）は、アステリスクで示されている。１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣが、コントロールとして含まれている。Ｅ．片側性又は両側性のホモロジーを持つよう操作されたｉＰＳＣクローンからのＭｈＡＸに次ぐＰＣＲアンプリコンのＡｆｌＩＩ制限処理は、試験された全クローンにおけるサイレント（Ｓ）変異の存在を示す。「Ｍ」で標識されたクローンは、シーケンシングによって、Ｍｕｎｉｃｈ変異も含むことが見いだされた。１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣが、切断の陰性コントロールとして含まれている。 図１２は、カセットが切除されたクローンのＦＡＣＳによる単離を示す。Ａ．ｅＧＦＰ１ ｓｇＲＮＡ発現ベクターでの処置６日後のカセットを切除されたクローンを濃縮するためのＦＡＣＳ分取スキームの概要。両側性又は片側性のμＨのいずれか一方を持つ複数のクローンにおいて、同様の切除率（～１～２％）が観察された。Ｂ．ｍＣｈｅｒｒｙ陰性及び陽性の細胞集団が分取され、純度が検証され、次にＨＡＴ選択あり又はなしでプレートに撒いた。クローン解析を行って、ＭｈＡＸの頻度及び忠実度、並びに片側性μＨの点変異の定着率が決定された。結果は、図１０Ｅ中に要約されている。観察された選択圧の非存在下におけるμ１１の修復率（～１５％）に基づき、我々は、同様のコロニー数を得るために、非選択細胞よりも１０倍高い密度でＨＡＴ選択下の細胞をプレートに撒くことを選んだ。 図１３は、代謝的な表現型の決定がＨＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}ｉＰＳＣにおけるプリンサルベージ欠損を確証させることを示す。Ａ．プリン代謝におけるデノボ合成及びサルベージ経路。ＨＰＲＴは、グアニンのグアニン一リン酸（ＧＭＰ）への変換、及びヒポキサンチンのイノシン一リン酸（ＩＭＰ）への変換の両方を触媒する。完全な又は部分的なHPRT欠損では、代謝産物は蓄積する。キサンチンオキシダーゼ（ＸＯ）は、ヒポキサンチンを尿酸へと変換する。大部分の哺乳類と異なり、ヒトは尿酸オキシダーゼ（ＵＯＸ）を欠き、尿酸をアラントインへ酵素的に変換しない。Ｂ．ＨＡＴ選択圧の存在下での親及び操作されたｉＰＳＣの増殖曲線解析。ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ} ｉＰＳＣは、ノックアウト（Δ１７）又は標的親クローン033-U-45と比較して、ＨＡＴ感受性の低下を示す。サイレント変異を持つｉＰＳＣの増殖は、１３８３Ｄ６と識別不能である。同様に操作された遺伝子型をもつ個々のクローンの挙動は、比較可能であったことが認められる。ＨＡＴ選択２４時間後のｉＰＳＣコロニーの代表的な形態が、右に示されている。スケールバー、２００μｍ。 図１３は、代謝的な表現型の決定がＨＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}ｉＰＳＣにおけるプリンサルベージ欠損を確証させることを示す。Ｃ．親及び操作されたｉＰＳＣクローンにおけるＨＰＲＴタンパク質レベルのウエスタンブロット解析。ノックアウト株であるΔ１７及び０３３－Ｕ－４５は、ＨＰＲＴタンパク質を産生しない。ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}及びサイレントコントロールクローンにおける発現レベルは、正常の１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣに匹敵する。ＡＣＴＩＮが、負荷のコントロールとして使用されている。Ｄ．親及び操作されたｉＰＳＣからの、消費された培地のＣＥ－ＭＳ代謝産物アッセイ。ヒポキサンチン及びグアニンがＨＰＲＴ欠損の結果蓄積し、ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}細胞においてより軽度の表現型であった。サイレントコントロールｉＰＳＣは、１３８３Ｄ６と同様に挙動する。チミジンレベルは、本質的に変化しないままである。２つの独立した試料からのデータが示されている（ｎ＝２）。Ｅ．患者又は正常のｉＰＳＣからの同質遺伝子コントロールの作出は、ゲノム工学によって促進される。操作された細胞のための従来のコントロール（下部左）は、親ｉＰＳＣに直接由来するが（上部）、継代方法及び遺伝子操作方法の広がりは、説明のできない技術的なバリエーションの供給源を課す。ＭｈＡＸを不完全なμＨと一緒に使用することで、同等の実験的操作を経てきた同質遺伝子コントロール（下部右）が、同時に単離され得、同質遺伝子コントロールの相互依存に新たな側面を提供する。 図１４は、ＭＭＥＪの忠実度に影響するパラメータを示す。ａ．ｉＰＳＣ染色体からの切除を模倣する、プラスミドベースのＭＭＥＪアッセイの概略図。ＭＭＥＪ効率は、ルシフェラーゼ活性を介して測定されている。細菌選択マーカーは、プラスミドの回収及び修復事象の遺伝子型決定を可能とする。ｂ．ルシフェラーゼ活性と隣接するマイクロホモロジー長の増加との間の相関関係を示すＭＭＥＪアッセイの結果。挿入図は、バックグラウンドと比較して５ｂｐのμＨで低レベルのルシフェラーゼ活性を示す。ｃ．ＨＰＲＴ遺伝子座に標的化された１１又は２９ｂｐのμＨを持つＭｈＡＸカセットの概略図。ｄ.ｃに示されたカセットの切除に次ぐ、ＨＡＴ耐性コロニー。ｅ.より長いホモロジーでより大きなＭＭＥＪ率を示す、切除されたクローンからの遺伝子型決定の結果。ｆ.ＭＭＥＪ修復率対する異種構造の役割を観察するための、隣接するプロトスペーサーの反転。ｇ.ｆに示されたカセットの切除に次ぐ、ＨＡＴ耐性コロニー。 図１５は、不完全なマイクロホモロジーは、患者の変異を持つｉＰＳＣと、それらの同質遺伝子コントロールｉＰＳＣを同時に作出することを示す。ａ.ＡＰＲＴ*J患者変異及び同質遺伝子コントロールｉＰＳＣを作製するための、片側性μＨを用いたＭｈＡＸ技術の概略図。ＧＦＰレポーターが、無作為の組込みを除外するために、バックボーンに含まれている。ｂ.中間体及び最終クローンを標的化するＡＰＲＴ遺伝子の遺伝子型決定。ｃ.ＡＰＲＴ遺伝子ターゲティングのサザンブロットの結果。ｄ.ＡＰＲＴカセット切除のサザンブロットの結果。ｅ.ＡＰＲＴアレルのスペクトルを示す（クローン）のＭｈＡＸ切除に次ぐ遺伝子型決定の概要。ｆ.すべてのクローン的に単離されたｉＰＳＣのうちの二倍体遺伝子型決定の概要。 図１６は、ＡＰＲＴ遺伝子ターゲティング及び切除のフローサイトメトリー解析を示す。ａ.標的クローンにおけるｍＣｈｅｒｒｙ蛍光のヒストグラム。ｂ.ＭｈＡＸ切除に次ぐｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞の分取を示すＦＡＣＳプロット。 図１７は、ＦＡＣＳ分取を使用して、促進されたＡＰＲＴ遺伝子編集を示す。ａ.標的化及び切除されたｉＰＳＣを単離するためのＦＡＣＳ分取プロトコールの概略図。ｂ.ＡＰＲＴ遺伝子編集のＦＡＣＳプロット。ｃ.アレルスペクトル及び切除された集団内における分布。ｄ.切除されたクローン間のアレルスペクトル及び分布。ｅ.同質遺伝子的に対になったｉＰＳＣクローンの新規な供給源。 図１８は、ＦＡＣＳ分取を使用して、促進されたＨＰＲＴ遺伝子編集を示す。 図１９は、ＭｈＡＸのための代替のプロトスペーサーの使用を示す。ａ.ＨＰＲＴ遺伝子座を標的にする２９ｂｐのμＨ及び種々の隣接するプロトスペーサーを持つ、ＭｈＡＸカセットの概略図。ｂ.ＨＰＲＴ修復アッセイにおいて試験されたプロトスペーサーの表。ｃ.カセットの切除及びＭＭＥＪ修復に起因するＨＡＴ耐性コロニー。

本発明は、痕跡が残らないゲノム配列を有する細胞を製造する方法であって、ゲノム内の標的化された領域中へと挿入された外因性核酸配列が完全に切除される方法（以下、「本発明の方法」ともいう）、を提供する。

本明細書中、用語「痕跡が残らない」は、外因性核酸配列が挿入されているゲノム配列の標的化された領域が、外因性核酸配列の残存断片及び内在性ゲノム配列の欠失なく、その以前の状態に回復されたことを意味する。

ここで用語「標的化された領域」とは、外因性核酸配列が挿入されるゲノム中の部位及びその近傍の領域を意味し、宿主細胞ゲノムの全領域の中から任意に選択され得る。一実施態様においては、該標的化された領域は、ゲノム配列中の、変異を導入したい（もしくは変異を復元したい）部位を含む領域であってもよい。

１．外因性核酸配列
本発明においてゲノム配列から除去されるべき「外因性核酸配列」は、
（ａ）その両末端に、該標的化された領域中のゲノム配列と相同な核酸配列（以下、「相同な核酸配列」ともいう）と、
（ｂ）該2つの相同な核酸配列の間に１個以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位と
を含む。

＜相同な核酸配列＞
上記（a）の相同な核酸配列は、上記（b）の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位における二本鎖切断（DSB）によって生じる、該相同な核酸配列を含む2つの切断末端の間でマイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）又は一本鎖アニーリングによるDNA修復が起こる限り特に制限はない。相同な核酸配列の例としては、該標的化された領域内に位置する連続する5～1000ヌクレオチド程度からなる核酸配列と相同な配列が挙げられる。天然には、MMEJは5～25ヌクレオチド程度のマイクロホモロジー配列を介して起こり、SSAはより長い（例えば、30ヌクレオチド以上）相同配列を介して起こるとされる。しかしながら、本発明においては、いずれの末端修復メカニズムによっても同等の結果を生じるので、いずれのメカニズムを用いているかを厳密に特定することは重要ではない。しかしながら、本発明の相同な核酸配列の構築の容易さ等を考慮すれば、該相同な核酸配列の好ましいヌクレオチド長として、5～100ヌクレオチド、あるいは5～50ヌクレオチドが挙げられる。マイクロホモロジーの長さが増すにつれて、MMEJによる修復効率が向上することが知られている（Villarreal et al., 2012）。実際、本発明者らのプラスミド末端結合アッセイを使用する予備的研究においても、少なくとも5～50ヌクレオチドの範囲で、配列長依存的に修復効率が向上することが確認されいる。

ここで用語「相同」とは、2つの核酸配列が完全に同一である場合だけでなく、配列間で１ないし数個（例えば、1、2又は3個）のヌクレオチドが相違する場合をも包含する。従って、外因性核酸配列に含まれる該相同な核酸配列は、対応する内因性ゲノム配列に対して、1ないし数個の変異を有し得る。また、2つの相同な核酸配列は、互いに完全に同一であっても、1ないし数個のヌクレオチドが相違していてもよい。

＜配列特異的ヌクレアーゼ認識部位＞
上記（b）において用語「配列特異的ヌクレアーゼ」とは、ある特定の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して該標的ヌクレオチド配列の内部もしくはその近傍で二本鎖DNAを切断し得るヌクレアーゼを意味する。配列特異的ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ自体が配列特異性を有するものであってもよく、例えば、制限酵素が挙げられるが、（i）DNA鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体（以後、「核酸配列認識モジュール」ともいう）と、前記（i）に連結された非特異的ヌクレアーゼ（例、Fok I等）との複合体（ここでの「複合体」には、複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールとヌクレアーゼとを単一分子内に有するものも包含される）であってもよい。制限酵素認識部位よりも長いヌクレオチド配列に対する認識能力をヌクレアーゼに付与できる点で、後者がより好ましい。具体的には、好ましい配列特異的ヌクレアーゼの例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート/CRISPR関連タンパク質（CRISPR/Cas）等が挙げられる。その他、制限酵素、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNAと特異的に結合し得るタンパク質のDNA結合ドメインを有するが、DNA二重鎖切断能を有しないフラグメントに、非特異的ヌクレアーゼを連結したものも、配列特異的ヌクレアーゼとして用いることができる。さらには、PPRモチーフの連続によって配列特異性を有するように構成されたPPRタンパク質と、非特異的ヌクレアーゼを連結した人工ヌクレアーゼを用いることもできる（特開2013-128413号公報参照）。

用語「配列特異的ヌクレアーゼ認識部位」とは、上記のいずれかの配列特異的ヌクレアーゼによって特異的に認識されるヌクレオチド配列を意味し、種々の制限酵素認識部位や、転写因子、RNAポリメラーゼ等のDNA結合タンパク質と特異的に結合し得るシス配列が含まれ得る。しかしながら、これらは利用できるヌクレオチド配列が制限されることや、ゲノム上の標的化された領域以外（すなわち、オフターゲット部位）にも標的ヌクレオチド配列が存在する蓋然性が高いことから、好ましくは、配列の自由度が高い、ZFN、TALEN、又はCRISPR/Cas等の人工ヌクレアーゼにより認識されるヌクレオチド配列を、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位として選択することができる。

該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位は、MMEJ又はSSAによるDNA修復の際にゲノム配列から切り出されるので、該認識部位としては、標的化された領域におけるゲノム配列に関係なく、任意のヌクレオチド配列を用いることができる。通常、ZFN又はTALENは目的の標的ヌクレオチド配列に合わせてその都度デザインする必要があるが、本発明においては、手持ちのZFN又はTALENによって認識されるヌクレオチド配列を、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位としてそのまま用いることができる。

該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位は、2つの前記相同な核酸配列の間に1個以上含まれる。配列特異的ヌクレアーゼ認識部位におけるDSBの結果生じる、２つの相同な核酸配列の間で、MMEJ又はSSAによる修復が起こる限り、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位の数は1個でもよい。しかしながら、本発明の好ましい実施態様においては、外因性核酸配列は、1以上の外因性遺伝子（例えば、薬剤耐性遺伝子及び蛍光タンパク質遺伝子のようなレポーター遺伝子を含む選択マーカー遺伝子等）を含むので、その場合、1か所切断では効率よくMMEJ又はSSAが生じない場合があり得る。そのため、外因性核酸配列が、前記相同な配列の間に遺伝子発現カセットのような長い挿入配列を含む場合、挿入配列が２つの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位に隣接することがより好ましい。２カ所でのDSBによって長い挿入配列は除去されるため、末端付近に前記相同な配列を含む2つの切断末端が生じ、MMEJ又はSSAによるDNA修復が可能となる。

この点に関連し、前記相同な核酸配列と配列特異的ヌクレアーゼ認識部位との間に、余分なヌクレオチド配列が付加されることを排除するものではないが、当該付加ヌクレオチド配列は、2つの相同な核酸配列によるMMEJ又はSSAを妨げない程度の長さであることが望まれる。従って、好ましい実施態様においては該相同な核酸配列と該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位とは、実質的に隣接している。

一方、前記相同な配列の間に挿入されるヌクレオチド配列が十分に短い場合には、該外因性核酸配列は、該相同な配列の間に1個の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位のみを含みさえすれば、当該部位でのDSBにより生じる切断末端の間でMMEJ又はSSAを起こすことができる。例えば、宿主ゲノム上の標的遺伝子を該外因性核酸配列の挿入により一旦破壊しておいて、所望の時期に該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位におけるDSBとその後のMMEJ又はSSAによる修復により、破壊された内因性遺伝子を再活性化することができる。

尚、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位におけるDSBの結果、MMEJ又はSSAによる修復が起こり得る2つの切断末端を生じるように、1又は2個の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位が配置されている限り、前記外因性核酸配列は、さらに1個以上の余分な配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含んでいてもよい。

前記外因性核酸配列が2個以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を有する場合、それらの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位は、同一のヌクレオチド配列を有するものであっても、異なるヌクレオチド配列を有するものであってもよいが、使用する配列特異的ヌクレアーゼが1種類でよい点で、前者が有利である。

２．本発明の方法
本発明の方法は、以下の工程を含む。
（1）該外因性核酸配列が挿入されたゲノム配列を有する宿主細胞中に、該配列特異的ヌクレアーゼもしくはそれをコードする核酸を導入する工程；及び
（2）工程（1）で得られた細胞を培養する工程

本発明の方法に用いられる宿主細胞は、遺伝子操作が可能な生物由来の細胞であれば特に制限されない。すなわち、本発明の方法は、任意の生物種（例えば、大腸菌、枯草菌等の細菌、酵母、昆虫、脊椎動物（例、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳類（例、ヒト、マウス、ラット等））、植物等）の任意の細胞種（例えば、体細胞、体性幹細胞、多能性幹細胞（例、ES細胞、iPS細胞等）など）に適用可能である。好ましい一実施態様において、宿主細胞はヒト又は他の哺乳動物由来の細胞、例えばES細胞やiPS細胞等の多能性幹細胞であり得る。別の好ましい一実施態様においては、宿主細胞は、疾患特異的な遺伝子変異を有するヒトから樹立された多能性幹細胞であり得る。

＜外因性核酸配列が挿入されるゲノム配列を有する宿主細胞＞
工程（1）に用いられる外因性核酸配列が挿入されたゲノム配列を有する宿主細胞は、上記外因性核酸配列がゲノム配列中の標的化された領域内に挿入されたものであれば、いかなる手段により作製された細胞でもよい。好ましい一実施態様においては、該宿主細胞は、相同組換えにより内因性ゲノム配列の標的化された領域内に上記外因性核酸配列を挿入することにより作製されたものである。相同組換えによる上記外因性核酸配列の挿入は、例えば、該外因性核酸配列の5’及び3’末端に、該相同な核酸配列に対応する宿主細胞のゲノム配列の5’及び3’末端に隣接するゲノム配列（以下、「フランキングゲノム配列」ともいう）をそれぞれ連結した核酸、好ましくはターゲッティングベクターを該宿主細胞に常法により導入し、ゲノム中の標的化された領域内の前記相同な配列に対応するゲノム配列に、該外因性核酸配列が挿入された細胞を選択することにより行われる。

相同組換え体の選択は、該外因性核酸配列内に選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質等の薬剤に耐性を付与する遺伝子や蛍光タンパク質のように可視化できるレポーター遺伝子等）が挿入されている場合には、対応する選択マーカーを用いて（例えば、選択マーカー遺伝子が薬剤耐性遺伝子の場合、該薬剤の存在下で細胞を培養することにより）実施することができる。一方、外因性核酸配列中に選択マーカー遺伝子が含まれない場合、例えば、相同組換えによる外因性核酸配列の挿入により内因性遺伝子が破壊された結果、薬剤応答性や栄養要求性に変化が生じる場合には、当該変化を検出することにより、相同組換え体を選択することができる。

相同組換え体の作製の際に、前記相同な核酸配列中に、対応する内因性ゲノム配列に対して１もしくは数個（例えば、２、３、４、５個）のヌクレオチド変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加）を導入することができる。当該変異は、2つの該相同な核酸配列の一方もしくは両方に導入することができ、両方に導入する場合、当該変異は同一の変異であっても、異なる変異（例、異なるヌクレオチドへの置換、異なる部位での変異等）であってもよい。

あるいはまた、前記フランキングゲノム配列内に１以上の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加）を導入することもできる。当該変異も2つのフランキングゲノム配列の一方もしくは両方に導入することができる。

好ましい実施態様において、前記2つのフランキングゲノム配列中に配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を挿入したターゲッティングベクターと、該認識部位を認識する配列特異的ヌクレアーゼとを、宿主細胞に導入することにより、相同組換えの効率を向上させることができる。ここで、該フランキングゲノム配列に導入される配列特異的ヌクレアーゼ認識部位は、前記外因性核酸配列中に含まれる配列特異的ヌクレアーゼ認識部位とは異なるヌクレオチド配列からなるものである。

配列特異的ヌクレアーゼとしては、前記外因性核酸配列中に含まれる配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を認識切断する配列特異的ヌクレアーゼに関して後述するものと、同様のものを用いることができる。好ましくは、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等の人工ヌクレアーゼが挙げられる。

本発明の別の実施態様においては、工程（1）に用いられる外因性核酸配列が挿入されたゲノム配列を有する宿主細胞は、MMEJを用いて内因性ゲノム配列の標的化された領域内に上記外因性核酸配列を挿入することにより作製することができる。MMEJを用いた標的化された領域への外因性核酸配列の導入は、例えば、Nakade et al.（2014）に記載の方法に準じて行うことができる。当該手法は、前記フランキングゲノム配列を必要としないため、当該配列をクローニングする労力を削減できる点で有利である。

＜工程（１）配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸の導入＞
工程（1）に用いられる配列特異的ヌクレアーゼは、上記外因性核酸配列中に含まれる配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を認識して、当該認識部位の内部もしくはその近傍で、ゲノム配列を二本鎖切断できるものである。ここで配列特異的ヌクレアーゼとしては、上記したものを用いることができるが、好ましくは、ZFN、TALEN又はCRISPR/Casなどの人工ヌクレアーゼ（核酸配列認識モジュールとヌクレアーゼとの複合体）である。

ジンクフィンガーモチーフは、Cys2His2型の異なるジンクフィンガーユニット（1フィンガーが約3塩基を認識する）を3～6個連結させたものであり、9～18塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Modular assembly法（Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141）、OPEN法（Mol Cell (2008) 31: 294-301）、CoDA法（Nat Methods (2011) 8: 67-69）、大腸菌one-hybrid法（Nat Biotechnol (2008) 26: 695-701）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、特許第4968498号公報を参照することができる。

TALエフェクターは、約34アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、1つのモジュールの12および13番目のアミノ酸残基（RVDと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なTALエフェクターを作製することが可能である。TALエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（REAL法(Curr Protoc Mol Biol (2012) Chapter 12: Unit 12.15）、FLASH法(Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465）、及びGolden Gate法（Nucleic Acids Res (2011) 39： e82)等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するTALエフェクターを設計することができる。TALエフェクターの作製の詳細については、特表2013-513389号公報を参照することができる。

上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、ヌクレアーゼとの融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、SH3ドメイン、PDZドメイン、GKドメイン、及びGBドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼとにそれぞれインテイン（intein）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。

核酸配列認識モジュールとヌクレアーゼとが結合した複合体（融合タンパク質を含む）を含んでなる本発明の配列特異的ヌクレアーゼと、ゲノムDNAとの接触は、該配列特異的ヌクレアーゼのタンパク質導入によって行われてもよいが、好ましくは、該ゲノムDNAを有する細胞に、該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を導入することにより実施されることが望ましい。

従って、核酸配列認識モジュールと、ヌクレアーゼとは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体形成し得るような形態で、又はそれらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に核酸を配置した発現ベクターの形態で提供される。RNAの場合は、好ましくは一本鎖RNAである。

ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター等の核酸配列認識モジュールをコードするDNAは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。

ヌクレアーゼをコードするDNAは例えば、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。

クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー及び/又は核移行シグナル（目的の二本鎖DNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル）を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、ヌクレアーゼをコードするDNAに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、両DNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識変換モジュールとヌクレアーゼとが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のDNAの適当な位置に、リンカー及び/又は核移行シグナルを連結することができる。

核酸配列認識モジュールをコードするDNA、ヌクレアーゼをコードするDNAは、化学的にDNA鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴDNA短鎖を、PCR法やGibson Assembly法を利用して接続することにより、その全長をコードするDNAを構築することによって得ることができる。化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで全長DNAを構築することの利点は、該DNAを導入する宿主に合わせて使用コドンをCDS全長にわたり設計できる点にある。異種DNAの発現に際し、そのDNA配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさDNA研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html）を用いることができ、または各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするDNA配列を参照し、該DNA配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。

核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼをコードするDNAを含む発現ベクターは、例えば、該DNAを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。

発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、pBR322，pBR325，pUC12，pUC13）；枯草菌由来のプラスミド（例、pUB110，pTP5，pC194）；酵母由来プラスミド（例、pSH19，pSH15）；昆虫細胞発現プラスミド（例：pFast-Bac）；動物細胞発現プラスミド（例：pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：BmNPV、AcNPV）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。

プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものを用いてもよい。

例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（サイトメガロウイルス）プロモーター、RSV（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、MoMuLV（モロニーマウス白血病ウイルス）LTR、HSV-TK（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。

宿主が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーターなどが好ましい。

発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、複製起点などを含有しているものを用いることができる。

核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼをコードするRNAは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼをコードするDNAをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。

核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼをコードするDNAを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールとヌクレアーゼとの複合体を宿主細胞内で発現させることができる。

宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，60，160 (1968)〕，エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research，9，309 (1981)〕，エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology，120，517 (1978)〕，エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology，41，459 (1969)〕，エシェリヒア・コリC600〔Genetics，39，440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Bacillus subtilis）MI114〔Gene，24，255 (1983)〕，バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry，95，87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）AH22，AH22R-，NA87-11A，DKD-5D，20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）NCYC1913，NCYC2036，ピキア・パストリス（Pichia pastoris）KM71などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがAcNPVの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Spodoptera frugiperda cell；Sf細胞）、Trichoplusia niの中腸由来のMG1細胞、Trichoplusia niの卵由来のHigh FiveTM細胞、Mamestra brassicae由来の細胞、Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。ウイルスがBmNPVの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Bombyx mori N 細胞；BmN細胞）などが用いられる。該Sf細胞としては、例えば、Sf9細胞（ATCC CRL1711）、Sf21細胞〔以上、In Vivo, 13, 213-217 (1977)〕などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Nature，315，592 (1985)〕。
動物細胞としては、例えば、サルCOS-7細胞、サルVero細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、dhfr遺伝子欠損CHO細胞、マウスL細胞，マウスAtT-20細胞、マウスミエローマ細胞，ラットGH3細胞、ヒトFL細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のiPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。
植物細胞としては、種々の植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ等の穀物、トマト、キュウリ、ナス等の商品作物、カーネーション、トルコギキョウ等の園芸植物、タバコ、シロイヌナズナ等の実験植物など）から調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片などが用いられる。

上記いずれの宿主細胞も、半数体（一倍体）であってもよいし、倍数体（例、二倍体、三倍体、四倍体など）であってもよい。

発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、PEG法、CaCl2共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
大腸菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，69，2110 (1972)やGene，17，107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168，111 (1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology，194，182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA，75，1929 (1978)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology,6，47-55 (1988)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、及びVirology，52，456 (1973)に記載の方法に従ってベクター導入することができる。

＜工程（２）宿主細胞の培養並びにＤＳＢ及びＭＭＥＪの誘導＞
ベクターを導入した細胞の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地は、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを含んでいてもよい。培地のpHは、好ましくは約5～約8である。

大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約15～約43℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
バチルス属菌の培養は、通常約30～約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Burkholder）最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，77，4505 (1980)〕や0.5％カザミノ酸を含有するSD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA，81，5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5～約8である。培養は、通常約20℃～約35℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞または昆虫を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Nature，195，788 (1962)〕に非働化した10％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2～約6.4である。培養は、通常約27℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5～約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（MEM）〔Science，122，501 (1952)〕、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）〔Virology，8，396 (1959)〕、RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association，199，519 (1967)〕、199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine，73，1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6～約8である。培養は、通常約30℃～約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、例えば、MS培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地のpHは好ましくは約5～約8である。培養は、通常約20℃～約30℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

以上のようにして、核酸配列認識モジュールとヌクレアーゼとの複合体、即ち配列特異的ヌクレアーゼを宿主細胞内で発現させることができる。

核酸配列認識モジュール及び/又はヌクレアーゼをコードするRNAの宿主細胞への導入は、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等により行うことができる。RNA導入は1回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、2～5回）繰り返して行うことができる。

工程（2）の培養工程の間に、宿主細胞内に導入された発現ベクター又はRNA分子から、配列特異的ヌクレアーゼが発現すると、核酸配列認識モジュールがゲノム配列中に挿入された外因性核酸配列内の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結されたヌクレアーゼの作用により、該認識部位の内部もしくはその近傍でDSBが起こる。その結果生じる両切断末端は、前記相同な核酸配列を含んでいるので、これらの配列を利用してMMEJ又はSSAが起こり、その結果、標的化された領域から外因性核酸配列が完全に除去された、痕跡が残らないゲノム配列（即ち、5’側フランキングゲノム配列－１つの前記相同な核酸配列－3’側フランキングゲノム配列からなる連続した配列）を有する細胞が得られる。

本願発明では、任意の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を使用することができる（いかなる場合でも、同じ認識部位を使用することができる）ので、それぞれの認識部位（標的ヌクレオチド配列）に応じて新たにZFモチーフやTALエフェクターを設計する必要はない。しかしながら、CRISPR/Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを単に合成するだけで、任意の配列を標的化することができる点で、より好ましい。従って、本発明の好ましい実施態様においては、配列特異的ヌクレアーゼとしてCRISPR/Cas系が用いられる。

本発明で使用されるCasタンパク質は、ガイドRNAと複合体を形成して、目的遺伝子中の標的ヌクレオチド配列とそれに隣接するprotospacer adjacent motif（PAM）を認識し結合し得る限り、特に制限はないが、好ましくはCas9又はCpf1である。Cas9としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9（SpCas9; PAM配列NGG（NはA、G、T又はC。以下同じ））、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）由来のCas9（StCas9; PAM配列NNAGAAW）、ナイセリア・メニンギチジス（Neisseria meningitidis）由来のCas9（MmCas9; PAM配列NNNNGATT）等が挙げられるが、それらに限定されない。通常、PAMによる制約が少ないSpCas9が用いられるが、本発明においては、標的ヌクレオチド配列を自由に設計できるので、他種由来のCas9も好ましく使用され得る。また、Cpf1としては、例えば、フランシセラ・ノヴィシダ（Francisella novicida）由来のCpf1（FnCpf1; PAM配列NTT）、アシダミノコッカス sp.（Acidaminococcus sp.）由来のCpf1（AsCpf1;PAM配列NTTT）、ラクノスピラ科細菌（Lachnospiraceae bacterium）由来のCpf1（LbCpf1; PAM配列NTTT）等が挙げられるが、それらに限定されない。

CRISPR/Casを配列特異的ヌクレアーゼとして用いる場合でも、ZFN等を配列特異的ヌクレアーゼとして用いる場合と同様に、それらをコードする核酸の形態で、宿主細胞に導入することが望ましい。

CasをコードするDNAは、ヌクレアーゼをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。

一方、ガイドRNAをコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なＤＮＡ配列と既知のtracrRNA配列（例えば、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt）とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することによって得ることができる。ガイドRNAをコードするDNAも、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター（例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U6、H1プロモーター等）及びターミネーター（例、T6配列）を用いることが好ましい。

尚、配列特異的ヌクレアーゼとしてCRISPR/Casを用いる場合、前記配列特異的ヌクレアーゼ認識部位は、ガイドRNAに含まれるcrRNA配列に相補的なヌクレオチド配列（すなわち、標的ヌクレオチド配列）に加えて、CasがDSB部位を認識するために必要なDNA切断部位認識配列PAM（PAMの具体的配列については上記参照）を含む必要がある。

CasをコードするRNAは、例えば、CasをコードするDNAを保有するベクターを鋳型として使用して、自体公知のインビトロ転写系にてmRNAに転写することにより調製することができる。

ガイドRNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のtracrRNA配列とを連結したオリゴＤＮＡ配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することで得ることができる。

CasをコードするDNAあるいはRNA、ガイドRNA又はそれをコードするDNAは、宿主の種族に応じて、上記と同様の方法により宿主細胞に導入することができる。

本発明の一実施態様において、前記外因性核酸配列中の2つの前記相同な核酸配列の間に、外因性遺伝子として、Casをコードする発現カセットを挿入することができる。その場合、Casタンパク質は宿主細胞内で既に発現しているので、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識するガイドRNAを宿主細胞に導入する限りは、該ガイドRNAとCasとが宿主細胞内で複合体を形成し、該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位におけるDSBを複合体によって生じさせることができる。このことは、配列特異的ヌクレアーゼを発現ベクターの形態で宿主細胞に導入することが不要であることを意味するので、該発現ベクターの除去のための追加的工程も不要となる点でこの実施態様は有用であるといえる。

ZFN又はTALEN等の別の配列特異的ヌクレアーゼを用いる場合でも、前記外因性核酸配列の2つの前記相同な核酸配列の間に、外因性遺伝子として、誘導プロモーターの制御下にある該配列特異的ヌクレアーゼをコードする発現カセットを挿入することもできる。その場合、プロモーターに対応する誘導物質の添加により宿主細胞内で該配列特異的ヌクレアーゼが発現し、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位におけるDSBを生じさせることができる。誘導プロモーターとしては、例えば、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等の高等真核細胞を宿主細胞とする場合には、メタロチオネインプロモーター（重金属イオンで誘導）、ヒートショックタンパク質プロモーター（ヒートショックで誘導）、Tet-ON/Tet-OFF系プロモーター（テトラサイクリン又はその誘導体の添加又は除去で誘導）、ステロイド応答性プロモーター（ステロイドホルモン又はその誘導体で誘導）等が挙げられる。適切な時期に培地に対応する誘導物質を添加（又は培地から誘導物質を除去）して配列特異的ヌクレアーゼの発現を誘導し、宿主細胞を培地中で一定期間培養して、DSB及びそれに続くMMEJ又はSSAを引き起こすことにより、ゲノムDNAの修復を実現するとともに、発現カセットの除去により配列特異的ヌクレアーゼの発現は停止し、off-target切断のリスクを低減することができる。

３．本発明の方法を使用した突然変異誘発
上述のように、本発明の方法の工程（1）に用いる宿主細胞を提供する際に、前記相同な核酸配列の一方もしくは両方の中の、対応する内因性ゲノム配列に対して1もしくは数個のヌクレオチド変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加）を導入することができる。
（i） 該相同な核酸配列の両方に同一の変異を導入した場合、本発明の方法を実施すると、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位でのDSBと、それに続く切断末端間でのMMEJ又はSSAが起こり、その結果、ゲノム中の該相同な核酸配列に対応する内因性ゲノム配列内に、当該変異を導入することができる。
（ii） 該相同な核酸配列の両方に異なる変異（例、異なるヌクレオチドへの置換、異なる部位での変異等）を導入した場合、本発明の方法を実施すると、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位でのDSBと、それに続く切断末端間でのMMEJ又はSSAが起こり、その結果、ゲノム中の該相同な核酸配列に対応する内因性ゲノム配列内に、いずれか一方の該相同な核酸配列に対応する変異がそれぞれ導入された、2種の同質遺伝子的な細胞を得ることができる。
（iii） 該相同な核酸配列の一方に変異を導入した場合、本発明の方法を実施すると、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位でのDSBと、それに続く切断末端間でのMMEJ又はSSAが起こり、その結果、ゲノム中の該相同な核酸配列に対応する内因性ゲノム配列内に、当該変異が導入された細胞と、当該変異が導入されていない、2種の同質遺伝子的な細胞を得ることができる。

さらに、
（iv） 本発明の方法の工程（1）に用いる宿主細胞が相同組換えにより提供される場合、前記フランキングゲノム配列内に内因性ゲノム配列に対して１以上の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加）を導入することができる。該フランキングゲノム配列内に変異が導入された宿主細胞に対して、本発明の方法を実施すると、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位でのDSBと、それに続く切断末端間でのMMEJ又はSSAが起こり、その結果、ゲノム中の該フランキングゲノム配列内に、当該変異を導入することができる。

例えば、上記（iii）の方法により、同一の遺伝的背景を有し、遺伝病の原因遺伝子における変異を有する、又は有しない2つの細胞系統を、同時に作製することができる。当該変異を有しない細胞系統をコントロールとして用いることにより、該遺伝病における当該変異の影響や、当該変異を有する細胞の薬剤感受性等を、より正確に評価することができる。

あるいは、ある特定の遺伝子変異を有する細胞（例えば、当該変異を有する患者から誘導したiPS細胞等）に、上記（i）や（iv）の方法を適用することにより、当該変異を有しない、即ち野生型遺伝子を有する自家細胞を作製することができる。このような野生型に復帰した自家細胞は、当該遺伝子変異に起因する疾患の治療のための移植細胞ソースとして応用することができる。

４．本発明の方法における使用のための核酸
本発明はまた、本発明の方法における使用のための核酸（以下、「本発明の核酸」ともいう）を提供する。当該核酸は、本発明の方法の工程（1）に用いられる宿主細胞の作製に用いられる。

本発明の核酸は、
（ａ）宿主ゲノム内の標的化された領域に相同な２つの核酸配列であって、該核酸配列のうちの１つの３’末端と、他方の核酸配列の５’末端とがオーバーラップする、２つの核酸配列；及び
（ｂ）該（ａ）の２つの核酸配列の間の１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位、
を含む。
上記（a）の2つの核酸配列は、本発明の方法における前記5’フランキングゲノム配列の3’末端に前記相同な核酸配列が付加された配列と、本発明の方法における前記3’ フランキングゲノム配列の5’末端に前記相同な核酸配列が付加された配列に相当し、該相同な核酸配列部分においてオーバーラップする。

また、上記（b）の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位は、本発明の方法における前記２つの相同な核酸配列の間に位置する1個以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位に相当する。

上記（a）の2つの核酸配列は、相同組換えの効率を向上させる目的で、前記5’及び3’フランキングゲノム配列内に上記（b）の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位とは異なる配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましい。

本発明の核酸は、２つ以上の上記（b）の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含むことが好ましく、そのうちの2つは、上記（a）の2つの核酸配列に、それぞれ実質的に隣接したものである。ここで用語「実質的に」とは、上記（a）の核酸配列と、配列特異的ヌクレアーゼ認識部位とが、直接的に連結されているか、上記（a）の2つの核酸配列がオーバーラップする末端間でMMEJ又はSSAが起こる程度の介在配列を介して連結されていることを意味する。この場合、本発明の核酸は、上記（a）の核酸配列に実質的に隣接する該2つの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位の間に、1以上の外因性遺伝子を含むことができる。該外因性遺伝子の例としては、本発明の方法の説明において前記したものが挙げられる。

５．本発明の方法における使用のためのキット
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。当該キットは、
（ａ）言及された本発明の核酸;及び
（ｂ）（ａ）の核酸に含まれる該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識する１つ又は２つ種類の配列特異的ヌクレアーゼ、又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸、
を含む。

上記（b）の配列特異的ヌクレアーゼとしては、本発明の方法の説明において前記したものが例示され、好ましくは、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas等の人工ヌクレアーゼが挙げられる。

上記（a）の核酸が、前記5’及び3’フランキングゲノム配列内に上記４（b）の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位とは異なる配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含む場合には、本発明のキットは、相同組換えの効率を向上させるための該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を認識して結合する、別の配列特異的ヌクレアーゼ又はそれをコードする核酸をさらに含み得る。

以下に実施例を挙げて、本発明を説明するが、これらは本発明を何ら制限するものではない。

材料及び方法
プラスミド構築
表１は、本研究において使用された配列を検証したプラスミドの一覧表を提供する。完全なプラスミドの配列は、要求に応じて、又はＡｄｄｇｅｎｅを通して入手可能である。クローニング及びバリデーションに使用したプライマーを表２に表す。
ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＮＣ－ＴＡＬＥＮは、以前に記載されている（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）。非反復可変性二残基（non-repeat-variable di-residue（ｎｏｎ－ＲＶＤ））バリエーションを持つＡｖｒ－ＴＡＬＥＮ発現ベクターを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＴＡＬＥＮ法（Sakuma et al., Scientific reports3, 3379, 2013）を使用して、ＣＭＶの代わりにＣＡＧプロモーターを含む改変ｐｔＣＭＶ－１３６／６３－ＶＲ発現ベクターへと構築した。次いで、ＤＮＡ結合モジュールを、２工程のＧｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ法を使用して構築した。構築されたモジュールは以下のとおりである：左、HD HD NI NG NG HD HD NG NI NG NN NI HD NG NN NG NI NN NI NG；右、NI NG NI HD NG HD NI HD NI HD NI NI NG NI NN HD NG。ＡＡＶＳ１を標的化するＴＡＬＥＮは、以前に記載されている（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９発現のために、ｓｇＲＮＡオリゴ（表２）を、以前に記載されたとおり（Ran et al., 2013）にＢｂｓＩで直線化させたｐＸ３３０（Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号４２２３０、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇ氏より寄贈された）にアニーリングさせてクローニングした。得られたプラスミド（ｐＸ－ＥＧＦＰ－ｇ１、－ｇ２、及び－ｇ３）の配列を検証した（表１）。
ＨＰＲＴ１ ＳＳＡレポーターベクターを、以前に記載されたとおり（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）に使用した。ｅＧＦＰ ｓｇＲＮＡのための追加のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＳＳＡレポーターベクターを、プロトスペーサー及びＰＡＭからなるオリゴをアニーリングさせた後（表２）、ＢｓａＩで直線化したｐＧＬ４－ＳＳＡにライゲーションさせることによって作製した。
ＨＰＲＴ１遺伝子編集のためのＭｈＡＸドナーベクターを作製するために、ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮで標的化された部位の周囲の１２５３ｂｐの相同領域を、２０１Ｂ７ ｉＰＳＣゲノムＤＮＡからＰＣＲ増幅し（Takahashi et al., 2007）、最小ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔバックボーンにクローニングし、配列を検証した（ｐ３－ＨＰＲＴ１）。ｐｕｒｏ－ΔＴＫ選択マーカーを、以前に記載されたとおり（Chen and Bradley, 2000）に設計し、ＡＡＶＳ１ドナーベクター（Addgene plasmid #22075）中に構築した。ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニング（クローンテック社）を使用して、２Ａ－ｐｕｒｏ－ΔＴＫカセットを、ｐ３－ＨＰＲＴ１ドナーベクター中へと導入した。簡単には、ｐ３－ＨＰＲＴ１ベクターを、切除及びＭＭＥＪ修復のための全ての操作上の配列（ｅＧＦＰ１プロトスペーサー及びＰＡＭ配列、適切に設計されたμＨ、並びにサイレント及び疾患関連変異（μＨ内もしくは本文中で示した特有のフランキング領域内のいずれかの中に含まれる）が挙げられる）を含み、１２～１５ｎｔのＩｎＦｕｓｉｏｎオーバーハング（表２）で終わるプライマーでインバースＰＣＲによって増幅させた。２Ａ－ｐｕｒｏ－ΔＴＫカセットを、Ｔ２Ａ及び選択マーカーコード領域が、ＨＰＲＴエキソン３のインフレームであるように増幅させて、ｐＨＰＲＴ１－Ｐｔｋ－ｆｔｓＧＦＰ１を得た。ｐ３－ＨＰＲＴ１－Ｓ１０４Ｒ－ＰｄＴＫ－ｍＣｈ及びｐ３－ＨＰＲＴ１－Ｓ１０４Ｒｆ－ＰｄＴＫ－ｍＣｈのＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}ドナーベクターを構築するために、改変μＨと点変異とを持つＩｎＦｕｓｉｏｎプライマーを、ＰＣＲに使用した（表２）。次に、まずｐＡＡＶＳ１－Ｐ－ＣＡＧ－ＤＥＳＴからＣＡＧ：：Ｇａｔｅｗａｙカセットをクローニングするために制限－ライゲーションを使用し（Addgeneプラスミド番号80490; Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）、次いでｍＣｈｅｒｒｙのＧａｔｅｗａｙクローニングによってＣＡＧ：：ｍＣｈｅｒｒｙレポーターを導入した。

ＳＳＡアッセイ
ＳＳＡアッセイを、以前に記載されたとおり（Ochiai et al., 2010）に実行した。簡単には、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ発現ベクターを各２００ｎｇ、１００ｎｇの適切なｐＧＬ４－ＳＳＡ標的ベクター、及び２０ｎｇのｐＧＬ４＿７４＿ｈＲｌｕｃＴＫ Ｒｅｎｉｌｌａリファレンスベクターを含むＤＮＡ混合物を、９６ウェルプレートにおいて、２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉ低血清培地（インビトロジェン社）中で調製した。次いで、０．７μＬのリポフェクタミン２０００（インビトロジェン社）を含有する２５μＬのＯｐｔｉ－ＭＥＭ Ｉを添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Thermo Scientific社）を１５％ ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ中４×１０^４個の細胞／１００μＬの密度で添加し、３７℃、５％ ＣＯ_２で、２４時間培養した。ルシフェラーゼ活性をアッセイするために、７５μＬの増殖培地を７５μＬのＤｕａｌ－Ｇｌｏ試薬（プロメガ社）で置換する前に、プレートをまず室温まで平衡化した。１０分間インキュベーションした後、１５０μＬの反応物を白色のマイクロタイタープレートへと移し、発光（１秒）を、Centro LB960（ベルトールド社）又は2104 EnVision Multilabel Plate Reader（パーキンエルマー社）で読み取った５０μＬのストップ試薬の添加と１０分間のインキュベーションに次いで、Ｒｅｎｉｌｌａ発光を同様に読み取った。活性を、Ｆｉｒｅｆｌｙ／Ｒｅｎｉｌｌａ強度の比率によって計算した。

ＥＳＣ及びｉＰＳＣ培養
未分化ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣを、以前に記載されたとおり、フィーダーを含まない条件下で維持した（Kim et al. 2016）。簡単には、Ｈ１ ｈＥＳＣ（Thomson et. al., 1998）及び１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣを、組換えヒトラミン－５１１ Ｅ８断片（ｉＭａｔｒｉｘ－５１１、ニッピ社）でコーティングされた６ウェル組織培養プレート上（０．５μｇ／ｃｍ^２）で、ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３又はＡＫ０２Ｎ（味の素株式会社）培地中で培養した。継代のために、細胞を、３７℃で１０分間の３００μＬのＡｃｃｕｍａｘ（Innovative Cell Technologies株式会社）での処置に次いで、ピペットでの穏やかな機械的解離によって、剥離させた。細胞を回収するために、１０μＭのＲＯＣＫ阻害剤Ｙ－２７６３２（和光純薬工業株式会社）を含有する７００μＬの培養液を添加した。細胞を、ＴＣ２０（バイオラッド社）上で、トリパンブルー色素排除法を使用して数えた。典型的には、各継代において１～３×１０^３個の細胞／ｃｍ^２をＹ－２７６３２含有培地中に播種した。４８時間後、培地を、Ｙ－２７６３２を含まないものへと変更した。
プレートに撒いた５～７日後、細胞は８０～９０％の培養密度に達し、再び継代のために調製した。凍結ｈｉＰＳＣストックを作るために、細胞を１×１０^６個の生細胞／１ｍＬ STEM-CELLBANKER（タカラバイオ株式会社）の密度で再懸濁し、２００～５００μＬの細胞懸濁液（２～５×１０^５個のｈｉＰＳＣ）をクライオチューブへと移した。ストックのバイアルを、ｉＭａｔｒｉｘ－５１１でコートされた６ウェル組織培養プレート上へと、Ｙ－２７６３２含有ＳｔｅｍＦｉｔ ＡＫ０３又はＡＫ０２Ｎ培地中で解凍させた（１つのバイアル／１０ｃｍ^２）。
４０９Ｂ２の維持（Okita, et. al., 2010）を、霊長類ES細胞用培地（株式会社リプロセル）中で、ＳＮＬフィーダー細胞上で実行した（Tsubooka, et. al., 2011）。継代のため、ＳＮＬフィーダー細胞を、ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中、１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ、０．２５％トリプシン、２０％ ＫＳＲ、及び１ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有し、Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋を含まない、３００μＬのＣＴＫ溶液（ナカライテスク株式会社）中、２分間、室温でのインキュベーションによってウェルから剥離させた。次に、ＣＴＫ溶液を除去し、ウェルを２ｍＬのＤＰＢＳで２回洗浄した。Recombinant Human FGF-basic（PEPROTECH社）を補填した１ｍＬの霊長類ＥＳ細胞用培地（株式会社リプロセル）を加え、コロニーをセルスクレーパーで収集し、ウェル全体をくまなく上下に数回ピペッティングすることで、小さな凝集塊へと解離させた。分割比は、新鮮なＳＮＬフィーダーでコーティングされたプレートに対し、～１：５であった。

ＴＡＬＥＮでのＨＰＲＴノックアウト
４０９Ｂ２ ｉＰＳＣにおけるＮＣ－ＴＡＬＥＮを使用したＨＰＲＴ１ノックアウト実験を、以前に記載されたとおり（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）に、ＳＮＬフィーダー上でＤＮＡの送達にはＮｅｏｎ（インビトロジェン社）エレクトロポレーションを用いて実行した。Ｈ１ ＥＳＣ及び１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣにおいてＡｖｒ－ＴＡＬＥＮを使用したＴＡＬＥＮ評価アッセイ及びＨＰＲＴ１ノックアウト実験を、以前に記載されたとおり（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）に、フィーダーを含まない条件下で、ＤＮＡの送達にはＮＥＰＡ２１（ネッパジーン株式会社）を用いて実行した。簡単には、ＣＡＧ－ｄＮＣ－ＨＰＲＴ１ ＴＡＬＥＮ（各３μg）又はＣＡＧ－Ａｖｒ－ＨＰＲＴ ＴＡＬＥＮ（各３μｇ）を、単細胞懸濁液中で、ＮＥＰＡ２１エレクトロポレーションによって１×１０^６個の細胞に遺伝子導入した。エレクトロポレーションした細胞を、１～５×１０^５個の細胞／６０ｍｍ培養皿の密度でプレートに撒いた。エレクトロポレーションの２日後、６－チオグアニン（６－ＴＧ、２０μＭ；シグマアルドリッチ社）選択を開始し、７～１０日間の期間にわたり毎日給餌した。集団解析のために、少なくとも５０～３００でコロニーを貯蔵し、ゲノムＤＮＡの調製の前に一度継代した。クローン解析のために、ｉＰＳＣコロニーをマイクロピペットで手動にて単離し、以前に記載されたように、９６ウェル形式で培養、処理、及び冷凍保管した（Kim et al., 2016）。選択したクローンを解凍し、液体窒素中での永久保管のために増やした。

ｉＰＳＣ遺伝子ターゲティング
遺伝子ターゲティングを、本質的に記載されたとおりに実行した（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）。簡単には、ヌクレアーゼ発現ベクター（ＣＲＩＳＰＲについて１μｇ、ＴＡＬＥＮについて各１μＧ）及びドナーベクター（３μｇ）を、単一細胞懸濁液中で、１×１０^６個の細胞に対してＮＥＰＡ２１エレクトロポレーションによって遺伝子導入した。エレクトロポレーションしたｉＰＳＣを、Ｙ－２７６３２含有Ｓｔｅｍｆｉｔ培地中１～５×１０^５個の細胞／６０ｍｍ培養皿の密度でプレートに撒いた。エレクトロポレーションの２日後、Ｙ－２７６３２を除去し、０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（シグマアルドリッチ社）を加え、７～１０日間の期間にわたり毎日給餌した。クローンを、マイクロピペットで手動にて単離し、上記のように、９６ウェル形式で処理した。

カセットの切除
カセットの切除を開始させるために、１μｇのｐＸ－ＥＧＦＰ－ｇ１発現ベクターを、単一細胞懸濁液中で、１×１０^６個の細胞に対してＮＥＰＡ２１エレクトロポレーションによって遺伝子導入し、Ｙ－２７６３２含有Ｓｔｅｍｆｉｔ培地中１～５×１０^５個の細胞／６０ｍｍ培養皿の密度でプレートに撒いた。エレクトロポレーションの２日後に、Ｙ－２７６３２を除去した。
ＨＡＴ（１×）選択によって濃縮されたカセットの切除を、７～１０日間の期間にわたり毎日給餌しながら実行した。クローンを手動にて単離し、上記のように、９６ウェル形式で処理した。
蛍光レポーターを含むカセットでは、カセットが切除されたｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞の濃縮をＦＡＣＳによって実施した。ｐＸ－ＥＧＦＰ－ｇ１でエレクトロポレーションしたｉＰＳＣを、通常通りプレートに撒き、選択圧の非存在下で回復させた。６日後、細胞を下に記載のようにＦＡＣＳ分取に供した。回復したｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞集団を計数し、ＨＡＴ（１×）の存在下又は非存在下で、クローン密度でプレートに撒いた。クローンを手動にて単離し、上記のように、９６ウェル形式で処理した。

フローサイトメトリーと細胞分取
ＧＦＰ又はｍＣｈｅｒｒｙの蛍光強度のルーチン的な測定のために、３．０×１０^５個の細胞をＦＡＣＳ緩衝液（２％ ＢＳＡを補填したＤＰＢＳ）中に懸濁し、BD LSRFortessa Cell Analyzer（ＢＤバイオサイエンス）を使用してBD FACSDivaソフトウェア（ＢＤバイオサイエンス）で解析した。ｐ３－ＨＰＲＴ１－Ｓ１０４Ｒ－ＰｄＴＫ－ｍＣｈ（片側性Ｓ１０４Ｒ Ｍｕｎｉｃｈ変異）又はｐ３－ＨＰＲＴ１－Ｓ１０４Ｒｆ－ＰｄＴＫ－ｍＣｈ（両側性Ｓ１０４Ｒ Ｍｕｎｉｃｈ変異）で標的化されたクローンのｍＣｈｅｒｒｙ蛍光強度を、９６ウェル形式で、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ ＶＹＢ（ミルテニーバイオテク株式会社）上で測定した。
カセットを切除されたｍＣｈｅｒｒｙ陰性ｉＰＳＣの単離のために、細胞をＦＡＣＳ緩衝液中で、～１×１０^６個の細胞／ｍＬの密度で、単一細胞の懸濁液として収集し、凝集塊を取り除くためにセルストレーナーを通してろ過した。シングレットに対してゲート設定した後、ｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞集団を、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩセルソーター（ＢＤバイオサイエンス）上で、２０μＭのＹ－２７６３２を含有するＳｔｅｍｆｉｔ ＡＫ０２Ｎ培地中に収集した。分取効率を、BD LSRFortessa Cell Analyzerを使用して決定した。
フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Tree Star社）によって解析して作成した。

クリスタルバイオレット染色
コンフルーエントな、又は薬剤選択された培養物からのｉＰＳＣのプレートを、氷冷ＤＰＢＳで２回洗浄し、氷冷メタノール（ナカライテスク株式会社）で１０分間、室温で固定した。メタノールを除去し、プレートの底部を覆うのに十分なクリスタルバイオレット溶液（ＨＴ９０１３２、シグマアルドリッチ社）を添加した。室温での１０分間のインキュベーション後、染色溶液を除去し、プレートをｄｄＨ_２Ｏで穏やかにすすいだ。室温で完全に乾燥させた後、ＳＴＹＬＵＳ ＸＺ－２（オリンパス株式会社）カメラで、ウェル全体の画像を取得した。

ゲノムＤＮＡの単離
ＰＣＲスクリーニング及びシーケンシング用のゲノムＤＮＡを、DNeasy Blood & Tissue Kit（株式会社キアゲン）を製造者の指示に従って使用して、０．５～１×１０^６個の細胞から抽出した。サザンブロット用のゲノムＤＮＡを、溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２％ ＳＤＳ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ）を使用して６ウェルのシャーレ（～１～３×１０^６個の細胞）の１つのコンフルーエントなウェルから抽出し、それに続き、標準的なフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿、及びＴＥ ｐＨ８．０中での再懸濁を行った。ハイスループットのサザンブロット又はＰＣＲスクリーニングのために、ゲノムＤＮＡを、プレート溶解緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ サルコシル、１０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍｇ／ｍＬ プロテイナーゼＫ）を使用して９６ウェル形式で抽出し（Ramirez-Solis et al., 1992）、それに続き、直接的なエタノール沈殿及び制限消化混合物又はＴＥ ｐＨ８．０中での再懸濁を行った。

ＰＣＲ遺伝子型決定
ＨＰＲＴ１（受入番号NG_012329.1）のエキソン１～９のプライマー設計を、ＮＣＢＩプライマーＢＬＡＳＴを使用し、任意の設定においてヒトリピートフィルター、ＳＮＰハンドリング、及びプライマー対特異性のヒト（taxid:9606）基準ゲノム（表２）、をチェックして実施した。Ｈ１ ＥＳＣ及び１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣについて、KAPA Taq Extraを用いて、以下のプロトコール（９８℃で１０秒間、５９℃で１５秒間、６８℃で４分間）×３０サイクル、４℃で保持、を使用してゲノムＤＮＡからエキソン１～９を増幅させ、そしてシーケンシングした。
遺伝子ターゲティングのために、ｐｕｒｏ耐性クローンをＰＣＲによってスクリーニングして、５’及び３’の標的接合部を検証した。ドナーベクターホモロジーアーム外のプライマー及び導入遺伝子特異的なプライマーを、図９及び１２、並びに表２中に記載されるように使用した。ＰＣＲを、以下のプロトコール（９８℃で１０秒間、５９℃で１５秒間、６８℃で４分間）×３０サイクル、４℃で保持、を使用して、KAPA Taq Extraを用いて実行した。接合部領域のシーケンシングを使用して、隣接するμＨ及びＣＲＩＳＰＲプロトスペーサーの忠実度を保証した。
標的カセットの切除に次ぐ、ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮ誘導変異スペクトル及びＭＭＥＪ修復率を、プライマーセットｄｎａ３０９／３１０を用い、ＡｍｐｌｉＴａｑ ３６０（ＡＢＩ）９５℃で１０分間、（９５℃で３０秒間、５７℃で３０秒間、７２℃で６０秒間）×３０サイクル、７２℃で７分間、４℃で保持、を使用して、プールした又はクローンゲノムＤＮＡ調製物からスクリーニングした。クローンからのＰＣＲ産物を、同一のプライマーを使用して直接シーケンスし、一方で、プールからのＰＣＲ産物はＴＯＰＯ ＴＡクローニングキット（インビトロジェン社）を使用してクローニングし、次に、得られた細菌コロニーからのＴ３／Ｔ７プライマーを用いたＰＣＲ増幅に次いで個々にシーケンスした。
片側性又は両側性の変異μＨでの切除後に、サイレント変異が定着したかを検証するために、ゲノムＤＮＡを、ｄｎａ１７２０／４１１プライマーを使用して増幅させた。切断されたアンプリコンをＡｆｌＩＩ制限酵素での処置後又は処置なしで、ゲル電気泳動によって分離させた。
シーケンシング
ＰＣＲ産物を、シーケンシングに先立って、ＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ（アフィメトリクス社）で処置した。BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit（アプライドバイオシステムズ）を使用して、エタノール沈殿によって精製し、３１３０ｘｌ Genetic Analyzer（アプライドバイオシステムズ）上で実行することによって、ＤＮＡシーケンシングを実施した。配列アライメントを、Sequencher v5.1（Genecodes）又はSnapgene v3.1.4 以上（GSL Biotech LLC.）を使用して実施した。ベースコールの信頼度が低いシーケンストレースファイルを、さらなる解析から除外した。

ＴＩＤＥ解析
約５０クローン（Ｈ１）又は２００クローン（１３８３Ｄ６）からなるｉＰＳＣの集団をプールしてゲノムＤＮＡを収集し、上記のように増幅させた。混合配列のＴＩＤＥ解析を、https://tide.nki.nl/（Brinkman et al., 2014）におけるオンラインツールを使用して実施した。１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣ又はＨ１ ＥＳＣからの配列データを、基準として使用した。ＴＩＤＥは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９用に設計されており、ＴＡＬＥＮは、スペーサー内の未確定の位置でＤＳＢを誘導するため、我々は、予測された切断点を、ベースコールの信頼度が見かけ上混合された配列と完全に一致して最初に低下したＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮ－Ｌ結合部位（ATTCCTATGACTGTAGAT^TTT）に隣接するように、スペーサーの５’末端に配置した。欠失サイズのウィンドウを、より大きな欠失に適応させるように、２０ｂｐに拡張した。残りのパラメータは、デフォルトに設定するか、又は提供されたシーケンストレースファイルの性質に基づいて自動的に調整されることを許容した。

サザンブロット
ＨＰＲＴ－Ｂ及びｍＣｈｅｒｒｙプローブ断片を、それぞれゲノムＰＣＲアンプリコン又はプラスミドＰＣＲアンプリコンから調製し（表２）、一方で、ＴＫプローブをプラスミド制限断片から調製した。ＤＩＧ標識ｄＵＴＰ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を、製造者の指示に従って、ＨＰＲＴ－Ｂ及びｍＣｈｅｒｒｙの場合には、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ株式会社）を使用してＰＣＲ増幅によって組み入れ、ＴＫの場合にはランダムプライミングによって組み入れた。
ゲノムＤＮＡ（５～１０μｇ）を、ＢＳＡ（１００μｇ／ｍＬ）、ＲＮａｓｅＡ（１００μｇ／ｍＬ）及びスペルミジン（１ｍＭ）の存在下、３～５倍過剰の制限エンドヌクレアーゼで一晩消化した。消化されたＤＮＡ断片を、０．８％アガロースゲル上で分離し、脱プリン化し、変性させ、２０×ＳＳＣを使用してＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜（ＧＥヘルスケア社）へと移行させた。膜を、ＵＶ架橋し、プレハイブリダイズし、４ｍＬのＤＩＧ Ｅａｓｙ Ｈｙｂバッファー（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）中１５０ｎｇ／ｍＬのジゴキシゲニン（ＤＩＧ）標識ＤＮＡプローブとともに、４２℃で一晩、常に回転させながらインキュベートした。６５℃での洗浄（０．５×ＳＳＣ；０．１％ ＳＤＳ）を繰り返した後、膜をブロックし（DIG Wash and Block Buffer Set、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）アルカリホスファターゼ接合抗ＤＩＧ抗体（１：１０，０００、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を膜に加えた。シグナルを、ＣＤＰ－ｓｔａｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）によって高め、ImageQuant LAS 4000 imaging system（ＧＥヘルスケア社）によって検出した。

顕微鏡観察
位相差像及び蛍光像を、適切なフィルター及び露出時間を使用して、ＢＺ－Ｘ７１０（株式会社キーエンス）上で取得した。
細胞増殖の測定
ｉＰＳＣ株を３×１０^４個の細胞／６ウェル培養シャーレでプレートに撒き、ＨＡＴなしで２日間増殖させ、次いでさらに２日間ＨＡＴあり又はなしで増殖させた。細胞を、プレートに撒いた２日、３日及び４日後に収集し１００μＬのＡＫ０２中に再懸濁した。１１μＬアリコートの細胞懸濁液を、トリパンブルー染色液０．４％（ギブコ社）と１：１で穏やかなピペット操作で混合し、１０μＬをCounting Slide（バイオラッド社）の両側にアプライした。細胞数を、TC20 Automated Cell Counter（バイオラッド社）を用いて決定した。

ウエスタンブロット
ＨＰＲＴタンパク質解析のために、全細胞可溶化液を、５０ｍＭの最終濃度でＤＴＴを含有する１００μＬのＮｕＰＡＧＥ ＬＤＳサンプルバッファー（１×）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）中で１０分間、１×１０^６個の細胞を煮沸することによって調製した。可溶化液を、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル上で分離させ、ＨＰＲＴ（F-1, sc-376938, 1:200, Santa Cruz社）及び抗アクチン（A2066, 1:5,000, シグマアルドリッチ社）抗体を使用してプロービングした。ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（Santa Cruz社: sc-2004）及びヤギ抗マウスＩｇＧ、ＨＰＲＴに対するHRP-Linked Whole Ab Sheep（ＧＥライフサイエンス:NA931-100UL）二次抗体並びに抗アクチンをそれぞれ、１：５０００希釈で使用した。シグナルを、ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロッティング検出試薬（ＧＥヘルスケア社）を使用して高め、ImageQuant LAS 4000 imaging system（ＧＥヘルスケア社）上で検出した。

メタボローム解析
培養液試料を、キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析（ＣＥ－ＭＳ）を使用して、記載（Wakayama, et. al., 2015）のように解析した。資料の調製には、示したｉＰＳＣクローンから１．５×１０^５個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルあたり、ＲＯＣＫｉ（１０μＭ）を含有する１５０μＬのＡＫ０２培地中に播種し、３７℃、５％ ＣＯ_２で培養した。翌日、培地を、１５０μＬのＲＯＣＫｉを含まない新鮮なＡＫ０２培地で置換した。培地のみの基準資料を調製し、同様に３７℃、５％ ＣＯ_２で培養した。２４時間後、１００μＬの消費された培地を収集し、Ｌメチオニンスルホン（和光純薬工業株式会社）、ＭＥＳ（株式会社同仁化学研究所）、及びＣＳＡ（和光純薬工業株式会社）内部標準（各２００μＭ）を含有する４００μＬのメタノールと混合した。２００μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ超純水の添加に次いで、試料を、５００μＬのクロロホルムで抽出した。水層を、５ｋＤａ限外濾過（ＨＭＴ）に供し、凍結乾燥した（ラブコンコ社）。凍結乾燥試料を解析前に、３－アミノピロリジン（シグマアルドリッチ社）及びトリメシン酸（和光純薬工業株式会社）内部標準（各２００μＭ）を含有する５０μＬのＭｉｌｌｉ－Ｑ超純水中に再懸濁した。データを、特にＣＥ－ＭＳべースのメタボロームデータ解析用に開発された、インハウスのソフトウェア（Master Hands-2.17.1.11）を使用して、解析及び定量化した。

結果
ＭＭＥＪは、ＨＰＲＴ１遺伝子座のＴＡＬＥＮ切断に次ぐＤＳＢＲの結果に偏りをもたらす
プログラムされたエンドヌクレアーゼを使用した遺伝子破壊は、無作為の挿入及び欠失（挿入欠失）変異を作り出すために、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）等の細胞のエラープローン修復経路に頼る。我々は、以前にこの現象を活用して、改変ＴＡＬＥＮ構築物の活性を評価するために、２０１Ｂ７ヒト女性ｉＰＳＣにおけるＨＰＲＴ酵素機能を破壊した（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）。そのアッセイにおいて、ヒトＨＰＲＴ１遺伝子のエキソン３を標的化する（図１Ａ）ＨＰＲＴ１＿Ｂ（Cermak et al., 2011）を倣って作られたＴＡＬＥＮの一過性導入と、それに次ぐ６チオグアニン耐性（６－ＴＧ^Ｒ）に関する濃縮が、再発される１７塩基の欠失からなる変異（Δ１７）を明らかにした。別の女性ｉＰＳＣ株（４０９Ｂ２）におけるＨＰＲＴ１のＴＡＬＥＮ媒介性破壊は、Δ１７アレルを、～２５％の頻度で再現した（図２）。ＮＨＥＪの結果は、マイクロホモロジー媒介末端結合と思われる代替の修復経路中の短い直列反復配列によって偏りがもたらされ得る（McVey and Lee, Trends in genetics : TIG 24, 529-538, 2008）。したがって我々は、（Bae et al., 2014）に基づいたカスタムのＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、予測されたＤＳＢ部位でのマイクロホモロジー（μＨ）を検出した。スクリプトは、１２ｂｐの非相同配列によって分離されている、左のＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥＮ－Ｌ）結合部位内及び介在スペーサー領域内に位置する５ｂｐのμＨ（μ５：「ＧＡＣＴＧ」）を予測した。さらなる検討は、１つのバリアント塩基（Ｔ又はＡ）のみで分離される、μ５に隣接する３ｂｐの第二のμＨ（μ３：「ＡＧＡ」）を明らかにし、その結果、構造「ＧＡＣＴＧＷＡＧＡ」（ここで、Ｗ＝Ｔ／Ａ（以後、μ５Ｗ３と呼ぶ）の不完全な化合物μＨがもたらされた。これらの知見は、さらなる研究を保証する、ＭＭＥＪを介した偏った修復経路を示唆した。

標的化された領域でのＭＭＥＪの評価に先立ち、我々は、我々のＨＰＲＴ１ ＴＡＬＥＮアッセイにおいて、３つの顕著な技術的改良を行った。最初に、ＨＰＲＴ１遺伝子座がＸ連鎖性であることを考慮して、我々は、ＨＰＲＴ１エキソン１～９において、両方ともが基準ヒトゲノムから偏向していない（データは示さず）、男性１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣ（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）及びＨ１ ＥＳＣ（Thomson et al., 1998）を利用することを選択した。両アレルのＸ活性化を促進する条件下（Ｘ^ａ／Ｘ^ａ, Tomoda et al., Cell stem cell 11, 91-99, 2012）で増殖させた女性ｉＰＳＣ株は、ヌクレアーゼ切断の頑強性を実証した（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013）ものの、男性細胞株における単一のＨＰＲＴ１コピーは、ＮＨＥＪ変異スペクトルを明らかにするのに役立つだろう。我々は第二に、我々のアッセイを、リーダーを含まない条件に適応させ（Nakagawa et al., 2014）、このことは、９６ウェル形式での単一細胞の継代、クローニング、及び解析を可能とすることによって、クローン解析を改善した（Kim et al., 2016）。そのうえ、ＨＰＲＴ１陰性ＳＮＬフィーダーを除去することで（Okita et al., 2011）、交差摂取又はフィーダー感受性を回避することによって、それぞれ６－ＴＧ及びＨＡＴ選択、の両方の薬剤毒性の動態学を有意に改善した。第三に、同一の標的配列（Cermak et al., 2011）を維持する一方で、ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮを、切断型のザントモナス・オリゼ・パソバー.（PthXo1）ベースＴＡＬＥスキャフォールド（Sakuma et al., Genes Cells 18, 315-326, 2013a）から、斑点細菌病菌（ＡｖｒＢｓ３）ベースの＋１３６／＋６３ ＴＡＬＥ構造（Christian et al. 2010; Sakuma et al., Scientific reports 3, 3379, 2013）へとアップデートし、新たなＣＡＧプロモーター駆動型発現ベクター（表１）から発現させた。これらの組み合わされたベクター改変は、単鎖アニーリングアッセイによって測定されたAvrＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮの切断活性において、３倍の増加をもたらした（Sakuma et al., Scientific reports 3, 3379, 2013; Fig. 3A）。増強されたゲノム切断活性は、１３８３Ｄ６男性ｉＰＳＣの遺伝子導入に次ぐ６－ＴＧ^Ｒコロニー形成の改善によっても実証された（図３Ｂ）。

これらの改善点をもって、我々は、男性ｉＰＳＣにおいてＡｖｒＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮによって誘導される変異のスペクトルの調査に着手した。我々は、６－ＴＧ^Ｒ男性ｉＰＳＣの混合集団におけるアレル頻度を、混合ＰＣＲアンプリコンからの計算的シーケンストレース分解を利用することによって、推定した（TIDE, Brinkman et al., 2014）。シーケンストレースファイルにおいて、オーバーラップするピークが、μ５Ｗ３の直後に観察され、それに先行する位置「Ｗ」においてＴ／Ａオーバーレイが観察された（図４Ａ～Ｃ）。種々の主要ではない欠失アレルのうち、Δ１７が、有意に大きな比率を占めることが見いだされ（６３．５％、図４Ｄ）、μ５Ｗ３を介したＭＭＥＪが強く支持された。男性Ｈ１ヒトＥＳ細胞においても、同様の頻度でＴＩＤＥ結果が立証された（４３．９％、図４Ｅ～Ｇ）。集団における、この明らかに高い割合のＭＭＥＪ修復が、ＰＣＲバイアスの人為現象である可能性を除外するために、我々は、６－ＴＧ^Ｒ ｉＰＳＣクローンを単離し、エキソン３のサンガーシーケンスを実施した（図１Ｂ及び図５）。クローン解析は、欠失が最も一般的なＮＨＥＪの結果である（８３％）こと（このうち、Δ１７アレルが大部分を構成した（６９％））を明らかにし、集団ベースのＴＩＤＥ解析と一致した。Δ１７アレルは、μ５Ｗ３における不完全さに従って、５（Ｔ）：１５（Ａ）（図１Ｃ）の比率でさらに細分することができ、これはおそらく、修復のための上流のμ５のより頻繁な使用、及びこれに一致する介在性「ＴＡＧＡ」配列の喪失によって指示されている。両方の種類のΔ１７欠失は、－１フレームシフトを生み出し、これはナンセンス変異（ｆｓＴｅｒ１０１）において終始する３つ（ＨＰＲＴ^Δ１７ＴではＤ９８Ｅ、Ｆ９９Ｌ、Ｉ１００Ｌ）又は４つ（ＨＰＲＴ^Δ１７ＡではＶ９７Ｅ、Ｄ９８Ｅ、Ｆ９９Ｌ、Ｉ１００Ｌ）のミスセンス変異をもたらし、これは６－ＴＧ耐性及びＨＡＴ感受性によって測定されるＨＰＲＴ機能の喪失をもたらすが（図６Ａ）、通常の培養条件下ではクローン形態又は増殖率に対するさらなる影響はない。ＴＡＬＥＮ媒介性ＨＰＲＴ１ノックアウトデータの解析は、我々を２つの主要な結論へと導いた（図１Ｄ）：最初に、一般的なＭＭＥＪ現象が、再現可能な介在配列の高忠実度の欠失をもたらし、第二に、不完全なμＨ（μ５Ｗ３）間のＭＭＥＪが、代替であるが予測可能なアレルの結果を引き起こす。
ＭＭＥＪ媒介性切除のために設計されたカセットを使用した点変異の定着

ＴＡＬＥＮ媒介性のＨＰＲＴ１破壊（図１）に触発されて、我々は、内因性配列が抗体選択マーカーに隣接するように、それらを、重複するμＨとして設計することによって、入れ子状のＤＳＢを修復するためにＭＭＥＪを利用するよう細胞を動員することができ、その結果、痕跡が残らない切除と遺伝子座の回復がもたらされると考えた（図７Ａ）。この、マイクロホモロジー媒介性切除（microhomology-assissted excision）（ＭｈＡＸ）技術を実証するために、我々は、遺伝子ターゲティング及び切除の両工程を追跡する意図をもって、ｐｕｒｏ－ΔＴＫ抗体対抗選択カセット（切断型チミジンキナーゼに対するピューロマイシンの融合物）を使用してＨＰＲＴ１エキソン３を標的化することを選択した。ＨＰＲＴ１は、ヒトｉＰＳＣにおいて発現されるため、我々は、カセットを２Ａ－ペプチド連結プロモーターレスジーントラップとして利用した；このアプローチは、バックグラウンドフリーなＡＡＶＳ１標的化のために使用されるアプローチ（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）と類似しているが、ＨＰＲＴ１オープンリーディングフレーム内へのインフレームな挿入を支持するスプライス受容体配列を欠く（図８Ａ）。

マーカーに隣接するＤＳＢを作り出すために、我々は、統合されたＣａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡプラスミド発現系（Ran et al., 2013）並びに定義されたエンドヌクレアーゼ切断点（Jinek et al., 2012）、を含む複数の利点を活用し、ＴＡＬＥＮよりもむしろＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用することを選択した。我々は、ヒトゲノムにおいてわずかなオフターゲット部位を有することが予測された、証明された活性を持つ候補ｓｇＲＮＡを検討し、ヒトＵ２ＯＳ骨肉腫細胞において高い活性及び低い毒性を有することがすでに示されているＡ.ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰ遺伝子を標的化する３つのｓｇＲＮＡ（Fu et al., 2014）にはじめに着目することを選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるルシフェラーゼ修復を測定するプラスミドベースのＳＳＡアッセイ（Ochiai et al., 2010）は、各ｓｇＲＮＡの相対活性を決定し（図９Ａ及びＢ）、ｅＧＦＰ ｓｇＲＮＡ１が最も強力であることが見いだされ、最初の報告（Fu et al., 2014）の結果を実証した。我々はさらに一連のｅＧＦＰ ｓｇＲＮＡの活性を、ＡＡＶＳ１遺伝子座へ標的化された構成的ＣＡＧ：：ＧＦＰ導入遺伝子の破壊を測定する、ヒトｉＰＳＣにおけるゲノム切断アッセイ（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）を使用して決定した（図９Ｃ）。濃縮しないヌクレアーゼでの遺伝子導入の５日後におけるＧＦＰに対するＦＡＣＳ解析は、ｓｇＲＮＡ１に関して、７．４％のＧＦＰ陰性画分を示し、ヒトｉＰＳＣのゲノム切断におけるその有用性を証明した。いずれのアッセイにおいても、どのｓｇＲＮＡでも明白な細胞毒性は観察されなかった。これらのデータに基づき、我々は、ＰＡＭ及び上流の切断部位が、設計されたμＨに近位になるように、カセットに隣接するｅＧＦＰ－１プロトスペーサーを、分岐した配向性で配置した（図７Ａ及び８Ａ）。

隣接するμＨを設計するにあたり、我々は、天然のμ５Ｔ３配列（図１Ａ）を活用した。我々は、ドナーベクターの右のホモロジーアーム内にサイレント変異を設計して、痕跡が残らない定着を実証する一方で、μ５Ｔ３とμ５Ａ３との間にあり得る相互作用も妨害した（図７Ａ及び８Ａ）。ｓｇＲＮＡライブラリのハイスループットスクリーニング及びコンピュータ解析（Doench et al., 2014; Doench et al., 2016）は、ＰＡＭの下流に配置された「Ｇ」ヌクレオチドは、Ｃａｓ９活性には好ましくないことを明らかにしてきた。したがって我々は、入れ子状態の各ｅＧＦＰ－１ ＰＡＭが、「Ｔ」又は「Ａ」ヌクレオチドによって隣接されるように、μＨを意図的に長くした。最後に、２Ａ－ｐｕｒｏ－ΔＴＫ発現のために、現在は５’隣接ｅＧＦＰ１プロトスペーサーを含むオープンリーディングフレームを維持するようにμ５Ｔ３が調節された。したがって、最終的な隣接μＨは、連続した１１ｂｐの配列「ＴＧＡＣＴＧＴＡＧＡＴ」であった。このμＨは、それらが選択マーカー及びＣＲＩＳＰＲで標的化された領域と直列に隣接するように、ＨＰＲＴ１ドナーベクターの左のホモロジーアームの３’末端及び右のホモロジーアームの５’末端内へとＰＣＲ増幅によって操作された（図７Ａ）。

プロトタイプＭｈＡＸ選択マーカーの、１３８３Ｄ６男性ｉＰＳＣ内への遺伝子ターゲティングは、ＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮを使用して刺激され、次いで、ピューロマイシンでの標的クローンの選択が行われた。全クローンは、ＰＣＲによって事前にスクリーニングされ、次いで、標的接合部のサンガーシーケンスが行われ（図８Ｂ）、引き続き、無作為の組込みを除外し、ＨＰＲＴのノックインを証明するために、それぞれ内部ＴＫ及び外部ＨＰＲＴプローブを使用したサザンブロットによって遺伝子型が同定された（図８Ｃ）。陽性コロニーは、薬剤選択されて、ＨＰＲＴ１ノックアウトが機能的に検証され（６－ＴＧ^Ｒ及びＨＡＴ^Ｓ；図７Ｂ、中央）、かつＨＡＴ培地におけるコロニー形成によって、親ｉＰＳＣの混入がないような純度（１０^６個の細胞あたり１個未満細胞）を保証した。

選択マーカーを切除するために、クローン０１６－Ａ３が、Ｃａｓ９及びｅＧＦＰ１ ｓｇＲＮＡの発現ベクターで遺伝子導入され（ｐＸ－ＥＧＦＰ－ｇ１）、次いで、コロニー形成に関するＨＡＴ選択が行われた。eGFP2 sgRNAがＨＡＴ^Ｒコロニー形成を誘導せず（図８Ｄ）、複数回の継代後にもアレルの自発的な復帰が起こらなかったことから（データは示さず）、コロニー形成は、ｅＧＦＰ１ ｇＲＮＡでの処置に特異的かつ依存的であった。ＦＩＡＵを使用したカセットに対する選択は効果がなく、これはもしかしたら、内因性ＨＰＲＴ１の低発現が２Ａ－ｐｕｒｏ－ΔＴＫを駆動するからかもしれず、これは我々のＡＡＶＳ１遺伝子座のジーントラップの経験におけるｎｅｏの低レベルの発現（Oceguera-Yanez et al., Methods 101, 43-55, 2016）と類似する。いずれの場合においても、得られたＨＡＴＲクローンもまた、ｐｕｒｏ及び６－ＴＧに感受性であり、痕跡が残らない切除を示唆している（図７Ｂ）。サザンブロット解析は、ＨＰＲＴ１遺伝子座の再構築を示す一方で、選択マーカーのためのプロービング（ＴＫプローブ）は、切除されたクローンにおいてバンド形成がなかったことを明らかにし、再組込みが起こることなくカセットが除去されたことを証明した（図７Ｃ）。

ゲノムＰＣＲ及びシーケンシング（図７Ｄ及びＥ）は、全てのクローン的に単離されたＨＡＴ^Ｒ ｉＰＳＣのうち９３％を超える（４２／４５）ものが、設計されたμＨのＭＭＥＪを通して起こると予測されたとおりに修復されたことを明らかにした。すべての４２クローンが、設計されたサイレント変異を有し、これは、それらが親１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣとは別個であり、ＭＭＥＪの結果として生じたことを示している。挿入欠失をもたらす隣接するＤＳＢのＮＨＥＪが予想されるため、我々は、ＨＡＴ選択圧の非存在下における修復の忠実度を探索した。クローン０１６－Ａ３を、ｐＸ－ｅＧＦＰ－ｇ１で遺伝子導入し、全ゲノムＤＮＡをＨＡＴ非選択集団から収集し、次いで、ＰＣＲによる標的化された領域の増幅及びＴＡクローン産物のシーケンスを行った。非選択集団において、複数のクローンが、種々の追加の短い挿入欠失あり又はなしで、２つのｅＧＦＰ１プロトスペーサー切断点での融合を示し（図７Ｅ、右、及び示されていないデータ）、伝統的なＮＨＥＪが修復経路であることが推測された。重要なことに、～１０．５％の配列（９／８６）が、ＭＭＥＪ切除のための正確な欠失サイズを有しており、MMEJ媒介修復について予測された完璧に再構築されたＨＰＲＴコーディング配列を表した（図７Ｅ、左）。したがって、我々は、ＭｈＡＸを、高い忠実度の痕跡が残らない選択マーカー切除方法及びゲノム内のデザイナー点変異を定着させるための新規のアプローチとして確立した。

片側性のμＨ変異は、同質遺伝子コントロールの同時単離を可能とする
ＨＰＲＴ１遺伝子座での不完全なμ５Ｗ３修復（図1）に対する我々の知見を鑑み、我々は、結果の二様性を意図的に活用して、単一の実験から変異体及びコントロールｉＰＳＣクローンの両方を作製できると推察した。我々はしたがって、AvrＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮで標的化された領域に隣接するＨＰＲＴ１のエキソン３内に位置する、ＣからＡへのトランスバージョン変異（３１２Ｃ＞Ａ；rs137852485）（Cariello et al., 1988）によって引き起こされる、ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}部分的酵素欠損（Wilson et al., J Biol Chem 256, 10306-10312, 1981）の再作製に着目することを選択した。外部変異の定着のために、上記したものと類似したＭｈＡＸカセット構造を使用して（図７Ａ）、我々は、３１２Ｃ＞Ａ Ｍｕｎｉｃｈ変異を中心（二重下線）に、かつもっぱら診断目的のＡｆｌＩＩ制限部位を作出する追加のサイレント変異３０６Ｇ＞ＴをμＨの５’末端（一重下線）に含む（図１０Ａ）、新たな隣接するμＨ「TAAGAGATATTGT」を設計した（図１０Ａ）。したがってＨＰＲＴ１ホモロジーにおけるオーバーラップは、変異の位置に適応するようにシフトされた（図１０Ａ及び図１１）。μ５Ｗ３の不完全な修復に伴って観察される現象を再現するために（図１）、我々は、μＨにおける患者の３１２Ｃ＞Ａ変異が、対称的（両側性）あるいは非対称的（下流のホモロジーが「TAAGAGCTATTGT」であるように片側性）のいずれか（図１０）である２つのターゲティングベクターを作出した。両側性にコードされた変異は、１００％のクローンにおいて定着すると仮定され、一方で、片側性にコードされた変異は、一部のクローンのみにおいて定着するだろうと仮定された。両方のμＨは、診断上特徴的なＡｆｌＩＩ ３０６Ｇ＞Ｔ変異を含有した。両方のμＨ成分は、左のホモロジーアーム内へとシフトされ、ターゲティング又は切除には影響しないと予想されたため、我々は、内因性μ５Ｗ３を破壊する努力はしなかった。最後に、我々は、カセットが切除されたｉＰＳＣの濃縮を改善させるために、構成的に発現するＣＡＧ：：ｍＣｈｅｒｒｙレポーター遺伝子を含めた。AvrＨＰＲＴ１＿Ｂ ＴＡＬＥＮを再び利用して、１３８３Ｄ６ ｉＰＳＣにおける遺伝子ターゲティングが刺激された。クローンは、切除へと進める前に、サザンブロット（図１１Ｄ）、ＰＣＲ増幅とそれに次ぐＡｆｌＩＩ切断（図１１Ｅ）及び接合部のシーケンス（データは示さず）、ＦＡＣＳによるｍＣｈｅｒｒｙ発現（図10B）、並びにＨＡＴ感受性及び６－ＴＧ耐性（図１０Ｂ）、によってスクリーニングされた。

切除は、標的クローンである０３３－Ｕ－４５（片側性）及び０３３－Ｂ－４３（両側性）のｐＸ－ＥＧＦＰ－ｇ１での遺伝子導入によって誘導され、０３３－Ｕ－４５及び０３３－Ｂ－４３それぞれについて１．９％及び１．４％の割合でｍＣｈｅｒｒｙ陰性集団が産生された（図１２）。ｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞は、＞９８％の純度までＦＡＣＳで分別され、ＨＡＴ選択圧あり又はなしで、クローン密度で再度プレートに撒いた。クローン単離及び代謝スクリーニングは、一定のｉＰＳＣ株が６－ＴＧ及びＨＡＴ耐性の逆転を呈し、正常ＨＰＲＴが示され、一方で他のｉＰＳＣ株が両方の薬剤に対する感受性を示したことを明らかにした（図１０Ｂ）。ＨＡＴ選択下において、０３３－Ｂ－４３ではいかなるクローンももたらされず、修復ができないか又は３１２Ｃ＞Ａ変異の表現型に対する影響のいずれかが示唆された（図１０Ｃ）。その一方で、０３３－Ｕ－４５は、ＨＡＴ選択圧下で、痕跡が残らない切除を達成したが、サイレントな３０６Ｇ＞Ｔ変異の定着をもっぱら表した（４９／４９）ｉＰＳＣコロニーを産生し、修復偏向又はＨＡＴに対するＨＰＲＴ１^３１２Ａの感受性の表現型のいずれかであることが示された。

切除、ＦＡＣＳ濃縮、及び選択圧の非存在下におけるコロニー形成は、痕跡が残らないよう操作されたクローンを産生した（図１０Ｃ）。μ１１で観察されたように（図７Ｅ）、ＮＨＥＪを介して修復されたクローンは、ｅＧＦＰ ｓｇＲＮＡ１切断点及び隣接するμＨの保持、からなる種々の挿入欠失変異を生み出した。両側性のμＨを持つクローンのうち、２．５％（５／２０４）は痕跡が残らないよう切除され、全てのクローンが、３０６Ｔサイレント及び３１２Ａ Ｍｕｎｉｃｈ変異の両方を有した。片側性のμＨ由来のクローンは、６．６％の割合（１４／２１１）で痕跡が残らないよう切除された。重要なことに、９／１４のクローンが、サイレント及びＭｕｎｉｃｈ変異の両方を有していた一方で、残り（５／１４）は、１つのサイレント変異のみを持っており（図１０Ｃ及びＤ）、これは、我々が、意図的に不完全なホモロジーを設計することによって、ＭＭＥＪの結果の偶然性を再現することができることを示した。ｍＣｈｅｒｒｙに対するＦＡＣＳ解析（図１０Ｂ）及び内部導入遺伝子プローブでのサザンブロット（図１０Ｅ）の両方が、正しく切除されたクローンの中でマーカー遺伝子はいかなる検出可能な割合においてもゲノム内に再挿入されないことの証拠を再び提供した。したがって、我々のデータは、不完全なμＨを媒介したＭＭＥＪは、等しい実験条件下で取り扱われた場合に、疾患及び関連する正常の同質遺伝子ｉＰＳＣクローンの同時の作出に適用され得ることを証明する。
操作されたＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}変異の表現型解析

最後に、我々は、ＨＰＲＴ操作の表現型上の結果を調べ、クローンのバリエーションの評価に着手した。プリンサルベージ経路におけるヒポキサンチンのイノシン一リン酸（ＩＭＰ）への変換には、ＨＰＲＴ酵素活性が必要である（図１３Ａ）。培養中に、プリンのデノボ合成が、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）によって遮断される場合、細胞は、ＤＮＡ合成について、全面的にプリンサルベージに頼らなければならない。ＭｈＡＸの手順の間に、ＨＡＴの濃縮は、選択的にＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ}クローンを排除し、ＨＰＲＴ^３０６Ｔクローンを支持した（図１０Ｃ）。しかしながら、通常のｉＰＳＣ維持条件下では、正常、変異体、又は同質遺伝子コンロトールのクローン間で、形態又は増殖率におけるいかなる差異も認められなかった。我々は、したがって、ＨＡＴ選択下で、操作されたｉＰＳＣクローンの増殖を検討した。ＨＡＴ処理開始から２４時間以内に、ノックアウトＨＰＲＴ^Δ１７Ａ及び０３３－Ｕ－４５は完全に排除され、一方で、ＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ} ｉＰＳＣは、細胞数において遅延した増殖を示した（ｄ３、図１３Ｂ）。この低下は、細胞形態における顕著な変化（図１３Ｂ、右）、及び７２時間までの完全な細胞死に付随した。興味深いことに、ＨＰＲＴ^Δ１７Ａ及び０３３－Ｕ－４５ノックアウトｉＰＳＣとは異なり、ＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ} ｉＰＳＣもまた、６－ＴＧに対する感受性を保持していたものの（２０μＭ、図１０Ｂ）、ＨＡＴ応答と同様に、１３８３Ｄ６又はＨＰＲＴ^３０６Ｔと比較した場合には細胞死は遅延されていた（データは示さず）。これらのデータは、ＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ}は限定されたグアニンサルベージ能を保持し、最終的には６－ＴＧ誘導毒性につながったけれども、デノボ合成の非存在下における全体的なプリンサルベージは、ＤＮＡ複製及び細胞増殖には不十分であることを示唆する。

病理学的には、低下したＨＰＲＴ機能は、高レベルのヒポキサンチン、及び過剰なヒポキサンチンの尿酸への変換という結果をもたらし（図１３Ａ）、尿酸は関節及び腱の中に蓄積して炎症性関節炎を引き起こし、又はより重症の場合には、腎結石もしくは尿酸腎症を引き起こす。高尿酸血症患者の細胞可溶化液を使用したインビトロアッセイは、ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}タンパク質の細胞内レベルは正常であることを見出した（Wilson et al., J Biol Chem 256, 10306-10312, 1981; Wilson et al., 1982）一方で、突然変異が、異常なヒポキサンチン触媒活性を持つ酵素という結果をもたらす（Wilson and Kelly, 1984）ことを示した。よって、ＨＰＲＴ^Δ１７Ａ及び０３３－Ｕ－４５ノックアウトｉＰＳＣ株からの可溶化液のウエスタンブロット解析においてＨＰＲＴタンパク質が検出不可能であったにもかかわらず、ＨＰＲＴ^３０６Ｔ又はＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ}の各３つのクローンは、１３８３Ｄ６のタンパク質発現レベルに匹敵するタンパク質発現レベルを明らかにした（図１３Ｃ）。ＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ} ｉＰＳＣにおけるＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}の代謝状態を評価するために、我々は、キャピラリー電気泳動飛行時間型質量分析（ＣＥ－ＭＳ）を実施して、消費された細胞培養培地中のイオン代謝産物を検出した（Wakayama et al., 2015））。ＨＰＲＴ媒介性プリンサルベージの機能不全について予測されたように、ヒポキサンチン及びグアニン両方のレベルが、１３８３Ｄ６と比較して、ノックアウトｉＰＳＣにおいて上昇していた（図１３Ｄ）。ＨＰＲＴ^３０６Ｔクローンは、１３８３Ｄ６に似た代謝プロファイルを有していた一方で、ＨＰＲＴ^{３０６Ｔ／３１２Ａ} ｉＰＳＣは、ＨＰＲＴ^Δ１７Ａ又は０３３－Ｕ－４５ノックアウトよりは少ない程度であるが、ヒポキサンチンとグアニンの両方を蓄積した。これらのデータは、完全な機能喪失よりはむしろ、低レベルのグアニン及びヒポキサンチンサルベージと一致した。かくして、我々は、痕跡が残らないよう、かつ確率論的に疾患関連又はコントロールの点変異を定着させるために、ＭｈＡＸ技術を使用して、ＨＰＲＴ１コード領域変種の特有のｉＰＳＣモデルを作出した。

ＭＭＥＪカセット切除に影響するパラメータ
ＭＭＥＪ効率に対して、μＨ長を増加させることの効果を探索するために、我々は、ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}アレルを作り出すために使用された我々のカセット設計と類似した、プラスミドベースのＭＭＥＪアッセイを開発した。我々は、クロラムフェニコール／ｃｃｄＢ陽性／陰性細菌選択カセットを、ｅＧＦＰ－１（ｐｓ１）プロトスペーサーと隣接させ、それを、０～５０ｂｐまで長さが増加する隣接μＨを持つルシフェラーゼ発現ベクター内へと挿入した（図１４ａ、ｂ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内への遺伝子導入に次いで、μＨ長とルシフェラーゼ活性との間には陽性の相関が観察され、増加するμＨ長とともにＭＭＥＪ率の改善が示唆された（図１４ｂ）。ｃｃｄＢ感受性細菌宿主におけるＫａｎ^Ｒカセットが切除されたプラスミドの回収は、試験されたすべてのμＨ長にわたって、類似したコロニー数を明らかにし（データは示さず）、ＭＭＥＪプラスミド系列を渡るｐｓ１切断に関する一定の効率を反映する。細菌コロニーからのμ０接合部のシーケンシングは、一貫したＮＨＥＪの様式を明らかにする一方で、μ２０接合部は、Ｋａｎ^Ｒクローンの６．２５％（２／３２）における完全なＭＭＥＪ媒介性修復を明らかにした。したがって、ルシフェラーゼ活性と一致して、μＨ長の増加は、ＮＨＥＪよりもＭＭＥＪ修復を改善させた。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の染色体外プラスミドからのＭＭＥＪによる正確なカセットの切除は、ｉＰＳ細胞ゲノムからのカセットの切除を正確には反映していないかもしれない。我々はしたがって、μ５Ａ３を破壊する３つの同義変異（ｃ.３０３Ａ＞Ｇ、ｃ.３０４Ｃ＞Ｔ、及びｃ.３０６Ｇ＞Ａ）の定着とともに、ＭＭＥＪがＨＡＴ耐性の回復をもたらす、ＨＰＲＴ遺伝子座における染色体アッセイを確立した。ＴＡＬＥＮを使用して、１１ｂｐ又は２９ｂｐ長のμＨによって隣接されるＭｈＡＸカセットを、ＨＰＲＴ１エキソン３に標的化した（図１４ｃ）。Ｐｕｒｏ^Ｒクローンを、以前のようにＰＣＲ及びサザンブロットによってスクリーニングし、６－ＴＧ^Ｒ及びＨＡＴ^Ｓであることが検証された一方で、フローサイトメトリーは、全ての正確に標的化されたｉＰＳＣにおけるｍＣｈｅｒｒｙの構成的かつ均一な発現を明らかにした（データは示さず）。予想されたとおり、ｍＣｈｅｒｒｙ陰性画分は、２つのコンストラクト間で類似しており、ｐｓ１プロトスペーサーでのＣａｓ９切断及びカセット切除の割合は、μＨ長によって影響されないことが示された。しかしながら、μ２９切除からのｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞は、より大きな数のＨＡＴ^Ｒコロニーを生じさせ（図１４ｄ）、ＭＭＥＪによる痕跡が残らない修復の亢進が示唆された。μ１１及びμ２９ ｍＣｈｅｒｒｙ陰性集団（ＨＡＴ濃縮をしていない）からのＨＰＲＴアレルの遺伝子型決定は、プラスミドアッセイにおいて観察された変化の倍率（図１４ｂ）と同様に、痕跡が残らない修復及び変異の定着における～４倍の増加（７．８％対～平均３５％）を明らかにした。このように、μＨの長さを増加させることは、ヒトｉＰＳＣ染色体からの痕跡が残らないカセット切除を改善させる。

酵母（PMID:17483423）及びマウスＥＳＣ（PMID:9418857）におけるＤＳＢＲからの証拠は、長い異種構造（heterology）（ＤＳＢの末端からホモロジーの開始点までの非相同配列）の存在は、ＭＭＥＪ又はＨＤＲ修復率に負に影響し得ることを示唆する。我々は、ｐｓ１プロトスペーサーのＰＡＭが選択カセットの近位に位置し、これまでに使用されたＰＡＭ遠位の配向性において作り出された６又は７ｂｐと比較して、いずれかの末端における１７ｂｐの異種構造をもたらすように、ｐｓ１プロトスペーサーを単純に反転させることによってこのパラメータを試験した（図１４ｅ）。ＰＡＭ遠位又は反転プロトスペーサーからのｍＣｈｅｒｒｙ陰性細胞画分によって測定されたところのカセット切除の割合は類似しており、配向性自体は、Ｃａｓ９切断に影響しないことが示された。いずれのプロトスペーサー配向性からのＨＡＴ選択集団においても、設計された同義変異を持つ、挿入欠失を含まない配列は濃縮され得るものの、全体的なＨＡＴ^Ｒコロニー形成における減少によって示されるように、伸長された異種構造によってＭＭＥＪ修復率は妨害された（図１４ｆ）。逆に、公用及び経験的データは、設計されたプロトスペーサーに内因性配列を提供するμＨ末端を慎重に選択することで、ＭＭＥＪの忠実度はさらに亢進され得ることを示唆する。これらの結果に基づき、引き続くＭｈＡＸ実験では、伸長されたμＨが利用され、ＰＡＭ遠位配向性が維持された。
ＡＰＲＴ遺伝子座の２対立遺伝子改変

多くの疾患発症性の変異は、常染色体性の劣性遺伝を示す。我々はしたがって、ＭｈＡＸ法を使用して、痕跡が残らない２対立遺伝子改変を実証することに着手した。この目的のために我々は、アデニンからアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）を合成するために必要であるアデノシンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）酵素を操作することを選択した。ＡＰＲＴ＊Ｊ変異（c.407T>C;rs104894507;M136T）は、部分的な酵素欠損をもたらし、２，８－ジヒドロキシアデニン（２，８－ＤＨＡ）結晶の蓄積を引き起こし、しばしば腎結石の形成、又はより重症な場合には、腎不全をもたらす（Kamatani et al., 1990）。ＡＰＲＴ＊Ｊ変異は、尿路結石症である日本人患者において蔓延している（７９％）ものの、ＡＰＲＴ＊Ｊ変異のインビトロなｉＰＳＣモデルは、まだ作出されていない。ＰＡＭ－遠位ｅＧＰＦ－１プロトスペーサーによって隣接されているジーントラップＭｈＡＸカセット（図１５ａ）を利用して、我々は、以下：

の隣接する３２ｂｐのμＨを設計し、ここで、診断上特徴的なＡｃｃ６５Ｉ制限部位を作り出す同義のｃ.４０２Ａ＞Ｔ変異（一重下線）は両側性で存在し、一方で、ＡＰＲＴ＊Ｊ変異（二重下線）は片側性で存在した。ドナーベクターバックボーンの無作為の組込みを低減するために、我々は、ＧＦＰ蛍光に対する陰性選択を利用した（図１５ａ、PMID:16258059）。ＡＰＲＴエキソン５において変異部位にオーバーラップするＣＲＩＳＰＲ ｓｇＲＮＡを、Ｔ７Ｅ１消化を使用してスクリーニングし、ＡＰＲＴ遺伝子ターゲティングで直接使用した。両方のアッセイにおける優れた能力のため、ＡＰＲＴ ｓｇＲＮＡ－２をを選択した。ピューロマイシン耐性ｍＣｈ^ｐｏｓ／ＧＦＰ^ｎｅｇ ｉＰＳＣクローンを顕微鏡観察によって同定し、選び取り、正しいターゲティングについて、ゲノムＰＣＲ、接合部シーケンシング、サザンブロット、及びフローサイトメトリーによってスクリーニングした。ｍＣｈｅｒｒｙの平均蛍光強度は、二峰性の分布を示し、これは、ヘテロ及びホモ接合性の標的クローンの遺伝子型決定によって検証されたように、コピー数依存的な様式で関連付けられていた（図１６）。

ヘテロ及びホモ接合性の標的クローンを各３つずつ、ｐＸ－ｅＧＦＰ－１の遺伝子導入を介した選択マーカーの切除に供した。切除率は、一貫してホモ接合性標的クローン（平均３．３％）に対して、ヘテロ接合性標的クローン（平均６．７％）で高く（図１５ｅ及び示していないデータ）、ゲノムから１又は２コピーの選択マーカーが取り除かれる必要性があることが反映された。切除されたｍＣｈ^ｎｅｇ集団を、ＦＡＣＳによって単離し、ゲノムＰＣＲによってアレルのスペクトルを解析した。予想通り、改変されていない正常アレルが、ヘテロ接合性標的クローンからの切除された集団において検出された配列のおそよ半分を構成していた。痕跡が残らないカセットの切除は、ヘテロ接合性クローンにおいて平均３０％の割合で起こった。興味深いことに、ホモ接合性の標的クローンは、ＮＨＥＪアレルにおいて相対的な増加を示し、痕跡が残らない切除の全体的な割合は平均１３％に減少した。片側性のμＨを再び観察して、サイレント及び病原性のアレル型を確率論的に作り出した。

ｍＣｈ^ｎｅｇ細胞の集団を、クローン単離及び遺伝子型決定のために、プレートに撒いた。両アレルの識別を保証するために、我々はＰＣＲアンプリコン内にイントロン３からのヘテロ接合体ＳＮＰ（rs8191489、G／C）を近隣に含ませ（データは示さず）、ヘテロ接合体修復事象を分解するためにＴＩＤＥ解析を利用した。すべてのクローン単離されたｉＰＳＣの二倍体の遺伝子型は、図１５ｇにおいて要約されている。ヘテロ接合性に標的化されたクローンＥＰ０５２－２－２における痕跡が残らない切除の割合は、集団解析から予測された割合と類似していた（３２．２％、図１５ｇ）。ホモ接合性クローンＥＰ０５２－２－１１は、９／１６０（５．６％）の痕跡が残らない２対立遺伝子改変を持つ切除クローンを生じさせ、ホモ接合性及び化合物ヘテロ接合性遺伝子型を表している（図１５ｇ）。ＴＩＤＥによる配列の分解は、ＮＨＥＪとして分類された追加の１８クローンが、他のアレルの痕跡が残らない切除を経て、アレルのＭｈＡＸ忠実度の全体的な割合（１６．９％）が我々の最初の集団解析と一致していることを明らかにした。

２対立遺伝子が操作されたＡＰＲＴ＊Ｊクローンが選択され、サザンブロット及びＡｃｃ６５Ｉ ＲＦＬＰアッセイを使用して、正確な遺伝子編集がさらに確認された（図１５ｃ、ｄ）。我々は、有毒なプリンアナログである２，６－ジアミノプリン（ＤＡＰ）（PMID:3837181）に対するＡＰＲＴ＊Ｊ ｉＰＳＣクローンの耐性を試験することによって、その表現型を決定した。親１３８３Ｄ６及びホモ接合性サイレント／サイレント変異体は、１０ｕｇ／ｍＬ ＤＡＰに対して、処置のほんの２４時間以内に、重い薬剤感受性を見せた。ヘテロ接合性の標的化細胞又はＡＰＲＴ＊Ｊ／サイレント細胞は、ＤＡＰに対してわずかな感受性しか持たなかったが、それでもまた４８時間以内には排除された一方で、ホモ接合性の標的化細胞及びＡＰＲＴ＊Ｊ／ＡＰＲＴ＊Ｊ細胞は、ＤＡＰ処置に対して完全に耐性であり、ＡＰＲＴノックアウト又は遺伝子編集の結果として細胞代謝における機能的な変化が実証された。
ＡＰＲＴ遺伝子座の「液状」改変は、一連の同質遺伝子アレルを作出する

ｉＰＳＣにおける痕跡が残らない遺伝子編集の過程を促進するという目標をもって、我々は、コピー数依存的な導入遺伝子発現及びＦＡＣＳによる無作為のターゲティング事象の蛍光対抗選択で、ジーントラップターゲティングの高い忠実度を活用することを選択した。ＡＰＲＴ遺伝子ターゲティングは、上記のように実行された（図１５）が、標的中間体のクローン単離及びスクリーニングの代わりに、Ｐｕｒｏ^Ｒ集団全体が、バルクで収集され、ＦＡＣＳに供されてｍＣｈ^ｐｏｓ／ＧＦＰ^ｎｅｇ ｉＰＳＣが単離された（図１７ａ、ｂ）。我々はさらに、ヘテロ接合性又はホモ接合性標的細胞（図１５／ＳＸ）をそれぞれ濃縮するために、ｍＣｈ^ｐｏｓ集団を、ｍＣｈ^ｌｏｗ（全体の５２．９％）及びｍＣｈ^ｈｉｇｈ（全体の１５．５％）へ分けた（図１７ｂ）。カセットの切除は、ｍＣｈ^ｈｉｇｈバルク集団からよりもｍＣｈ^ｌｏｗバルク集団からのほうがより効率的であり（２．６％対７．０％）（図１７ｂ）、これはヘテロ接合性又はホモ接合性標的クローンからの１又は２コピーの導入遺伝子の切除と一致した（図１５）。

我々はまず、得られた２つの切除された集団に対して、遺伝子型決定解析を実施し、アレルを３つのカテゴリーに分類した：非標的化、これは正常及び挿入欠失アレル（遺伝子ターゲティングの間に作り出される）を含む；ＮＨＥＪ、これはカセット切除の修復の間に起こる（これらは操作された配列を保持するために、挿入欠失と区別される）；並びにＭＭＥＪ、これらは病原性及び／又はサイレント変異を含む（図１７ｃ）。注目すべきことに、ｍＣｈ^ｌｏｗ集団はより頻繁な挿入欠失を含んでいた一方で、ｍＣｈ^ｈｉｇｈ集団はＮＨＥＪに偏向し、１又は２対立遺伝子標的化細胞のＦＡＣＳ濃縮を確証し、かつＡＰＲＴ－ｓｇＲＮＡ２の、ＤＳＢのエラープローン修復を誘発する潜在力もまた明らかにした。正常及び挿入欠失アレルを除外すると、痕跡が残らない切除の忠実度は、ｍＣｈ^ｈｉｇｈよりもｍＣｈ^ｌｏｗ集団でわずかに高かった（２６．５対２２．７％）。ＨＰＲＴ_{Ｍｕｎｉｃｈ}アレルについて、ＦＡＣＳベースのターゲティン及び切除という同様の工程が実施され（図１８）、これは、クローン化中間体において以前に観察された割合と類似した割合で（５．６対６．６％）、痕跡が残らないよう遺伝子編集されたクローンを生じさせた。最後に、我々は、バルクで切除された集団から、クローン単離及びＡＰＲＴ＊Ｊアレルの解析を実施した。このように、我々のＨＰＲＴ及びＡＰＲＴ遺伝子編集アプローチは、不完全なμＨを通して操作されたＭＭＥＪは、均一な実験条件下で取り扱われたときに、疾患及び正常の両方の同質遺伝子ｉＰＳＣクローンを同時に産生することを示した（図１７ｅ）。
ＭｈＡＸカセット切除のための代替のｓｇＲＮＡ

我々は、ヒトゲノムにおいて低いオフターゲット部位を有することが予測される一連の候補ｓｇＲＮＡをスクリーニングした（図１９）。候補のリストは、我々がすでにＭｈＡＸに対して活性であると実証済みであるＡ.ｖｉｃｔｏｒｉａのＧＦＰ遺伝子を標的化するｓｇＲＮＡ、ヒトのほぼ一倍体（ｎｅａｒ－ｈａｐｌｏｉｄ）ＨＡＰ１細胞においてＮＨＥＪを介して内因性遺伝子タギングを刺激するのに最近使用されたゼブラフィッシュｔｉａ１ｌ（Lackner et al., 2015）を標的化する１つのｓｇＲＮＡ（Hwang et al., 2013）、及びＰＩＴＣｈ（ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＭＭＥＪを利用した遺伝子ノックインに使用される、完全に人工的なｓｇＲＮＡ配列（Nakade et al., 2014））を含んだ。

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本発明は、好ましい実施態様に重点を置いて記載されてきたが、好ましい実施態様は改変されてもよいことが、当業者には明らかである。本発明は、本明細書において詳細に記載されている方法の他の方法も含み得ることが意図される。したがって、本発明は、添付した「特許請求の範囲」の要旨及び範囲の中に含まれるすべての改変を包含する。
さらに、本明細書中で述べられた特許及び特許出願明細書を含む任意の刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。

本出願は、米国仮出願番号６２／３７０，０４７号を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含される。

Claims (14)

1. 痕跡が残らないゲノム配列を有し、かつ、変異を持つゲノム配列を有する細胞と、痕跡が残らないゲノム配列を有し、かつ、該変異を持たない同質遺伝子細胞とを同時に製造する方法であって、ゲノム内の標的化された領域中へと挿入された外因性核酸配列が完全に切除され、
   ここで、該外因性核酸配列が、各末端における標的化された領域中のゲノム配列と相同な核酸配列と、二つの該相同な核酸配列間の１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位と、を含み、該相同な核酸配列のどちらか一方だけが、対応する内因性ゲノム配列中に変異を有し、かつ該方法が：
   （１）該配列特異的ヌクレアーゼ又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を、該外因性核酸配列が挿入されるゲノム配列を有する宿主細胞中へと導入する工程；及び
   （２）工程（１）で得られた細胞を培養する工程、を含み、
   これによって、該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位における二本鎖切断、及びこれに続いて、その結果生じる該相同な核酸配列を含む切断末端間におけるマイクロホモロジー媒介末端結合又は一本鎖アニーリングが引き起こされて、該外因性核酸配列が標的化された領域から完全に切除されて痕跡が残らないよう復帰されたゲノム配列を有する細胞が産生され、該標的化された領域中に変異を持つゲノム配列を有する細胞と、該変異を持たない同質遺伝子細胞が同時に産生される、
   方法。
2. 該外因性核酸配列が、２つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含み、かつそのうちの２つがそれぞれ、該２つの相同な核酸配列に実質的に隣接し、外因性遺伝子が該２つの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位の間に挿入される、請求項１記載の方法。
3. 該外因性遺伝子が、選択マーカー遺伝子である、請求項２記載の方法。
4. 該配列特異的ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）又はクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ）である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
5. 該宿主細胞が、
   該外因性核酸配列を含み、該外因性核酸配列の両末端に該相同な核酸配列と相同なゲノム配列の両末端にフランキングゲノム配列をそれぞれ含む核酸を細胞中に導入し、
   それによって、相同組換えによって宿主ゲノムの標的化された領域内へ該外因性核酸配列が挿入される、
   ことによって得られる、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
6. 該フランキングゲノム配列のどちらか一方又は両方が、対応する内因性ゲノム配列内に変異を有し、それによって該フランキングゲノム配列内に該変異を持つゲノム配列を有する細胞が産生される、請求項５記載の方法。
7. 該相同組換えが、各フランキングゲノム配列内の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位における配列特異的二本鎖切断によって媒介される、請求項５又は６に記載の方法。
8. 該配列特異的ヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓである、請求項７記載の方法。
9. 該宿主細胞が、胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
10. 該標的化された領域が、その部位における変異が疾患を引き起こす部位を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
11. （ａ）宿主ゲノム内の標的化された領域に相同な２つの核酸配列であって、該核酸配列のうちの１つの３’末端と、他方の核酸配列の５’末端とがオーバーラップする、２つの核酸配列；及び
    （ｂ）該（ａ）の２つの核酸配列の間の１つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位、
    を含み、該相同な核酸配列のどちらか一方だけが、対応する内因性ゲノム配列中に変異を有する、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法における使用のための核酸。
12. 該外因性核酸配列が、２つ以上の配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を含みかつそれらのうちの２つがそれぞれ、該（ａ）の２つの核酸配列に実質的に隣接して配置され、該２つの配列特異的ヌクレアーゼ認識部位の間に外因性遺伝子が挿入されている、請求項１１記載の核酸。
13. （ａ）請求項１１又は１２の核酸;及び
    （ｂ）（ａ）の核酸に含まれる該配列特異的ヌクレアーゼ認識部位を特異的に認識する１つ以上の種類の配列特異的ヌクレアーゼ、又は該配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸、
    を含み、該相同な核酸配列のどちらか一方だけが、対応する内因性ゲノム配列中に変異を有する、請求項５～８のいずれか１項に記載の方法における使用のためのキット。
14. 該配列特異的ヌクレアーゼが、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓである、請求項１３記載のキット。

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