CN107354170A - 一种基因敲除载体以及制备cd163基因敲除猪成纤维细胞的方法 - Google Patents
一种基因敲除载体以及制备cd163基因敲除猪成纤维细胞的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基因敲除载体以及制备CD163基因敲除猪成纤维细胞的方法，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO：2所示。通过该载体可以简单、快速、高效地敲除猪CD163基因，获得纯合敲除CD163基因的猪或猪成纤维细胞。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种基因敲除载体以及制备CD163基因敲除猪成纤维细胞的方法。
背景技术
猪生殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪生殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV)引起的以猪厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高度死亡性为主要特征的一种高度接触性传染病。因该病在临床上表现为耳部皮肤紫绀，所以又被称为“蓝耳病”。该病于1987年首次在美国被发现，紧接着于1989年在欧洲爆发，1995年底在中国大陆首次爆发，猪群的感染率高达90％，给养猪业带来了极大的经济损失，已成为世界范围内一种严重危害养猪业的传染病。
PRRSV在体内主要感染分化良好的猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolarmacrophages，PAM)。PRRSV侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现，硫酸乙酰肝素(Heparin Sulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)和CD163(Cluster of Differentiation 163)分子是PAM上存在的能与PRRSV结合的三个重要受体分子。其中，CD163是一种富含半胱氨酸的清道夫受体，是典型的Ⅰ型糖基化蛋白，也是一种巨噬细胞分化的抗原，分子大小是130kD，固又被称为M130蛋白。CD163起初是作为巨噬细胞和单核细胞的特异性鉴别蛋白质被认识的，在肺、脾脏、肝脏、淋巴集结和胸腺组织的巨噬细胞中都有表达。有研究表明，在PRRSV非易感细胞系(BHK-21和PK-15)中转染表达CD163分子可以使这些细胞系感染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子，抗人CD163的抗体可以阻断PRRSV的感染，表明CD163是该病毒的必需受体。CD163蛋白结构域SRCR5是病毒感染细胞所必需的，而氨基端的4个SRCR和胞质尾部是非必需的，其中SRCR5结构域正是由CD163第7外显子所编码。
因此，研究CD163敲除猪可以为CD163受体是否是PRRSV感染过程中的重要角色提供必要证据，并为研究猪蓝耳病发病的机制提供平台。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种基因敲除载体，所述载体可用于简单、快速、高效地敲除猪CD163基因。
本发明的第二目的在于提供一种制备CD163基因敲除猪成纤维细胞的方法，通过该方法可以简单、快速、高效地获得CD163基因敲除的纯合子猪成纤维细胞。
本发明的第三目的在于提供根据上述方法制备的猪成纤维细胞。
本发明的第四目的在于提供一种制备CD163基因敲除猪的方法，通过该方法可以简单、高效地获得纯合的CD163基因敲除猪。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种基因敲除载体，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
CRISPR(clustered,regularly interspaced，short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白(Cas蛋白)共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。
目前，来自Streptococcus pyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白(含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单(5’-NGG-3’)，几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞。
在本申请中，所述载体为CRISPR/Cas9基因敲除载体。传统的ZFN和TALEN技术需要经过复杂的操作并花费大量精力才有可能将目标基因敲除，而本发明所述载体系统大大降低基因敲除的操作难度，能够通过简单的操作和较低的成本即可将CD163基因敲除，且在基因敲除的过程中不需要引入外源基因。然而，CRISPR/Cas9尽管存在较高的敲除效率、且具有操作简单、制备成本低的优点，但同时也存在较高的脱靶风险，容易影响打靶的效果。本申请出人意料地发现，以SEQ ID NO：2所示DNA序列作为打靶位点，特异性好，不易脱靶，可以有效提高打靶效率，在短时间内获得纯合子CD163基因敲除猪或猪成纤维细胞系。
在一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9载体骨架为pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551和pX552，优选地，所述载体骨架为pX330。
本发明还提供一种制备CD163基因敲除猪成纤维细胞的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)、构建上述基因敲除载体；
(2)、将所述基因敲除载体转入猪成纤维细胞中，并通过筛选和鉴定获得CD163基因纯合敲除的单克隆细胞系，即得所述CD163基因敲除猪成纤维细胞。
在一些实施方式中，所述步骤(1)具体包括：合成如SEQ ID NO：3-4所示寡核苷酸单链，退火形成双链，与经过酶切的质粒连接，筛选获得阳性克隆即得所述基因敲除载体。
在一些实施方式中，所述步骤(2)具体包括：将4～6μg基因敲除载体通过电转染的方式转入1×106～2×106个猪成纤维细胞，通过有限稀释法筛选单克隆细胞系，并鉴定所述单克隆细胞系是否为CD163基因纯合敲除的阳性单克隆细胞系。
在一些实施方式中，所述阳性单克隆细胞系的具体鉴定方法包括：提取单克隆细胞系的基因组DNA，使用如SEQ ID NO：5-6所示引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果判定所述单克隆细胞系是否为CD163基因纯合敲除的阳性单克隆细胞系。
在一些实施方式中，所述PCR扩增的退火温度为60-62℃，循环数为32-38。
本发明还提供由上述方法制备的猪成纤维细胞。本发明所述猪成纤维细胞为CD163基因纯合敲除的猪成纤维细胞，可以利用该猪成纤维细胞制备纯合敲除CD163基因猪，以便在活体水平上进行猪蓝耳病的研究。
本发明还提供一种制备CD163基因敲除猪的方法，所述方法以上述猪成纤维细胞作为核移植供体细胞，将其细胞核移植入去核的卵母细胞，制备重组克隆胚胎并移植入母体内经妊娠获得CD163基因敲除猪。
在一些实施方式中，所述方法还包括对CD163基因敲除猪进行鉴定的步骤：提取所述CD163基因敲除猪的DNA，使用核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或测序，根据电泳或测序结果确定所述猪是否已经将CD163基因敲除，其中具体的PCR扩增条件为：退火温度60-62℃，循环数为32-38。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明采用CRISPR/Cas9基因敲除系统，以及如SEQ ID NO：2所示DNA序列作为靶位点，构建CD163基因的基因敲除载体，以该基因敲除载体为依托建立敲除猪成纤维细胞CD163基因的方法以及制备CD163基因敲除猪的方法，通过上述基因敲除载体和相应方法可以在短时间内快速获得纯合敲除CD163基因的猪成纤维细胞或猪，为蓝耳病发病机制的研究提供平台。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为pmaxGFP作为对照的转染效率图；
图2为pX330-CD163-gRNA载体对猪成纤维细胞基因组切割情况的PCR测序图谱；
图3为CD163基因敲除的猪成纤维细胞单克隆鉴定结果；
图4为CD163基因修饰猪PCR鉴定结果；
图5为PCR测序鉴定克隆猪的碱基缺失情况以及峰图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下述实施例中的猪胎儿成纤维细胞(porcine embryonic fibroblast，PEF)按照如下方法制备：
将猪35日龄左右胚胎，去除胎儿的头、尾、四肢、内脏和骨头，并将血液清理干净。用弯头眼科剪持续剪切胎儿30min保证充分剪碎，将剪碎的胎儿组织用剪头的蓝枪头吸取到15mL离心管中，加入5mL完全培养基，自然沉降数分钟后除去上面溶液，并在下层组织块中加入几滴FBS，用尖端1cm处弯曲的15cm玻璃巴氏管吸出，平铺于两个T75培养瓶中，瓶底朝上放置，并在对侧加入15mL完全培养液，于6-8h后小心翻转培养瓶，将组织块浸入培养液中，每两天换一次液，待细胞长满T75培养瓶后冻存备用。其中，猪为中国农业科学院北京畜牧兽医研究所饲养的猪。
实施例1靶向CD163基因的CRISPR/Cas9敲除载体的构建
在编码猪CD163基因SRCR5结构域的第7外显子(序列如SEQ ID NO：1所示)的打靶区域设计打靶位点(gRNA)，该打靶位点的序列为GGAAACCCAGGCTGGTTGGA(SEQ ID NO：2)。根据gRNA序列合成互补配对的寡聚核苷酸单链，如表1所示，小写字母为酶切位点。
表1 gRNA序列
| 名称 | 序列5’-3’ |
| CD163-gRNA-F | caccGGAAACCCAGGCTGGTTGGA(SEQ ID NO.3) |
| CD163-gRNA-R | aaacTCCAACCAGCCTGGGTTTCC(SEQ ID NO.4) |
构建的靶向CD163基因的CRISPR/Cas9敲除载体，命名为pX330-CD163-gRNA：
将表1合成的1对寡聚核苷酸在98℃变性10min，然后自然冷却至室温的条件下对其进行退火；用限制性内切酶Bbs I对含有Cas9序列的pX330骨架载体在37℃条件下酶切2h，切胶回收线性化片段后，与退火的寡聚核苷酸16℃连接1h，随后转化Top10或DH5α感受态细胞，涂布于含氨苄的LB平板生长，挑取单菌落扩大培养并测序，测序引物为U6-FWD。序列正确，进行扩大培养后，用质粒去内毒素大提试剂盒(EndoFree Plasmid Maxi Kit)上提供的方法，提取pX330-CD163-gRNA质粒，所提的质粒用于细胞的转染。
实施例2 CD163基因修饰的猪胚胎成纤维细胞系的建立
1.细胞转染：转染前一天将原代猪胎儿成纤维细胞复苏至6cm平皿中，当细胞达到70-80％汇合度时即可进行细胞转染。转染步骤严格按照Basic Primary FibroblastsNucleofector Kit(Lonza)试剂盒说明书进行操作。转染pX330-CD163-gRNA质粒的同时，以转染pmaxGFP质粒作为对照，48h后拍照观察转染效率(参见图1)。
2.敲除效率的检测：电转染后的细胞培养48h后，一部分用于铺板，另外收集部分细胞，提取细胞基因组，以检测打靶效率。以提取的细胞基因组为模板，用Pre mix Taq DNA聚合酶进行PCR，引物为CD163-F：5’-AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3’(SEQ ID NO：5)和CD163-R：5’-GTGGTTTCCCTCCTGGGG-3’(SEQ ID NO：6)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京天一辉远公司测序，测序结果显示pX330-CD163-gRNA质粒能切割猪成纤维细胞基因组(参见图2)。
3.阳性单克隆细胞系的筛选：电转48h后细胞汇合度大约为90％左右时以适宜的密度铺板，每3天更换一次培养液。铺板后的细胞大约培养10天左右，可以观察到合适大小的克隆点形成。将单克隆细胞进行扩大培养，同时取部分细胞用于提取基因组鉴定基因型。
4.阳性单克隆细胞系的鉴定。对所挑取的161个细胞单克隆进行鉴定：以提取的细胞基因组为模板，用Pre mix Taq DNA聚合酶进行PCR，扩增出300bp片段，引物为CD163-F：5’-AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3’(SEQ ID NO：5)和CD163-R：5’-GTGGTTTCCCTCCTGGGG-3’(SEQID NO：6)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京天一辉远公司测序。根据测序结果，筛选能够造成移码突变的纯合敲除细胞系用作核移植时的供体细胞。
5.结果成功的获得了多株CD163双等位基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系(参见图3)，这些细胞系已经从基因水平上进行了鉴定：M：100bp marker；1.121#细胞克隆；2：122#细胞克隆；3：123#细胞克隆；4：124#细胞克隆；5：34#细胞克隆；6：72#细胞克隆。其中，34#细胞克隆为CD163基因缺失50bp的纯合敲除细胞系，72#细胞克隆为杂合敲除细胞系。
实施例3体细胞核移植技术制备CD163基因修饰的抗蓝耳病克隆猪
利用体细胞核移植技术制备CD163双等位基因碱基缺失的抗蓝耳病基因修饰猪：
以实施例2获得的纯合敲除的阳性细胞作为核移植供体细胞，以体外成熟40h的青年猪卵母细胞为核移植受体细胞，将核移植供体细胞移入去核的卵母细胞，经电融合与激活，构建成重组克隆胚胎，挑选发育状态良好的克隆重组胚胎用手术法移入自然发情的经产母猪子宫内进行妊娠,手术法胚胎移植步骤为呼吸机麻醉，并伴有2％的水合氯醛维持麻醉，在手术架上仰卧保定,腹中线做一个长约10cm的手术切口,曝露卵巢、输卵管及子宫,用胚胎移植玻璃管沿输卵管伞部进入约5cm，将发育状态良好克隆重组胚胎移植到输卵管壶腹部－峡部结合处。胚胎移植后，技术人员注意观察其返情情况，定期用B型超声波检查受体母猪妊娠情况。
实验结果：成功获得猪生殖与呼吸综合征病毒受体CD163基因修饰猪。
实施例4 CRISPR/Cas9介导的抗蓝耳病基因修饰猪的鉴定
实验过程：出生后的小猪喂养数天后，剪取猪耳和尾巴组织，用BioTeke细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型目录号DP1902)提取基因组。以提取的基因组为模板，用Pre mix Taq DNA聚合酶进行PCR，扩增出300bp片段，引物为CD163-F：5’-AAGCCCACTGTAGGCAGAA-3’(SEQ ID NO：5)和CD163-R：5’-GTGGTTTCCCTCCTGGGG-3’(SEQ IDNO：6)。扩增条件为95℃，5min；95℃，30s；61℃，30s；72℃，30s；72℃，10min；36个循环，2％琼脂糖凝胶电泳观察条带，PCR产物送北京天一辉远公司测序。其中以阴性猪的基因组和水作为阴性对照。
实验结果：2％琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示：M：100bp marker；1：克隆猪1；2：克隆猪2；3：水；4：阴性猪基因组。测序结果以及图谱如图5所示。克隆猪鉴定结果表明CD163双等位基因碱基缺失50bp，与预期阳性细胞克隆的结果一致。
结论：基因水平上证实了上述制备的克隆猪为CD163基因修饰的抗蓝耳病克隆猪。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> 一种基因敲除载体以及制备CD163基因敲除猪成纤维细胞的方法
<130> 111111111
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 320
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 1
tcagcccaca ggaaacccag gctggttgga ggggacattc cctgctctgg tcgtgttgaa 60
gtacaacatg gagacacgtg gggcaccgtc tgtgattctg acttctctct ggaggcggcc 120
agcgtgctgt gcagggaact acagtgcggc actgtggttt ccctcctggg gggagctcac 180
tttggagaag gaagtggaca gatctgggct gaagaattcc agtgtgaggg gcacgagtcc 240
cacctttcac tctgcccagt agcaccccgc cctgacggga catgtagcca cagcagggac 300
gtcggcgtag tctgctcaag 320
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Sus scrofa
<400> 2
ggaaacccag gctggttgga 20
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccggaaa cccaggctgg ttgga 25
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
aaactccaac cagcctgggt ttcc 24
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aagcccactg taggcagaa 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gtggtttccc tcctgggg 18
Claims (10)
1.一种基因敲除载体，其特征在于，所述基因敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
2.根据权利要求1所述的基因敲除载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas9载体骨架为pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551和pX552，优选地，所述载体骨架为pX330。
3.一种制备CD163基因敲除猪成纤维细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)、构建权利要求1或2所述基因敲除载体；
(2)、将所述基因敲除载体转入猪成纤维细胞中，并通过筛选和鉴定获得CD163基因纯合敲除的单克隆细胞系，即得所述CD163基因敲除猪成纤维细胞。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：合成如SEQ ID NO：3-4所示寡核苷酸单链，退火形成双链，与经过酶切的质粒连接，筛选获得阳性克隆即得所述基因敲除载体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：将4～6μg基因敲除载体通过电转染的方式转入1×106～2×106个猪成纤维细胞，通过有限稀释法筛选单克隆细胞系，并鉴定所述单克隆细胞系是否为CD163基因纯合敲除的阳性单克隆细胞系。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述阳性单克隆细胞系的具体鉴定方法包括：提取单克隆细胞系的基因组DNA，使用如SEQ ID NO：5-6所示引物进行PCR扩增，并对扩增产物进行测序，根据测序结果判定所述单克隆细胞系是否为CD163基因纯合敲除的阳性单克隆细胞系。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的退火温度为60-62℃，循环数为32-38。
8.根据权利要求3-7任一项所述方法制备的猪成纤维细胞。
9.一种制备CD163基因敲除猪的方法，其特征在于，所述方法以权利要求8所述猪成纤维细胞作为核移植供体细胞，将其细胞核移植入去核的卵母细胞，制备重组克隆胚胎并移植入母体内经妊娠获得CD163基因敲除猪。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对CD163基因敲除猪进行鉴定的步骤：提取所述CD163基因敲除猪的DNA，使用核苷酸序列如SEQ ID NO：5-6所示的上下游引物对提取的DNA基因组进行扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或测序，根据电泳或测序结果确定所述猪是否已经将CD163基因敲除，其中具体的PCR扩增条件为：退火温度60-62℃，循环数为32-38。
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