CN108103099A - 一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗蓝耳病Marc‑145细胞系及其制备方法和应用。所述抗蓝耳病毒Marc‑145细胞系是将Marc‑145细胞系的CD163胞外域SRCR5敲除所得到。本发明还提供了一对剪切Marc‑145细胞CD163受体SRCR5的gRNA，序列分别如SEQ ID NO.2～3所示。本发明将Marc‑145细胞表面CD163受体胞外第5个结构域SRCR5经CRISPR/CAS9基因编辑技术删除后，所得抗蓝耳病Marc‑145细胞系能够完全抵抗PRRSV感染，包括抗高致病性毒株HP‑PRRSV。而且，该抗蓝耳病Marc‑145细胞系表面CD163受体表达正常，其他生物学功能正常。本发明的抗蓝耳病Marc‑145细胞系对研究PRRSV致病机理及挖掘新型抗病或易感基因具有重要意义，为PRRSV研究提供了一个新的模型，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有重要的指导意义。

Description

一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于细胞基因工程技术领域。更具体地，涉及一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)又称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive andrespiratory syndrome viruse，PRRSV)引起，PRRS主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、弱仔及各年龄阶段猪特别是仔猪呼吸道症状，特征性病变为间质性肺炎，死亡率极高，是一种高度接触性的全球性的重要传染病。该病最早于1987年在美国爆发，随后蔓延到欧洲，我国于1996年分离到该病毒。目前，根据基因组序列和抗原性差异，将PRRSV分为两种基因型，一种以Lelystad Virus(LV)毒株为代表的欧洲型，另一种以ATCC VR-2332毒株为代表的美洲型。在我国，PRRSV主要以美洲型为主，但据报道也分离到欧洲型毒株。2006年，我国爆发了猪高热病，对养猪业造成严重的经济损失，后来将此毒株定义为高致病型毒株(Highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome viruse，HP-PRRSV)，目前，高致病性蓝耳病(Highly pathogenic porcine reproductive andrespiratory syndrome，HP-PRRS)是对养猪业损害最大的疾病之一，由于该病毒具有免疫抑制性、抗体依赖增强性、持续性感染、病毒血症维持时间长等特点，目前尚没有很好的疫苗和药物可以防控蓝耳病。

PRRSV属于尼多病毒目(Nidovirales)、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、动脉炎病毒属(Arterivirus)成员，电镜下观察病毒粒子呈球形或椭圆形，有囊膜。病毒基因组为一条单股正链RNA，全长约为15Kb，含有5′和3′非编码区，中间为10个开放阅读框(openreading frame，ORF)，其中ORF2-7分别翻译病毒糖蛋白(glycoprotein GP)GP2a、GP2b、GP3、GP4、GP5、GP5a、M及N蛋白。其中最重要的是GP5和N蛋白，它们不仅是病毒粒子的主要组成部分，而且在病毒粒子的包装、成熟、免疫逃避及抗体诱导中产生重要的作用。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：(1)嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞(Porcinealveolar macrophages，PAMs)，PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；(2)抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；(3)疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；(4)抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；(5)病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；(6)混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。

Marc-145细胞系，上皮样细胞，来源于猴肾细胞，从母细胞(MA-104细胞)克隆而得到，可连续传代培养。此细胞主要用于病毒的培养，特别是2007年爆发的猪蓝耳病病毒对此细胞尤为敏感，是猪蓝耳病病毒及其防控技术研究中的重要材料。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种不感染PRRSV的Marc-145细胞，即通过CRISPR/CAS9基因编辑技术使原本可感染PRRSV的Marc-145细胞转换成不感染PRRSV的Marc-145细胞，并通过单克隆获得细胞系。本发明制备的抗蓝耳病Marc-145细胞系对研究PRRSV致病机理及挖掘新型抗病或易感基因具有重要意义，为PRRSV研究提供一个新的模型，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有重要的指导意义。

本发明的目的是提供一种抗蓝耳病Marc-145细胞系，尤其是抗高致病型毒株HP-PRRSV的Marc-145细胞系。

本发明另一目的是提供所述抗蓝耳病Marc-145细胞系的制备方法。

本发明再一目的是提供所述抗蓝耳病Marc-145细胞系的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种抗蓝耳病毒Marc-145细胞系的构建方法，是将Marc-145细胞系的CD163胞外域SRCR5敲除，得到抗蓝耳病毒Marc-145细胞系。

所述蓝耳病毒包括所述蓝耳病毒包括经典毒株和高致病性毒株。

具体优选地，所述高致病性毒株为高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV。

所述抗蓝耳病毒Marc-145细胞系的构建方法，是敲除PRRSV侵入Marc-145细胞必需的CD163受体胞外域SRCR5，而不是敲除整个CD163基因。

具体是敲除Marc-145细胞系的CD163基因第7个外显子。所述CD163基因第7个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，剪切敲除Marc-145细胞系的CD163基因第7个外显子的gRNA(剪切Marc-145细胞CD163受体SRCR5的gRNA)序列分别如SEQ ID NO.2～3所示。

本发明敲除Marc-145细胞系的CD163胞外域SRCR5所用方法为CRISPR/CAS9基因编辑技术；具体是：首先在编码Marc-145细胞表面CD163受体胞外第5个结构域SRCR5的外显子7上下游设计gRNA，接着筛选剪切效率最高的针对外显子7的上下游gRNA，然后共转染Marc-145细胞，通过双荧光筛选系统最终获得CD163受体胞外第5个结构域SRCR5删除的Marc-145细胞系。

具体地，作为一种可选择的优选实施方式，本发明构建抗蓝耳病毒Marc-145细胞系的方法如下：

(1)将引导Cas9蛋白靶向切割活性最高的两条sgRNA(序列分别如SEQ ID NO.2和3所示)分别变性退火成双链寡核苷酸片段，并在片段两侧加上磷酸基团；

(2)将步骤(1)所得两个双链寡核苷酸片段分别克隆到带EGFP绿色荧光蛋白标签的Cas9与sgRNA共表达载体PX458，和带有DsRed红色荧光蛋白标签的Cas9与sgRNA共表达载体PX459上，获得两个载体，即获得双荧光筛选系统；

(3)将步骤(2)构建好的两个载体共转染Marc-145细胞，通过流式细胞仪将红色荧光与绿荧光双阳性的细胞群分选出；

(4)分选前准备96孔板若干个，对每个96孔板每孔加入150μl预热的条件培养基(50％新鲜全DMEM和50％已使用全DMEM混合过滤)；分选后，细胞培养三天后，每孔加入50μl全DMEM培养基，一周后显微镜下观察细胞单克隆情况，并作相应标记，更换培养基；

(5)细胞单克隆堆积生长状态下，需要进行胰酶消化(胰酶10μl即可)，加入培养基继续培养，待96孔板长满进行48孔板扩大培养，直至长至6孔板后，进行冻存和基因型鉴定，获得CD163第5个结构域SRCR5双敲纯合子。

其中，步骤(1)中反应程序为37℃，30min；95℃，5min；-5℃/min降至25℃。

步骤(2)中所用酶切位点为BbsI。

步骤(3)共转染的条件：电压：1050V，脉冲：30ms，电击次数：2次。

另外，本发明构建得到的抗蓝耳病毒Marc-145细胞系，也在本发明的保护范围之内。

本发明制备的抗蓝耳病毒Marc-145细胞系CD163基因仍然在Marc-145细胞膜上表达，CD163受体其他生物学功能仍然保存，即基因编辑过的Marc-145细胞与野生型细胞在生长速度、细胞活力等其他指标一样。同时通过不同感染时间、不同感染复数等试验确证了，制备的抗蓝耳病毒Marc-145细胞系能够完全抵抗HP-PRRSV感染，不论高致病型毒株HP-PRRSV接毒时间多长，病毒感染复数多高，该细胞系对HP-PRRSV完全不感染，抗PRRSV非常显著。

因此，本发明构建的抗蓝耳病毒Marc-145细胞系可以作为PRRSV病毒研究模型，包括PRRSV致病机理研究、挖掘新型抗病或易感基因研究，以及PRRSV抗性猪的筛选和培育研究等；对研究PRRSV致病机理及挖掘新型抗病或易感基因具有重要意义，为PRRSV研究提供一个新的模型，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有重要的指导意义。

另外，本发明筛选得到的用于构建抗蓝耳病毒Marc-145细胞系的gRNA(即剪切Marc-145细胞CD163受体SRCR5的gRNA)，其上下游序列分别如SEQ ID NO.2～3所示，也应在本发明的保护范围之内。

以及含有上述gRNA的DNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体，也应在本发明的保护范围之内。

所述CRISPR/Cas9打靶载体是以PX458和PX459空载体为基础，插入所述gRNA的DNA序列所得；所用酶切位点为BbsI。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次通过CRISPR/CAS9基因编辑技术敲除Marc-145细胞表面CD163受体胞外域SRCR5，然后通过单克隆培养获得了一种能够完全抵抗HP-PRRSV感染的Marc-145细胞系。

本发明制备的抗蓝耳病Marc-145细胞系只敲除了PRRSV侵入Marc-145细胞必需的CD163受体胞外域SRCR5，而不是敲除整个CD163基因，即CD163基因仍然在Marc-145细胞膜上表达，CD163受体其他生物学功能仍然保存，即基因编辑过的Marc-145细胞与野生型细胞在生长速度、细胞活力等其他指标一样。

另外，为了确证本发明制备的抗蓝耳病Marc-145细胞系能够完全抵抗HP-PRRSV感染，我们通过不同感染时间、不同感染复数试验发现：即使将HP-PRRSV接毒时间延长至72小时，CD163受体SRCR5敲除细胞系完全不感染HP-PRRSV；同理，HP-PRRSV感染复数增加到5，该细胞系同样能够完全抵抗HP-PRRSV感染。故以上试验确证本发明制备的抗蓝耳病Marc-145细胞系能够完全抵抗HP-PRRSV感染。

附图说明

图1为Marc-145细胞表面CD163受体第五个结构域SRCR5敲除模式图。

图2为T7EⅠ酶切实验验证6种gRNA-pX458/459活性电泳图。

图3为单克隆基因型电泳图。

图4为单克隆基因型测序验证图。

图5为qRT-PCR、Western blot检测Marc-145细胞CD163受体SRCR5敲除后CD163表达量。

图6为qRT-PCR检测Marc-145细胞CD163受体SRCR5敲除后抗PRRSV试验。

图7为Western blot检测Marc-145细胞CD163受体SRCR5敲除后抗PRRSV试验。

图8为免疫荧光检测Marc-145细胞CD163受体SRCR5敲除后抗PRRSV试验。

图9为病毒滴度TCID₅₀检测Marc-145细胞CD163受体SRCR5敲除后抗PRRSV试验。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

本发明Marc-145细胞表面CD163受体第五个结构域SRCR5敲除模式如图1所示，具体见下述实施例。

实施例1 CRISPR/Cas9打靶载体构建

1、sgRNA的设计

在非洲绿猴CD163基因(序列号为XM_007967478.1)外显子7(序列如SEQ ID NO.1所示)两端内含子区域选择sgRNA打靶潜在目的区域序列，设计sgRNA序列，初步筛选选择了较好的6条作为候选sgRNA，序列如下表1和表2：

表1 上游引物(5′-3′)

注：字体加粗并下划线部分为粘性末端。

表2 下游引物

注：字体加粗并下划线部分为粘性末端。

2、sgRNA的变性退火及磷酸化

将合成的每对sgRNA单链寡核苷酸变性退火成双链寡核苷酸片段，并在片段两侧加上磷酸基团，以便后续载体连接。

反应程序为37℃，30min；95℃，5min；-5℃/min降至25℃。之后将产物按照1：200体积比加ddH₂O稀释，以备后续酶切连接使用。

3、sgRNA插入PX458和PX459空载体

将每条经过变性退火及磷酸化的sgRNA双链寡核苷酸片段分别插入到PX458和PX459空载体中，酶切和连接反应在同一个体系中进行。所用酶切位点为BbsI。

4、质粒化学转化、涂板、挑单克隆摇菌并测序，筛选阳性克隆细胞，菌液测序，验证gRNA连接情况。

实施例2 阳性克隆细胞电转染Marc-145细胞

1、在电转染前需要根据实验要求确定细胞数量(每100μL体系需要的细胞数目为1×10⁶左右)，并且由于电转对细胞状态要求较高，因此需保证有较好的细胞状态。

2、按细胞传代流程，消化细胞后，1600rpm离心4min，吸掉上清，加入1mL PBS洗涤并用细胞计数仪计算细胞数量。计数后，同样将PBS细胞悬液1600rpm离心4min，吸掉上清，按每1×10⁶细胞加入100μL细胞悬浮液R，吹打均匀。同时按照每100μL细胞悬浮液加入8μg质粒，轻轻吹打均匀备用。

3、准备接收电转后细胞的培养皿，添加细胞培养基后放入37℃培养箱预热，以降低电转后对细胞的伤害。

4、将3至5mL电转缓冲液E2加入电转杯，并将电转杯安装至电击台上，设置好电转仪的电转条件待用。

5、用电转枪慢慢吸取加入了质粒的细胞悬液，切记避免气泡的产生，否则电转时容易产生电火花影响电转效率。将电转枪插入电转杯内，设置电转参数(电压1050V，脉冲30ms，电击次数2次)后开始电击，启动电转。将电转后的细胞接种至预热好的培养皿内，做好标记即可放入培养箱内培养。

6、24h后给细胞换上新鲜的培养基，在荧光显微镜下观察，估计转染效率，筛选转染效率最高的共转染克隆组合。

实施例3 流式分选

1、细胞准备：电转后24h荧光强度较强，可进行流式分选，切记需准备阴性对照。用胰酶消化贴壁的PEF细胞，1600rpm离心4min，吸掉上清，用PBS重悬，吹打均匀待用。

2、将细胞悬液经50μm尼龙膜过滤到流式管中，以防堵塞流式分选仪。同时准备接收阳性细胞的培养皿，即可准备上机。

3、在FACScalibur流式细胞分析仪上分析细胞的荧光比例与强度。注意对于EGFP和DsRed双阳性细胞，除了需设置双阴性细胞对照外，还需准备单阳性细胞以确保分选的准确性。

实施例4 T7EⅠ酶切实验

1、实验方法

(1)经流式分选后直接提取细胞基因组，若分选后细胞较少，可分选后再培养至一定数量后再提取基因组，扩增出包含CRISPR/Cas9识别位点的CD163基因片段，后用胶回试剂盒纯化PCR产物。纯化后的PCR产物高温变性后，经逐步降温退火形成异源双链DNA。

(2)在变性退火产物中加入0.5μL T7EⅠ酶，放于预热至37℃水浴锅内，反应30min，配制10％的PAGE胶用于酶切电泳。电泳结束后，小心取出PAGE胶，于配制好的EB中染色15min左右。染色后用清水清洗3次去除残余的EB，置于凝胶成像系统观察并拍照。通过Image J软件估算CRISPR/Cas9的切割效率。

2、结果如附图2所示：

6个gRNA都有剪切活性，上游1号gRNA剪切效率最高，下游9号gRNA剪切效率最高，故后续选1号与9号gRNA共转筛选单克隆。

实施例5 CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞系单克隆培养

1、实验方法

(1)将引导Cas9蛋白靶向切割活性最高的两条sgRNA(序列分别如SEQ ID NO.2和3所示)分别克隆到带EGFP绿色荧光蛋白标签的Cas9与sgRNA共表达载体PX458，和带有DsRed红色荧光蛋白标签的Cas9与sgRNA共表达载体PX459上，获得双荧光筛选系统。将构建好的两个载体共转染Marc-145细胞，通过流式细胞仪将红色荧光与绿荧光双阳性的细胞群分选出。

(2)分选前准备96孔板若干个，对每个96孔板每孔加入150μl预热的条件培养基(50％新鲜全DMEM和50％已使用全DMEM混合过滤)；

(3)分选后，放入细胞培养箱，三天后，每孔加入50μl全DMEM培养基，一周后显微镜下观察细胞单克隆情况，并作相应标记，更换培养基。

(4)细胞单克隆堆积生长状态下，需要进行胰酶消化(胰酶10μl即可)，加入培养基继续培养，待96孔板长满进行48孔板扩大培养，直至长至6孔板后，进行冻存和基因型鉴定。

2、结果如附图3、4所示：

87号为CD163第5个结构域SRCR5双敲纯合子，即我们所需要的，通过测序(附图4)进一步得到验证；4、40、61、88号为杂合子，通过测序(附图4)进一步得到验证。

实施例6 CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞系CD163表达检测

1、在含10％胎牛血清DMEM培养液的6孔板中培养CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞或野生型细胞12h，PBS洗3遍，收集细胞，分别做qRT-PCR与Western-Blot检测。

2、结果如附图5所示：与野生型WT相比，基因编辑过的CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞系的CD163mRNA水平和蛋白水平没有显著性变化，提示本发明的基因编辑对CD163表达量无影响。

实施例7 HP-PRRSV不同感染时间CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞系抗病毒试验

1、qRT-PCR检测

(1)在含10％胎牛血清DMEM培养液的6孔板中培养CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞或野生型细胞至汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒HP-PRRSV，培养12、24、36、48、60、72h，PBS洗3遍，收集细胞，qRT-PCR检测。

(2)结果如附图6所示：即使PRRSV感染时间延长至72h，基因编辑过的87、4号单克隆细胞PRRSV N蛋白不表达，与WT相比，具有极显著差异。

2、Western blot检测

(1)在含10％胎牛血清DMEM培养液的6孔板中培养CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞或野生型细胞至汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒HP-PRRSV，培养12、24、36、48、60、72h，PBS洗3遍，0.25％胰酶消化，裂解细胞，测蛋白浓度，Western-Blot检测。

(2)结果如附图7所示：即使PRRSV感染时间延长至72h，基因编辑过的87、4号单克隆细胞PRRSV N蛋白不表达，与WT相比，具有极显著差异。杂合子88、40号单克隆细胞会感染PRRSV，与野生型相似。

3、免疫荧光检测

(1)在含10％胎牛血清DMEM培养液的6孔板中培养CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞或野生型细胞至汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒HP-PRRSV，培养12、24、36、48、60、72h，PBS洗3遍，收集细胞，免疫荧光检测。

结果如附图8所示：即使PRRSV感染时间延长至72h，基因编辑过的87、4号单克隆细胞PRRSV N蛋白不表达，与WT相比，具有极显著差异。杂合子88、40号单克隆细胞会感染PRRSV，与野生型相似。

4、病毒滴度TCID₅₀检测

(1)在含10％胎牛血清DMEM培养液的6孔板中培养CD163胞外域SRCR5敲除Marc-145细胞或野生型细胞至汇合度70％时，弃去培养液，PBS洗3次，以感染复数MOI＝1接毒HP-PRRSV，培养12、24、36、48、60、72h，收集细胞上清做病毒滴度TCID₅₀检测。

(2)结果如附图9所示：即使PRRSV感染时间延长至72h，基因编辑过的87、4号单克隆细胞PRRSV N蛋白不表达，与WT相比，具有极显著差异。特别是4号，效果更明显。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种抗蓝耳病Marc-145细胞系及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 315

<212> DNA

<213> Marc-145细胞CD163基因第7个外显子序列(CD163 gene exon)

<400> 1

cccacaggga acccagactg gttggaggag acattccctg ttctggacgc gttgaagtga 60

agcatggtga cacatggggc tccgtctgtg attcggattt ctctctggaa gctgccagcg 120

ttctatgcag ggaattacag tgtggcacag tcgtctctat cctgggggga gctcactttg 180

gagagggaaa tggacagatc tgggctgaag aattccagtg tgagggacat gagtcccatc 240

tttcactctg cccagtagca ccccgcccag aaggaacttg tagccacagc agggatgttg 300

gagtagtctg ctcaa 315

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 上游gRNA序列(forward gRNA)

<400> 2

caccgaacag agttatcatc gcctc 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 下游gRNA序列(reverse gRNA)

<400> 3

caccgctcat actgtgaaag ggatg 25

Claims (10)

1.一种抗蓝耳病毒Marc-145细胞系的构建方法，其特征在于，将Marc-145细胞系的CD163胞外域SRCR5敲除，得到抗蓝耳病毒Marc-145细胞系。

2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，是敲除PRRSV侵入Marc-145细胞必需的CD163受体胞外域SRCR5，而不是敲除整个CD163基因，CD163基因表达不受影响。

3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，是敲除Marc-145细胞系的CD163基因第7个外显子。

4. 根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，所述CD163基因第7个外显子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5. 根据权利要求3所述构建方法，其特征在于，剪切敲除Marc-145细胞系的CD163基因第7个外显子所用的gRNA序列如SEQ ID NO.2～3所示。

6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，利用CRISPR/CAS9基因编辑技术，筛选针对外显子7的上下游gRNA，共转染Marc-145细胞，通过双荧光筛选系统，获得CD163受体胞外第5个结构域SRCR5删除的Marc-145细胞系。

7.根据权利要求1～6任一所述方法构建得到的抗蓝耳病毒Marc-145细胞系。

8.权利要求7所述抗蓝耳病毒Marc-145细胞系在作为PRRSV病毒研究模型或在PRRSV病毒抗性猪的筛选与培育方面的应用。

9. 一种用于构建抗蓝耳病毒Marc-145细胞系的gRNA，其特征在于，其上下游序列分别如SEQ ID NO.2～3所示。

10.一种含有权利要求9所述gRNA序列的CRISPR/Cas9打靶载体。