CN113980912B - 可复制ibv病毒qx亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用 - Google Patents

可复制ibv病毒qx亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株IBV病毒QX亚型毒株，并公开可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用，挑选多株传代细胞系进行IBV病毒的感染，检测IBV病毒的复制载量和滴度，初步筛选能复制IBV病毒的细胞系；对所筛选出的细胞系利用siRNA干扰方法和/或基因敲除方法，干扰和/或敲除抑制病毒复制的相关基因，筛选得到使病毒大量复制的稳定传代细胞系。本发明构建一株敲除miRNA生成过程中相关酶的稳定传代细胞系可以极显著提高传染性支气管炎病毒QX亚型的复制量。该基因敲除的细胞系有望开发成为替代传统鸡胚繁毒的工具细胞系，应用细胞系繁殖的家禽病毒纯度高，杂质少，纯化简便且可以显著降低病毒的繁殖成本。

Description

可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法 和应用
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域，具体涉及可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用。
背景技术
鸡传染性支气管炎是由传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性传染病。该病广泛流行于世界，给养鸡业带来了巨大的经济损失。鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)属于冠状病毒科，γ-冠状病毒属，是影响世界养鸡业的主要病原之一。IBV为单股正链RNA病毒，基因组全长27.6kb左右，至少有10个开放阅读框(ORF)，编码小膜蛋白(E)、膜蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)和纤突蛋白(S)4种主要结构蛋白。
IBV主要侵害家禽呼吸系统、消化系统及泌尿生殖系统，临床上对蛋鸡的危害最为严重。低于2周龄的鸡感染IBV后可能引起输卵管永久损伤，从而导致产蛋能力下降或丧失产蛋能力。9-18周龄的蛋鸡感染IBV会引起产蛋率显著下降(高达50％)，持续8周以上，常出现软壳畸形蛋，蛋清呈水样。IBV爆发后相当长的一段时间鸡蛋质量低且蛋壳不平整，对养殖户造成巨大损失。IBV主要通过呼吸道感染，除蛋鸡外，不同品种、性别及日龄的鸡都对IBV易感，且死亡率较高。近年来的流行病学调查结果显示目前我国主要流行的鸡传染性支气管炎病毒为QX和M41亚型，其中IBV(QX)亚型占比超过60％，流行范围最为广泛。
目前，IBV疫苗免疫保护效果并不理想，原因主要有两点：其一，IBV基因组的RNA酶缺乏严密的校正功能，所以该病毒极易发生突变。其二，该病毒的基因型、血清型复杂，不同血清型之间无交叉反应或交叉反应很小，所以IBV在全球范围内存在广泛流行，影响养禽业发展。其三，鸡传染性支气管炎病毒QX亚型缺少细胞系，造成病毒相关研究滞后，影响疫苗研发。IBV目前仍旧采用传统的体外培养，即鸡胚和气管环。从鸡胚中收获尿囊液不仅消耗大量的鸡胚，而且含有大量杂蛋白，且纯化方式繁杂。目前已有报道采用传代细胞系如Vero细胞系来培养IBV，但仅适用于极少数弱毒株的繁殖，且获得的病毒滴度较低。目前国内和国际上广泛流行的鸡传染性支气管炎主要为QX亚型。因为缺乏该亚型的复制细胞系，使得目前国际和国内仍主要通过鸡胚来繁殖该毒，也因此使得鸡传染性支气管炎QX亚型的反向遗传学以及细胞机制的相关研究滞后。
因此，急需开发和筛选一株可以使鸡传染性支气管炎QX亚型毒株复制增殖，且可以获得较高毒价的传代细胞系。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一株IBV病毒QX亚型毒株。
本发明还要解决的技术问题是提供了可使得鸡传染性支气管炎病毒QX亚型复制的细胞系，并通过基因工程技术对该细胞进行编辑，筛选出可显著提高病毒复制量且稳定传代的细胞系，从而降低病毒的繁育成本。
本发明还要解决的技术问题是提供了该细胞系在传染性支气管炎QX亚型毒株复制增殖中的应用。
本发明还要解决的技术间题是提供了该细胞系在制备传染性支气管炎病毒QX亚型疫苗中的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一株IBV病毒QX亚型毒株，所述IBV病毒QX亚型毒株于2021年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202172。
本发明内容还包括可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系的构建方法，包括以下步骤：
1)挑选多株传代细胞系进行IBV病毒的感染，检测IBV病毒的复制载量和滴度，初步筛选能复制IBV病毒的细胞系；
2)对步骤1)所筛选出的细胞系利用siRNA干扰方法和/或基因敲除方法，干扰和/或敲除抑制病毒复制的相关基因，筛选得到使病毒大量复制的稳定传代细胞系。
其中，所述步骤1)中的多株传代细胞系包括DF-1细胞、HEK293T细胞、Vero细胞、AGS细胞、NCI-N87细胞和MGC803细胞中的一种或几种。
其中，所述步骤1)中的复制载量达到1×103～1×105。
其中，所述步骤2)中的细胞系为NCI-N87细胞。
其中，所述步骤2)中的抑制病毒复制的相关基因为Ago2，Ago4、Dicer1、Dicer2、Avid或Exportin5中的一种或几种。
其中，所述步骤2)中siRNA如下表所示：
siRNA 序列
si-Ago2 TGACAATCGTTTCTCTTCA
si-Ago4 GGAGAACAATCAAACTGCA
si-Dicer1 CCTGCTGAGTTAGAAGAAA
si-Dicer2 GTCCAAGAGTTACTATCAA
si-Avid GGAAGAATCAGCCTCGCAACA
si-Exportin5 CTACTGCAGCTTGTCCTTA
。
其中，所述步骤2)中通过RT-qPCR的方法进行筛选。
进一步地，本发明首先是通过动物实验以检测病毒的组织嗜性：将IBV病毒QX亚型毒株对2周龄大的白羽鸡进行滴鼻接毒，然后分别采集了不同时间点肺脏、脾脏、肾脏以及腺胃的组织样品，采用荧光定量PCR的方法来检测病毒的含量；
其次，对所筛选的组织挑选多株传代细胞系进行病毒的感染：分别挑选出相对应组织的传代细胞系依次为DF-1(鸡的成纤维细胞)，HEK293T，Vero细胞以及3株人源细胞系AGS、NCI-N87和MGC803(全部购自ATCC细胞库)；再其次，通过荧光定量PCR以及空斑等实验检测病毒的复制载量和滴度，从而初步筛选可以复制传染性支气管炎病毒的细胞系；
最后，对所筛选出的细胞系使用siRNA以及CRISPR Cas9基因敲除技术，敲除宿主抑制病毒复制的相关基因，并通过抗性筛选得到可使病毒大量复制的稳定传代细胞系：先通过siRNA方法，分别干扰DF-1和NCI-N87细胞内(Ago2，Ago4)，(Dicer1，Dicer2，Avid)和exportin5等3类基因，然后通过RT-qPCR的方法挑选出可以影响病毒复制的基因；然后将含有该基因的CRISPR Cas9质粒转染至细胞，从而获得敲除该基因且可稳定传代的细胞系。
进一步地，本发明的细胞系的构建方法具体包括以下步骤：
步骤1：探究病毒对鸡的组织嗜性；将鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株通过滴鼻方式接种给鸡，并分别采取不同时间点的气管、脾脏、肾脏以及腺胃的组织样品，收集RNA及蛋白等样品检测病毒含量，并挑选出易感染病毒的器官；
步骤2：根据步骤1挑选几株传代细胞系进行病毒的接种培养；筛选病毒可以复制的细胞系；
步骤3：对于步骤2筛选出使病毒复制的细胞系通过RNAi的方法进行基因干扰，并筛选干扰后可促进病毒大量复制的宿主基因；
步骤4：在步骤2筛选出的病毒复制细胞系对步骤3筛选的传染性支气管炎QX亚型病毒复制的相关基因进行敲除，并通过抗性筛选挑取可使病毒大量复制的基因敲除单克隆细胞系，并将其传代后冻存。
进一步地，所述步骤2的传代细胞系包括DF-1(鸡的成纤维细胞)，HEK293T，Vero细胞以及人的3株胃癌细胞系AGS、NCI-N87和MGC803。将细胞复苏后，待细胞密度在80％左右进行病毒接种，并置于细胞培养箱孵育2h，然后洗掉未感染的病毒并加入病毒维持液继续培养，分别收集12h、24h、36h、48h以及60h的RNA及其蛋白样品，并通过RT-qPCR及免疫印迹试验来检测不同时间点的病毒的复制量；
进一步地，所述步骤2的传代细胞系复苏与传代的方法如下：将冻存于液氮中的细胞迅速取出，并置于37℃水浴锅中不停搅拌，直至细胞冻存液完全融化。将细胞冻存液转移至离心管内，并加入约5倍体积的细胞培养基，离心1600rpm，10min。弃掉上清，加入完全培养基并转移至细胞培养瓶，置于细胞培养箱内培养。细胞经3次传代以上，待细胞倍增速率稳定后，用于病毒的接种或者细胞的传代。
进一步地，所述步骤3中的基因干扰方法为RNAi基因干扰术，其操作方法如下：将设计好的小干扰RNA片段(siRNA)分别干扰DF-1和NCI-N87细胞内(Ago2，Ago4)，(Dicer1，Dicer2，Avid)和exportin5等3类基因分别转染到细胞中，干扰24小时后如步骤2的方式接种Qx亚型病毒并置于细胞培养箱孵育2h，然后洗掉未感染的病毒并加入病毒维持液继续培养；分别收集感染后6h、12h、24h、36h以及48h的RNA及其24h和48h的蛋白样品，并通过RT-qPCR及免疫印迹试验来检测不同时间点的病毒的复制量。
进一步地，所述步骤2和步骤3的病毒接种量为5×106PFU/mL。
进一步地，所述步骤2和步骤3的细胞培养箱含5％二氧化碳，温度为36℃～42℃。
进一步地，所述的传染性支气管炎病毒为一株新型IBV(QX株)，由本实验室分段扩增得到全序列，并经上海生物工程公司测序(见序列表)。该序列与National Center forBiotechnology Information数据库中现有的IBV序列比对后，同源性为92％～97％，与之最相近的为ck/CH/LJS/101109毒株，同源性为96.56％。
进一步地，所述步骤4中的基因敲除方法为CRISPR Cas9基因敲除技术，其操作方法如下：将构建好的质粒用罗氏试剂转染进入细胞内，并用含有嘌呤霉素的完全基培养。然后筛选出可稳定表达该质粒的细胞，经过连续传代后冻存。
进一步地，所述步骤4中的细胞筛选的方法如下：先将细胞置于细胞培养皿内培养，将经嘌呤霉素筛选出的细胞群用0.25％的胰酶消化下来，并转移至24孔板内继续培养，待其长满后，并依次转移至12及6孔板内培养，最后转移至细胞瓶中，待其长满后进行传代。
进一步地，所述的传代细胞系培养基为1640(上海源培公司)；血清为澳洲胎牛血清(Sigma)。
本发明内容还包括所述的构建方法构建获得的可复制IBV病毒QX亚型的基因敲除细胞系。
本发明内容还包括所述的细胞系在传染性支气管炎病毒复制增殖中的应用，特别是IBV病毒QX亚型毒株中的应用。
本发明内容还包括所述的细胞系在制备传染性支气管炎病毒疫苗中的应用。特别是IBV病毒QX亚型毒株中的应用。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：
1、本发明所筛选的细胞系是目前国内外首次报道的第一株鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株可以复制的人源细胞系NCI-N87，本发明通过RNAi方法干扰细胞系中影响病毒复制的基因后，鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株的病毒复制水平提升10倍到1000倍不等。本发明还通过CRISPR-Cas9技术敲除人源细胞系NCI-N87中的Dicer，Ago2，和Ago4，筛选出稳定敲除上述基因的细胞系NCI-N87-Dicer，NCI-N87-Ago2和NCI-N87-Ago4，经过荧光定量和免疫印迹试验验证敲除细胞系中鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株的复制水平。
2、本发明相对于现有病毒繁殖技术，使用改造的传代细胞系来培养鸡的传染性支气管炎病毒，利用了细胞对病毒的适应性强，可极显著提高病毒的滴度，并且可以大规模培养，具有广阔的市场应用前景和巨大的社会效益与价值。此外本发明所涉及的病毒为国内流行株，使用改造后的细胞系可显著提高病毒复制量，且操作简单，培养周期短，可以大幅度降低病毒的培育成本。本发明的细胞系既可以加速鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株的相关机制研究，也可以为临床上生产鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株疫苗提供新的细胞毒疫苗奠定基础。
附图说明
图1为鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株鸡体内组织嗜性；
图2为鸡传染性支气管炎病毒QX亚型毒株在不同细胞内的复制量；
图3为NCI-N87细胞复制相关基因干扰效率检测；
图4为NCI-N87细胞不同基因干扰后对病毒复制量的影响；
图5为NCI-N87细胞基因敲除后对病毒复制量的影响；
图6为NCI-N87细胞Ago2基因敲除病毒噬菌斑的检测；
图7为CRISPR-Cas9质粒图谱。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1鸡传染性支气管炎Qx亚型病毒的分离与获得
鸡传染性支气管炎病毒为一株新型IBV(Qx株)。鸡传染性支气管炎病毒由南京农业大学动物医学院病理教研组从送检的黄羽及白羽病死鸡中取鸡气管、肝脏、脾脏、肠道、肺脏和胰腺混合样匀浆取上清，尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚后收集尿囊液后经RT-PCR，并将PCR产物(S1基因)回收，送测序公司测序，该序列与National Center for BiotechnologyInformation数据库中现有的IBV序列比对，所分离到的IBV属于QX型。然后由本实验室分段扩增得到全序列，并经上海生物工程公司测序(见序列表)。该序列与National Cemer forBiotechnology Information数据库中现有的IBV序列比对后，同源性为92％～97％，与之最相近的为ck/CH/LJS/101109毒株，同源性为96.56％；后将该分离的鸡传染性支气管炎QX亚型毒株于2021年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：V202172，其分类命名为鸡传染性支气管炎病毒IBV-NJ18112002952。
实施例2保藏编号为CCTCC NO：V202172的病毒对于鸡的组织嗜性的差别
病毒接种与分离：选取2周龄大的SPF级别的白羽鸡，给鸡进行鸡传染性支气管炎QX亚型病毒(保藏编号为CCTCC NO：V202172)滴鼻，病毒的EID50＝10-5.8/0.1ml，同时设置阴性对照组；并依次采取1h、4h、12h及24h时间点的气管、脾脏、肾脏以及腺胃等组织样品。用含2％青-链霉素混合抗生素的PBS溶液洗涤组织，然后取同等重量的组织置于研磨管内，加入Trizol并置于匀浆机内充分研磨。将研磨液转移至离心管，加入氯仿后充分混匀并离心；吸取上清并加入等体积的异丙醇，混匀过夜沉淀RNA；次日离心并用75％的乙醇洗涤杂质，最后获取RNA。
保藏编号为CCTCC NO：V202172的病毒复制量的测定：本实验采用RT-qPCR的方法检测病毒的载量。将RNA经反转录获得cDNA，采用qPCR试剂盒(诺唯赞公司)进行相对定量的检测，qPCR扩增体系如表1，条件如表2所示。然后经GraphPad软件绘制柱形图，并分析不同组织间病毒复制量的差异。数据采用单因子方差(One-Way ANOVA)或者t检验(Studem’s t-tests)分析进行差异显著性检验。鸡传染性支气管炎QX亚型病毒在肾脏及脾脏中复制载量很低；24h可在在腺胃及气管中检测到大量病毒，且病毒在腺胃中随时间增加可持续复制(图1)。
表1 qPCR体系
表2 qPCR条件
实施例3保藏编号为CCTCC NO：V202172的病毒在不同细胞复制量的筛选
细胞的筛选：根据鸡传染性支气管炎QX亚型病毒的组织嗜性不同，共筛选出与之对应的几株传代细胞系，分别为DF-1(鸡的成纤维细胞)，HEK293T，Vero细胞以及人的3株胃癌细胞系AGS、NCI-N87和MGC803(全部购自ATCC细胞库)。将所有的细胞复苏与传代，直至细胞倍增速率稳定后，分别用0.05％及0.25％的胰酶消化下来，铺至12孔板内，待细胞密度为70％-80％时，换用不含血清的培养基，每孔滴加5×104PFU/mL的病毒，置于细胞培养箱与细胞共同孵育2h，并设置阴性对照。用不含血清的培养基洗涤3次，加入含2％血清及2％青-链霉素抗生素病毒维持液继续培养。依次收集6h、12h、24h、36h、48h及60h时间点的细胞RNA样品，并进行RT-qPCR，条件及体系同实施例2。采用相对定量的方法比较不同细胞间以及相同细胞间不同时间点病毒的复制差异。QX亚型病毒在HEK293T，Vero细胞以及人的2株胃癌细胞系AGS和MGC803中只能检测到微量的病毒；在DF-1细胞中36h可检测到1×103的病毒载量，但随着时间增加，病毒载量逐渐减少；但在NCI-N87细胞中，随着感染时间的增加，病毒持续存在，且病毒载量可达到1×105左右(图2)。
敲除基因的筛选：本发明首先选用siRNA干扰的方法来敲低可能与病毒复制的3类基因：(Ago2，Ago4)，(Dicer1，Dicer2，Avid)以及Exportin5。siRNA干扰试剂盒由上海生工公司合成，序列见表3。首先在离心管内先用60μL的转染缓冲液将2.5μL的siRNA稀释，然后加入6μL的转染试剂(Roche公司)，轻柔吹打混匀制备成终浓度为50nM的转染复合物，并与室温孵育15min；而后将转染复合物加入提前铺好的无双抗的含10％血清及2％青-链霉素的1640完全培养基的12孔板内，孔板内的细胞密度应为30％-50％；最后将细胞板摇晃均匀后置于37℃的5％CO2的培养箱中培养48h。用Trizol法提取细胞内的总RNA，采用RT-qPCR的方法检测细胞内相应基因沉默的效果，条件及体系同实施例2。与对照组相比，上述3类基因在转染了siRNA均极显著的下调(P＜0.0001)(图3)。
表3 siRNA序列
siRNA名称 序列
si-Ago2 TGACAATCGTTTCTCTTCA
si-Ago4 GGAGAACAATCAAACTGCA
si-Dicer1 CCTGCTGAGTTAGAAGAAA
si-Dicer2 GTCCAAGAGTTACTATCAA
si-Avid GGAAGAATCAGCCTCGCAACA
si-Exportin5 CTACTGCAGCTTGTCCTTA
实施例3 NCI-N87细胞的培养与基因编辑及其复制病毒载量的提升
1、细胞的培养与传代：人的胃癌上皮细胞系NCI-N87，其细胞密度对生长速率起着重大作用，因此冻存细胞时必须选取代数较年轻且完全铺满整瓶的细胞。将冻存于液氮中的细胞迅速取出，于37℃水浴锅中快速搅拌，直至细胞完全融化；将细胞转移至15mL离心管内，缓慢加入5倍体积的培养基并轻柔吹打混匀，1650rpm，10min离心；弃去上清，加入3mL的含10％血清及2％青-链霉素的1640完全培养基，轻柔吹打混匀，转移至细胞瓶内，将体积定容至5mL，十字法摇晃混匀后置于培养箱内培养。每天观察细胞的生长状态并及时更换培养基，直至细胞完全铺满细胞瓶底部可进行传代。传代时先将细胞瓶内培养基弃掉；用1640培养基清洗细胞瓶；加入0.25％胰酶并置于细胞培养箱内消化5min；迅速弃去大部分胰酶，用剩余胰酶在室温继续消化2min，并轻轻拍打细胞瓶直至细胞脱落；加入完全培养基终止消化，并充分吹打细胞瓶，直至瓶底没有细胞黏附；将细胞液进行传代，直至细胞生长倍速稳定后，可用于后续实验。
2、基因编辑细胞的筛选：胃癌细胞基因的沉默共分为siRNA基因干扰对病毒复制量的影响的探究和获取经CRISPR Cas9基因敲除后的稳定传代细胞系两部分。
步骤1)如实施例2所述方法将合成的Ago2，Ago4，Dicer1，Dicer2，Avid以及Exportin5的siRNA(参见表3)转染至铺有NCI-N87细胞的12孔板内；24h后更换不含血清的培养基，每孔加入5×104PFU/mL的鸡传染性支气管炎QX亚型病毒(保藏编号为CCTCC NO：V202172)在细胞培养箱内共孵育2h；用1640培养基洗涤3次，加入含2％血清和2％青-链霉素抗生素病毒维持液；用Trizol法分别收集6h、12h、24h、36h、48h及60h的接了鸡传染性支气管炎QX亚型病毒(保藏编号为CCTCC NO：V202172)的细胞RNA样品，通过RT-qPCR的方法检测和比较不同时间点基因沉默后病毒的复制量，条件及体系同实施例2。结果表明本发明所选3类siRNA基因沉默后均可提高病毒的复制量，其中Dicer1和Ago2干扰组可使QX亚型病毒载量提高100～300倍(图4)。
步骤2)如步骤1，本实验分别选取了含Dicer1和Ago2的Cas9质粒(Addgene公司合成，货号分别为68807和73530)(图7)，质粒上带有嘌呤霉素抗性基因。首先要确定适宜NCI-N87细胞生长的嘌呤霉素浓度，本实验先将NCI-N87细胞分别铺于直径为60mm的细胞培养皿内，待细胞长至80％左右依次加入0.5μg/mL、0.8μg/mL、2μg/mL、6.3μg/mL浓度嘌呤霉素来进行筛选浓度的测试；杀死全部细胞的时间分别为0.5μg/mL 6天、0.8μg/mL 5天、2μg/mL 2天、6.3μg/mL1天，重复实验3次，最终选择0.5μg/mL作为筛选浓度。然后进行基因敲除操作，1000ng的含Dicer1和Ago2的Cas9质粒分别转染进细胞；48h后加入含0.5μg/mL嘌呤霉素的含10％血清及2％青-链霉素的1640完全培养基进行筛选；72h后，将存活下来的细胞传代到新的细胞培养皿，等待细胞贴壁后进行第2次嘌呤霉素筛选，以去除假阳性；24h后，给细胞换液并加入含0.25μg/mL嘌呤霉素的完全培养基继续培养；将筛选下来的少量细胞消化至12孔板培养，待其长满后依次消化至6孔板以及细胞培养瓶中；分别得到N87-Dicer1细胞、N87-Ago2细胞；最终将细胞瓶内长满的细胞消化并冻存。
病毒复制的检测：分别将上述改造过的NCI-N87细胞(N87-Dicer1细胞和N87-Ago2细胞)，首先均匀铺至12孔板内，并加入鸡传染性支气管炎QX亚型病毒(保藏编号为CCTCCNO：V202172)共同孵育，每孔加入5×104PFU/mL，用Trizol法分别收集12h、24h、36h及48h的RNA样品，通过RT-qPCR的方法检测和比较不同时间点病毒的复制量，条件及体系同实施例2。除此以外，本实验还用蛋白裂解液收集了细胞的蛋白样品，通过免疫印迹试验的方法来检测细胞内Dicer1和Ago2蛋白的敲除效率以及基因敲除后对病毒复制情况的影响。与对照组相比，敲除后的细胞从24h可以检测到大量的病毒，且随着时间的增加，病毒可以稳定存在；病毒的相对载量也提高了200～400倍(图5)。
鸡传染性支气管炎QX亚型病毒滴度的测定：本发明采用病毒噬菌斑的方法来测定该病毒的滴度(原始浓度为5×104PFU/mL)。将步骤二得到的N87-Ago2细胞培养收集稀释100倍的病毒原液，以及稀释103、104、105及106加入铺有细胞的12孔板，共同孵育2h后加入提取配好的0.9％低熔点琼脂糖与病毒维持液(4％血清，2％青-链霉素抗生素)等体积配比的混合溶液，待其凝固后，倒置于细胞培养箱培养，并观察空斑的形成情况。用多聚甲醛固定，并经结晶紫染色后对空斑进行数量统计。QX亚型病毒感染细胞后，随着病毒浓度的增高，病毒蚀斑逐渐增多，最终计算病毒滴度为1.5×106PFU/mL(图6)。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系及其构建方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27689
<212> DNA
<213> 鸡传染性支气管炎QX亚型病毒(Infectious bronchitis virus)
<400> 1
actgaaaata gatattatta tatatctatt acactagcct tgcgctagat ttccaactta 60
acaaaacgga cttaaatacc tacagctggt ccttctaggt gttccattgc agtgcacttt 120
agtgccctgg atggcacctg gccacctgtc aggttttagt tattaaataa tattgttgct 180
agtatcactg cttgttttgt tgtgtctcac tttattacat ccgttgcttg ggctacctag 240
tgccagcgtc ctgcaggcgc cgtggtcggt tcgagtgcga agaacctctg gttcatctag 300
cggtacgcgg gtgtgtggaa gtagcacttc agaggtacgt tctgttgtgt gaaacacggg 360
gtcacctccc cccacattcc tctaagggct tttgagccta gcgttgggct acgttctcgc 420
acaaggtcgg ctatacgacg gttgtagggg gtagtgccga acaacccctg aggtgacagg 480
ttctggtggt gtttagtgag cagacataca atagacagtg acaacatggc ttcaagccta 540
aaacagggag catcttccca aaaccagagg agtgtcgttc ttgttaccaa agacattccc 600
gaccaactct gtgacgcttt gtttttctat acgtcacaca atccaaaaga ttacgctgat 660
gctttcgcct ttaggcagaa gttcgaccgt agtctcggtg ctgggaaaca gtttaaattt 720
gaaactgttt gtggtccatt cttcttgaag ggagtggata aaataacacc aggagtccca 780
gccaaagtta taaaagccac ttcaaagttg gctgacttag aagacatctt tggtgtctca 840
cctcttgcac ggaaataccg tgaacttttg aaaacagcat gccattggtc tctcactgta 900
gaagcgctgg atgctcgtgc acaaactctt gacgaaatct ttgaaccaac tgaaatattt 960
tggcttcaag tggctgcaaa ggttcaggtt tcagccatgg caatgcgcag acttgttggt 1020
gaggttactg caaaagtcat ggattcactt ggctcaaatt tgagcgctct gttccaagtt 1080
gttaaggaaa caatggccag aatctttcaa aaggctctgg ccatttttga gagtgtgagt 1140
gaattgccac aacgtattgc tgcacttaag atggcttttg ccaagtgtgc aagattaatt 1200
acagttgtgg ttgttggaca tgccctcact attagagagt tttctggaac ttgtcttgca 1260
agcattaatg gtgcagttgc aaaatccttt gaagaacttc caacaggctt tatgggcgct 1320
aaggtctttt caactcttgc cttctttaaa gaagcagcag taaagattgt agaaaatata 1380
ccaaatgcgc caagaggtac taaaggtttt gaagtcgttg gcaatgccaa aggtacacaa 1440
gttgttgtcc gtggcatgcg aagcgactta actttgcttg accaaaaagc tgaagttcct 1500
gtggaatcag aaggttggtc tgcaatcttg gagggacatc tttgctatgt ctttaagagt 1560
ggtgatcgct tttatgcggc acctctttca ggaaattttg cattgcatga tgtgcattgc 1620
tgcgagcgtg tagtctgtct gtctgatggt gtaacaccgg agataaatga tgggcttgtt 1680
cttgctgcaa tttactcatc ttttagtgtt tcggaacttg tggcagcact taaaaaaggt 1740
gaaccattca agttcttggg gcacaaattt gtttatgcga aggaagcggc agtttctttc 1800
accttggcaa aagcagcaac cattggagat gtcctgaagc tgtttcaatc agcaagagta 1860
aagacgaagg atgtgtggtc tgcacttact gaacagtctt ttgaattctg gaaacttgcg 1920
tacaatagag tgcgcaatct tgaagaagtt ctgaagactc atttttgtaa agctcaaatg 1980
tcagttgtga tcctagcagt agtgcttggt gagggcattt ggcatctctg ttcacaagtc 2040
atttataaat tgagtggctt gttttctaaa gttgttgact tttgtgaaaa acactggaaa 2100
ggtttctgca cacagctgcg aaaagctagg cttgttgtta cagaaaatct ctgtgtgttg 2160
aaaggaattg ctcagcattg ttttcaactt ttgctggaag caatacattc catgtacaag 2220
agttttaaga aatgcgcact tggtaggatt tccggtgatc tcttcttctg gaaaggaggt 2280
gtgcataaaa taattcacga tggcgatgaa atttggtttg acgccgtcga tactattgaa 2340
gttggagatt tgggtaccgt ccaagaaaaa cttatagatt ttgaggtttg cgaggatgtg 2400
atacttccag aaaatcaacc tggccacatg gttcaaatcc aggatgatgg aaagaactat 2460
atgttcttcc gttttaagaa ggatgagaac atttattata caccaatgtc acaacttggt 2520
gctattaatg ttatttgcaa agcgggtggc aagactgtca cgtttggtga aacaactgta 2580
aaggaaatac caccacctga tgttgtgcct attaaggtaa gcattgagtg ttgtggtgaa 2640
ccatggaata caatcttcaa gaaggcttat aaagagccca ttgaagttga gacagacctc 2700
acagtagaac aactgctcac tgtgatctat gataaaatgt gtgaagatct caaactgttt 2760
ccagaggcac cagaacctcc accatttgag aatgttgcac ttgttgataa aaacggtaaa 2820
gatctggatt gcataaaatc atgccatctc atctaccgtg attatgagag cgatgatgac 2880
atcgaggaag aagatgctga ggagtgtgat acagatccag ctgatgctga ggaatgtgat 2940
actgcttcag agtgtgaaga agaagatgaa gatacaaagg tgctgtctct tttgcaagac 3000
ccagccagta acaagtatcc tctacctctt gatgatgatt atagtgtcta taatggatgt 3060
attgttcata aggacgctct ggatgttgtt aacttaccat ctggtgaaga aacttttgtt 3120
gtcaataact gttttgaagg ggctgtaaaa ccgcttccgc agaaggttgt tgatgtcctt 3180
ggagattggg gagaggccgt tgatgcacaa gaacaattgt gtgaacaaga gtctgaatct 3240
gttaaagaat cagttgagaa atctactggt gttggtggtt cagcaattga agaagctgtt 3300
gttgtagagc aggaagtagt ccctgttgtt gaagagtctc aagaagtagt tgtttttacg 3360
cctgctgatt tagaagtagc taaagaaaca tcagaggatg tcgacgagtt tgttcttgtt 3420
gctgatgttc ttacagaaaa agttgtgctt caagaaaaag aagagccaca agtagaacag 3480
gagcctattc aagttgtcaa accacaacgt gagaaaaagg ctaaaaagtt taaagtcagg 3540
caaaccacat gtgaaaaacc caaatttttg gagtacacaa catgtgtagg tgatttgact 3600
gttgtaattg ccaaaagcat tggaaaaatt aaagagtttt gcgttgttaa cgccgcaaat 3660
gagcatatgt ctcatggtgg tggcgttgcg aaggcaattg ctgacttttg tggacctgat 3720
tttgtggaat attgtgagga ctatgttaag aaacatgggc cacaacaaag acttgtcaca 3780
ccttcgtatg tcaaaggcat tcaatgtgtg aataatgttg taggaccccg ccatggcgac 3840
aaagatttgg aagaaaaact tgtcgctgcc tacaagagtg ttcttgtaga tggtgtagtc 3900
aattatgttg tgccagttct ctcatcggga atttttggtg tagattttaa aacttcaata 3960
gacgcgatgc gtaaggcttt tgaagggctt aacatacgcg tgcttctctt ttctctgagt 4020
caagaacaca tcgcttattt cgacgcaact tgtaagcaga agaaaattta tcttacagaa 4080
gatggtgtta aataccgctc tgttgtagtg aaacctggcg actctttggg tcaatttggt 4140
caggtttttg caaagaacaa gacagttttt acagcagatg atgttgagga cgaagaagtt 4200
ctcttcactc caacaactga caaagctgtt cttgaatact atggattgga tgcgcaaaag 4260
tatgtaatat atttgcaaac actcgcgcag aaatgggaag tccaatatag ggacaatttt 4320
atcttactta aatggcgtga tggaaactgc tggattagtt cagctatggt gctccttcag 4380
gccgctaaga ttaggtttag aggttttctt gcagaggcat gggctaaatt cttgggtgga 4440
gaccctacgg attttgttgc ttggtgctat gcaagttgca atgctaaagt tggtgatttt 4500
tcagactgca attggctttt ggctaacttg gcagaacact ttgatgcaga ttacacaaat 4560
gcactgctta agaagcgtgt gtcgtgtaac tgtggtgtta agagttatga acttagaggc 4620
cttgaagctt gtattcaacc agtaagggct cctaaccttc tacattttaa gacgcaatat 4680
tcaaattgtc caacttgtgg tgcaaatagt atggatgaag ttgttgaagc atcactcccg 4740
tacttgttgc ttgttgctac tgatggtcct gctgcagttg attgtgatga aaatgctgca 4800
ggaaatgttg tttttattgg gtccaccaac agtggacact gttatacaca agctgttgga 4860
aaagcttttg ataatttggc tcaagatagg aaatttggaa agagatcgcc ttacattact 4920
gcaatgtatg tgcgcttctc tcttaagagt caaaattctc tgtctgttgc taaaaagagt 4980
aagagtaaga gtgaagtggt aaaggaagat gtttctaacc ttgccactag ttcaaaattc 5040
agttttgatg atcttactga ctttgaacag tggtatgata gtaacatcta tgaaagtctt 5100
aaagtgcagg aaacacctga gagtatgggt gagtatgtgt catttacaac aaaggaagat 5160
tccaagttgc cactgacact taaagttaga ggtatcaaat caggtgttga ctttaagtca 5220
aaggatggtt ttacttataa cttgacacct gatactgatg aaaattcaaa agcacctgtc 5280
tactatccta ctttagactc tgtaagtcct aaggcaatat gggtggacgg gactgctaat 5340
tttgttggtg gacaccccaa ccataaaagt aaaactctgc ctatccccac attctgggaa 5400
tgcgcagaaa cctttgtaaa aataggcgaa aaagttgatg gtgtaactac gggcctctgg 5460
cgtgcagaac accttaatag acctaatttg gaaaggatct ttaacgtcgt taagaagacg 5520
atggttggaa ctagtgttgt tactacacaa tgtggtaaat taattagtaa agcagctaca 5580
ttcgttgccg ataaagtagg agatggtgta gttcgtaatg tttttgatag aattaaaggg 5640
tgttttgggt ctactaggga gcattttgaa agaagagtgt ctccgcagtg cttaaaaact 5700
ctctttttct tcgtcttctg tttcttgaag gctagtgtta agggtttaat ggctagctac 5760
aagagtgtgt tatgtaaagt gttatttact gctttactta tattgtggat tgtctacact 5820
agtgatccag ttatacttac tggaatacgt gtgttagatt tcctatttga aggttcattt 5880
tgtagtcctt atgcggatta tggtaaagag tcttttgatg ttttacgcta ctgtggaagt 5940
gattttgctt gtcgtgtttg tttacatggc aaggattctc ttcatttgta taaacatgcc 6000
tatagcgtag aacagtttta taaagatgca gttaatggta tcagttttac atggaattgg 6060
ctttatatgc tgtttctact attgtttgtt aagccagtag caggttttgt tattatttgc 6120
tactgtataa ggtacttggt tttgagcaca actgttttac aaactggtgt aggattttta 6180
gactggttta tccaaacagt gtttgctaac tttaatttta tgggtgcagg attttatttc 6240
tggctttttt ataaggtata tatacaggtg catcatatta tgtactgtaa ggatataaca 6300
tgtgaagtgt gtaagcgagt tgcacgtagt aatagacatg aggttagtgt tgttgttaac 6360
gggcgtaaac agcgtgttca cgtctacact aactcaggct ataagttctg taagagacat 6420
aattggtact gtagaaattg tgacaagtat ggccaccaaa acacatttat gtctcctgaa 6480
gttgctggcg agctttctga aaagcttaag cgccatgtta aacctacagc attcgcatac 6540
catgtagtgg atgatgcatg cttagttgat gactttgtta atctgaagta taatgctgcc 6600
actccatgta aagaaggtgt gcattctgct gttaaatgtt ttagtgtatc tgacttctta 6660
aagaaagctg tttttcttaa ggatgcacaa aaatgtgagc aaatatctaa tgatagtttt 6720
atagtttgta atacacacag tgcgcatgca ttagaggaag caaaaaacgc tgccatctat 6780
tatgcgcaat gtctctgtaa accaattctt atacttgatc aggccctcta tgaacaattg 6840
gtggtagaac ctgtgtcaaa aagtgtagta gataaggttt gtagtatcct gtctaatata 6900
atatctgtag actctgcagc tttgaattat aaggctggca cacttcgtga tgccctcctt 6960
tctgttacta aagatgaaga agccgtcgat atggctatct tctgtcataa taatgatgtt 7020
gaatatacta gtgatggttt tactaatgtt gtgccgtcat atggtataga tactgataaa 7080
ttaacacctc gtgatagagg ctttttaata aatgcagatg cctccattgc taatttgaaa 7140
gtgaaaaatt caccgccagt agtatggaag tattctgatc ttataaaact gtctgacagt 7200
tgtcttaagt atttaatatc ggcaactgtc aaatcaggag gtagattttt cataacaaga 7260
tctggtgcta agcaagttat ttcttgttac actcagaaat tgttagtgga aaagaaggct 7320
ggtggtgtcg ttagtggcac tattagtagt tttaagagtt gttgtaagtg gctcttagtg 7380
ttttatttaa tctttacagt gtgttgtttg ggttattatc aatgggaaat gagtacagaa 7440
tttgctcacc ccatgtatga tgttaattcc acaatgcatg tagaagggtt taaggttata 7500
gataagggtg tacttcgtga taatgtgcca gaagacacgt gcttttctaa taagtatgtt 7560
aattttgact cattttgggg aaaatcttat gtaaatagta gggactgtcc tattgtaacc 7620
gctattatag acggttctgg aacagtaact gctggtgtgc ctggtttcgt acagtgggtt 7680
atggatggtg taatgtttat ccatatgaca cagactgagc gaaaaccgtg gtatattcct 7740
acttggttta atagagaaat tgttggttac acccacgatt ctattattac agaaggtgaa 7800
ttttatactt ccatagcatt gtttgcttct agatgtttgt atttaacatc tagtaacaca 7860
ccacagcttt attgctttaa tggtgataat gatgctcctg gtgctctacc atttgcaagt 7920
atacttcctc atagagaaca ccagcaacct aatggagtca ggcttattgt gcctcagcaa 7980
attatgcaca caccatacgt agttaagtta gtttcagaca gctattgtag gagtagtgtt 8040
tgtgaggtta ctaaaccagg ttattgtgtc tctatgaatt ctcaatgggt tttgtttaat 8100
gatgaataca caattaaacc tggtgtattt tgtggttcta ctgttagaga acttttgttt 8160
agtatggtta gcacattctt tacgggtgtt aatccaaata tctatatgca attggcaact 8220
atgttcttaa cacttgttgc tgttgtgtta gtttttgcaa tggttataat gtttcaaggt 8280
gtttttaaag cttatgcaac cactgtattt actataatgc ttgtttggtt tattaatgca 8340
tttatattat gtgtgcatag ttataatggt gttttagcta ttatactact tgtactctat 8400
tgttatgcat cacttgtgac gagtcgtaat actgtcataa taatgcactg ttggctcgtt 8460
tttacatttg gtttaatagt acctagttgg atagcttgtg tctacttagg ttttgtgcta 8520
tacatgtata caccgctgtt cttgtggtgc tatggtacaa ctaaaaattg ccgcaagctt 8580
tatgaaggca atgattttgt tggtaattat gatcttgctg cgaagagtac gtttgtaatt 8640
cgtggccctg aatttgttaa acttactaat gagataggtg ataaatttga acattacctc 8700
tcagcgtatg ctaggcttaa atactactct ggcactggca gtgagcaaga ttacttgcaa 8760
gcctgtcgtg catggttggc ctatgcacta gaccaattta gaagcagtgg tgtagaagta 8820
gtttatactc caccacgata ttcaattggt gttagtagat tacaagctgg ttttaagaaa 8880
ctagtgtctc ctagtagtgc tgttgagaag tgcattgtta gtgtatccta taggggtaat 8940
aatcttaatg gattgtggtt gggtgactcc atctactgtc cacgtcatgg gttaggtaaa 9000
tttagtggtg accaatgggg tgatgtactt aatcttgcta ataatcatga gtttgaagta 9060
gtaactggaa atggtgttac tttgagtgtt gtcagtaggc gtttgaaagg tgcagtttta 9120
attttacaaa ctgcaattgt caatgctgat acaccgaagt ataaattctt gaaagcaaat 9180
tgtggtgata gtttcacaat agcttgctct tatggtggta cagttatagg actctacccc 9240
gttactatgc gttctaatgg aactattaga gcatcgtttc ttgctggagc atgtggttca 9300
gtaggtttta atatagaaaa gggtgtagta aatttttact acatgcatca tctagagtta 9360
cctaatgcat tacacacagg aactgaccta atgggtgagt tttatggtgg ttatatagat 9420
gaagaggttg ctcagaaagt tcaacctgat aagttagtta ctaataatat tttggcatgg 9480
ctttatgcag caattattag tgttaaagag agtagttttt caacaccaaa atggcttgaa 9540
agtactacta tcagtattga tgattataat aagtgggcag gtgataatgg ttttacatca 9600
tttgtaagct gtactgctat tactaagtta agtgctataa caggagtaga tgtttgtaaa 9660
ctccttcgta ctattatggt aaaaagtgca caagggggta gtgaacctat tttgggacaa 9720
tataattttg aggatgaaat gacaccggaa tctgttttta atcaagtggg tggtgttagg 9780
ttacaatctt ctgttgtaaa gagagccgca tcttggtttt ggagtagatg tgtgctagct 9840
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tttggcatta ttccattaat gagtaagtgt ggtaagaagt cttcttacta cacgactttt 23820
gataatgatg tggtaactga acaatacaga cctaaaaagt ctgtttaatg atccaaactc 23880
ccacctcatt tgtaatacta ttaattcttc tttggtttaa acttgtgcta agttgtttca 23940
gggagcgtgt tatagcactt cagcaactaa tacaagttct actccaaatt attaatagta 24000
acttacattc tagactgctc ttgcagcata gtctaaacta atgttagatt ttgaaaaagt 24060
acttgaaact ggtgatcaga taattcaaca aatcagtttc aatttacagc atatttcaag 24120
tgttctagac acagaattat ttgacccctt tgaagtttgt tattacagag gaggtaattt 24180
ttgggaaata gagtcagctg aggagtcagc tgatgatgaa tttattgact aaatcgctag 24240
aggagaatgg aagttttcta acggcacttt atgtatttgt aggtttcata gcactttacc 24300
tactaggacg agcgctacaa gcttttgtac aagcagctga tgcttgttgt ttattttggt 24360
acacatgggt agtaattcca ggtgctaagg gcactgcctt tgtgtacaag catacatatg 24420
gtaaaaaact taacaatccg gaattagaag cggttattgt taacgagttc ccgaagaacg 24480
gttggaataa taaaactcta ccaaattttc aagatgtcca acgagacaaa ttgcaccctt 24540
gattctgagc aggctattct gctcttcaag gaatataatc tatttataac cgcattccta 24600
ctgtttataa ccatactact tcagtatgga tacgcaacta ggagtcggct tatttacata 24660
ctgaaaatga tagtgttatg gtgtttctgg ccccttaaca ttgcagtagg tgtaatttca 24720
tgtatatacc caccaaatac aggaggcctt gtagccgcga taatactcac tgtgtttgcg 24780
tgtttttctt ttataggtta ttggattcag agcattagac tctttaagcg gtgtagatct 24840
tggtggtctt ttaaccccga gagcaatgcc gtaggttcaa tactcctaac aaatggtcaa 24900
caatgtaatt ttgctataga gagtgtgcca atggtacttt ctcctattat aaagaatggt 24960
gctctttatt gtgagggtca gtggctcgct aaatgtgaac cagaccactt gcctaaagac 25020
atttttgtgt gtacaccaga tagacgcaac atttaccgta tggtgcagaa atatactggt 25080
gaccaaagcg gaaataagaa aaggtttgct acatttgtct atgcaaagca gtcagtagac 25140
actggcgagc tagaaagtgt agcaacagga ggaagtagtc tttacacata aatgtgtgtg 25200
tgtagagagt atttaaaatt actttttgat agtgcctcta ttttaagagc gcataagagt 25260
attcattttg aggatttcaa cataaaccca ttttgtttca tactctcttt tcaagagtta 25320
ttatttaaaa aacagttttt ccactctttt gtgccaaaaa ctgttgttgt taatggtgta 25380
gccttccaag tagataatgg aaaagtctac tatgaaggaa accccatttt tcagaaaggt 25440
tgttgcaggt tatggtccca gtataagagg gattaaaata gtcaaaccac caacaacaat 25500
tttttgtatt taaaggcgtt tggatttaca agcgcttaag aaaaaacaaa ttacggaatg 25560
aaatgggtgt ctaatttaag accaacgttc acttcctgtt ataaagccct actattaact 25620
ccattaaaaa ttttaaatag gttaattcta gatcacggac cgaggggtac ttttagttgt 25680
ggccggggcg tggttttatt ccaattaaat tttatagctt ggtatatacc ccccaccaat 25740
ccctgggatg aataataata aaaataatcc ttttcccgga acaataacaa gaaaagcgcg 25800
aatttatctg aaacaagggt taaattgtgt ttattttctt aacaaagcag gacaagcaga 25860
atcttgtccc gcgtgcacat cactaatatt ccaagggaaa acttgtgagg atcacataaa 25920
taataataac ttactatcat ggcaagcagt aaggcatctg gaaaaacaga cgccccagcg 25980
ccagttatta aactaagagg accaaaacca cccaaagttg gttcttcagg gaatgcatca 26040
tggtttcagg cattgaaagc caagaaactg aatgcacctg cacctaagtt tgaggggagt 26100
ggtgttcctg ataatgaaaa tattaaaaca agccagcagc atgggtactg gagacgccaa 26160
gctaagtata agctaagtaa aggttggaag aaaaaccagt cccagatgcg tggtacttct 26220
attacactgg gaacaggacc agccgctgaa ctggaattgg ggtggattct tcaggatggt 26280
atagtgtggg ctgctgctaa gcgtgctgat gtaaaatcca gatccaatca gggtacaaga 26340
gatcctgata agtttgatca atacccgcta cgattttcag acggaggacc tgatggaaat 26400
ttccgttggg acttcaatcc tctgaatcgt ggtaagagtg gaaggtctac agcagcttcg 26460
tcagcagcat cctctagggc accttcaaga gaaggttctc gtggaagact tagtggggct 26520
gaagagaatc ttattgctcg tgcagcaaaa attattcaag accagcagaa gaagggctct 26580
cgcattacaa aggccaaggc agaagagatg attcatcgcc gctattgtaa gcgaacagtt 26640
ccacctggtg tttctattga taaagttttt ggccctcgta ctaaaggtaa ggagggaaat 26700
tttggtgatg acaagatgaa tgaggaaggc attaaggatg ggcgtgttac tgcaatgctc 26760
aaccttgtac ctagtagcca tgcttgtctt tttggtagcc aagtgacacc taagcttcaa 26820
cctgatggtc tgcacttgac ttttagattt actactgtgg tgccacgtga tgacccgcag 26880
tttgataatt atgtaaagat ttgtgatgag tgtgttgatg gtgtaggaac acgtccgaaa 26940
gacgaagttg taagaccaaa atcacgcaca aactcaagac ctgctacaag aacaaattct 27000
ccagcgccaa gacaacagcg cccaaagaag gagaaaaagc caaagaagca ggatgatgaa 27060
gtggataaag cattgacctc agatgaggag aggaacaatg cacagctgga atttgatgat 27120
gaacccaaag tgattaattg gggtgattca gcacttggtg aaaatgaact ttgagtaaca 27180
taatggactt gctacatttt atgtggcatt gctgttgtta ttacttttct gcttttctct 27240
caatcattat gggttttgat tgtgattatg tgcagtatct tagttggttt cccttgttga 27300
ttgcagtttg ttctctttct gtgcttattg tttttattct gctttattct ttgttatatc 27360
gtagaagttt attaaaggtt aaggaagata ggcatgtagc ttgattacct acatgtctat 27420
cgccagggaa atgtctaatc tgtctactta gtagcctgga aatgaacggt agacccttag 27480
attttaattt agtttaattt ttagtttagt ttaagttagt ttagagtagg tataaagaag 27540
ccagtgccgg ggccacgcgg atacgatcga gggtacagca ctaggacgcc cactagggga 27600
agagctaaat tttagtttaa gttaatttta attggctaag tatagttaaa atttataggc 27660
tagtatagag ttagagtaaa aaaaaaaaa 27689

Claims (7)

1.一株IBV病毒QX亚型毒株，其特征在于，所述IBV病毒QX亚型毒株于2021年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：V202172。
2.可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：通过siRNA方法，分别干扰NCI-N87细胞内Ago2和Dicer1基因，然后将含有所述Ago2和Dicer1基因的CRISPR Cas9质粒分别转染至NCI-N87细胞，从而获得敲除该基因且可稳定传代的细胞系，然后接种权利要求1所述的IBV病毒QX亚型毒株共同孵育即得基因敲除细胞系。
3.根据权利要求2所述的可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，所述细胞系的复制载量达到1×103～1×105。
4.根据权利要求2所述的可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系的构建方法，其特征在于，所述Ago2和Dicer1 基因的siRNA碱基序列如下所示：
si-Ago2：TGACAATCGTTTCTCTTCA；
si-Dicer1：CCTGCTGAGTTAGAAGAAA。
5.权利要求2~4任一项所述的构建方法构建获得的可复制IBV病毒QX亚型毒株的基因敲除细胞系。
6.权利要求5所述的细胞系在传染性支气管炎病毒复制增殖中的应用。
7.权利要求5所述的细胞系在制备传染性支气管炎病毒疫苗中的应用。
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Zika virus infection induces RNAi-mediated antiviral immunity in human neural progenitors and brain organoids;Yan-Peng Xu 等;Cell Research;第29卷;摘要，第266页左栏第2段、右栏第3段，图2 *

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