CN116769016A - pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的组合物及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的组合物及应用，涉及基因编辑技术领域。该pAPN突变体的734位为丙氨酸，突变后的pAPN突变体能够维持自身正常表达，同时降低表达该pAPN突变体的宿主与TGEV发生特异性结合能力，在猪抗病育种方面具有重要的科学和实际意义。

Description

pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的组合物及应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及一种pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的组合物及应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)是仔猪发病和死亡的最主要疫病之一，是世界动物卫生组织要求的必须严格检疫的猪传染性疾病。TGE的潜伏期很短，传播速度快，发病急，在不同品种不同年龄的猪群都可快速建立感染。2周龄以下的小猪感染猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus，TGEV)后的死亡率极高，尤其是小于10日龄的仔猪致死率可达100％。因此TGE被认为是危害养猪产业的重要传染病之一。
TGEV可与宿主细胞发生特异性结合，首先病毒S蛋白的S1部分作为识别位点可以特异性识别宿主细胞表面受体，随后S蛋白发生构象变化，使得病毒与细胞膜发生融合作用。广泛存在于小肠上皮细胞表面的pAPN蛋白是TGEV感染宿主细胞的重要受体，同时唾液酸作为辅助因子，对TGEV的黏附起重要作用，唾液酸有助于黏附更多的病毒粒子并促进病毒穿越小肠上皮粘液层，保护病毒免受乳化破坏。
但是，除了在介导TGEV入侵方面发挥着重要作用外，pAPN在小肠中还发挥水解肽、酰胺等结构中的酰胺键从而参与多种肽代谢，在细胞生长、免疫调节和血压调节中具有重要作用。此外，APN与肿瘤的侵袭、迁移和免疫细胞趋化等密切相关，因此直接对pAPN进行敲除可能影响机体的其他生理功能。
删除或突变受体分子介导病毒进入宿主细胞的关键功能域或关键氨基酸，使受体丧失介导病毒进入细胞的能力，同时最大程度上保留其维持细胞正常生命活动的功能，是最好的以受体分子为靶分子建立抗TGEV感染的策略。CRISPR/Cas9基因编辑技术作为新一代基因编辑技术，可实现基因的“精准”编辑，这为抗TGEV基因编辑猪的构建提供了有利的工具。因此，开发一种pAPN基因关键位点精准突变，其既能保持pAPN蛋白正常表达，又能够抵抗TGEV感染的精准基因编辑猪尤为重要，在猪抗病育种方面具有重要的科学和实际意义。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种pAPN突变体，该pAPN突变体的734位为丙氨酸，表达该pAPN突变体蛋白的机体具有抗TGEV的能力。
本发明的第二目的在于提供编码上述pAPN突变体的多核苷酸。
本发明的第三目的在于提供用于pAPN基因定点修饰的组合物。
本发明的第四目的在于提供上述用于pAPN基因定点修饰的组合物的应用。
本发明的第五目的在于提供一种非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法。
本发明的第六目的在于提供一种pAPN突变的细胞。
本发明的第七目的在于提供一种非诊断和治疗目的的基因编辑猪的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种pAPN突变体，该pAPN突变体的734位为丙氨酸。
优选地，所述pAPN突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或，与包含与SEQ IDNO：1至少80％同一性的氨基酸序列的pAPN突变得到；
优选地，所述pAPN突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的734位由苏氨酸突变为丙氨酸的多肽。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种编码上述pAPN突变体的多核苷酸。
优选地，编码pAPN的734位突变的多核苷酸序列为GCC。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于pAPN基因定点修饰的组合物，该组合物包括第一sgRNA、第二sgRNA和供体DNA；第一sgRNA和第二sgRNA分别靶向pAPN基因的两个靶位点；
供体DNA含有pAPN基因第734位氨基酸的定点修饰片段，且所述定点修饰片段位于所述两个靶点之间，所述供体DNA使pAPN的T734突变为A734；
优选地，所述供体DNA使编码pAPN基因第734位的核苷酸序列为GCC；
优选地，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
优选地，编码第一sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
优选地，编码第二sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
优选地，所述组合物包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括表达所述第一sgRNA的表达盒；所述第二载体包括表达所述第二sgRNA的表达盒；
优选地，所述第一载体还包括基因编辑蛋白表达盒；
优选地，所述第二载体还包括基因编辑蛋白表达盒；
优选地，所述第一载体表达的基因编辑蛋白和所述第二载体表达的基因编辑蛋白分别独立的包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，进一步分别独立的优选为Cas9；
优选地，所述第一载体和所述第二载体的骨架分别独立的来源于pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552；进一步分别独立的优选为pX458。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述用于pAPN基因定点修饰的组合物在如下(a)～(c)任意一项中的应用；
(a)非疾病和诊断治疗目的的构建pAPN基因定点修饰的细胞系；
(b)制备预防猪传染性胃肠炎的产品；
(c)非疾病和诊断治疗目的的构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法，该制备方法包括向目的细胞导入上述组合物，得到pAPN基因定点修饰的细胞；
优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞或猪回肠上皮细胞；
优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法；进一步优选为电穿孔法。
优选地，导入操作后通过筛选和鉴定，得到pAPN基因定点修饰的细胞；
优选地，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定或PCR鉴定；
优选地，使用SEQ ID NO：14～15所示引物进行PCR鉴定。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种pAPN突变的细胞，该细胞表达上述pAPN突变体；或，含有上述多核苷酸；或，由上述制备方法制备得到的细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的基因编辑猪的制备方法，该制备方法包括将上述细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪；
或，通过显微注射的方法，将上述组合物显微注射到猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪；
优选地，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定或PCR鉴定；
优选地，使用SEQ ID NO：14～15所示引物进行PCR鉴定。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的pAPN突变体的734位为丙氨酸，能够维持pAPN自身正常表达，同时降低表达该pAPN突变体的宿主与TGEV发生特异性结合的能力。
本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的组合物包括第一sgRNA，第二sgRNA和供体DNA，该组合物能够对pAPN基因的两个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的定点修饰片段替换位于两个靶位点之间的第734位氨基酸，实现pAPN第734位氨基酸的精准突变。在精确修饰pAPN基因的同时，能够避免破坏或改变pAPN基因的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。
利用上述组合物得到pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法，具有方法操作简单、成本低廉的优势，且细胞中pAPN基因第734位氨基酸能够被准确修饰。利用pAPN突变的细胞得到的基因编辑猪的制备方法，具有操作方便，普适性强的优势，且制备得到的第734位氨基酸基因编辑猪具有良好的TGEV抗性同时保留了pAPN蛋白正常表达。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1提供的pAPN基因第729位氨基酸和第734位氨基酸的精确修饰过表达猪回肠上皮细胞中pAPN蛋白的表达图；
图2为本发明实施例1提供的pAPN基因第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞中pAPN蛋白的表达图；
图3为本发明实施例1提供的pAPN基因第729位氨基酸、第734位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，荧光定量PCR(qPCR)检测TGEV RNA拷贝数结果图；
图4为本发明实施例1提供的pAPN基因第729位氨基酸和第734位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测TGEV-N蛋白结果图；
图5为本发明实施例1提供的pAPN基因第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测TGEV-N蛋白结果图；
图6为本发明实施例1提供的pAPN基因第729位氨基酸、第734位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，间接免疫荧光(IFA)检测pAPN和TGEV表达结果图；
图7为本发明实施例1提供的第729位氨基酸、第734位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，TCID50检测结果图；
图8为本发明实施例2提供的猪pAPN基因第734位点氨基酸精确突变模式图；
图9为本发明实施例3提供的pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的猪回肠上皮细胞单克隆的测序结果图；
图10为本发明实施例3提供的pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞抵抗TGEV感染qPCR检测结果图；
图11为本发明实施例3提供的pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞抵抗TGEV感染IFA检测结果图；
图12为本发明实施例4提供的pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞的测序结果图；
图13为本发明实施例5提供的pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的基因编辑猪的测序结果图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种pAPN突变体，该pAPN突变体的734位为丙氨酸。本发明提供的突变体是将pAPN中的734位突变为丙氨酸后得到的突变体。本发明不限制突变前的pAPN是否还含有其他突变位点，因此本发明提供的pAPN突变体的前体可以为野生型pAPN，或者已经以野生型pAPN为基础，突变了其他位点的pAPN突变体。pAPN突变体的前体为按照本领域一般的定义下被认为的pAPN蛋白。
在可选地实施方式中，所述pAPN的野生型氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或，与包含与SEQ ID NO：1至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ IDNO：1至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
在可选地实施方式中，所述pAPN突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的734位由苏氨酸突变为丙氨酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种编码上述pAPN突变体的多核苷酸。本文中“多核苷酸”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，多核苷酸包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。多核苷酸的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸编码上述pAPN突变体，编码可选地为编码正义链或反义链。多核苷酸可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。在可选地实施方式中，编码pAPN的734位突变的多核苷酸序列为GCC，该位点表达为丙氨酸。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种用于pAPN基因定点修饰的组合物。
该组合物包括第一sgRNA、第二sgRNA和供体DNA，第一sgRNA和第二sgRNA分别靶向pAPN基因的两个靶位点，可以实现基因编辑蛋白靶向pAPN基因第734位氨基酸位点附近序列，对其具体序列不做限定，只要能够实现精准靶向功能即可。
在可选地实施方式中，编码第一sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。在可选地实施方式中，编码第二sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。具有SEQ ID NO：2和3序列的sgRNA的靶向性更强，修饰更精确。
该组合物还包括供体DNA，供体DNA含有pAPN基因第734位氨基酸的定点修饰片段，该定点修饰片段用于替换pAPN基因编码的734位氨基酸，使pAPN的734位突变为A734，实现序列重组，且所述定点修饰片段位于第一sgRNA和第二sgRNA靶向的两个靶点之间。供体DNA具体序列不做限定，只要能够实现对734位氨基酸突变即可。
在可选地实施方式中，供体DNA使编码pAPN基因第734位的核苷酸序列为GCC，进一步优选地，供体DNA将编码pAPN多核苷酸的第734位氨基酸的ACT均替换为GCC。在可选地实施方式中，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，该供体DNA能将pAPN基因编码的734被准确替换为A734(丙氨酸)。
在可选地实施方式中，前述组合物中编码第一sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，编码第二sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，供体DNA的核苷酸序列如SEQ IDNO：4所示。
本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的组合物中，第一sgRNA和第二sgRNA可靶向目标片段，基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切。再利用供体DNA实现序列重组，供体DNA为修饰目的靶序列的替换模板，可以在第一sgRNA和第二sgRNA的引导下特异性的识别pAPN基因第734位氨基酸位点附近序列，基因编辑蛋白对靶标片段进行酶切并引导供体DNA序列替换细胞中原有的同源片段，从而达到实现pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的目的。本发明提供的组合物在精确修饰pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的同时，能够避免破坏或改变pAPN基因的其余氨基酸的正常表达，第734位氨基酸精确修饰在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点，为制备、培育pAPN单氨基酸精确突变的抗TGEV猪新品种提供有力支撑。
需要说明的是，本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的组合物可以以本领域可接受的任何形式与基因编辑蛋白，或表达基因编辑蛋白的多核苷酸组合使用。基因编辑蛋白能够在多种细胞中进行有效地酶切，并且引导酶切后的序列重组，具有适用范围广、酶切效率高等优点。本发明对基因编辑蛋白的种类不做限定，只要能够实现基因组编辑功能即可。
在可选地实施方式中，该组合物包括第一载体和第二载体；第一载体包括表达所述第一sgRNA的表达盒；第二载体包括表达所述第二sgRNA的表达盒。
在可选地实施方式中，第一载体还包括基因编辑蛋白表达盒，第一载体表达的基因编辑蛋白包括但不限于Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9。在可选地实施方式中，第一载体的骨架来源于例如可以但不限于pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。
在可选地实施方式中，第二载体还包括基因编辑蛋白表达盒，第一载体表达的基因编辑蛋白包括但不限于Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9。在可选地实施方式中，第二载体的骨架来源于例如可以但不限于pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。
Cas9和pX458普适性广，通用性较强，且产品成熟度较高，使用pX458作为基因编辑载体骨架，能够达到更高的酶切效率。
在可选地实施方式中，分别将序列如SEQ ID NO：9～10和SEQ ID NO：11～12所示的寡核苷酸单链退火形成双链，分别与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得第一载体和第二载体。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述组合物在如下(a)～(c)任意一项中的应用；
(a)非疾病和诊断治疗目的的构建pAPN基因定点修饰的细胞系；
(b)制备预防猪传染性胃肠炎的产品；
(c)非疾病和诊断治疗目的的构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型。
本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的组合物可以实现pAPN基因定点修饰。利用该系统可以构建pAPN基因定点修饰的细胞系，而且由于T734是影响TGEV受体活性最重要的一个氨基酸位点，将其点突变后能够阻断pAPN与TGEV的结合，抵抗TGEV的感染，从而极大地增强机体对TGEV的抗性，构建猪传染性胃肠炎抗性猪。便于使用，将其制备成试剂盒等产品形式。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法，该制备方法包括向目的细胞导入上述用于pAPN基因定点修饰的组合物，得到pAPN基因定点修饰的细胞。其中导入的方法包括但不限于电穿孔法或脂质体转染法，优选为转染效率更高的电穿孔法。目的细胞包括但不限于猪成纤维细胞或猪回肠上皮细胞；猪成纤维细胞优选为猪胎儿成纤维细胞，相较于其他细胞，猪胎儿成纤维细胞克隆效率更高。
在可选的实施方式中，所述制备方法还包括导入操作后通过筛选和鉴定，得到pAPN基因定点修饰的细胞。筛选优选为通过流式分选筛选单克隆细胞，鉴定单克隆细胞是否为pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的细胞，鉴定优选为测序鉴定。
在可选的实施方式中，可以提取单克隆细胞的DNA，利用SEQ ID NO：14～15所示引物进行PCR扩增，扩增产物通过测序确认细胞是否实现精准修饰。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了pAPN突变的细胞。所述pAPN突变的细胞包括能够表达前述实施方式中pAPN突变体的细胞；或者，所述细胞含有编码前述实施方式中pAPN突变体的多核苷酸，该多核苷酸在所述pAPN突变的细胞中可以表达或者不表达，该多核苷酸在所述pAPN突变的细胞中可以只复制但不表达。在可选的实施方式中，该pAPN突变的细胞是采用上述非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法制备得到的细胞。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种非诊断和治疗目的的基因编辑猪的制备方法。
在可选的实施方式中，该制备方法包括将上述pAPN突变的细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪。
在另一些可选的实施方式中，通过显微注射的方法，将上述用于pAPN基因定点修饰的组合物显微注射到猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪。
在可选的实施方式中，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤，优选采用测序鉴定基因编辑猪是否表达pAPN突变体。
在可选的实施方式中，可以提取基因编辑猪的DNA，利用SEQ ID NO：14～15所示引物进行PCR扩增，扩增产物通过测序确认猪是否实现精准修饰。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
主要试剂：
分离猪胎儿成纤维细胞用的胶原酶type IV购自sigma；细胞培养用的DMEM、FBS、PS、NEAA和Glutamine均购自Gibco；提取细胞和耳组织DNA试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成；用于PCR的KOD FX PCR酶购自TOYOBO。
pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal Pig Intestinal-2I Knock Out，IPI-2I-KO)参见文献“徐长江,王晓朋,徐奎等.利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系[J].中国畜牧兽医,2021,48(7):2282-2290.DOI:10.16431/j.cnki.1671-7236.2021.07.002.”。
主要仪器：
CO2培养箱(Thermo Scientific,3111)；超净工作台(AIRTECH,SW-CJ-1FD)；荧光倒置显微镜(ZEISS，observerA1)；PCR仪(BIO-RID，C1000 Touch)；凝胶成像系统(BIO-RID，Universal HoodⅡ)；显微操作系统(Eppendorf，Celltram vario)；细胞流式分选仪(BD，Aria III)。
实施例1pAPN基因第729位氨基酸、第734位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞的建立及功能验证
一、pAPN基因729位氨基酸、第734位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰过表达细胞建立及pAPN表达检测：
1.将野生型pAPN基因CDS序列(SEQ ID NO：5)、729位氨基酸、第734位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列(SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8)分别连接到PLVX载体骨架中，分别命名为PLVX-WT、PLVX-729、PLVX-734和PLVX-735，质粒测序，扩繁后备用。
2.电转染前一天，将pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal PigIntestinal-2I Knock Out，IPI-2I-KO)复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。
3.将PLVX-WT、PLVX-729、PLVX-734、PLVX-735和PLVX空载体，电转染到IPI-2I-KO细胞，成功获得精确修饰过表达细胞，分别命名为IPI-2I-WTOE、IPI-2I-729OE、IPI-2I-734OE、IPI-2I-735OE和IPI-2I-Vector，用于后续TGEV感染试验时的供体细胞。
二、功能验证：
将上述步骤1获得的IPI-2I-WTOE、IPI-2I-729OE、IPI-2I-734OE、IPI-2I-735OE和IPI-2I-Vector细胞转染24h后进行TGEV感染试验，具体步骤如下：
1.分别将IPI-2I-WTOE、IPI-2I-729OE、IPI-2I-734OE、IPI-2I-735OE和IPI-2I-Vector细胞接种TGEV病毒株(MOI＝1)。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为Mock组。
2.感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测pAPN的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
pAPN蛋白检测结果如图1和图2所示，结果表明：IPI-2I-WTOE、IPI-2I-729OE、IPI-2I-734OE和IPI-2I-735OE组中pAPN均正常表达。
3.感染12h后收集细胞，用PBS清洗4-5次，提取RNA，利用qPCR检测细胞中TGEV病毒拷贝数。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
qRT-PCR结果如图3所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE细胞相比较，IPI-2I-729OE和IPI-2I-735OE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数无显著变化(P>0.05)，而IPI-2I-734OE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数极显著降低(***P<0.001)。
4.感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测TGEV-N蛋白的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
TGEV-N蛋白表达如图4和图5所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE细胞相比较，IPI-2I-729OE和IPI-2I-735OE细胞TGEV-N蛋白无明显变化，而IPI-2I-734OE细胞中TGEV-N蛋白表达量明显降低。
5.感染12h后收集细胞，利用间接免疫荧光(IFA)检测细胞中TGEV感染情况。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
IFA检测结果如图6所示，结果表明：IPI-2I-WT细胞接毒后，细胞中TGEV大量感染；与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-729OE和IPI-2I-735OE组细胞中TGEV感染量无明显变化，而IPI-2I-734OE细胞中TGEV感染量明显减少。
6.感染12h后收集细胞上清液，利用TCID50方法检测细胞中TGEV病毒滴度。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
TCID50检测结果如图7所示，结果表明：细胞接毒后，IPI-2I-WTOE细胞中TGEV病毒滴度较高；与IPI-2I-WT细胞相比，IPI-2I-729OE和IPI-2I-735OE细胞中病毒滴度无显著变化，而IPI-2I-734OE细胞中病毒滴度极显著降低(***P<0.001)。
综上结果表明，pAPN基因第729位氨基酸和第735位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞均不能有效抵抗TGEV感染，说明并不是pAPN基因任意位点精确修饰就可以抵抗TGEV感染；但第734位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞可以有效抵抗TGEV感染，说明pAPN基因第734位为TGEV感染的关键位点，pAPN基因第734位氨基酸精确修饰后可有效抵抗TGEV感染。
实施例2pAPN基因734位定点修饰系统表达载体的构建
一、sgRNA序列设计及载体构建：
1.以猪pAPN基因为目标序列，利用sgRNA分析工具CRISPOR(crispor.tefor.net)选取靠近编码T734位氨基酸位点同时分值又较高的打靶位点，如下所示：
编码pAPN-sgRNA-1的序列：CTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID NO：2)；
编码pAPN-sgRNA-2的序列：CGAGCGCCCAGAAAATCTGA(SEQ ID NO：3)。
sgRNA序列合成：
针对pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2序列合成互补配对的寡聚核苷酸序列：
pAPN-sgRNA-1-F：caccgCTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID NO：9)；
pAPN-sgRNA-1-R：aaacGCTTCCTGAGGTATTTCTAGc(SEQ ID NO：10)；
pAPN-sgRNA-2-F：caccgCGAGCGCCCAGAAAATCTGA(SEQ ID NO：11)；
pAPN-sgRNA-2-R：aaacTCAGATTTTCTGGGCGCTCGc(SEQ ID NO：12)。
2.构建第一载体和第二载体，分别命名为pX458-pAPN-sgRNA-1和pX458-pAPN-sgRNA-2
(1)将步骤1中pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2相应的互补的寡聚核苷酸分别在98℃条件下处理10min，然后自然冷却至室温进行退火。
(2)用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的pX458骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段。
(3)将上述的退火双链片段与线性化的载体骨架在16℃条件下连接1h，冰浴30min，热激45s，然后转化到Top10或DH5α的感受态细胞，在含氨苄的LB平板上涂布生长，次日挑取单菌落扩大培养并测序。测序引物如下：U6-FWD:GAGGGCCTATTTCCCATGATT(SEQ IDNO：13)。
(4)序列正确后经培养提取得到第一载体(pX458-pAPN-sgRNA-1质粒)和第二载体(pX458-pAPN-sgRNA-2质粒)，-20℃冻存，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
二、供体DNA序列设计及载体构建：
1.供体DNA序列设计：
根据sgRNA序列设计得到用于pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的供体DNA，命名为pAPN-dsODN-734，pAPN-dsODN-734具体序列如SEQ ID NO：4所示。所示的dsODN序列作为双链donor序列，当双链donor序列替换掉野生型序列后，T734被成功替换为A734。猪pAPN基因T734单氨基酸精确突变模式图如图8所示。
2.将步骤二第1部分中得到的pAPN-dsODN-734连接到PUC57骨架载体(金斯瑞生物科技公司，SD1176)中，并进行测序验证，将测序正确的重组质粒进行扩繁，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
实施例3pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞单克隆的建立及功能验证
一、pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞单克隆的建立
将野生型猪回肠上皮细胞(IPI-2I-WT)提前两天复苏至10cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。将5μg pX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μg pAPN-dsODN共转染入IPI-2I-WT细胞中，转染步骤严格按照BasicPrimary Nucleofector Kit(Lonza，VPI-1002)试剂盒说明书进行操作。
电转48h后，将细胞收集起来，通过流式分选仪分选细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。分选后的细胞大约培养10天左右，将单克隆细胞传至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。结果表明，获得了pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的IPI-2I(IPI-2I-734PE)细胞(图9)，该细胞可用于后续TGEV感染试验的供体细胞。
二.pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞单克隆功能验证
将上述获得的IPI-2I-734PE细胞进行TGEV感染试验。分别在IPI-2I-WT和IPI-2I-734PE细胞接种TGEV病毒株(MOI＝1)，Mock组为IPI-2I-WT细胞未接毒空白对照组。
感染12h后收集细胞，提取RNA检测细胞中TGEV病毒拷贝数。qPCR结果如图10，结果表明，TGEV基因组RNA在IPI-2I-WT细胞上大量复制；与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-734PE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数极显著降低(***P<0.001)。
感染12h后进行间接免疫荧光检测，IFA结果如图11所示，结果表明，IPI-2I-WT细胞接毒后，细胞中TGEV大量感染；与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-734PE细胞中几乎没有TGEV感染。
上述结果表明，pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪回肠上皮单克隆细胞可以有效抵抗TGEV感染，说明pAPN基因第734位氨基酸为TGEV感染的关键位点，pAPN基因第734位氨基酸精确修饰后可有效抵抗TGEV感染。
实施例4pAPN基因第734位氨基酸精确修饰猪成纤维细胞单克隆的建立
一、猪胎儿成纤维细胞的制备
将猪35日龄胚胎去除头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴胎牛血清，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基地猪场饲养的猪。
二、细胞转染
转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。将5μg pX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μgDonor-734质粒共转染猪胎儿成纤维细胞，然后将电转的细胞转移到6孔板培养，转染步骤严格按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。
三、单克隆细胞的流式分选及传代
电转48h后，消化细胞并收集到流式管，通过流式分选仪分选单个GFP阳性细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。待96孔板中的细胞长满传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
四、单克隆细胞的鉴定
对所挑取的单克隆细胞进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO：14(pAPN-TY-F2序列：CAAGGATTTGTGGAGGAGAA)和SEQ ID NO：15(pAPN-TY-R2序列：GCTGAGCGGAGTTTGTCG)所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，扩增出1443bp片段。扩增条件为94℃5min；94℃30s，62.6℃30s，68℃1min 40s，34个循环；72℃，5min。PCR产物送北京天一辉远公司测序。根据测序结果，筛选pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞用作核移植时的供体细胞。
测序结果显示，本实施例成功的分别获得了多株pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞(PEF-734PE)，部分阳性细胞的测序结果如图12所示。
实施例5体细胞核移植技术制备pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的基因编辑猪
以实施例3获得的纯合基因编辑的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的去核后的猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠，其中手术法胚胎移植步骤为：受体母猪静脉注射舒泰(Zoletil)麻醉剂进行诱导麻醉，注射剂量为5mg/kg体重。麻醉后将受体母猪移至手术架上仰卧保定，并进行呼吸麻醉(异氟烷浓度为3％～4％)。受体母猪腹中线做一个长约10cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。胚胎移植后，技术人员定期观察，并用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。
小猪出生后，剪取耳组织并提取基因组DNA，使用上述SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：15的核苷酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物测序检测基因型。
测序结果显示，本实施例成功的获得了pAPN基因第734位氨基酸精确修饰的基因编辑猪(PIG-734PE)，部分基因编辑猪的测序结果如图13所示。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种pAPN突变体，其特征在于，pAPN的734位为丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的pAPN突变体，其特征在于，所述pAPN突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或，与包含与SEQ ID NO：1至少80％同一性的氨基酸序列的pAPN突变得到；
优选地，所述pAPN突变体为SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的734位由苏氨酸突变为丙氨酸的多肽。
3.编码权利要求1所述pAPN突变体的多核苷酸。
4.根据权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，编码pAPN的734位突变的多核苷酸序列为GCC。
5.用于pAPN基因定点修饰的组合物，其特征在于，包括第一sgRNA、第二sgRNA和供体DNA；第一sgRNA和第二sgRNA分别靶向pAPN基因的两个靶位点；
供体DNA含有pAPN基因第734位氨基酸的定点修饰片段，且所述定点修饰片段位于所述两个靶位点之间，所述供体DNA使pAPN的T734突变为A734；
优选地，所述供体DNA使编码pAPN基因第734位的核苷酸序列为GCC；
优选地，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；
优选地，编码第一sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
优选地，编码第二sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括第一载体和第二载体；所述第一载体包括表达所述第一sgRNA的表达盒；所述第二载体包括表达所述第二sgRNA的表达盒；
优选地，所述第一载体还包括基因编辑蛋白表达盒；
优选地，所述第二载体还包括基因编辑蛋白表达盒；
优选地，所述第一载体表达的基因编辑蛋白和所述第二载体表达的基因编辑蛋白分别独立的包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，进一步分别独立的优选为Cas9；
优选地，所述第一载体和所述第二载体的骨架分别独立的来源于pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552；进一步分别独立的优选为pX458。
7.权利要求5或6所述的用于pAPN基因定点修饰的组合物在如下(a)～(c)任意一项中的应用；
(a)非疾病和诊断治疗目的的构建pAPN基因定点修饰的细胞系；
(b)制备预防猪传染性胃肠炎的产品；
(c)非疾病和诊断治疗目的的构建猪传染性胃肠炎抗性猪模型。
8.一种非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括向目的细胞导入权利要求5或6所述的组合物，得到pAPN基因定点修饰的细胞；
优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞或猪回肠上皮细胞；
优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法；进一步优选为电穿孔法；
优选地，导入操作后通过筛选和鉴定，得到pAPN基因定点修饰的细胞；
优选地，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定或PCR鉴定；
优选地，使用SEQ ID NO：14～15所示引物进行PCR鉴定。
9.pAPN突变的细胞，其特征在于，表达权利要求1或2所述的pAPN突变体；或，含有权利要求3或4所述的多核苷酸；或，由权利要求8所述的制备方法制备得到的细胞。
10.一种非诊断和治疗目的的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求9所述的细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪；
或，通过显微注射的方法，将权利要求5或6所述的组合物显微注射到猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，将所述基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN基因第734位氨基酸修饰的基因编辑猪；
优选地，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定或PCR鉴定；
优选地，使用SEQ ID NO：14～15所示引物进行PCR鉴定。
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