CN116064665A - 猪hbb基因定点修饰系统及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪HBB基因定点修饰系统及应用。本发明提供用于猪HBB基因定点修饰的系统，该系统中含有的第一载体、第二载体和第三载体可以表达基因编辑蛋白和sgRNA，对HBB基因的三个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的定点修饰片段替换位靶位的待定点修饰片段，实现HBB基因CDS序列第176～179位碱基精确删除。精准模拟我国人群最常见的β地中海贫血突变基因型β^{41‑42(‑CTTT)}模型，为我国人群β地中海贫血病发病机制解析，新型治疗方法开发提供精准模型。

Description

猪HBB基因定点修饰系统及应用

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，具体地说，涉及猪HBB基因定点修饰系统及应用。

背景技术

β地中海贫血是一种常见的隐性遗传性常染色体血液疾病，主要由于β珠蛋白基因的缺失或突变导致β珠蛋白链合成障碍引起α与非α珠蛋白链合成失去平衡而导致的溶血性贫血。据现有流行病学调查资料显示，广东省人群的β地中海贫血基因携带率高达2.54％，广西地区人群β-地中海贫血基因携带率高达6.78％～7.97％。在东南亚国家以及我国南方各省人群中，β珠蛋白基因CD41-42(-CTTT)突变约占β地中海贫血突变的36％以上，其纯合子表现为重型地中海贫血。合适的动物模型是研究β-地中海贫血的发生机制、基因治疗效果的重要手段。尽管β地中海贫血动物模型发展很快，但是这些动物模型大多是基于国外较常见的IVS-2-654突变，并不包括中国人群的β-珠蛋白基因主要突变位点CD41-42(-CTTT)。因此，建立精准模拟人类β^{CD41-42(-CTTT)}突变基因的疾病模型，对于我国β地中海贫血的发生机制、新型治疗方法开发显得尤为重要。猪是非常好的人类疾病模型动物，在器官大小、生理、病例理等方面都与人非常接近，利用猪制备β地中海贫血疾病模型，其应用价值远远高于小鼠、大鼠、兔等小型动物，对治疗人类β地中海贫血具有更为重要的参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供猪HBB基因定点修饰系统及应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供靶向猪HBB基因的CRISPR/Cas载体，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：1、2或3所示序列中的至少一条。

优选地，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、2或3中的任意两条。

第二方面，本发明提供一种猪HBB基因定点修饰系统，包含所述的CRISPR/Cas载体以及供体DNA。

其中，所述供体DNA含有猪HBB基因第2外显子定点修饰片段，所述定点修饰片段是指将猪HBB基因的第176～179位碱基删除。

进一步地，所述CRISPR/Cas载体包含基因编辑蛋白表达盒和sgRNA表达盒。

所述基因编辑蛋白可选自Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2等，优选Cas9。

所述CRISPR/Cas载体的骨架载体可选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552等，优选pX458。

进一步地，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。

进一步地，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

第三方面，本发明提供所述系统的以下任一应用：

(a)构建HBB基因定点修饰的细胞系；

(b)制备人类p地中海贫血细胞系模型；

(c)构建人类β地中海贫血猪模型。

第四方面，本发明提供猪HBB基因定点修饰细胞的制备方法，包括向目的细胞中导入所述系统，得到HBB基因定点修饰的细胞。

优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞，更优选猪胎儿成纤维细胞；

优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法。

优选地，导入操作后通过筛选和鉴定，得到HBB基因定点修饰的细胞。

优选地，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞。

优选地，所述鉴定包括测序鉴定。

第五方面，本发明提供按照所述方法制备得到的猪HBB基因定点修饰细胞。

第六方面，本发明提供HBB基因定点修饰的基因编辑猪的制备方法，将所述猪HBB基因定点修饰细胞移植入去核的猪卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母猪体内经妊娠，得到HBB基因定点修饰的基因编辑猪。

优选地，基因编辑猪出生后还包括对基因编辑猪进行鉴定的步骤。

优选地，所述鉴定包括测序鉴定。

本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。

本发明提供一种用于HBB基因定点修饰的系统，含有第一载体、第二载体、第三载体以及供体DNA。

所述第一载体包括基因编辑蛋白表达盒和第一sgRNA(SEQ ID NO：1)表达盒。

所述第二载体包括基因编辑蛋白表达盒和第二sgRNA(SEQ ID NO：2)表达盒。

所述第三载体包括基因编辑蛋白表达盒和第三sgRNA(SEQ ID NO：3)表达盒。

其中，第一sgRNA、第二sgRNA和第三sgRNA分别靶向HBB基因的三个靶位点。

所述供体DNA含有HBB基因第2外显子定点修饰片段，所述定点修饰片段用于替换HBB基因待定点修饰片段。

所述HBB基因定点修饰为将猪HBB基因序列第176～179位碱基删除。

进一步地，编码所述第一sgRNA为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

优选地，编码所述第二sgRNA为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

优选地，编码所述第三sgRNA为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述供体DNA为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

进一步地，所述基因编辑蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9。

进一步地，所述第一载体和第二载体均独立地包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供用于猪HBB基因定点修饰的系统，该系统中含有的第一载体、第二载体和第三载体可以表达基因编辑蛋白和sgRNA，对HBB基因的三个靶位点进行有效酶切，利用供体DNA的定点修饰片段替换位靶位的待定点修饰片段，实现HBB基因序列第176～179位碱基精确删除。精准模拟我国人群最常见的β地中海贫血突变基因型β^41-42(-CTTT)模型，为我国人群β地中海贫血病发病机制解析，新型治疗方法开发提供精准模型。

附图说明

图1为本发明实施例1中猪HBB基因打靶示意图。agaa部分为打靶区域。

图2为本发明实施例1中sgRNA连接pX458载体测序结果。

图3为本发明实施例1中sgRNA编辑效率验证。其中，sgRNA-1编辑效率为31％，sgRNA-2编辑效率为29％，sgRNA-7编辑效率为29％，其他sgRNA均未发生编辑。

图4为本发明实施例2提供的Donor载体测序结果。深色阴影区域为缺失片段上游序列，浅色阴影区域为缺失片段下游序列。方框内碱基为同义替换，防止sgRNA对Donor载体的编辑。

图5为本发明实施例2中HBB基因精准缺失4个碱基的猪胎儿成纤维细胞(pigembryonic fibroblast，PEF)细胞构建示意图。

图6为本发明实施例3中流式分选后单克隆细胞生长情况。

图7为本发明实施例3中获得的单克隆细胞基因型。

具体实施方式

本发明提供一种用于HBB基因定点修饰的系统，该系统含有第一载体、第二载体、第三载体和供体DNA，其中，第一载体包括基因编辑蛋白表达盒和第一sgRNA表达盒，第二载体包括基因编辑蛋白表达盒和第二sgRNA表达盒，第三载体包括基因编辑蛋白表达盒和第三sgRNA表达盒，第一sgRNA、第二sgRNA和第三sgRNA分别靶向HBB基因的三个靶位点；供体DNA含有HBB基因的修饰片段，该定点修饰片段用于替换HBB基因待定点修饰片段，HBB基因定点修饰为将猪HBB基因序列第176～179位碱基删除。

上述系统中，第一sgRNA、第二sgRNA、第三sgRNA或者其中任意两条sgRNA的组合可靶向目标片段，基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切，再利用供体DNA实现序列重组，该系统在不改变HBB其他氨基酸的情况下将猪HBB基因序列的第176～179位碱基删除。供体DNA为修饰目的靶序列的替换模板，在特异性的识别HBB基因第738位氨基酸位点附近序列的第一sgRNA、第二sgRNA或者第三sgRNA的引导下，基因编辑蛋白对靶标片段进行酶切并引导供体DNA序列替换细胞中原有的同源片段，从而达到HBB基因序列第176～179位碱基删除的目的。本发明提供的系统在精确删除HBB基因第176～179位碱基的同时，能够避免破坏或改变HBB基因的其余氨基酸的正常表达，精准模拟我国人群β地中海贫血疾病最主要的p^{CD41 -42(-CTTT)}突变。

需要说明的是，基因编辑蛋白能够在多种细胞中进行有效地酶切，并且引导酶切后的序列重组，具有适用范围广、酶切效率高等优点。对基因编辑蛋白的种类不做限定，只要能够实现基因组编辑功能即可。第一sgRNA、第二sgRNA和第三sgRNA可以实现基因编辑蛋白靶向HBB基因第176～179位点附近序列，对其具体序列不做限定，只要能够实现精准靶向功能即可。供体DNA将目标靶片段替换实现序列重组，具体为HBB基因第176～179位点被删除，供体DNA具体序列不做限定，可以实现第176～179位点被删除即可。

在优选的实施方式中，编码第一sgRNA为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，编码第二sgRNA为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列，编码第三sgRNA为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。该方案的靶向性更强，修饰更精确。

在优选的实施方式中，基因编辑蛋白包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选为Cas9。第一载体、第二载体和第三载体均独立地包括pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选为pX458。Cas9、pX458普适陛广，通用性较强，且产品成熟度较高，使用其作为基因编辑载体骨架，能够达到更高的酶切效率。

在优选的实施方式中，本发明的第一载体、第二载体和第三载体均为重组质粒，该重组质粒包括基因编辑载体骨架和编码sgRNA的序列，其中基因编辑载体骨架可以为CRISPR质粒、TALEN质粒或锌指质粒，优选为CRISPR质粒。

在一些具体的实施方式中，分别将SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2以及SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列连接到载体骨架中，筛选获得阳性克隆即得第一载体、第二载体和第三载体。

本发明还提供上述系统在如下(a)-(c)中的应用：

(a)构建HBB基因定点修饰的细胞系；

(b)制备人类β地中海贫血细胞系模型；

(c)构建人类β地中海贫血猪模型。

本发明提供的上述系统可以实现HBB基因定点修饰。利用该系统可以构建HBB基因定点修饰的细胞系。

本发明还提供一种HBB基因定点修饰的细胞的制备方法以及制备得到的细胞，该制备方法包括向目的细胞导入本发明的系统，得到HBB基因定点修饰的细胞。目的细胞优选为猪成纤维细胞，进一步优选为猪胎儿成纤维细胞，相较于其他细胞，猪胎儿成纤维细胞克隆效率更高；导入的方法优选为电穿孔法或脂质体转染法，进一步优选为电穿孔法，转染效率更高。

在优选的实施方式中，向目的细胞导入系统后通过筛选和鉴定，得到HBB基因定点修饰的细胞。筛选方法优选为通过流式分选筛选单克隆细胞，鉴定单克隆细胞是否为HBB基因第176～179位点精确删除的细胞，鉴定方法优选为测序鉴定。

在一些实施方式中，可以提取单克隆细胞的DNA，利用SEQ ID NO：7-8所示引物进行PCR扩增，扩增产物通过测序确认细胞是否实现精准修饰。

上述HBB基因定点修饰的细胞可以进一步用于制备基因编辑猪，将细胞移植入去核的卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将重组克隆胚胎移植入母体内经妊娠，获得HBB基因定点修饰的基因编辑猪。

在优选的实施方式中，基因编辑猪出生后还需要鉴定，优选为测序鉴定。

在一些实施方式中，可以提取基因编辑猪的DNA，利用SEQ ID NO：7-8所示引物进行PCR扩增，扩增产物通过测序确认猪是否实现精准修饰。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中使用的主要试剂：

分离猪胎儿成纤维细胞使用的胶原酶type IV购自Sigma；

细胞培养使用的DMEM、FBS、PS、NEAA、Glutamine、Trypsase均购自Gibco；

提取细胞和耳组织DNA试剂盒购自天根生化科技有限公司；

引物由北京擎科生物科技有限公司合成；

用于PCR的KOD FX PCR酶购自TOYOBO。

主要仪器：

CO₂培养箱(Thermo Scientific，3131/3111)；

荧光倒置显微镜(LEICA，DMI66B)；

PCR仪(BIO-RID，C1000 Touch)；

凝胶成像系统(BIO-RID，Universal HoodII)；

显微操作系统(Eppendorf，Celltram vario)；

细胞流式分选仪(Aria III)。

实施例1载体的构建和活性检测

1、以猪HBB基因为目标序列，利用sgRNA分析工具CRISPOR(crispor.tefor.net)对sgRnA进行评分，选取靠近第176～179位点同时分值又较高的sgRNA，具体如下：

sg-1：5′-TTGTCTACCCCTGGACTCAG-3′(SEQ ID NO：1)；

sg-2：5′-TGACGGCATCGGCATTGGAC-3′(SEQ ID NO：2)；

sg-3：5′-CTCGAAGAACCTCTGAGTCC-3′；

sg-4：5′-CGAAGAACCTCTGAGTCCAG-3′；

sg-5：5′-GTGAATGTGGACGAAGTTGG-3′；

sg-6：5′-GGTATCCAGGGCTTCAGGAG-3′；

sg-7：5′-GGCTGCTGGTTGTCTACCCC-3′(SEQ ID NO：3)。

为了便于与载体骨架连接，针对上述7条sgRNA序列添加接头序列并合成互补配对的寡聚核苷酸引物。

2、构建载体，分别命名为pX458-HBB-sgRNA-1～pX458-HBB-sgRNA-7：

将步骤1中合成的寡聚核苷酸引物分别在98℃条件下处理10min，然后自然冷却至室温，对其进行退火。

用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的pX458骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段。

将上述退火双链片段与载体线性片段混匀16℃连接1h，转化到Top10或DH5α的感受态细胞，在含氨苄的LB平板上涂布生长，然后挑取单菌落扩大培养并测序。测序引物如下：

U6-FWD：5′-GAGGGCCTATTTCCCATGATT-3′。

阳性克隆经培养提取得到pX458-HBB-sgRNA-1到pX458-HBB-sgRNA-7质粒，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(Endo-Free Plasmid Maxi Kit)。

3、细胞转染

转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。转染步骤严格按照Basic Primary 20 FibroblastsNucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。具体来讲，将通过实施例1取得的重组质粒各5μg，通过电转的方式分别转染猪胎儿成纤维细胞，得到7种转染后的细胞。

猪HBB基因打靶示意图见图1，sgRNA连接pX458载体测序结果见图2。

4、活性检测

电转染后48h，收集细胞，提取细胞基因组，进行PCR扩增，用错配内切酶T7EnI检测sgRNA的活性。

以提取的细胞基因组为模板，用HBB-2F-737：5′-CTGCAGAGTCCCCAGCTATG-3′(SEQID NO：7)与HBB-2R-737：5′-ATTCAAGCCTCACCCTGTGG-3′(SEQ ID NO：8)组成的引物对进行PCR扩增，扩增产物进行变性退火后，加入T7EnI酶进行酶切，酶切1h后进行凝胶电泳检测。

结果表明(图3)，在转染sgRNA-1、sgRNA-2和sgRNA-7对HBB基因靶区域进行了有效编辑，其中sgRNA-1编辑效率为31％，sgRNA-2编辑效率为29％，sgRNA-7编辑效率为29％，其余sgRNA均未对HBB基因靶区域发生编辑。

实施例2 DonorDNA序列设计

根据第一sgRNA、第二sgRNA和第三sgRNA序列设计得到供体DNA，具体如下：

HBB-sg1-Donor序列如SEQ ID NO：4所示；

HBB-sg2-Donor序列如SEQ ID NO：5所示；

HBB-sg7-Donor序列如SEQ ID NO：6所示。

上述序列作为双链donor序列，分别连接到pUC57载体中，并测序验证(图4)，当双链Donor序列替换掉野生型序列后，猪HBB基因第176～179位点被删除。猪HBB基因精确突变模式图如图5所示。

实施例3 HBB基因第176～179位点精准删除猪胎儿成纤维细胞的建立及基因型验证

1、猪胎儿成纤维细胞的制备

将35日龄猪胚胎去除头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴胎牛血清，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，猪胚胎取自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所试验基地猪场。

2、细胞转染

转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至10cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。将5μgpX458-HBB-sgRNA-1质粒或者5μgpX458-HBB-sgRNA-2质粒或者5μg pX458-HBB-sgRNA-7质粒，与5μg对应的Donor质粒(HBB-sg1-Donor或者HBB-sg2-Donor或者HBB-sg7-Donor)共转染入猪胎儿成纤维细胞中，转染步骤严格按照BasicPrimary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。

3、阳性单克隆细胞的筛选

电转36h后，将细胞收集起来，通过流式分选仪分选单个细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。分选后的细胞大约培养10天左右，可以观察到96孔板中的细胞长满，然后将长满的单克隆细胞进行传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组DNA鉴定基因型。

4、阳性单克隆细胞的鉴定

对所挑取的细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组DNA为模板，用核苷酸序列HBB-2F-737：5′-CTGCAGAGTCCCCAGCTATG-3′(SEQ ID NO：7)与HBB-2R-737：5′-ATTCAAGCCTCACCCTGTGG-3′(SEQ ID NO：8)所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，扩增出737bp片段。扩增条件为94℃5min；98℃30s，62.6℃30s，68℃100s，34个循环；72℃，5min。2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京天一辉远公司测序。根据测序，筛选HBB基因第176～179位点精确删除的猪成纤维细胞用作核移植时的供体细胞。

5、实验结果

测序结果显示，本实施例成功的获得了多株HBB基因第176～179位点精确删除的猪成纤维细胞(图6)。阳性细胞的测序结果如图7所示。

实施例4体细胞核移植技术制备HBB基因第176～179位点精确删除的基因编辑猪

以实施例3获得的纯合敲除的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠，其中手术法胚胎移植步骤为：受体母猪静脉注射舒泰(Zoletil)麻醉剂进行诱导麻醉，注射剂量为5mg/kg体重。麻醉后将受体母猪移至手术架上仰卧保定，并进行呼吸机麻醉(异氟烷浓度为3％～4％)。受体母猪腹中线做一个长约8cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。胚胎移植后，技术人员定期观察，并用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。

小猪出生后，剪取耳组织并提取基因组DNA，使用上述SEQ ID NO：7-8所示的核苷酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物测序检测基因型。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.靶向猪HBB基因的CRISPR/Cas载体，其特征在于，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自如SEQ ID NO：1、2或3所示序列中的至少一条。

2.根据权利要求1所述的CRISPR/Cas载体，其特征在于，其sgRNA作用位点的核苷酸序列选自SEQ ID NO：1、2或3中的任意两条。

3.猪HBB基因定点修饰系统，其特征在于，包含权利要求1或2所述的CRISPR/Cas载体以及供体DNA；

所述供体DNA含有猪HBB基因第2外显子定点修饰片段，所述定点修饰片段是指将猪HBB基因的第176～179位碱基删除。

4.根据权利要求3所述的系统，其特征在于，所述CRISPR/Cas载体包含基因编辑蛋白表达盒和sgRNA表达盒。

5.根据权利要求4所述的系统，其特征在于，所述基因编辑蛋白选自Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，优选Cas9；和/或

所述CRISPR/Cas载体的骨架载体选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，优选pX458。

6.根据权利要求4或5所述的系统，其特征在于，当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQID NO：1所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；和/或

当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQID NO：5所示；和/或

当sgRNA作用位点的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示时，供体DNA的核苷酸序列如SEQID NO：6所示。

7.权利要求4-6任一项所述系统的以下任一应用：

(a)构建HBB基因定点修饰的细胞系；

(b)制备人类β地中海贫血细胞系模型；

(c)构建人类β地中海贫血猪模型。

8.猪HBB基因定点修饰细胞的制备方法，其特征在于，包括向目的细胞中导入权利要求4-6任一项所述系统，得到HBB基因定点修饰的细胞；

优选地，所述目的细胞为猪成纤维细胞，更优选猪胎儿成纤维细胞；

优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法。

9.按照权利要求8所述方法制备得到的猪HBB基因定点修饰细胞。

10.HBB基因定点修饰的基因编辑猪的制备方法，其特征在于，将权利要求9所述细胞移植入去核的猪卵母细胞，得到重组克隆胚胎，将所述重组克隆胚胎移植入母猪体内经妊娠，得到HBB基因定点修饰的基因编辑猪。

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