CN116445454A - 一种用于培育抗tgev感染的猪品种的成套系统及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于培育抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种的成套系统及其应用。所述系统包括基因编辑蛋白、pAPN‑sgRNA‑1、pAPN‑sgRNA‑2和供体DNA，基因编辑蛋白可对pAPN基因的两个靶位点进行有效酶切，通过将位于两个靶位点之间的待定点修饰片段替换为供体DNA，可实现将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子突变为编码丙氨酸的密码子，进而实现将猪pAPN蛋白第737位氨基酸由色氨酸到丙氨酸的精准突变。本发明系统能够避免破坏或改变pAPN蛋白其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。

Description

一种用于培育抗TGEV感染的猪品种的成套系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于培育抗TGEV感染的猪品种的成套系统及其应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)是一种高度接触传染性疾病，该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)，主要引起猪腹泻、呕吐、脱水和死亡，其中初生仔猪中死亡率高达100％。因此TGE被认为是危害养猪产业的重要传染病之一。目前对于TGE仍没有有效的控制手段和治疗方法，虽然接种疫苗可以在一定程度上缓解疫情的扩大蔓延，但是常规TGE疫苗也存在着缺陷。随着生物技术的不断发展，利用基因编辑技术培育抗病毒性腹泻猪新品种是生猪绿色健康养殖的产业需求。
TGEV入侵宿主细胞通过病毒的S蛋白与宿主细胞膜上的特异性受体蛋白分子相互结合来实现。就TGEV本身而言，致病性的差异往往是多种因素导致的，既有可能是单一基因片段的一个或多个氨基酸差异导致的，也有可能是多个基因片段的协同作用。已有研究发现pAPN蛋白是TGEV进入细胞的关键受体，但是关于该蛋白发挥作用的是哪些(或哪个)关键氨基酸位点未见报道。因此探讨决定TGEV致病性的pAPN关键氨基酸位点，并利用基因编辑技术创制关键氨基酸位点精确突变的基因编辑猪，以期为培育能够抵抗TGEV感染的猪新品种奠定材料基础，对于生猪产业具有重要的科学和实际意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何培育能够抵抗TGEV感染的猪品种。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种成套系统。
本发明提供的成套系统包括基因编辑蛋白、pAPN-sgRNA-1、pAPN-sgRNA-2和供体DNA；
所述pAPN-sgRNA-1和所述pAPN-sgRNA-2分别靶向pAPN基因的两个不同的靶序列，将所述pAPN-sgRNA-1的靶序列与所述pAPN-sgRNA-2的靶序列之间的片段记作待定点修饰片段(所述待定点修饰片段不包含所述pAPN-sgRNA-1的靶序列与所述pAPN-sgRNA-2的靶序列)；所述待定点修饰片段含有编码猪pAPN蛋白第737位色氨酸的密码子；所述供体DNA含有定点修饰片段，所述定点修饰片段为将所述待定点修饰片段中编码猪pAPN蛋白第737位色基酸密码子突变为丙氨酸的密码子后得到的片段。
上述成套系统中，所述基因编辑蛋白具体可为Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9蛋白。
上述成套系统中，所述供体DNA依次包括上游同源臂序列(所述上游同源臂序列包含所述pAPN-sgRNA-1的靶序列)、所述定点修饰片段和下游同源臂序列(所述下游同源臂序列包含所述pAPN-sgRNA-2的靶序列)；所述上游同源臂序列为自所述待定点修饰片段中的第一个核苷酸对应的位点起向其上游方向(此处上游方向是相对于猪基因组序列而言)延伸得到的任意一个DNA片段(该片段不包含待定点修饰片段中的第一个核苷酸)；
所述下游同源臂为自所述待定点修饰片段中的最后一个核苷酸对应的位点起向其下游方向(此处下游方向是相对于猪基因组序列而言)延伸得到的任意一个DNA片段(该片段不包含待定点修饰片段中的最后一个核苷酸)。
所述上游同源臂序列和所述下游同源臂序列的长度可为100-900bp，优选400-500bp。
所述pAPN-sgRNA-1和所述pAPN-sgRNA-2均靶向pAPN基因上的两个不同的目标靶点，基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切，再利用供体DNA实现序列重组，该系统在不改变pAPN蛋白其余氨基酸的情况下对编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子进行精确替换，将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子替换为编码丙基酸的密码子。具体为：供体DNA在所述pAPN-sgRNA-1和所述pAPN-sgRNA-2的引导下，所述基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切并引导供体DNA替换细胞中原有的同源片段，从而实现将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子(TGG)突变为编码丙氨酸的密码子(GCC)，进而实现将猪pAPN蛋白第737位氨基酸由色氨酸到丙氨酸的精准突变。本发明提供的系统在精确修饰pAPN蛋白第737位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变pAPN蛋白的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点，为制备、培育pAPN单氨基酸精确突变的抗TGEV猪新品种提供有力支撑。
在实际应用中，为了防止所述供体DNA被所述pAPN-sgRNA-1和/或所述pAPN-sgRNA-2识别、切割，可对所述供体DNA中的所述pAPN-sgRNA-1的靶序列和/或所述pAPN-sgRNA-2的靶序列上的一个或多个碱基进行同义突变。
进一步的，所述pAPN-sgRNA-1的靶序列如SEQ ID No.1所示。
所述pAPN-sgRNA-2的靶序列如SEQ ID No.2所示。
所述定点修饰片段的核苷酸序列如下：TCGAACCCCTCTTCCAACATTTCGAAACTCTCACTAAAAACGCCAC。
所述待定点修饰片段的核苷酸序列具体如下：TCGAACCCCTCTTCCAACATTTCGAAACTCTCACTAAAAACTGGAC。
更进一步的，所述供体DNA为SEQ ID No.3所示的双链DNA。
为了解决上述技术问题，本发明又提供了一种成套载体。
本发明提供的成套载体包括表达上述成套系统的载体。
进一步的，所述成套载体由表达上述基因编辑蛋白和上述pAPN-sgRNA-1的载体、表达上述基因编辑蛋白和上述pAPN-sgRNA-2的载体和含有上述供体DNA的载体组成。
更进一步的，所述表达上述基因编辑蛋白和上述pAPN-sgRNA-1的载体为将SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示单链DNA退火后的双链DNA片段连入至基因编辑骨架载体后得到的载体；
所述表达上述基因编辑蛋白和上述pAPN-sgRNA-2的载体为将SEQ ID No.7和SEQIDNo.8所示单链DNA退火后的双链DNA片段连入至基因编辑骨架载体后得到的载体。
所述基因编辑骨架载体包括基因编辑蛋白编码序列和sgRNA编码序列，具体可为pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458，pX458普适性广，通用性较强，且产品成熟度较高，使用其作为基因编辑载体骨架，能够达到更高的酶切效率。
利用本发明提供的上述成套系统或上述成套载体可以实现pAPN基因定点修饰，如利用上述成套系统或上述成套载体可以构建pAPN基因定点修饰的细胞系，而且由于pAPN蛋白第737位点是影响TGEV受体活性最重要的一个氨基酸位点，将其点突变后能够阻断pAPN与TGEV的结合，抵抗TGEV的感染，从而极大地增强机体对TGEV的抗性，构建猪传染性胃肠炎抗性猪，以有效解决培育能够抵抗TGEV感染的猪品种的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了将猪pAPN蛋白第737位色氨酸突变为丙氨酸的物质的新用途。
本发明提供了将猪pAPN蛋白第737位色氨酸突变为丙氨酸的物质在如下1)-4)任一种中的应用：
1)制备预防和/或治疗猪传染性胃肠炎的产品；
2)构建pAPN基因定点修饰的细胞系；
3)构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型；
4)培育抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种。
所述将猪pAPN蛋白第737位色氨酸突变为丙氨酸的物质可为上述成套系统或上述成套载体。
为了解决上述技术问题，本发明最后提供了如下A1)-A3)任一种方法：
A1)pAPN基因定点修饰的细胞系的构建方法，包括如下步骤：将上述成套系统或上述成套载体导入猪源细胞，得到pAPN基因定点修饰的细胞系；
A2)抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种的培育方法，包括如下步骤：将A1)所述的细胞系移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，然后将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因定点修饰的基因编辑猪，该pAPN基因定点修饰的基因编辑猪即为抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种；
A3)抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种的培育方法，包括如下步骤：将上述成套系统或上述成套载体显微注射至猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，然后将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因定点修饰的基因编辑猪，该pAPN基因定点修饰的基因编辑猪即为抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种。
上述A1)所述方法中，所述导入的方法可为电穿孔法或脂质体转染法。所述导入后还包括筛选和鉴定的步骤。所述筛选的方法可通过流式分选筛选单克隆细胞。所述鉴定的方法可为测序鉴定，具体可为先提取单克隆细胞的DNA，然后利用SEQ ID No.12和SEQ IDNo.13所示引物进行PCR扩增，再将扩增产物通过测序确认细胞是否实现精准修饰。
上述A2)和A3)所述方法中，所述基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤。所述鉴定的方法可为测序鉴定，具体可为先提取基因编辑猪的DNA，然后利用SEQ ID No.12和SEQIDNo.13所示引物进行PCR扩增，再将扩增产物通过测序确认是否实现精准修饰。
按照上述方法构建得到的pAPN基因定点修饰的细胞系也属于本发明的保护范围。
上述任一所述方法或应用或细胞中，所述pAPN基因定点修饰是指将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子(TGG)突变为编码丙氨酸的密码子(GCC)。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、利用本发明成套系统制备pAPN基因定点修饰细胞的方法具有操作简单、成本低廉的优势，且制备得到的细胞中pAPN蛋白第737位氨基酸被准确修饰。2、利用pAPN基因定点修饰细胞制备基因编辑猪的方法具有操作方便、普适性强的优势，且制备得到的精确基因编辑猪不仅具有良好的TGEV抗性，同时保留了pAPN蛋白生理活性功能。
本发明提供的用于培育抗TGEV感染的猪品种的成套系统包括基因编辑蛋白、pAPN-sgRNA-1、pAPN-sgRNA-2和供体DNA，基因编辑蛋白可对pAPN基因的两个靶位点进行有效酶切，通过将位于两个靶位点之间的待定点修饰片段替换为供体DNA，可实现将编码猪pAPN蛋白第737位色基酸的密码子(TGG)突变为编码丙氨酸的密码子(GCC)，进而实现将猪pAPN蛋白第737位氨基酸由色氨酸到丙氨酸的精准突变。基于本发明成套系统进行pAPN基因定点修饰的方法在精确修饰pAPN蛋白第737位氨基酸的同时，能够避免破坏或改变pAPN蛋白其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留了pAPN蛋白的生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的猪pAPN蛋白W737单氨基酸精确突变模式图。
图2为本发明实施例1提供的猪pAPN蛋白E739单氨基酸精确突变模式图。
图3为本发明实施例2提供的pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞中pAPN蛋白的表达图。
图4为本发明实施例2提供的pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，荧光定量PCR(qRT-PCR)检测TGEV RNA拷贝数结果图。
图5为本发明实施例2提供的pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测TGEV蛋白结果图。
图6为本发明实施例2提供的pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，间接免疫荧光(IFA)检测pAPN和TGEV表达结果图。
图7为本发明实施例3提供的pAPN蛋白第739位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞中pAPN蛋白的表达图。
图8为本发明实施例3提供的pAPN蛋白第739位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，qRT-PCR检测TGEV RNA拷贝数结果图。
图9为本发明实施例3提供的pAPN蛋白第739位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，Western Blot检测TGEV蛋白结果图。
图10为本发明实施例3提供的pAPN蛋白第739位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，IFA检测pAPN和TGEV表达结果图。
图11为本发明实施例4提供的pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞的测序结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中涉及的主要试剂及其来源如下：用于分离猪胎儿成纤维细胞的胶原酶type IV是sigma的产品。用于细胞培养的DMEM、FBS、PS、NEAA、Glutamine、Trypsase均是Gibco的产品。提取细胞和耳组织DNA试剂盒是天根生化科技有限公司的产品。用于PCR的KOD FX PCR酶是TOYOBO的产品。
下述实施例中涉及的引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。
下述实施例中涉及的主要仪器如下：CO2培养箱(Thermo Scientific，3111)、超净工作台(AIRTECH，SW-CJ-1FD)、荧光倒置显微镜(ZEISS，observerA1)、PCR仪(BIO-RID，C1000 Touch)、凝胶成像系统(BIO-RID，Universal HoodⅡ)、显微操作系统(Eppendorf，Celltram vario)、细胞流式分选仪(BD，Aria III)。
下述实施例中的猪pAPN蛋白的氨基酸序列在NCBI中的GenBank为NP_999442.1。
下述实施例中的Cas9蛋白的氨基酸序列在NCBI中的GenBank为ANW61896.1。
下述实施例中的pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal Pig Intestinal-2IKnock Out，IPI-2I-KO)记载于文献“徐长江,王晓朋,徐奎等.利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系[J].中国畜牧兽医,2021,48(7):2282-2290.DOI:10.16431/j.cnki.1671-7236.2021.07.002.”中。
实施例1、pAPN基因定点修饰系统的设计及其表达载体的构建
一、pAPN基因定点修饰系统的设计
1、pAPN基因定点修饰系统1的设计
本发明中的pAPN基因定点修饰系统1包括Cas9蛋白、pAPN-sgRNA-1、pAPN-sgRNA-2和供体DNA1(dsODN序列1)：
pAPN-sgRNA-1的靶序列如SEQ ID No.1所示。
pAPN-sgRNA-2的靶序列如SEQ ID No.2所示。
供体DNA1(dsODN序列1)为SEQ ID No.3所示的双链DNA分子。
本发明的pAPN基因定点修饰系统1可将猪基因组中编码pAPN蛋白第737位氨基酸的密码子由TGG替换为GCC，以使pAPN蛋白第737位的氨基酸由色氨酸变为丙氨酸，具体突变模式如图1所示。
2、pAPN基因定点修饰系统2的设计
本发明中的pAPN基因定点修饰系统2包括Cas9蛋白、pAPN-sgRNA-1、pAPN-sgRNA-2和供体DNA2(dsODN序列2)：
pAPN-sgRNA-1的靶序列如SEQ ID No.1所示。
pAPN-sgRNA-2的靶序列如SEQ ID No.2所示。
供体DNA2(dsODN序列2)为SEQ ID No.4所示的双链DNA分子。
本发明的pAPN基因定点修饰系统2可将猪基因组中编码pAPN蛋白第739位氨基酸的密码子由GAG替换为GCC，以使pAPN蛋白第739位的氨基酸由谷氨酸变为丙氨酸，具体突变模式如图2所示。
二、pAPN基因定点修饰系统表达载体的构建
1、pX458-pAPN-sgRNA-1和pX458-pAPN-sgRNA-2重组载体的构建
1)针对pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2序列合成如下互补配对的寡聚核苷酸序列：
pAPN-sgRNA-1-F：caccgCTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID No.5)；
pAPN-sgRNA-1-R：aaacGCTTCCTGAGGTATTTCTAGc(SEQ ID No.6)；
pAPN-sgRNA-2-F：caccgCGAGCGCCCAGAAAATCTGA(SEQ ID No.7)；
pAPN-sgRNA-2-R：aaacTCAGATTTTCTGGGCGCTCGc(SEQ ID No.8)。
2)将步骤1)中pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2相应的互补的寡聚核苷酸分别在98℃条件下处理10min，然后自然冷却至室温进行退火，得到退火双链片段。
3)用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9编码基因序列的PX458骨架载体(Addgene，#48138)在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化载体骨架。
4)将步骤2)获得的退火双链片段与步骤3)获得的线性化载体骨架在16℃条件下连接1h，冰浴30min，热激45s，然后转化到Top10或DH5α的感受态细胞，在含氨苄的LB平板上涂布生长，次日挑取单菌落扩大培养并采用引物GAGGGCCTATTTCCCATGATT进行测序。
5)将测序正确的单菌落培养后提取质粒，分别命名为重组质粒pX458-pAPN-sgRNA-1和pX458-pAPN-sgRNA-2，-20℃冻存，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
所述重组质粒pX458-pAPN-sgRNA-1为将SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示单链DNA退火后的双链DNA片段连入至PX458骨架载体的限制性内切酶Bbs I位点后得到的质粒。
所述重组质粒pX458-pAPN-sgRNA-2为将SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示单链DNA退火后的双链DNA片段连入至PX458骨架载体的限制性内切酶Bbs I位点后得到的质粒。
2、Donor载体的构建
1)Donor-737载体的构建
将dsODN序列1连入至PUC57载体(金斯瑞生物科技公司，SD1176)中的BamHI和MluI限制性内切酶位点之间，得到重组载体并进行测序验证，将测序正确的单菌落培养后提取质粒并命名为Donor-737，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
2)Donor-739载体的构建
将dsODN序列2连入至PUC57载体(金斯瑞生物科技公司，SD1176)中的BamHI和MluI限制性内切酶位点之间，得到重组载体并进行测序验证，将测序正确的单菌落培养后提取质粒并命名为Donor-739，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
实施例2、pAPN基因第737位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞的建立及功能验证
一、pAPN基因第737位氨基酸精确修饰过表达细胞的建立
1、将野生型pAPN基因CDS序列(SEQ ID No.9)连入至PLVX载体(钦诚生物，QCP0424)，得到PLVX-WT重组载体。
将第737位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列(SEQ ID No.10)连入至PLVX载体(钦诚生物，QCP0424)，得到PLVX-737重组载体。
2、电转染前一天，将pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal PigIntestinal-2I Knock Out，IPI-2I-KO)复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。
3、分别将PLVX-WT重组载体、PLVX-737重组载体和PLVX载体电转染至IPI-2I-KO细胞，成功获得精确修饰过表达细胞，分别命名为IPI-2I-WTOE、IPI-2I-737OE和IPI-2I-Vector，用作TGEV感染试验时的供体细胞。
二、功能验证
将上述步骤一获得的IPI-2I-WTOE、IPI-2I-737OE和IPI-2I-Vector细胞进行TGEV感染试验，具体步骤如下：
1、分别将IPI-2I-WTOE、IPI-2I-737OE和IPI-2I-Vector细胞接种TGEV病毒株，MOI＝1。
2、感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测pAPN的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
pAPN蛋白检测结果如图3所示，结果表明：细胞接毒后，IPI-2I-WTOE和IPI-2I-737OE组中pAPN均正常表达。
3、感染12h后收集细胞，用PBS清洗4-5次，提取细胞RNA，利用qRT-PCR检测细胞中TGEV病毒拷贝数。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
qRT-PCR结果如图4所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE组细胞相比较，IPI-2I-737OE组细胞中TGEV基因组RNA拷贝数极显著降低(***P<0.001)。
4、感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测TGEV病毒的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
TGEV病毒感染量如图5所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE组细胞相比较，IPI-2I-737OE组细胞中TGEV感染量明显减少。
5、感染12h后收集细胞，利用IFA检测细胞中TGEV感染情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
IFA检测结果如图6所示，结果表明：IPI-2I-WT细胞接毒后，细胞中TGEV大量感染，与IPI-2I-WT组细胞相比较，IPI-2I-737OE组细胞中TGEV感染量明显减少。
综上结果表明，pAPN基因第737位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞可以有效抵抗TGEV感染，说明pAPN基因第737位为TGEV感染的关键位点，pAPN基因第737位氨基酸精确修饰后可有效抵抗TGEV感染。
实施例3、pAPN基因第739位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞的建立及功能验证
1、将野生型pAPN基因CDS序列(SEQ ID No.9)连入至PLVX载体中，得到PLVX-WT重组载体。
将第739位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列(SEQ ID No.11)连入至PLVX载体中，得到PLVX-739重组载体。
2、电转染前一天，将pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal PigIntestinal-2I Knock Out，IPI-2I-KO)复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。
3、分别将PLVX-WT重组载体、PLVX-739重组载体和PLVX载体电转染到IPI-2I-KO细胞，成功获得精确修饰过表达细胞，分别命名为IPI-2I-WTOE、IPI-2I-739OE和IPI-2I-Vector，用作TGEV感染试验时的供体细胞。
二、功能验证
将上述步骤一获得的IPI-2I-WTOE、IPI-2I-739OE和IPI-2I-Vector细胞进行TGEV感染试验，具体步骤如下：
1、分别将IPI-2I-WTOE、IPI-2I-739OE和IPI-2I-Vector细胞接种TGEV病毒株，MOI＝1。
2、感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测pAPN的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
pAPN蛋白检测结果如图7所示，结果表明：细胞接毒后，IPI-2I-WTOE和IPI-2I-739OE组中pAPN均正常表达。
3、感染12h后收集细胞，用PBS清洗4-5次，提取细胞RNA，利用qRT-PCR检测细胞中TGEV病毒拷贝数。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
qRT-PCR结果如图8所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE组细胞相比较，IPI-2I-739OE组细胞中TGEV基因组RNA拷贝数显著降低(*P<0.05)。
4、感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测TGEV病毒的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
TGEV病毒感染量如图9所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE组细胞相比较，IPI-2I-739OE组细胞中TGEV感染量无明显变化。
5、感染12h后收集细胞，利用IFA检测细胞中TGEV感染情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
IFA检测结果如图10所示，结果表明：与IPI-2I-WT组细胞相比较，IPI-2I-739OE组细胞中TGEV感染量无明显变化。
综上结果表明，pAPN基因第739位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞不能有效抵抗TGEV感染，说明pAPN基因第739位不是TGEV感染的关键位点，pAPN基因第739位氨基酸精确修饰后不能有效抵抗TGEV感染。
实施例4、pAPN基因第737位氨基酸精确修饰猪成纤维细胞单克隆的建立
一、猪胎儿成纤维细胞的制备
将猪35日龄胚胎去除头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴胎牛血清，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基地猪场饲养的猪。
二、细胞转染
转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。将5μg实施例1中制备的pX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg实施例1中制备的pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μg实施例1中制备的Donor-737质粒共转染入猪胎儿成纤维细胞中，然后将电转后的细胞转移到6孔板培养，转染步骤严格按照Basic PrimaryFibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。
三、单克隆细胞的流式分选及传代
电转48h后，消化细胞并收集到流式管，通过流式分选仪分选单个GFP阳性细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。待96孔板中的细胞长满传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
四、单克隆细胞的鉴定
对所挑取的单克隆细胞进行鉴定，具体步骤如下：以提取的细胞基因组DNA为模板，采用pAPN-TY-F2和pAPN-TY-R2进行PCR扩增，得到大小为1443bp的PCR产物。
pAPN-TY-F2：5’-CAAGGATTTGTGGAGGAGAA-3’(SEQ ID No.12)；
pAPN-TY-R2：5’-GCTGAGCGGAGTTTGTCG-3’(SEQ ID No.13)。
PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，62.6℃30s，68℃1min 40s，34个循环；72℃，5min。PCR产物送北京天一辉远公司测序。根据测序结果，筛选pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞用作核移植时的供体细胞。
测序结果显示，本实施例成功的获得了多株pAPN蛋白第737位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞，阳性细胞的测序结果如图11所示。
实施例5、体细胞核移植技术制备pAPN基因第737位氨基酸精确修饰的基因编辑猪
以实施例3获得的纯合基因编辑的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的去核后的猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠，其中手术法胚胎移植步骤为：受体母猪静脉注射舒泰(Zoletil)麻醉剂进行诱导麻醉，注射剂量为5mg/kg体重。麻醉后将受体母猪移至手术架上仰卧保定，并进行呼吸麻醉(异氟烷浓度为3％～4％)。受体母猪腹中线做一个长约10cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。胚胎移植后，技术人员定期观察，并用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。小猪出生后，剪取耳组织并提取基因组DNA，使用pAPN-TY-F2和pAPN-TY-R2进行PCR扩增，并对PCR扩增产物进行测序检测基因型。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

Claims (10)

1.成套系统，所述成套系统包括基因编辑蛋白、pAPN-sgRNA-1、pAPN-sgRNA-2和供体DNA；
所述pAPN-sgRNA-1和所述pAPN-sgRNA-2分别靶向pAPN基因的两个不同的靶序列，将所述pAPN-sgRNA-1的靶序列与所述pAPN-sgRNA-2的靶序列之间的片段记作待定点修饰片段；所述待定点修饰片段含有编码猪pAPN蛋白第737位色氨酸的密码子；所述供体DNA含有定点修饰片段，所述定点修饰片段为将所述待定点修饰片段中编码猪pAPN蛋白第737位色基酸密码子突变为丙氨酸的密码子后得到的片段。
2.根据权利要求1所述的成套系统，其特征在于：所述基因编辑蛋白为Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2。
3.根据权利要求1或2所述的成套系统，其特征在于：所述pAPN-sgRNA-1的靶序列如SEQID No.1所示；
或，所述pAPN-sgRNA-2的靶序列如SEQ ID No.2所示；
或，所述供体DNA依次包括上游同源臂序列、所述定点修饰片段和下游同源臂序列；所述上游同源臂序列为自所述待定点修饰片段中的第一个核苷酸对应的位点起向其上游方向延伸得到的任意一个DNA片段；
所述下游同源臂为自所述待定点修饰片段中的最后一个核苷酸对应的位点起向其下游方向延伸得到的任意一个DNA片段；
或，所述供体DNA为SEQ ID No.3所示的双链DNA。
4.成套载体，所述成套载体包括表达权利要求1-3任一所述成套系统的载体。
5.根据权利要求4所述的成套载体，其特征在于：所述成套载体由表达权利要求1-3中所述基因编辑蛋白和所述pAPN-sgRNA-1的载体、表达权利要求1-3中所述基因编辑蛋白和所述pAPN-sgRNA-2的载体和含有权利要求1-3中所述供体DNA的载体组成。
6.根据权利要求5所述的成套载体，其特征在于：所述表达权利要求1中所述基因编辑蛋白和所述pAPN-sgRNA-1的载体为将SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示单链DNA退火后的双链DNA片段连入至基因编辑骨架载体后得到的载体；
或，所述表达权利要求1中所述基因编辑蛋白和所述pAPN-sgRNA-2的载体为将SEQIDNo.7和SEQ ID No.8所示单链DNA退火后的双链DNA片段连入至基因编辑骨架载体后得到的载体。
7.将猪pAPN蛋白第737位色氨酸突变为丙氨酸的物质在如下1)-4)任一种中的应用：
1)制备预防和/或治疗猪传染性胃肠炎的产品；
2)构建pAPN基因定点修饰的细胞系；
3)构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型；
4)培育抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述将猪pAPN蛋白第737位色氨酸突变为丙氨酸的物质为权利要求1-3任一所述的成套系统或权利要求4-6任一所述的成套载体。
9.如下A1)-A3)任一种方法：
A1)pAPN基因定点修饰的细胞系的构建方法，包括如下步骤：将权利要求1-3任一所述的成套系统或权利要求4-6任一所述的成套载体导入猪源细胞，得到pAPN基因定点修饰的细胞系；
A2)抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种的培育方法，包括如下步骤：将A1)所述的细胞系移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，然后将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因定点修饰的基因编辑猪，该pAPN基因定点修饰的基因编辑猪即为抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种；
A3)抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种的培育方法，包括如下步骤：将权利要求1-3任一所述的成套系统或权利要求4-6任一所述的成套载体显微注射至猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，然后将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因定点修饰的基因编辑猪，该pAPN基因定点修饰的基因编辑猪即为抗猪传染性胃肠炎病毒感染的猪品种。
10.按照权利要求9所述方法构建得到的pAPN基因定点修饰的细胞系。
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