CN113957069A - 用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，提供了一种用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物及其应用。本发明提供特异性识别猪pAPN基因的成套sgRNA可以靶向识别pAPN基因第736位和第738位氨基酸附近的序列，特异性强。在此基础上，结合切割蛋白和双链donor序列组成的组合物，可以实现pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰。在该组合物的编辑下，pAPN基因第736位和第738位氨基酸得到精准有效修饰，能够避免破坏或改变pAPN基因的其余氨基酸的正常表达。因此其不仅可以抵抗TGEV感染，并能在最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能。

Description

用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物及 其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物及其应用。
背景技术
猪传染性肠胃炎(transmissible gastroenteritis,TGE)是一种急性传染性肠道疾病，具有传播速度快，致死率高的特点，一旦猪感染该种病毒会降低猪的体重和生长速度，临床上猪传染性肠胃炎对哺乳仔猪造成的危害最为严重。
pAPN基因为猪传染性肠胃炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)的细胞表面受体之一，CDS全长2892bp，含有21个外显子，编码963个氨基酸，分子量约为150kDa。TGEV感染过程中病毒S蛋白与受体pAPN发生特异性结合的位置是pAPN上第717-813位氨基酸。目前的研究中，为了降低TGEV感染，采用的方式多为通过基因编辑抑制或阻断pAPN基因的表达，该方法可以有效的预防和控制病毒的侵袭和转移。然而，pAPN基因还参与其他的生理过程，例如细胞生长、信号转导、免疫调节、血管新生等等，目前的方式虽然阻碍了TGEV感染，同时也改变了细胞的其他生理过程。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种特异性识别猪pAPN基因的成套sgRNA。
本发明的第二目的在于提供一组用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物。
本发明的第三目的在于提供成套sgRNA或组合物在pAPN基因编辑中的应用。
本发明的第四目的在于提供基因编辑细胞及其制备方法。
本发明的第五目的在于提供基因编辑猪的制备方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
特异性识别猪pAPN基因的成套sgRNA，包括pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2；
编码pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
编码pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
一组用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物，包括切割蛋白、双链donor序列和上述的成套sgRNA；
成套sgRNA引导切割蛋白靶向识别位点并进行切割；
编码pAPN基因第736位和第738位氨基酸的密码子位于成套sgRNA的识别位点之间；
双链donor序列用于将pAPN基因N736替换为A736，以及，T738替换为V738。
进一步地，N736替换为A736的方案为将编码N736的密码子AAC替换为GCT，T738替换为V738的方案为将编码T738的密码子ACC替换为GTC；
优选地，双链donor序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
进一步地，切割蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9；
优选地，目标切割载体1表达切割蛋白和pAPN-sgRNA-1，目标切割载体2表达切割蛋白和pAPN-sgRNA-2；
优选地，目标切割载体1和目标切割载体2的载体骨架均独立地为CRISPR质粒；
优选地，所述CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，优选为CRISPR/Cas9；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。
上述成套sgRNA或组合物在pAPN基因编辑中的应用。
一种基因编辑细胞的制备方法，将上述组合物转入目标细胞中，得到基因编辑细胞。
进一步地，所述目标细胞包括猪成纤维细胞，优选包括猪胎儿成纤维细胞；
优选地，通过电穿孔法转入或通过脂质体转染法转入。
上述制备方法制备得到的基因编辑细胞。
一种基因编辑猪的制备方法，将基因编辑细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的基因编辑猪；
或者通过显微注射的方法，将所述的组合物显微注射到猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的基因编辑猪。
进一步地，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供特异性识别猪pAPN基因的成套sgRNA可以靶向识别pAPN基因第736位和第738位氨基酸附近的序列，特异性强。在此基础上，结合切割蛋白和双链donor序列组成的组合物，可以实现pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰。切割蛋白在成套sgRNA的引导下，分别识别两个作用靶点，并在两个作用靶点实现序列切割，双链donor序列用于替换切割下来的片段，其中，编码pAPN基因第736位和第738位氨基酸的密码子位于成套sgRNA的识别位点之间，替换后，pAPN基因N736替换为A736，T738替换为V738。在该组合物的编辑下，pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时得到精准有效修饰，能够避免破坏或改变pAPN基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。
本发明提供的基因编辑细胞以及基因编辑猪的制备方法，操作简单、成本低廉，普适性强，且制备得到的基因编辑细胞和基因编辑猪具有良好的TGEV抗性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的猪pAPN基因N736和T738双氨基酸精确突变模式图；
图2为本发明实施例2提供的pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞的测序结果图；
图3为本发明实施例2提供的pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞抵抗TGEV感染qRT-PCR检测结果图；
图4为本发明实施例2提供的pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞抵抗TGEV感染IFA检测结果图；
图5为本发明实施例2提供的pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞抵抗TGEV感染TCID50检测结果图；
图6为本发明实施例3提供的pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞的测序结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
pAPN蛋白是TGEV进入细胞的关键受体，但除了在介导TGEV入侵方面发挥着重要作用外，pAPN在小肠中还发挥水解肽、酰胺等结构中的酰胺键，从而释放不同的N-中性氨基酸的作用。同时pAPN蛋白在其他组织中还参与很多重要的生理过程，例如细胞生长、免疫调节和血压调节。因此直接对pAPN进行敲除可能影响机体的其他生理功能。本申请氨基酸点突变研究结果显示pAPN肽链中位于第16外显子的第736位的天冬酰胺(Asparagine,N)和第738位的苏氨酸(Threonine,T)是影响其作为TGEV受体活性最重要的两个氨基酸位点。
基于上述内容，本发明提供了特异性识别猪pAPN基因的成套sgRNA，包括pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2；其中，编码pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
该成套sgRNA的特异性强，识别效率高。
编码pAPN-sgRNA-1的序列：CTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID NO：1)；
编码pAPN-sgRNA-2的序列：CGAGCGCCCAGAAAATCTGA(SEQ ID NO：2)。
一组用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物包括切割蛋白、双链donor序列和本发明的成套sgRNA；成套sgRNA引导切割蛋白靶向识别位点并进行切割；编码pAPN基因第736位和第738位氨基酸的密码子位于成套sgRNA的识别位点之间；双链donor序列用于将pAPN基因N736替换为A736，以及，T738替换为V738。
在该组合物的编辑下，pAPN基因第736位和第738位氨基酸得到精准有效修饰，能够避免破坏或改变pAPN基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点，能够为制备、培育pAPN双氨基酸精确突变的抗TGEV猪新品种提供有力支撑。
需要说明的是，切割蛋白在此不做特殊限定，可以实现在sgRNA的引导下靶序列切割的功能即可，例如可以为Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2等。
在优选地实施方式中，N736替换为A736的方案为将编码N736的密码子AAC替换为GCT，T738替换为V738的方案为将编码T738的密码子ACC替换为GTC，进一步优选为双链donor序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
pAPN-dsODN序列：CCTTTGAGCACAGTCTGGCCTTGTGCGAGGCCTTTAGCCTCTGGCCTCTTGCTCCTGTAGCCATTAGCTCTTGCTACATCTGCCCACCCACATCAGAGGCTCCATGGGTCTCCAGATGACTCAGGCATGAGTCTCTTCTTTGAAGCTATTTTTAGGGCTGCATCCTCGGCATGTGGAGGTTCCCAAGCTAGGGGTTGAATCGGAGCTGTAGCCGCCAGCCTACACCACAGCCACAGCAACACGGGATCCGAGCCACATCTGCGACCTACACCACAGCTCACAGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGTGGGGCCAGGGTTGAACCCATGTCCTCATGTTTCCCAGTCAGATTCGTTTCTGCTGTGCCATGACGGGAACTCTGGAACTTCCTCTTTGAAGCTCTTTATGTTTTGTTCTTGTTTTTTGTTTTTGTTTTTCTAGAAATACCTCAGGAAGCAAGTCGAACCCCTCTTCCAACATTTCGAAACTCTCACTAAAGCTTGGGTCGAGCGCCCAGAAAACTTAATGGACCAGTGAGTATGAGCTCGCTTGGTCTGGAGATCATGGGTGGTGCAGGTAGCCTGACCTGGGGGCCCATAGCAAGTCCAGCAGCATCCTCTCTGGAGCTCCCAACTCCTGGCCGGACCAGGGCCACAGTCAGGGAGAGCGACCCCTCCCAACCCCACTCCCGGCCCCAGGAGTAGGGACTCTGCTCTGAGGCTCTGTGTGGCCTATGAACCATCTGGCCTCTTTGGGCAAAGGACCAAACTGAACCTCTGAGGGTCCCTCACCCGCATGGTGAGGTTCTAGGTGTTAAAGCTGGGGCTGGAGCCTGTGCCAGCCCTCCCCAGGCTGCCCAAGGGCAAGAAGCAAAGAAGGGAACCCAAAGGTGGCTGGTGGGCTATACCTGCAGAGTGCGGGTCTGCCTCCCTGTTGGGAGTTGTGTGTCAGCAGGGGAGTCTTGGTCAGCGTCAGGTCCAGGCGTGCTGACAGAGTGT(SEQ ID NO：3)。
在优选地实施方式中，切割蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9；目标切割载体1表达切割蛋白和pAPN-sgRNA-1，目标切割载体2表达切割蛋白和pAPN-sgRNA-2，目标切割载体1和目标切割载体2的载体骨架均为CRISPR质粒。
在优选地实施方式中，CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，优选为CRISPR/Cas9；CRISPR/Cas9质粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。
CRISPR/Cas9和pX458普适性广，通用性较强，且产品成熟度较高，使用其作为基因编辑载体骨架，能够达到更高的酶切效率。
在优选地实施方式中，分别将序列如SEQ ID NO：4-5和SEQ ID NO：6-7所示的寡核苷酸单链退火形成双链，分别与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得目标切割载体1和目标切割载体2。
pAPN-sgRNA-1-F序列：caccgCTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID NO：4)；
pAPN-sgRNA-1-R序列：aaacGCTTCCTGAGGTATTTCTAGc(SEQ ID NO：5)；
pAPN-sgRNA-2-F序列：caccgCGAGCGCCCAGAAAATCTGA(SEQ ID NO：6)；
pAPN-sgRNA-2-R序列：aaacTCAGATTTTCTGGGCGCTCGc(SEQ ID NO：7)。
成套sgRNA或组合物在pAPN基因编辑中的应用。成套sgRNA可以实现靶位点的特异性识别，组合物可以实现pAPN基因第736位和第738位氨基酸精准修饰。将N736和T738准确替换为A736和V738后，能够阻断pAPN与TGEV的结合。
本发明提供一种基因编辑细胞及其制备方法，将本发明的组合物转入目标细胞中，得到基因编辑细胞。进一步地，通过筛选和鉴定得到基因编辑细胞。其中，目标细胞可以为猪成纤维细胞，进一步优选为猪胎儿成纤维细胞(猪胎儿成纤维细胞相较于其他细胞，克隆效率更高)；转入的方式可以为电穿孔或脂质体转染。
本发明还提供基因编辑猪的制备方法，将本发明的基因编辑细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，或者通过显微注射的方法，得到pAPN基因修饰胚胎，将重组克隆胚胎或基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的基因编辑猪。进一步地，对基因编辑猪进行测序鉴定。
本发明中的鉴定方法优选为：提取样本(细胞或猪)的DNA，使用如SEQ ID NO：8-9所示引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果判定。
pAPN-TY-F2序列：CAAGGATTTGTGGAGGAGAA(SEQ ID NO：8)；
pAPN-TY-R2序列：GCTGAGCGGAGTTTGTCG(SEQ ID NO：9)。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
主要试剂：分离猪胎儿成纤维细胞用的胶原酶type IV购自sigma；细胞培养用的DMEM、FBS、PS、NEAA、Glutamine、Trypsase均购自Gibco；提取细胞和耳组织DNA试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成；用于PCR的KOD FX PCR酶购自TOYOBO。
主要仪器：CO2培养箱(Thermo Scientific,3111)；荧光倒置显微镜(ZEISS,observerA1)；PCR仪(BIO-RID,C1000 Touch)；凝胶成像系统(BIO-RID,Universal HoodⅡ)；显微操作系统(Eppendorf，Celltram vario)；细胞流式分选仪(BD，Aria III)。
实施例1重组质粒pX458-pAPN-sgRNA载体的构建和双链donor序列设计
1.首先锁定编码猪pAPN基因的第736位和第738位氨基酸附近序列，利用sgRNA分析工具CRISPOR(crispor.tefor.net)选择一个靠近N736和T738位点同时分值又较高的打靶位点，其序列如SEQ ID NO：1(CTAGA AATACCTCAGGAAGC)和SEQ ID NO：2(CGAGCGCCCAGAAAATCT GA)所示。根据打靶位点序列合成如SEQ ID NO：4(pAPN-sgRNA-1-F序列：caccgCTAGAAATACCTCAGGAAGC)和SEQ ID NO：5(pAPN-s gRNA-1-R序列：aaacGCTTCCTGAGGTATTTCTAGc)；SEQ ID NO：6(p APN-sgRNA-2-F序列：caccgCGAGCGCCCAGAAAATCTGA)和SEQ ID NO：7(CD-13-sgRNA-2-R序列：aaacTCAGATTTTCTGGGCGCTCGc)所示的互补配对的寡聚核苷酸序列。同时，根据sgRNA序列本实施例还设计了一条如SEQ ID NO：3(pAPN-dsODN序列：CCTTTGAGCACAGTCTGGCCTTGTGCGAGGCCTTTAGCCTCTGGCCTCTTGCTCCTGTAGCCATTAGCTCTTGCTACATCTGCCCACCCACATCAGAGGCTCCATGGGTCTCCAGATGACTCAGGCATGAGTCTCTTCTTTGAAGCTATTTTTAGGGCTGCATCCTCGGCATGTGGAGGTTCCCAAGCTAGGGGTTGAATCGGAGCTGTAGCCGCCAGCCTACACCACAGCCACAGCAACACGGGATCCGAGCCACATCTGCGACCTACACCACAGCTCACAGCAATGCCAGATCCTTAACCCACTGAGTGGGGCCAGGGTTGAACCCATGTCCTCATGTTTCCCAGTCAGATTCGTTTCTGCTGTGCCATGACGGGAACTCTGGAACTTCCTCTTTGAAGCTCTTTATGTTTTGTTCTTGTTTTTTGTTTTTGTTTTTCTAGAAATACCTCAGGAAGCAAGTCGAACCCCTCTTCCAACATTTCGAAACTCTCACTAAAGCTTGGGTCGAGCGCCCAGAAAACTTAATGGACCAGTGAGTATGAGCTCGCTTGGTCTGGAGATCATGGGTGGTGCAGGTAGCCTGACCTGGGGGCCCATAGCAAGTCCAGCAGCATCCTCTCTGGAGCTCCCAACTCCTGGCCGGACCAGGGCCACAGTCAGGGAGAGCGACCCCTCCCAACCCCACTCCCGGCCCCAGGAGTAGGGACTCTGCTCTGAGGCTCTGTGTGGCCTATGAACCATCTGGCCTCTTTGGGCAAAGGACCAAACTGAACCTCTGAGGGTCCCTCACCCGCATGGTGAGGTTCTAGGTGTTAAAGCTGGGGCTGGAGCCTGTGCCAGCCCTCCCCAGGCTGCCCAAGGGCAAGAAGCAAAGAAGGGAACCCAAAGGTGGCTGGTGGGCTATACCTGCAGAGTGCGGGTCTGCCTCCCTGTTGGGAGTTGTGTGTCAGCAGGGGAGTCTTGGTCAGCGTCAGGTCCAGGCGTGCTGACAGAGTGT)所示的dsODN序列作为双链donor序列，当双链donor序列替换掉野生型序列后，N736和T738被成功替换为A736和V738。猪pAPN基因N736和T738双氨基酸精确突变模式图如图1所示。
2.构建的靶向pAPN基因的第736位和第738位氨基酸附近序列的CRISPR/Cas9重组质粒，命名为pX458-pAPN-sgRNA-1和pX458-pAPN-sgR NA-2。将合成的寡聚核苷酸在98℃条件下处理10min，然后自然冷却至室温的条件下对其进行退火；用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的pX458骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段后，与退火的寡聚核苷酸16℃连接1h，随后转化Top10或DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄的LB平板生长，挑取单菌落扩大培养并测序，测序引物为SEQ ID NO：10所示的U6-FWD(U6-FWD:GAGGGCCTATTTCCCATGATT)。序列正确，进行扩大培养后，用质粒去内毒素大提试剂盒(Endo-Free Plasmid Maxi Kit)上提供的方法，提取pX458-pAPN-sgRNA-1质粒和pX458-pAPN-sgRNA-2质粒，所提的质粒用于细胞的转染。
实施例2 pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞单克隆的建立及功能验证
1.pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞的建立
将野生型猪回肠上皮细胞(Immortal Pig Intestinal-2I wild type,IPI-2I-WT)提前两天复苏至10cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。将5μgpX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μg pAPN-dsODN共转染入IPI-2I-WT细胞中，转染步骤严格按照Basic Primary Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。
电转36h后，将细胞收集起来，通过流式分选仪分选单个的阳性细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。分选后的细胞大约培养10天左右，可以观察到96孔板中的细胞长满，然后将长满的单克隆细胞进行传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO：8(pAPN-TY-F2序列：CAAGGATTTGTGGAG GAGAA)和SEQ ID NO：9(pAPN-TY-R2序列：GCTGAGCGGAGTTT GTCG)所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，扩增出1443bp片段。扩增条件为94℃5min；98℃30s，62.6℃30s，68℃100s，34个循环；72℃，5min。2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序。细胞测序结果如图2所示，筛选pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰的IPI-2I(IPI-2I-736+738PE)细胞用作TGE V感染试验时的供体细胞。
2.pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞的功能验证
将上述获得的IPI-2I-736+738PE细胞进行TGEV感染试验。利用qRT-PCR检测TGEV基因组在细胞中拷贝数，分别在IPI-2I-WT和IPI-2I-736+738PE细胞接种TGEV病毒株(MOI＝1)，Mock组为IPI-2I-WT细胞未接毒空白对照组。感染12h和24h后收集细胞，提取RNA检测细胞中TGEV病毒拷贝数。qRT-PCR结果如图3，结果表明，TGEV基因组RNA在IPI-2I-WT细胞上大量复制，与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-736+738PE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数极显著降低(***P<0.001)。
利用间接免疫荧光(IFA)检测细胞中TGEV感染情况，分别在IPI-2I-WT和IPI-2I-736+738PE细胞接种TGEV病毒株(MOI＝1)，Mock组为IPI-2I-WT细胞未接毒空白对照组。感染12h后进行间接免疫荧光检测，IFA结果如图4所示，结果表明，IPI-2I-WT细胞接毒后，细胞中TGEV大量感染，与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-736+738PE细胞中几乎没有TGEV感染。
利用TCID50检测细胞中TGEV病毒滴度，分别在IPI-2I-WT和IPI-2I-736+738PE细胞接种TGEV病毒株(MOI＝1)，Mock组为IPI-2I-WT细胞未接毒空白对照组。感染12h和24h后收集细胞上清液，随后利用LLC-PK1细胞分别检测上清液中TGEV病毒滴度。TCID50结果如图5所示，结果表明，细胞接毒后，IPI-2I-WT细胞中TGEV病毒滴度较高，与IPI-2I-WT细胞相比，IPI-2I-736+738PE细胞中病毒滴度极显著降低(***P<0.001)。
综上结果表明，pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞可以有效抵抗TGEV感染，说明pAPN基因第736位和第738位氨基酸为TGEV感染的关键位点，pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰后可有效抵抗TGEV感染。
实施例3 pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰猪成纤维细胞单克隆的建立
1.猪胎儿成纤维细胞的制备
将猪35日龄胚胎去除头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴胎牛血清，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基地猪场饲养的猪。
2.细胞转染
转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至10cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。将5μg pX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μg pAPN-dsODN共转染入猪胎儿成纤维细胞中，转染步骤严格按照Basic PrimaryFibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。
3.阳性单克隆细胞的筛选
电转36h后，将细胞收集起来，通过流式分选仪分选单个的阳性细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。分选后的细胞大约培养10天左右，可以观察到96孔板中的细胞长满，然后将长满的单克隆细胞进行传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
4.阳性单克隆细胞的鉴定
对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO：8(pAPN-TY-F2序列：CAAGGATTTGTGGAGGAGAA)和SEQ ID NO：9(pAPN-TY-R2序列：GCTGAGCGGAGTTTGTCG)所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，扩增出1443bp片段。扩增条件为94℃5min；98℃30s，62.6℃30s，68℃100s，34个循环；72℃，5min。2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序。根据测序，筛选pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞用作核移植时的供体细胞。
5.实验结果
测序结果显示，本实施例成功的获得了多株pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞，其效率为2.5％。阳性细胞的测序结果如图6所示。
实施例4体细胞核移植技术制备pAPN基因第736位和第738位氨基酸精确修饰的基因编辑猪
以实施例3获得的纯合基因编辑的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的去核后的猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎。挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠，其中手术法胚胎移植步骤为：受体母猪静脉注射舒泰(Zoletil)麻醉剂进行诱导麻醉，注射剂量为5mg/kg体重。麻醉后将受体母猪移至手术架上仰卧保定，并进行呼吸麻醉(异氟烷浓度为3％～4％)。受体母猪腹中线做一个长约10cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。胚胎移植后，技术人员定期观察，并用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。
小猪出生后，剪取耳组织并提取基因组DNA，使用上述SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物测序检测基因型。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物及其应用
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctagaaatac ctcaggaagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgagcgccca gaaaatctga 20
<210> 3
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cctttgagca cagtctggcc ttgtgcgagg cctttagcct ctggcctctt gctcctgtag 60
ccattagctc ttgctacatc tgcccaccca catcagaggc tccatgggtc tccagatgac 120
tcaggcatga gtctcttctt tgaagctatt tttagggctg catcctcggc atgtggaggt 180
tcccaagcta ggggttgaat cggagctgta gccgccagcc tacaccacag ccacagcaac 240
acgggatccg agccacatct gcgacctaca ccacagctca cagcaatgcc agatccttaa 300
cccactgagt ggggccaggg ttgaacccat gtcctcatgt ttcccagtca gattcgtttc 360
tgctgtgcca tgacgggaac tctggaactt cctctttgaa gctctttatg ttttgttctt 420
gttttttgtt tttgtttttc tagaaatacc tcaggaagca agtcgaaccc ctcttccaac 480
atttcgaaac tctcactaaa gcttgggtcg agcgcccaga aaacttaatg gaccagtgag 540
tatgagctcg cttggtctgg agatcatggg tggtgcaggt agcctgacct gggggcccat 600
agcaagtcca gcagcatcct ctctggagct cccaactcct ggccggacca gggccacagt 660
cagggagagc gacccctccc aaccccactc ccggccccag gagtagggac tctgctctga 720
ggctctgtgt ggcctatgaa ccatctggcc tctttgggca aaggaccaaa ctgaacctct 780
gagggtccct cacccgcatg gtgaggttct aggtgttaaa gctggggctg gagcctgtgc 840
cagccctccc caggctgccc aagggcaaga agcaaagaag ggaacccaaa ggtggctggt 900
gggctatacc tgcagagtgc gggtctgcct ccctgttggg agttgtgtgt cagcagggga 960
gtcttggtca gcgtcaggtc caggcgtgct gacagagtgt 1000
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caccgctaga aatacctcag gaagc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaacgcttcc tgaggtattt ctagc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caccgcgagc gcccagaaaa tctga 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aaactcagat tttctgggcg ctcgc 25
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
caaggatttg tggaggagaa 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gctgagcgga gtttgtcg 18
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gagggcctat ttcccatgat t 21

Claims (10)

1.特异性识别猪pAPN基因的成套sgRNA，其特征在于，包括pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2；
编码pAPN-sgRNA-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
编码pAPN-sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一组用于pAPN基因第736位和第738位氨基酸同时修饰的组合物，其特征在于，包括切割蛋白、双链donor序列和权利要求1所述的成套sgRNA；
成套sgRNA引导切割蛋白靶向识别位点并进行切割；
编码pAPN基因第736位和第738位氨基酸的密码子位于成套sgRNA的识别位点之间；
双链donor序列用于将pAPN基因N736替换为A736，以及，T738替换为V738。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，N736替换为A736的方案为将编码N736的密码子AAC替换为GCT，T738替换为V738的方案为将编码T738的密码子ACC替换为GTC；
优选地，双链donor序列包括如SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所示的组合物，其特征在于，切割蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9；
优选地，目标切割载体1表达切割蛋白和pAPN-sgRNA-1，目标切割载体2表达切割蛋白和pAPN-sgRNA-2；
优选地，目标切割载体1和目标切割载体2的载体骨架均独立地为CRISPR质粒；
优选地，所述CRISPR质粒包括CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2，优选为CRISPR/Cas9；
优选地，所述CRISPR/Cas9质粒包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。
5.权利要求1所述的成套sgRNA或权利要求2-4任一项所述的组合物在pAPN基因编辑中的应用。
6.一种基因编辑细胞的制备方法，其特征在于，将权利要求2-4任一项所述的组合物转入目标细胞中，得到基因编辑细胞。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述目标细胞包括猪成纤维细胞，优选包括猪胎儿成纤维细胞；
优选地，通过电穿孔法转入或通过脂质体转染法转入。
8.权利要求6或7所述制备方法制备得到的基因编辑细胞。
9.一种基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求8所述的基因编辑细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第736位和第738位氨基酸修饰的基因编辑猪；
或者通过显微注射的方法，将权利要求2-4任一项所述的组合物显微注射到猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第736位和第738位氨基酸修饰的基因编辑猪。
10.根据权利要求9所述的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定。
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