CN104593331B

CN104593331B - 表达猪pCD163的细胞系、其制备方法及应用

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Publication number: CN104593331B
Application number: CN201510027577.6A
Authority: CN
Inventors: 杜以军; 王金宝; 丛晓燕; 陈蕾; 齐静; 孙文博; 吴家强; 陈智; 于江; 郭立辉; 任素芳
Original assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Current assignee: Institute Animal Science and Veterinary Medicine of Shandong AAS
Priority date: 2015-01-20
Filing date: 2015-01-20
Publication date: 2017-07-28
Anticipated expiration: 2035-01-20
Also published as: CN104593331A

Abstract

本发明涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪pCD163的细胞系，通过RT‑PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI‑neo中，构建真核表达质粒pCI‑pCD163，将真核表达质粒pCI‑pCD163转染MARC‑145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。所述的细胞系在临床分离PRRSV病毒和生产PRRSV疫苗中的应用。本发明构建的pCD163‑MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了PRRSV增殖率低的局限性；对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。

Description

表达猪pCD163的细胞系、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪pCD163的细胞系，还涉及此细胞系的制备方法及应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS），俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive andrespiratory syndrome virus, PRRSV）引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。现阶段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。

PRRSV表现出相当严格的细胞嗜性，PRRSV在感染猪体时，其主要的靶细胞为肺泡巨噬细胞（PAM），在体外培养时，则只能在CL2621、MARC-145等细胞中增殖。PAM非常容易感染PRRSV，但是PAM难于获得且只能原代培养，操作成本高昂，无法在PRRSV的疫苗生产中使用；MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但是存在着增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的局限性。

CD163是PRRSV细胞受体，可以单独介导PRRSV的吸附和内吞。研究发现，将 CD163分子导入PRRSV非易感细胞，使该细胞表达CD163蛋白后就能够感染并增殖PRRSV，成为PRRSV易感细胞。CD163在MARC-145细胞中的表达量很低，导致了MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低。

公开号为CN103525773A的中国发明专利申请，公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用。通过构建能够表达猪蓝耳病病毒受体硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重链Ⅱ A受体中的单个或多个的Marc145细胞或MA-104细胞，再利用该细胞接种猪蓝耳病病毒，收集病毒液，猪蓝耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可进一步用于蓝耳病疫苗生产。说明书中具体实施方式详细公开了细胞系的构建方法及病毒培养效价，构建过程中使用的载体为pIRES2-EGFP。利用能表达猪蓝耳病病毒受体细胞接种病毒，可连续收获病毒且收获病毒滴度提高2～5倍，而所制备疫苗的效力并没有降低，在不增加额外生产成本的基础上，使单位时间产能提高2～5倍。本发明人认为，上述效果还有进一步提升的空间。

发明内容

为了解决以上现有技术中pCD163在MARC-145细胞中的表达量低，导致了MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的问题，本发明提供了一种可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV的表达猪pCD163的细胞系pCD163-MARC。

本发明还提供了所述细胞系pCD163-MARC的制备方法。

本发明还提供了所述细胞系pCD163-MARC的应用。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种表达猪pCD163的细胞系，通过以下步骤得到的：

通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。

根据GenBank公布的pCD163的基因序列（GenBank No: HM991330）设计一对扩增pCD163受体基因序列的引物，序列如下：

pCD163-Fwd(XhoI): 5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，

pCD163-Rev(NotI): 5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。

所述的细胞系，优选RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，PCR反应体系为25 µL，含cDNA 1 µL，Mg²⁺ 1.5 mmoL/L，dNTP 200 µmoL/L，10×LA PCR Buffer 2.5 µL，pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)各400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2 U；

反应条件为：预变性95 °C 5 min；然后进行35个循环，循环条件为95 °C 45 s，61°C 45 s，72 °C 1 min；然后72 °C延伸10 min。

所述的细胞系在临床分离PRRSV和生产PRRSV疫苗中的应用。

所述的应用，优选将含有PRRSV的病料样品接种至所述的细胞系，盲传5代，出现明显CPE的为分离到病毒。

所述的应用，优选将所述的细胞系感染PRRS疫苗株，培养若干小时后收毒，用于疫苗的生产。

采集健康猪肺脏分离PAM（猪肺泡巨噬细胞），提取RNA，通过RT-PCR扩增获得pCD163基因。然后将该基因插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163。将该质粒转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选。采用有限稀释法获得单克隆细胞并扩大培养，IFA、Western blot鉴定获得的细胞系，通过pCD163-MARC与CN103525773A中的细胞系对PRRSV增殖的差异比较试验，证实pCD163-MARC细胞系增殖PRRSV的优势。

本发明所构建的pCD163-MARC细胞系比CN103525773A中公开的Marc-145/CD163细胞（以下简称对照细胞）对PRRSV增殖的滴度提高了10^0.6-0.7TCID₅₀，更适合于临床PRRSV的分离和疫苗生产。

本发明的有益效果是：

（1）本发明构建的pCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了以往MARC-145细胞系PRRSV增殖率低的局限性；

（2）通过病毒增殖实验证明，在相同的条件下，本发明构建的pCD163-MARC细胞系对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。

附图说明：

图1为从PAM细胞中扩增出的pCD163基因电泳图，其中1和2均为pCD163 RT-PCR产物，M为DL 15,000 DNA Marker，

图2为本发明重组真核表达质粒pCI-pCD163 XhoI/NotI双酶切鉴定图谱，其中1和3代表两个不同重组阳性质粒XhoI/NotI双酶切结果；2和4代表两个不同重组阳性质粒对照；M为DL 15,000 DNA Marker，

图3为间接免疫荧光（IFA）检测两种细胞中CD163蛋白的表达情况，其中左图为MARC-145细胞，右图为本发明构建的pCD163-MARC细胞系，

图4为Western blot检测两种细胞中CDl63蛋白的表达情况，其中1为MARC-145细胞中CD163蛋白的表达情况，2为本发明构建的pCD163-MARC细胞系中CD163蛋白的表达情况，下部分为β-actin内参，

图5为PRRSV经典株SD-1株(A)和高致病性毒株SD-JN株(B)感染pCD163-MARC细胞与CN103525773A中公开的Marc-145/CD163细胞（对照细胞）后分别取样，测定的一步生长曲线，

图6为PRRSV经典株SD-1株(A)和高致病性毒株SD-JN株(B)感染pCD163-MARC细胞与对照细胞后分别取样，Real-time PCR测定的PRRSV的RNA的量。

具体实施方式

1．表达pCD163的重组真核质粒pCI-pCD163的构建

1.1 引物设计

根据GenBank公布的pCD163的基因序列（GenBank No: HM991330）设计设计一对扩增pCD163受体基因序列的特异性引物pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)。在引物pCD163-Fwd(XhoI)的5’端引入XhoI酶切位点和Kozak序列，引物序列如下：

pCD163-Fwd(XhoI):5-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3

pCD163-Rev(NotI): 5-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3

两条引物pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)横跨pCD163整个蛋白编码区，预计扩增片段长度为3380 bp。

1.2 猪巨噬细胞的分离培养及总RNA的提取

采用肺气管冷PBS灌洗法分离获得猪肺泡巨噬细胞，将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS 30.0 mL从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，l–2 min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，4 °C 2000 rpm离心10min，收集沉淀。PBS洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的RPMI-1640营养液吹散细胞，置培养瓶中于37 °C、含CO₂5v%的培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非吸附细胞。继续用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液培养备用，用TRIzol试剂提取总RNA，作为RT-PCR的模板。

1.3 RT-PCR扩增

以RNA经反转录酶Oligo d(T)反转录后得到cDNA为模板， pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)为引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25 µL，含cDNA 1 µL，Mg²⁺ 1.5mmoL/L，dNTP 200 µmoL/L，10×LA PCR Buffer 2.5 µL，pCD163-Fwd(XhoI)和pCD163-Rev(NotI)各400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2 U。反应条件为：预变性95 °C 5 min；然后进行35个循环，循环条件为95 °C 45 s，61 °C 45 s，72 °C 1 min；然后72 °C延伸10 min，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收获得pCD163基因的PCR产物。结果见图1。

1.4 重组真核表达质粒的构建及鉴定

用XhoI/NotI双酶切pCD163基因的扩增产物，胶回收得到编码pCD163基因片段1，用XhoI/NotI双酶切真核表达质粒pCI-neo，胶回收得到载体基因片段2，将pCD163基因片段1和载体基因片段2连接，转化DH5α感受态细菌，37 °C过夜培养16 h，挑取菌落于氨苄青霉素抗性的LB培养基中37 °C过夜振荡培养，第二天提取质粒，进行XhoI/NotI双酶切鉴定。结果见图2。鉴定为阳性的质粒pCI-pCD163交由TaKaRa公司测序。用Vector NTI和DNAStar软件分析所插入的基因序列和推导氨基酸序列。

2．稳定表达pCD163的MARC-145细胞系pCD163-MARC的构建

2.1 MARC-145细胞G418耐受性测试

消化MARC-145细胞，用10%的胎牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到1×10⁴个细胞/mL，在12孔细胞板上每孔接种1 mL，于37 °C、含CO₂5v%的培养箱中培养。第二天按照下列浓度加G418进行耐受性测试：200、400、600、800、1000、1200和1400 µg/mL。保持各孔G418的浓度不变，每3天更换新鲜培养基。筛选到第7天时，引起细胞全部死亡的G418浓度作为MARC-145进行单克隆筛选的最佳药物作用浓度。本发明筛选的最佳G418作用浓度为600 µg/mL。

2.2 重组质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞

具体操作按Lipofectamine^TM 2000（Invitrogen）说明书进行。转染在6孔细胞板上进行，在转染的前一天，消化MARC-145细胞，用10%的胎牛血清DMEM（不含抗生素）稀释细胞，使其密度达到1×10⁴个细胞/mL，在6孔细胞板上每孔接种2.5 mL，于37 °C、含CO₂5v%的培养箱中培养。在灭菌的1.5 mL的离心管中先加入500 µL、37 °C预热的OPTI-MEM无血清培养基，然后加入1.0 µg的重组质粒pCI-pCD163，轻轻混匀；在另一个灭菌的1.5 mL的离心管中先加入500 µL、37 °C预热的OPTI-MEM无血清培养基，然后加入2.5 µL Lipofectamine^TM2000转染试剂，轻轻混匀，在室温放置5 min；然后将两个1.5 mL的离心管中的液体混匀在一起，室温放置20 min；从CO₂培养箱中取出细胞板，弃去上清，把液体混合物轻轻加入到细胞面上，然后立即把细胞板放入CO₂培养箱中；温育6 h后，吸掉上清，轻轻加入2.0 mL 37 °C预热的含10%的胎牛血清DMEM，放入CO₂培养箱继续培养。同时设未转染的MARC-145细胞对照。

2.3 pCD163-MARC细胞系的筛选

转染24小时后，在培养基中加入600 µg/mL G418，每3天更换新鲜培养基。筛选到第7天时，对照未转染的MARC-145细胞全部死亡，转染pCI-pCD163的MARC-145细胞出现存活的抗性细胞克隆。挑取单克隆抗性细胞并扩大培养，长成单层后消化细胞制备细胞悬液，测定细胞数量，有限稀释法稀释细胞，接种96孔细胞培养板，使得每个孔细胞数量为1–2个，于37 °C、含CO₂5v%的培养箱中培养，每3天更换一次新鲜的600 µg/mL G418的生长液。长成单层后消化细胞再进行亚克隆，如此进行3次细胞亚克隆。然后将得到的单克隆细胞株扩大培养，进行鉴定。

3． pCD163-MARC细胞系的鉴定

3.1 IFA鉴定

分别将筛选到的pCD163-MARC细胞和对照MARC-145细胞铺入含有载玻片的24孔板，于37 °C、含CO₂5v%的培养箱中培养30 h。30 h后，加入与原培养液等体积的预冷PBS洗涤细胞3次，后用预冷的4%多聚甲醛固定，4 °C作用45 min，PBS洗涤3次，每次5min；加入0.2% TritonX-100通透15 min；然后取出载玻片，加入1:600稀释的小鼠抗pCD163的单克隆抗体，37 °C作用45 min，PBS洗3次，每次5 min；加入1:600稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG(H+L)的二抗，37 °C孵育45 min，PBS洗涤3次，每次5 min；然后将载玻片置于含有60%甘油、0.1%叠氮钠的PBS的长的载玻片上，用指甲油封边。于荧光显微镜下观察，记录结果。结果见图3。筛选到的pCD163-MARC细胞系呈现较亮的绿色荧光，而对照MARC-145细胞荧光较淡，说明pCD163蛋白在pCD163-MARC细胞系的表达量明显高于对照MARC-145细胞。

3.2 Western blot鉴定

分别将筛选到的pCD163-MARC细胞和对照MARC-145细胞铺入6孔板，于37 °C、含CO₂5v%的培养箱中培养30 h。30 h后弃去培养液，加入与原培养液等体积的预冷PBS洗涤细胞2次，将6孔板置于冰上，加入细胞裂解液裂解细胞30 min后，4 °C 12000 rpm离心10min。取上清液与上样缓冲液混合后煮沸10分钟。将制得的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳后，参照Bio-Rad公司半干转印仪操作说明进行电转印，然后进行免疫检测。将丽春红染色后的NC膜转移至封闭液中，室温轻摇1 h后4 °C封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液TBST洗膜5次，每次5 min，然后加入1:5000稀释的小鼠抗pCD163的单克隆抗体，室温下振荡1 h；再用TBST洗膜5次，每次5 min，然后加入以封闭液1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，室温振荡1 h；再用TBST洗膜5次，每次5 min，最后用化学发光显色试剂盒（Supersignal^® West Pico TrialKit）进行显色，在X胶片上曝光、显影和定影观察。

试验同时设立β-actin对照，一抗为β-actin单克隆抗体（Santa Cruz公司），二抗为1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP。

检测检测结果见图4，从图中可以看到，pCD163得到了正确的表达，分子量约120kD。本发明的pCD163-MARC细胞系中pCD163蛋白表达量明显高于对照MARC-145细胞。经过Bio-Rad ChemiDoc XRS System分析， pCD163-MARC细胞系中pCD163蛋白表达量约为对照MARC-145细胞中CD163蛋白表达量的8.7倍。将筛选到的pCD163-MARC细胞系传至20代，通过检测发现均可稳定高效表达pCD163，各代次之间表达量无差异。

3.3 pCD163-MARC和对照细胞增殖PRRSV的生长曲线测定

将pCD163-MARC细胞与对照细胞同时感染1MOI的PRRSV经典株SD-1株（GenBankNo: AY747596）和高致病性毒株SD-JN株（GenBank No: FJ422123），分别于24 h、48 h、72h、96 h和120 h取样，测定TCID₅₀，绘制两株病毒的一步生长曲线。检测结果见图5(A)和(B)，两株病毒生长曲线趋势相似，在96 h，在pCD163-MARC细胞的滴度最高分别为1×10^8.6TCID₅₀/mL和1×10^8.3TCID₅₀/mL，在对照细胞的滴度最高分别为1×10^8.0TCID₅₀/mL和1×10^7.7TCID₅₀/mL，pCD163-MARC细胞对两株病毒的滴度相比较于对照细胞，有明显提高。

3.4 pCD163-MARC和对照细胞增殖PRRSV的RNA测定

将上述24 h、48 h、72 h、96 h和120 h取的样品，用TRIzol试剂提取病毒RNA，以oligo d(T)_12-18为引物进行反转录后的cDNA作为SYBR Green Real-time PCR的模板，测定样品中的PRRSV的RNA。

SYBR Green Real-time PCR的引物序列为：

上游引物N-Fwd: 5’-AATAACAACGGCAAGCAGCAG-3’，

下游引物N-Rev: 5’-CCTCTGGACTGGTTTTGTTGG-3’。

反应条件为：预变性95 °C 2 min；然后进行40个循环，循环条件为95 °C 15 s，61°C 1 min。结果见图6(A)和(B)，pCD163-MARC细胞增殖的经典株SD-1株和高致病性毒株SD-JN株PRRSV的RNA明显高于对照细胞。

4． pCD163-MARC细胞系的应用

4.1 临床样品PRRSV的分离

将本实验室2012.06-2014.06临床上RT-PCR检测阳性的PRRSV病料样品120份同时接种pCD163-MARC细胞与对照细胞，盲传5代，出现明显CPE的判为分离到病毒，分离率分别为100%和85%，pCD163-MARC细胞明显提高了PRRSV分离率，更适合于临床PRRSV的分离。

4.2 PRRS疫苗毒的初步生产

将pCD163-MARC细胞与MARC-145细胞扩大至转瓶培养，同时感染1MOI的广东大华农动物保健品股份有限公司生产的PRRS疫苗JXA1-R株，96 h收毒，在pCD163-MARC细胞的滴度为1×10^8.5TCID₅₀/mL，在对照细胞的滴度为1×10^7.8TCID₅₀/mL。pCD163-MARC细胞较对照细胞有更强的PRRS疫苗JXA1-R株的增殖能力，可以初步应用于PRRS疫苗毒的生产。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种表达猪pCD163的细胞系，其特征是通过以下步骤得到的：

通过RT-PCR扩增获得pCD163受体基因，将其插入真核表达载体pCI-neo中，构建真核表达质粒pCI-pCD163，将真核表达质粒pCI-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得;

RT-PCR扩增获得pCD163受体基因中使用的引物序列如下：

pCD163-Fwd:5’-ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，

pCD163-Rev: 5’-ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。

2.根据权利要求1所述的细胞系，其特征在于RT-PCR扩增获得pCD163受体基因中PCR反应体系为25 µL，含cDNA 1 µL，Mg²⁺ 1.5 mmoL/L，dNTP 200 µmoL/L，10×LA PCR Buffer2.5 µL，pCD163-Fwd和pCD163-Rev各400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2 U；

反应条件为：预变性95 ℃5 min；然后进行35个循环，循环条件为95℃ 45 s，61 ℃ 45s，72 ℃ 1 min；然后72 ℃延伸10 min。

3.一种权利要求1或2所述的细胞系在临床分离PRRSV病毒和生产PRRSV疫苗中的应用，其特征在于将含有PRRSV的病料样品接种至所述的细胞系，盲传5代，出现明显CPE的为分离到病毒。