CN116948979B - pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的系统及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的系统及应用。本发明提供了使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质在如下任一中的应用：1)构建非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞系；2)制备抗猪传染性胃肠炎病毒的细胞等；本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的系统能够对pAPN基因的两个靶位点进行有效酶切，实现pAPN第727位氨基酸的精准突变。在精确修饰pAPN基因的同时，能够避免破坏或改变pAPN的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。

Description

pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的系统及应用
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域，尤其是涉及一种pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的系统及应用。
背景技术
猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritis，TGE)是一种以感染仔猪严重腹泻和快速脱水致死为主要临床特征的高度接触传染性的肠道性疾病，是世界动物卫生组织要求的必须严格检疫的猪传染性疾病。该病病原为猪传染性胃肠炎病毒(transmissiblegastroenteritis virus，TGEV)，2周龄以下的小猪感染TGEV后的死亡率极高，尤其是小于10日龄的仔猪致死率可达100％。因此TGE被认为是危害养猪产业的重要传染病之一。
TGEV入侵宿主细胞首先通过病毒的S蛋白与宿主细胞膜上的特异性受体蛋白分子相互结合来实现。猪氨基肽酶N(porcine aminopeptidase N,pAPN)广泛存在于小肠上皮细胞表面，具有较为广泛的生物学功能。pAPN是TGEV感染宿主细胞的重要受体，同时唾液酸作为辅助因子，对TGEV的黏附起重要作用，唾液酸有助于黏附更多的病毒粒子并促进病毒穿越小肠上皮粘液层，保护病毒免受乳化破坏。pAPN可以作为蛋白水解酶水解多肽(神经肽和血管作用肽等)，还能够作为信号传导分子，参与细胞的信号传导和炎症趋化，因此pAPN与血管生长、肿瘤侵袭等多种生理功能相关，直接对pAPN进行敲除可能影响机体的其他生理功能。
CRISPR/Cas9基因编辑技术作为新一代基因编辑技术，可实现基因的精准编辑，这为抗TGEV基因编辑猪的构建提供了有利的工具。
因此，开发一种pAPN基因关键位点精确突变，其既能保持pAPN蛋白正常表达，又能够抵抗TGEV感染的精准基因编辑猪尤为重要，在猪抗病育种方面具有重要的科学价值和实际应用意义。
发明内容
本发明的目的是提供pAPN突变体和用于pAPN基因定点修饰的系统及应用。
第一方面，本发明提供了使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质在如下任一中的应用：
1)构建非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞系；
2)制备抗猪传染性胃肠炎病毒的细胞；
3)制备抗猪传染性胃肠炎病毒猪；
4)抗猪传染性胃肠炎病毒猪育种；
5)制备预防或治疗猪传染性胃肠炎的产品，或预防或治疗猪传染性胃肠炎；
6)制备提高机体或机体细胞对猪传染性胃肠炎病毒抗性产品，或提高机体或机体细胞对猪传染性胃肠炎病毒抗性；
7)构建猪传染性胃肠炎病毒抗性细胞模型；
8)构建猪传染性胃肠炎病毒抗性猪模型。
上文中，所述使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变，同时不影响pAPN自身正常表达。
上文所述应用中，所述pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸。
上文所述应用中，机体为哺乳动物，进一步地为家畜，再进一步地，为猪。
上文所述应用中，所述使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质为定点突变系统；
所述定点突变系统进一步为CRISPR系统。
在本发明中，所述CRISPR系统包括sgRNA1或表达其的表达盒或载体、sgRNA2或表达其的表达盒或载体和用于同源重组的供体DNA或表达其的表达盒或载体；sgRNA1和sgRNA2分别靶向pAPN基因的两个靶位点；可以实现基因编辑蛋白靶向pAPN第727位氨基酸位点附近序列，对其具体序列不做限定，只要能够实现精准靶向功能即可。供体DNA含有pAPN第727位氨基酸的定点修饰片段，该定点修饰片段用于替换pAPN基因编码的727位氨基酸，使pAPN的F727突变为A727，实现序列重组。供体DNA具体序列不做限定，只要能够实现对727位氨基酸突变即可。
在本发明的实施例中，所述sgRNA1的靶点的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；所述sgRNA2的靶点的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；具有SEQ ID NO：1和2序列的sgRNA的靶向性更强，修饰更精确。
在本发明的实施例中，所述用于同源重组的供体DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。该供体DNA能将pAPN基因编码的F727(苯丙氨酸)被准确替换为A727(丙氨酸)。
本发明提供的用于pAPN基因定点突变的CRISPR系统中，sgRNA1和sgRNA2可靶向目标片段，基因编辑蛋白对目标靶点进行酶切。再利用供体DNA实现序列重组，供体DNA为修饰目的靶序列的替换模板，可以在sgRNA1和sgRNA2的引导下特异性的识别pAPN基因编码第727位氨基酸位点附近序列，基因编辑蛋白对靶标片段进行酶切并引导供体DNA序列替换细胞中原有的同源片段，从而达到实现pAPN第727位氨基酸精确修饰的目的。
本发明提供的CRISPR系统在pAPN第727位氨基酸精确修饰的同时，能够避免破坏或改变pAPN的其余氨基酸的正常表达，第727位氨基酸精确修饰在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点，为制备、培育pAPN单氨基酸精确突变的抗TGEV猪新品种提供有力支撑。
需要说明的是，本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的CRISPR系统可以以本领域可接受的任何形式与基因编辑蛋白，或表达基因编辑蛋白的多核苷酸组合使用。基因编辑蛋白能够在多种细胞中进行有效地酶切，并且引导酶切后的序列重组，具有适用范围广、酶切效率高等优点。本发明对基因编辑蛋白的种类不做限定，只要能够实现基因组编辑功能即可。
在本发明的实施例中，所述CRISPR系统包括第一载体和第二载体，以及表达供体DNA的载体；所述第一载体包括表达所述sgRNA1的表达盒；所述第二载体包括表达所述sgRNA2的表达盒；
优选地，所述第一载体还包括基因编辑蛋白表达盒；
优选地，所述第二载体还包括基因编辑蛋白表达盒；
优选地，第一载体表达的基因编辑蛋白和第二载体表达的基因编辑蛋白分别独立的包括Cas9、Cas9n、Cpf1或C2c2，不限于此，进一步分别独立的优选为Cas9；
优选地，所述第一载体和所述第二载体的骨架分别独立的来源于pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552，不限于此；进一步分别独立的优选为pX458。
Cas9和pX458普适性广，通用性较强，且产品成熟度较高，使用pX458作为基因编辑载体骨架，能够达到更高的酶切效率。
在可选地实施方式中，分别将序列如SEQ ID NO：4-5和SEQ ID NO：6-7所示的寡核苷酸单链退火形成双链，分别与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得第一载体和第二载体。
在本发明的实施例中，所述CRISPR系统包括第一载体pX458-pAPN-sgRNA-1、第二载体pX458-pAPN-sgRNA-2和表达供体DNA的载体Donor-727。
上述所述应用中，所述产品为试剂盒或药物。
第二方面，本发明提供了一种构建猪传染性胃肠炎病毒抗性细胞模型，包括如下步骤：使出发细胞表达pAPN突变蛋白，得到目标细胞，即为猪传染性胃肠炎抗性细胞模型；
在本发明的实施例中，所述出发细胞采用的为猪回肠上皮细胞。
所述pAPN突变蛋白为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到的蛋白。
上文中，所述野生型pAPN蛋白的氨基酸序列SEQ ID NO：10所示或对应于SEQ IDNO：10所示的pAPN蛋白。
第三方面，本发明提供了一种非诊断和治疗目的的pAPN蛋白突变细胞的构建方法，包括如下步骤：使目的细胞中野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到pAPN蛋白突变细胞。
上文中使目的细胞中野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，具体为向目的细胞导入上述使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质(即定点突变系统)，得到pAPN蛋白突变细胞；
优选地，所述目的细胞包括但不限于猪成纤维细胞，优选为猪耳成纤维细胞。
优选地，导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法；进一步优选为电穿孔法。
在可选的实施方式中，所述制备方法还包括导入操作后通过筛选和鉴定，得到pAPN基因定点修饰的细胞。筛选优选为通过流式分选筛选单克隆细胞，鉴定单克隆细胞是否为pAPN第727位氨基酸精确修饰的细胞，鉴定优选为测序鉴定。
在可选的实施方式中，可以提取单克隆细胞的DNA，利用SEQ ID NO：8～9所示引物进行PCR扩增，扩增产物通过测序确认细胞是否实现精准修饰。
优选地，导入操作后通过筛选和鉴定，得到pAPN基因精确修饰的细胞；
优选地，所述筛选包括通过流式分选筛选单克隆细胞；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定或PCR鉴定；
优选地，使用SEQ ID NO：8～9所示引物进行PCR鉴定。
第四方面，本发明提供了一种非诊断和治疗目的的pAPN蛋白突变基因编辑猪的构建方法，为如下方法1或方法2：
所述方法1包括如下步骤：
1)使离体猪成纤维细胞中pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，得到目标细胞；
2)将所述目标细胞作为核移植供体细胞通过体细胞核移植入母猪体内，生产的子代即为pAPN蛋白突变基因编辑猪；
所述方法2包括如下步骤：
将第一方面中使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质显微注射到猪合子期胚胎中，得到pAPN基因修饰胚胎，再将所述pAPN基因修饰胚胎移植入母体内经妊娠，获得pAPN蛋白突变基因编辑猪。
上文中pAPN蛋白突变基因编辑猪为该猪基因组上的pAPN蛋白编码基因为pAPN突变蛋白的编码基因；
上述pAPN突变蛋白为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到的蛋白。
上述猪成纤维细胞，优选为猪耳成纤维细胞。
优选地，基因编辑猪出生后还包括鉴定的步骤；
优选地，所述鉴定包括测序鉴定或PCR鉴定；
优选地，使用SEQ ID NO：8～9所示引物进行PCR鉴定，扩增产物通过测序确认猪是否实现精准修饰。
第五方面，本发明提供了第一方面中使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质。
第六方面，本发明提供了pAPN突变体，为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到的蛋白。
上文中，本发明不限制突变前的pAPN是否还含有其他突变位点，因此本发明提供的pAPN突变体的前体可以为野生型pAPN，或者已经以野生型pAPN为基础，突变了其他位点的pAPN突变体。pAPN突变体的前体为按照本领域一般的定义下被认为的pAPN蛋白。
在可选地实施方式中，所述野生型pAPN蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示或对应于SEQ ID NO：10所示的pAPN蛋白，具体如SEQ ID NO：10所示，或，与包含与SEQ ID NO：10至少80％同一性的氨基酸序列，例如可以为但不限于为包含与SEQ ID NO：10至少80％、85％、90％、95％或98％同一性的氨基酸序列。
第七方面，本发明提供了编码第六方面所述pAPN突变体的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞。
本文中“核酸分子”指的是任何长度的核苷酸的聚合物形式，核酸分子包括核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸。核酸分子的实例包括但不限于单链、双链或多链DNA或RNA、基因组DNA、cDNA、DNA-RNA杂合体或者包含嘌呤和嘧啶碱基或其他天然、化学或生化修饰、非天然或衍生的核苷酸碱基的聚合物。多核苷酸编码上述pAPN突变体，编码可选地为编码正义链或反义链。核酸分子可以是天然存在的、合成的、重组的或它们的任意组合。在可选地实施方式中，编码pAPN的727位突变的核酸分子中727的突变后碱基序列为GCC，该位点表达为丙氨酸。
本发明提供的用于pAPN基因精确修饰的CRISPR系统可以实现pAPN基因定点修饰。利用该系统可以构建pAPN基因定点修饰的细胞系，而且由于F727是影响TGEV受体活性的重要氨基酸位点，将其点突变后能够阻断pAPN与TGEV的结合，抵抗TGEV的感染，从而极大地增强机体对TGEV的抗性，构建猪传染性胃肠炎抗性猪。便于使用，将其制备成试剂盒等产品形式。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了pAPN突变的细胞。所述pAPN突变的细胞包括能够表达前述实施方式中pAPN突变体的细胞；或者，所述细胞含有编码前述实施方式中pAPN突变体的多核苷酸，该多核苷酸在所述pAPN突变的细胞中可以表达或者不表达，该多核苷酸在所述pAPN突变的细胞中可以只复制但不表达。在可选的实施方式中，该pAPN突变的细胞是采用上述非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法制备得到的细胞。
第八方面，本发明提供了第六方面所述pAPN突变体或第七方面所述核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体或重组细胞在如下任一中的应用：
1)构建非疾病和诊断治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞系；
2)制备抗猪传染性胃肠炎病毒的细胞；
3)制备抗猪传染性胃肠炎病毒猪；
4)抗猪传染性胃肠炎病毒猪育种；
5)制备预防或治疗猪传染性胃肠炎的产品，或预防或治疗猪传染性胃肠炎；
6)制备提高机体或机体细胞对猪传染性胃肠炎病毒抗性产品，或提高机体或机体细胞对猪传染性胃肠炎病毒抗性；
7)构建猪传染性胃肠炎病毒抗性细胞模型；
8)构建猪传染性胃肠炎病毒抗性猪模型。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供的pAPN突变体的第727位氨基酸由苯丙氨酸突变为丙氨酸，能够维持pAPN自身正常表达，同时降低表达该pAPN突变体的宿主与TGEV发生特异性结合。
本发明提供的用于pAPN基因定点修饰的CRISPR系统包括sgRNA1，gRNA2和供体DNA，该CRISPR系统能够对pAPN基因的两个靶位点进行有效酶切，实现pAPN第727位氨基酸的精准突变。在精确修饰pAPN基因的同时，能够避免破坏或改变pAPN的其余氨基酸的正常表达，因此在抵抗TGEV感染的基础上，最大程度上保留pAPN蛋白生理活性功能，并且具有适用范围广、基因编辑效率高等优点。
利用上述CRISPR系统得到pAPN基因定点修饰的细胞的制备方法，具有方法操作简单、成本低廉的优势，且细胞中pAPN第727位氨基酸能够被准确修饰。利用pAPN突变的细胞得到的基因编辑猪的制备方法，具有操作方便，普适性强的优势，且制备得到的第727位氨基酸突变基因编辑猪具有良好的TGEV抗性同时保留了pAPN蛋白正常表达。
下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
附图说明
图1为pAPN蛋白第726位氨基酸、第727位氨基酸和第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞中pAPN蛋白的表达图。
图2为pAPN蛋白第726位氨基酸、第727位氨基酸和第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，荧光定量PCR(qPCR)检测TGEV RNA拷贝数结果图。
图3为pAPN蛋白第726位氨基酸、第727位氨基酸和第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测TGEV-N蛋白结果图。
图4为pAPN蛋白第726位氨基酸、第727位氨基酸和第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞TGEV感染后，间接免疫荧光(IFA)检测pAPN和TGEV表达结果图。
图5为猪pAPN蛋白第727位点氨基酸精确突变模式图。
图6为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰的猪回肠上皮细胞的测序结果图。
图7为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰的猪回肠上皮细胞中pAPN蛋白的表达图。
图8为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞TGEV感染后，荧光定量PCR(qPCR)检测TGEV RNA拷贝数结果图。
图9为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞TGEV感染后，蛋白质免疫印迹(Western Blot)检测TGEV-N蛋白结果图。
图10为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞TGEV感染后，间接免疫荧光(IFA)检测pAPN和TGEV表达结果图。
图11为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮细胞的pAPN酶活性检测结果图。
图12为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞的测序结果图。
图13为pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰的基因编辑猪的测序结果图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
主要试剂：
分离猪耳成纤维细胞用的胶原酶type IV购自sigma；细胞培养用的DMEM、FBS、PS、NEAA和Glutamine均购自Gibco；提取细胞和耳组织DNA试剂盒购自天根生化科技有限公司；引物由北京擎科生物科技有限公司合成；用于PCR的KOD FX PCR酶购自TOYOBO。
主要仪器：
CO2培养箱(Thermo Scientific,3111)；超净工作台(AIRTECH,SW-CJ-1FD)；荧光倒置显微镜(ZEISS，observerA1)；PCR仪(BIO-RID，C1000 Touch)；凝胶成像系统(BIO-RID，Universal HoodⅡ)；显微操作系统(Eppendorf，Celltram vario)；细胞流式分选仪(BD，Aria III)。
下述实施例中野生型猪回肠上皮细胞(IPI-2I-WT)和pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal Pig Intestinal-2I Knock Out，IPI-2I-KO)均记载于文献“徐长江,王晓朋,徐奎等.利用CRISPR/Cas9编辑系统构建pAPN基因敲除的IPI-2I细胞系.中国畜牧兽医,2021,48(7):2282-2290.”中。
下述实施例中的精确修饰指定点突变，具体为氨基酸定点突变。
实施例1、pAPN第726位氨基酸、pAPN第727位氨基酸、pAPN第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞的获得及抗TGEV功能验证
一、pAPN第726位氨基酸、第727位氨基酸和第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞建立及pAPN表达检测
野生型pAPN基因CDS序列的核苷酸序列为SEQ ID NO：12；
第726位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列为将野生型pAPN蛋白编码基因(SEQID NO：12)中第2176-2178位的CTC突变为GCC(即将野生型pAPN蛋白第726位的亮氨酸密码子CTC突变为丙氨酸密码子GCC)，其他核苷酸不变得到的基因。
第727位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列为将野生型pAPN蛋白编码基因(SEQID NO：12)中第2179-2181位的TTC突变为GCC(即将野生型pAPN蛋白第727位的苯丙氨酸密码子TTC突变为丙氨酸密码子GCC)，其他核苷酸不变得到的基因，第727位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列的核苷酸序列具体为SEQ ID NO：13。
第728位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列为将野生型pAPN蛋白编码基因(SEQID NO：12)中第2182-2184位的CAA突变为GCC(即将野生型pAPN蛋白第728位的谷氨酰胺密码子CAA突变为丙氨酸密码子GCC)，其他核苷酸不变得到的基因。
1.将野生型pAPN基因CDS序列、第726位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列、第727位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列(核苷酸序列为SEQ ID NO：13)和第728位氨基酸精确修饰的pAPN基因CDS序列分别连接到PLVX骨架载体(Y0025620-1，北京擎科生物科技股份有限公司)的多克隆位点(BamHI和XbaI酶切位点)中，分别命名为PLVX-WT、PLVX-726、PLVX-727和PLVX-728，质粒测序，扩繁后备用。
2.电转染前一天，将pAPN基因敲除的猪回肠上皮细胞(Immortal PigIntestinal-2I Knock Out，IPI-2I-KO；该细胞不表达pAPN基因)复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。
3.将PLVX-WT、PLVX-726、PLVX-727、PLVX-728和PLVX空载体，电转染到IPI-2I-KO细胞，分别命名为IPI-2I-WTOE、IPI-2I-726OE、IPI-2I-727OE、IPI-2I-728OE和IPI-2I-Vector。同时将未转染的IPI-2I-KO细胞作为空白对照组。
转染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测pAPN的表达情况，抗体为APN多克隆抗体(ABclonal，A5662)。
pAPN蛋白检测结果如图1所示，结果表明：IPI-2I-WTOE、IPI-2I-726OE、IPI-2I-727OE和IPI-2I-728OE组中过表达载体被成功转染至IPI-2I-KO细胞，pAPN均正常表达。
该结果说明成功获得精确修饰过表达pAPN的猪回肠上皮细胞，可用于后续TGEV感染试验时的供体细胞。
二、pAPN第726位氨基酸、pAPN第727位氨基酸、pAPN第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞的抗TGEV功能验证
将上述步骤一转染获得的IPI-2I-WTOE、IPI-2I-726OE、IPI-2I-727OE、IPI-2I-728OE和IPI-2I-Vector细胞进行TGEV感染试验，具体步骤如下：
1.分别将IPI-2I-WTOE、IPI-2I-726OE、IPI-2I-727OE、IPI-2I-728OE和IPI-2I-Vector细胞接种TGEV病毒株(MOI＝1)。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为Mock组。
2.感染12h后收集细胞，用PBS清洗4-5次，提取RNA，利用qPCR检测细胞中TGEV病毒拷贝数。同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
qRT-PCR结果如图2所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE细胞相比较，IPI-2I-726OE和IPI-2I-728OE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数无显著变化(P>0.05)，而IPI-2I-727OE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数极显著降低(***P<0.001)。
3.感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测TGEV-N蛋白表达情况，同时将未接毒IPI-2I-KO细胞作为空白对照组(Mock组)。
TGEV-N蛋白表达如图3所示，结果表明：与IPI-2I-WTOE细胞相比较，IPI-2I-726OE和IPI-2I-728OE细胞TGEV-N蛋白无明显变化，而IPI-2I-727OE细胞中TGEV-N蛋白表达量明显降低。
4.感染12h后收集细胞，利用间接免疫荧光(IFA)检测细胞中TGEV感染情况。
IFA检测结果如图4所示，结果表明：IPI-2I-WTOE细胞接毒后，细胞中TGEV大量感染；与IPI-2I-WTOE细胞相比较，IPI-2I-726OE和IPI-2I-728OE组细胞中TGEV感染量无明显变化，而IPI-2I-727OE细胞中TGEV感染量明显减少。
综上结果表明，pAPN第726位氨基酸和第728位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞不能有效抵抗TGEV感染，说明pAPN第726位和第728位氨基酸不是TGEV感染的关键位点；但pAPN第727位氨基酸精确修饰过表达猪回肠上皮细胞能够有效抵抗TGEV感染，说明pAPN第727位氨基酸为TGEV感染的关键位点。
实施例2、pAPN第727位氨基酸精确定点修饰系统表达载体的构建
野生型pAPN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10。
针对野生型pAPN蛋白进行定点突变修饰，得到如下突变体：
pAPN蛋白突变体727，其为将野生型pAPN蛋白氨基酸序列第727位的苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变得到的蛋白；
pAPN蛋白突变体727编码基因，其为将野生型pAPN蛋白编码基因(SEQ ID NO：12)中第2179-2181位的TTC突变为GCC(即将野生型pAPN蛋白第727位的苯丙氨酸密码子TTC突变为丙氨酸密码子GCC)，其他核苷酸不变得到的基因。
具体制备方法如下：
一、sgRNA序列设计和载体构建
1.sgRNA序列合成
以猪pAPN基因为目标序列，利用sgRNA分析工具CRISPOR(crispor.tefor.net)选取靠近编码第727位氨基酸位点同时分值又较高的打靶位点，如下所示：
编码pAPN-sgRNA-1的序列为：CTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID NO：1)
编码pAPN-sgRNA-2的序列为：GTTTCGAAATGTTGGAAGAG(SEQ ID NO：2)。
针对pAPN-sgRNA-1和pAPN-sgRNA-2序列合成互补配对的寡聚核苷酸序列：
pAPN-sgRNA-1-F：caccgCTAGAAATACCTCAGGAAGC(SEQ ID NO：4)；
pAPN-sgRNA-1-R：aaacGCTTCCTGAGGTATTTCTAGc(SEQ ID NO：5)；
pAPN-sgRNA-2-F：caccGTTTCGAAATGTTGGAAGAG(SEQ ID NO：6)；
pAPN-sgRNA-2-R：aaacCTCTTCCAACATTTCGAAAC(SEQ ID NO：7)。
2.构建第一载体和第二载体
(1)将步骤一中获得的pAPN-sgRNA-1-F/pAPN-sgRNA-1-R和pAPN-sgRNA-2-F/pAPN-sgRNA-2-R分别在98℃条件下处理10min，然后自然冷却至室温进行退火，得到pAPN-sgRNA-1退火产物和pAPN-sgRNA-2退火产物。
(2)用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的pX458骨架载体(addgene，48138)在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段，即为线性化的载体骨架。
(3)将上述的退火双链片段分别与线性化的载体骨架在16℃条件下连接1h，冰浴30min，热激45s，然后转化到Top10或DH5α的感受态细胞，在含氨苄的LB平板上涂布生长，次日挑取单菌落扩大培养并测序。测序引物如下：U6-FWD:GAGGGCCTATTTCCCATGATT(SEQ IDNO：11)。
3.序列正确后经培养提取得到第一载体(pX458-pAPN-sgRNA-1质粒)和第二载体(pX458-pAPN-sgRNA-2质粒)，-20℃冻存，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
第一载体和第二载体分别命名为pX458-pAPN-sgRNA-1和pX458-pAPN-sgRNA-2。
二、供体DNA序列设计及Donor-727载体构建
1.供体DNA序列设计
根据sgRNA序列设计得到用于pAPN第727位氨基酸精确修饰的供体DNA,命名为pAPN-dsODN-727，pAPN-dsODN-727具体序列如SEQ ID NO：3所示。
该pAPN-dsODN-727作为双链Donor序列，当该双链Donor序列替换掉野生型pAPN基因序列后，野生型pAPN蛋白中的F727被成功替换为A727。pAPN蛋白第727位单氨基酸精确突变模式图如图5所示。
2.Donor-727载体的构建
将步骤一中得到的供体DNA pAPN-dsODN-727连接到PUC57骨架载体(金斯瑞生物科技公司，SD1176)的多克隆位点(EcoRV s酶切位点)中，并进行测序验证，将测序正确的重组质粒进行扩繁，得到载体Donor-727，用于后续的细胞转染。质粒提取采用质粒去内毒素大提试剂盒(康为世纪，CW2104M)。
实施例3、pAPN第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮阳性细胞的获得及抗TGEV功能验证
一、pAPN第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮阳性细胞的获得
1.将野生型猪回肠上皮细胞(IPI-2I-WT)复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时即可进行细胞转染。将5μg实施例2中制备的pX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg实施例2中制备的pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μg实施例2中制备的Donor-727质粒共转染入IPI-2I-WT中，转染步骤严格按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza，VPI-1002)试剂盒说明书进行操作。
2.电转48h后，消化细胞并收集到流式管，通过流式分选仪分选单个GFP阳性细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。待96孔板中的细胞长满传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
3.对所挑取的单克隆细胞进行鉴定，具体步骤如下：以提取的细胞基因组DNA为模板，采用pAPN-TY-F2(SEQ ID No：8)和pAPN-TY-R2(SEQ ID No：9)进行PCR扩增，得到大小为1443bp的PCR产物。
PCR扩增条件为94℃5min；94℃30s，62.6℃30s，68℃1min 40s，34个循环；72℃，5min。PCR产物送北京天一辉远公司测序。根据测序结果，筛选pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰的IPI-2I(IPI-2I-727PE)细胞用作后续实验。
测序结果显示，本实施例成功的获得了多株含有pAPN蛋白第727位氨基酸精确修饰的IPI-2I-727PE细胞，阳性细胞的测序结果如图6所示。
与IPI-2I-WT细胞相比，IPI-2I-727PE细胞仅为将IPI-2I-WT细胞基因组上pAPN蛋白第727位苯丙氨酸的密码子TTC替换为丙氨酸的密码子GCC。
二、pAPN第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮阳性细胞抗TGEV功能验证将上述步骤一筛选获得的IPI-2I-727PE细胞进行TGEV感染试验，具体步骤如下：
1.将IPI-2I-727PE和IPI-2I-WT细胞分别接种TGEV病毒(MOI＝1)。同时将未接毒IPI-2I-WT细胞作为空白对照组(Mock组)。
2.感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测pAPN的表达情况，抗体为APN多克隆抗体(ABclonal，A5662)。
结果显示，IPI-2I-727PE细胞中，pAPN蛋白的表达水平和IPI-2I-WT细胞相当(图7)。这说明pAPN第727位氨基酸精确修饰不影响该蛋白的正常表达。
3.感染12h后收集细胞，用PBS清洗4-5次，提取RNA，利用qPCR检测细胞中TGEV病毒拷贝数。同时将未接毒IPI-2I-WT细胞作为空白对照组(Mock组)。
qRT-PCR结果如图8所示，结果表明：与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-727PE细胞中TGEV基因组RNA拷贝数极显著降低(****P<0.001)。
4.感染12h后收集细胞，提取细胞蛋白，利用Western Blot检测TGEV-N蛋白的表达情况。同时将未接毒IPI-2I-WT细胞作为空白对照组(Mock组)。
TGEV-N蛋白表达如图9所示，结果表明：与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-727PE细胞中TGEV-N蛋白表达量明显降低。
5.感染12h后收集细胞，利用间接免疫荧光(IFA)检测细胞中TGEV感染情况。同时将未接毒IPI-2I-WT细胞作为空白对照组(Mock组)。
IFA检测结果如图10所示，结果表明：IPI-2I-WT细胞接毒后，细胞中TGEV大量感染；与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-727PE细胞中TGEV感染量明显减少。
综上结果表明，pAPN第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸的猪回肠上皮细胞可以有效抵抗TGEV感染，说明pAPN第727位氨基酸为TGEV感染的关键位点，pAPN第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸可有效抵抗TGEV感染。
实施例4、pAPN第727位氨基酸精确修饰猪回肠上皮阳性细胞的酶活性测定
将IPI-2I-WT、IPI-2I-727PE、IPI-2I-KO细胞培养24h，收集细胞，使用PBS洗涤细胞悬液。然后，以每孔200μL PBS将5×105细胞悬浮于96孔板中，加入l-亮氨酸-对硝基苯胺底物(Sigma-Aldrich，L9125)至终浓度1.6mM,37℃孵育1h，每15min用酶标仪测定405nm吸光度，检测pAPN酶活性。
pAPN酶活性检测结果如图11所示，结果表明：与IPI-2I-WT细胞相比较，IPI-2I-727PE组细胞的pAPN酶活性在反应时间15min、30min、45min和60min均无显著差异，而IPI-2I-KO细胞的酶活性极显著降低(***P<0.001)。
由此可见，pAPN第727位氨基酸精确修饰(苯丙氨酸突变为丙氨酸)不影响该蛋白正常的酶活性。
实施例5、pAPN第727位氨基酸精确修饰猪成纤维细胞单克隆的获得
一、猪耳成纤维细胞的制备
采集1月龄健康的大白纯种猪耳源组织。耳组织样首先在75％酒精浸泡、PBS(Invitrogen，C10010500BT)清洗，然后利用手术刀片刮取表皮组织，在细胞培养皿内用眼科剪将剩余部分剪碎，最后将组织块转移到T-25细胞培养瓶(Eppendorf，0030710126)，放入CO2培养箱培养，并观察组织块周围细胞爬出情况。每2d换液一次。待细胞密度生长至80％-90％左右后冻存备用，得到原代猪耳成纤维细胞。
二、细胞转染
转染前一天将上述获得的原代猪耳成纤维细胞复苏至10cm平皿中，当细胞达到80％左右汇合度时，得到待转染猪耳成纤维细胞，即可进行细胞转染。
将实施例2构建的5μg pX458-pAPN-sgRNA-1质粒、5μg pX458-pAPN-sgRNA-2质粒和5μg Donor-727质粒共转染猪耳成纤维细胞，然后将电转后的细胞转移到6孔板培养，转染步骤严格按照Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。
三、单克隆细胞的流式分选及传代
电转48h后，消化细胞并收集到流式管，通过流式分选仪分选单个GFP阳性细胞到96孔板中并进行培养，每3天更换一次培养液。待96孔板中的细胞长满传代培养至48孔板，待48孔板细胞长满，取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
四、单克隆细胞的获得
对所挑取的单克隆细胞进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用核苷酸序列如SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，扩增出1443bp片段。扩增条件为94℃5min；94℃30s，62.6℃30s，68℃1min 40s，34个循环；72℃，5min。PCR产物送北京天一辉远公司测序。
根据测序结果，选取pAPN蛋白第727位氨基酸苯丙氨酸突变为丙氨酸的猪成纤维细胞为阳性细胞，该细胞可用作核移植时的供体细胞。
部分阳性细胞的测序结果如图12示，测序结果显示，本实施例成功的获得了多株阳性细胞，即pAPN第727位氨基酸精确修饰(苯丙氨酸密码子TTC突变为丙氨酸密码子GCC)的猪成纤维细胞，命名为PEF-727PE。
实施例6、体细胞核移植技术制备pAPN第727位氨基酸精确修饰的基因编辑猪
以实施例5获得的pAPN第727位氨基酸精确修饰的猪成纤维细胞PEF-727PE作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的去核后的猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产大白母猪子宫内进行妊娠，其中手术法胚胎移植步骤为：受体母猪静脉注射舒泰(Zoletil)麻醉剂进行诱导麻醉，注射剂量为5mg/kg体重。麻醉后将受体母猪移至手术架上仰卧保定，并进行呼吸麻醉(异氟烷浓度为3％～4％)。受体母猪腹中线做一个长约10cm的手术切口，曝露卵巢、输卵管及子宫，用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部-峡部结合处。胚胎移植后，技术人员定期观察，并用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。
仔猪出生后，剪取耳组织并提取基因组DNA，使用上述SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9的核苷酸序列进行PCR扩增，PCR扩增产物测序检测基因型。
测序结果显示，本实施例成功获得了pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸的基因编辑猪(PIG-727PE)，即pAPN第727位氨基酸精确修饰的基因编辑猪。部分基因编辑猪的测序结果如图13所示，与野生型pAPN蛋白相比，pAPN第727位氨基酸精确修饰的基因编辑猪中的pAPN蛋白第727位苯丙氨酸密码子TTC突变为丙氨酸密码子GCC，其他氨基酸残基不变，该猪为具备抵抗TGEV感染的目标猪。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (11)

1.使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质在如下任一中的应用：
1）构建非诊断和治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞系；
2）制备抗猪传染性胃肠炎病毒的细胞；
3）制备抗猪传染性胃肠炎病毒猪；
4）抗猪传染性胃肠炎病毒猪育种；
5）制备预防或治疗猪传染性胃肠炎的产品；
所述pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸；
所述使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质为CRISPR系统；
所述CRISPR系统包括sgRNA1、sgRNA2和用于同源重组的供体DNA；
所述sgRNA1的靶点的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；所述sgRNA2的靶点的核苷酸序列为SEQ ID NO：2；所述用于同源重组的供体DNA的核苷酸序列为SEQ ID NO：3；
所述野生型pAPN蛋白为SEQ ID NO：12编码的蛋白质。
2.一种构建猪传染性胃肠炎病毒抗性细胞模型的方法，包括如下步骤：使出发细胞表达pAPN突变蛋白，得到目标细胞，即为猪传染性胃肠炎病毒抗性细胞模型；
所述pAPN突变蛋白为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到的蛋白；
所述野生型pAPN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10；
所述使出发细胞表达pAPN突变蛋白采用权利要求1中的所述CRISPR系统。
3.一种非诊断和治疗目的的pAPN蛋白突变细胞的构建方法，包括如下步骤：使目的细胞中野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到pAPN蛋白突变细胞；
所述野生型pAPN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10；
所述使目的细胞中野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸采用权利要求1中的所述CRISPR系统。
4.一种非诊断和治疗目的的pAPN蛋白突变基因编辑猪的构建方法，包括如下步骤：
1）使离体猪成纤维细胞中pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，得到目标细胞；
2）将所述目标细胞作为核移植供体细胞通过体细胞核移植入母猪体内，生产的子代即为pAPN蛋白突变基因编辑猪；
所述野生型pAPN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10；
所述使离体猪成纤维细胞中pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸采用权利要求1中的所述CRISPR系统。
5.权利要求1中所述使pAPN蛋白第727位氨基酸残基发生突变的物质。
6.pAPN突变体，为将野生型pAPN蛋白第727位苯丙氨酸突变为丙氨酸，其他氨基酸残基不变，得到的蛋白；
所述野生型pAPN蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：10。
7.编码权利要求6所述pAPN突变体的核酸分子。
8.含有权利要求7所述核酸分子的表达盒。
9.含有权利要求7所述核酸分子的重组载体。
10.含有权利要求7所述核酸分子的重组细胞。
11.权利要求6所述pAPN突变体或权利要求7所述核酸分子或权利要求8所述表达盒或权利要求9所述重组载体或权利要求10所述重组细胞在如下任一中的应用：
1）构建非诊断和治疗目的的pAPN基因定点修饰的细胞系；
2）制备抗猪传染性胃肠炎病毒的细胞；
3）制备抗猪传染性胃肠炎病毒猪；
4）抗猪传染性胃肠炎病毒猪育种；
5）制备预防或治疗猪传染性胃肠炎的产品。
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