CN107794244A

CN107794244A - Vero‑pAPN细胞系及其制备方法

Info

Publication number: CN107794244A
Application number: CN201711087398.7A
Authority: CN
Inventors: 张磊; 戚伟强; 尹彦龙
Original assignee: Wuhan Nakataku Kangmin Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Yangling Kairui Biotechnology Co., Ltd
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2018-03-13

Abstract

本发明涉及构建一种Vero‑pAPN细胞系，所采用的构建方法为慢病毒介导法。相较于亲本Vero细胞以及瞬转方式构建的表达pAPN的Vero细胞系来说，该细胞能够稳定表达更高水平的APN蛋白，提高PEDV繁殖滴度，成为更适宜于增殖PEDV的宿主细胞。该细胞可用于后续的病毒培养、分离、纯化，并为疫苗的制备提供宿主原料。

Description

Vero-pAPN细胞系及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及构建一种稳定表达猪氨肽酶N（PorcineAminopeptidase N, pAPN）的Vero-pAPN细胞系及其制备方法。本发明采用慢病毒介导的方法构建稳定细胞系Vero-pAPN，该细胞可用于猪流行性腹泻病毒的培养与分离。

背景技术

猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDvirus, PEDV）引起的一种高传染性疾病，可以感染各种阶段的猪引发急性水样腹泻，特别是哺乳仔猪感染后会造成严重脱水，其致死率可以高达100%。该病自上世纪七十年代初在英国发现后，比利时、荷兰、德国、法国等国家相继报导该病的发生。我国于1976年发现猪流行性腹泻，并在1983年确认猪流行性腹泻病毒PEDV的存在。近年来，该病暴发区域正不断扩张，2013年PEDV首次在美国被鉴定出来，并迅速传播至墨西哥在内的美洲其它地区。猪流行性腹泻已成为全球养猪行业重要的腹泻疾病之一，给养殖行业造成了严重的经济损失。所以对于猪流行性腹泻病的防御迫在眉睫。

目前为止，对于由病毒引起的疾病的防控采用最多的措施是疫苗接种给宿主动物予以保护，而我国市场现有的疫苗以灭活疫苗和减毒疫苗为主，虽然已有针对于PEDV的疫苗，但遗憾的是其免疫效果不佳，并不能有效的保护猪群免于PEDV的侵害。目前PEDV疫苗的生产仍面临着病毒的培养困难、病毒增殖速度缓慢、病毒侵染能力低等问题，从而导致了其疫苗生产困难、免疫效果差强人意等现象。故而改善病毒培养条件，构建适于病毒增殖的细胞宿主是最佳解决途径之一。

猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于冠状病毒科冠状病毒属成员，是单链正向RNA包膜病毒，表面广泛分布着杆状突起。PEDV基因组全长28 kb，除5’非编码区（5’ UTR）与3’ UTR外，还有7个开放阅读框（ORF），其分别编码4个结构蛋白（S、E、M、N）和3个非结构蛋白。其中S蛋白含有PEDV与宿主细胞受体结合和融合的位点，能够介导病毒进入宿主细胞，对于病毒侵染能力有重要影响。自1971年PEDV被发现以来，由于PEDV难以在体外培养，研究人员先后在不同的宿主细胞系上进行PEDV的体外培养研究，最终于1988年利用Vero细胞在胰酶的存在下成功繁殖出PEDV[]，到目前，Vero细胞仍是分离培养PEDV的理想材料。PEDV是冠状病毒属中的一员，与其他成员一样，其细胞受体都是宿主的氨基肽酶N（APN），而且研究发现，猪可溶性pAPN在体外可以提高抗PEDV抗体水平，并对PEDV在Vero细胞内的增殖有促进作用。

发明内容

本发明的目的主要针对上述所涉及的PEDV分离培养困难的问题，提供一种Vero-pAPN细胞系，并且提供构建Vero-pAPN细胞系的方法以解决构建稳定细胞系效率低的问题。

构建Vero-pAPN细胞系的方法：利用慢病毒介导的方法将pAPN基因插入Vero细胞染色体组，使新构建的细胞能够稳定表达更多的猪氨基肽酶pAPN，从而增强猪流行性腹泻病毒PEDV对宿主细胞的侵染力，解决其繁殖困难问题。Vero细胞被带有pAPN和嘌呤霉素基因的慢病毒侵染后，利用嘌呤霉素（puromycin）进行筛选。Western blotting和免疫荧光显微技术对筛选后的细胞进行验证，证明相较于亲本细胞，新构建的Vero细胞的pAPN蛋白表达量更多并且表达稳定。此外，比较在两种细胞上PEVD的滴定度发现，PEDV在Vero-pAPN宿主细胞上具有更高的滴定度。

慢病毒介导法：将pAPN基因插入穿梭载体CD513B-1中得到新的载体CD513-Papn（见图1载体图谱），将构建的穿梭载体与三个骨架载体pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G共转入HEK293T细胞中进行慢病毒的包装，测定包装后慢病毒的滴定度。以MOI=10的病毒液对Vero进行吸附转导，并用含嘌呤霉素的培养基进行筛选培养。

本发明的优势是：本发明第一次通过慢病毒介导的方法构建得到稳定表达猪氨基肽酶pAPN的Vero-pAPN细胞系。

附图说明

图1为构建的含有pAPN基因序列的CD513B-pAPN载体图谱。

图2为质粒共转HEK293T细胞后的荧光信号；图2-A 为空白对照；图2-B为转染CD513B的阳性对照；图2-C为转染CD513B-pAPN细胞的荧光信号。

图3 PCR检测Vero-pAPN不同克隆细胞目的基因APN的插入；图3中M为1000 bp DNAMarker；clone1-10为挑取的不同克隆细胞；Control为阴性对照。

图4为Western检测Vero-pAPN细胞中pAPN蛋白的表达与稳定性

图5为在Vero-pAPN和亲本细胞中PEDV病毒的生长动力学曲线

具体实施方式

载体CD513B-pAPN的构建

根据NCBI中pAPN序列（序列号：KU986724）合成pAPN基因片段，在两端加上酶切位点XbaI与BamHI，且C端带有6×His标签方便后续检测。经过酶切、连接、转化等基因工程技术将pAPN片段插入到CD513B载体上，得到的新载体命名为CD513B-pAPN。

慢病毒包装

将构建的载体CD513B-pAPN与三个骨架载体pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G共转染HEK293细胞：2×10⁵个/mL 的细胞密度铺6孔板，待第二天长至80%进行转染；取500 μLOpti-MEM，向其中分别加入0.5 μg pPACKH1-GAG、0.5 μg pPACKH1-REV、0.5 μg pVSV-G、1.5 μg CD513B-pAPN混合均匀后加入6 μL Turbofect，吹吸混匀静置20 min，均匀滴入6孔板中，37℃培养48h收毒。

慢病毒滴定度测定

将HEK293T细胞以1×10⁵个/mL 的细胞密度铺24孔板，第二天长至50%，取96孔板做慢病毒5倍梯度稀释，由5^-1稀释至5^-8（稀释液中加入10 μg/mL Polybrone）。取6个稀释梯度5^-3稀释至5^-8，加入24孔板中培养8 h换液，继续培养至72h，荧光显微镜下观察荧光信号，测得病毒滴定度为1×10⁶TCID50/mL。

最佳转导MOI的确定

分别以MOI=0.1、1、5、10进行慢病毒转导，转导培养基为含10 μg/mL Polybrone的0.5%FBS的MEM培养基，8 h换液继续培养72h，观察转导细胞荧光信号。如图4所示在MOI=10的感染复数下转染效率最高。

单克隆筛选

Vero细胞以1×10⁵个/mL 的细胞密度铺24孔板，第二天长至50%，慢病毒Leti-APN以MOI=10进行转导，8 h换液继续培养72h；消化细胞转移至6孔板中进行筛选，加入筛选培养基即含10 μg/mL嘌呤霉素的10%FBS的MEM培养基，三天换一次液待细胞成团生长；进行有限稀释，分离得到单个细胞后继续扩大培养，并冻存。

PCR检测

利用设计的检测引物进行PCR检测：APN-For: ATCCTGGGAATCCTGCTTGGAGTTG；APN-Rev:TTAGGAG GCATGTTGCTCAGGGCTG，检测不同克隆细胞基因组中的APN基因的插入情况，检测的片段长为740bp。如图3，挑选不同的单克隆进行PCR检测，可以看的克隆1~10均有APN基因的插入。

Western blot检测

用RIPA细胞裂解液裂解挑取的克隆细胞，BCA法进行蛋白质定量。每条泳道上样20μg蛋白，进行10%SDS-PAGE，结束后将蛋白转至 PVDF膜，用5%的脱脂奶粉37℃封闭2 h后，以anti-His抗体（1:1500稀释）为一抗室温孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，加入HRP标记山羊抗鼠二抗（1：3000稀释），37 ℃孵育1 h，TBST洗涤3次，每次10 min，用PBS洗涤1次，用ECL化学发光试剂盒显色后曝光。设立检测细胞内β-Actin蛋白为内参对照，同时设立Vero细胞作为阴性对照，如图4。

病毒生长动力学曲线的绘制

在24孔细胞培养板中培养筛选的细胞1×10⁵个/孔，待细胞密度为70％～80％时，用MOI=0.1的病毒感染细胞，分别在感染后的12、24、36、48和60 h收集细胞和细胞上清中的病毒。收集的细胞通过反复冻融的方式释放病毒，然后将病毒液接种至筛选细胞Vero-pAPN和亲本细胞测定病毒滴度，并绘制病毒生长动力学曲线，如图5。

Claims

1.一株稳定表达pAPN蛋白的Vero-pAPN细胞系，该细胞可作为猪流行性腹泻病毒PEDV的宿主细胞，进行病毒的培养、分离、纯化，其特征在于：稳定地将氨基肽酶APN插入Vero细胞染色体，使之能够稳定高水平表达APN，通过增加PEDV受体APN含量从而使PEDV病毒侵染能力提高，获得高滴定度的病毒；通过慢病毒介导的方法将pAPN和嘌呤霉素基因转入Vero细胞中，使之能够在含有嘌呤霉素培养基中生存达到筛选目的；用Western blot和免疫显微技术检测证明，与亲本细胞相比，Vero-pAPN细胞表达的APN蛋白量更多；病毒滴定度测定结果显示，PEDV 在Vero-pAPN细胞中的滴定度更高，比亲本细胞更适宜成为PEDV的宿主细胞。

2.一种制备权利要求1所述的稳定表达pAPN蛋白的Vero-pAPN细胞系的方法，其利用慢病毒介导的方法将APN基因插入Vero细胞染色体，其特征在于：通过载体构建的方法，将pAPN基因插入含有嘌呤霉素基因的穿梭质粒载体，形成新的穿梭质粒CD513B-pAPN；以共转的方式将穿梭质粒和骨架质粒同时转入HEK293T细胞中进行慢病毒的包装；测定慢病毒滴定度后，以MOI=1的浓度进行慢病毒侵染Vero细胞实验，通过慢病毒吸附侵染的方式将目的基因pAPN导入Vero细胞，而嘌呤霉素基因的存在使成功介导的细胞得以在含有嘌呤霉素培养基中存活，筛选后的细胞通过有限稀释法得到Vero-pAPN单克隆细胞，该细胞用于后续鉴定以确定其稳定过表达pAPN蛋白。

3.一种利用慢病毒介导的方法将APN基因插入Vero细胞染色体的方法，其特征在于：通过载体构建的方法，将pAPN基因插入含有嘌呤霉素基因的穿梭质粒载体，形成新的穿梭质粒CD513B-pAPN；以共转的方式将穿梭质粒和骨架质粒同时转入HEK293T细胞中进行慢病毒的包装；测定慢病毒滴定度后，以MOI=1的浓度进行慢病毒侵染Vero细胞实验，通过慢病毒吸附侵染的方式将目的基因pAPN导入Vero细胞，而嘌呤霉素基因的存在使成功介导的细胞得以在含有嘌呤霉素培养基中存活，筛选后的细胞通过有限稀释法得到Vero-pAPN单克隆细胞，该细胞用于后续鉴定以确定其稳定过表达pAPN蛋白。

4.根据权利要求2或3所述方法，其慢病毒包装的主要步骤为：

1）用含10%FBS的MEM细胞培养液将HEK293T细胞培养至单层；

2）每孔加入1.5 mL新鲜培养基（含10% FBS的MEM）替换旧培养基，放回培养箱中继续培养；

3）准备转染复合物：取出一支灭菌的 1.5 mL 离心管，加入 500 μL Opti-MEM 培养基，依次加入目的质粒 1.5 μg 和三种辅助质粒pPACKH1-GAG、pPACKH1-REV、pVSV-G各 0.5μg，充分混匀后，加入 6 μL Turbofect 转染试剂，轻轻涡旋，室温孵育 20 min；

4）将转染复合物逐滴加入到待转染的细胞中，轻轻混合；

5）37 ℃继续培养48 h 后观察有强的绿色荧光信号时收毒。

5.权利要求2或3所述方法，其中慢病毒滴定度的测定步骤为：

1）将HEK293T细胞以2×10⁵个/mL的细胞密度铺于经0.1% Gelatin处理的24孔板上，第二天长至40~50%；

2）取96孔板做慢病毒5倍梯度稀释，取80 μL Dilution Medium (MEM+0.5%FBS+8 μg/mL polybrene) 加入孔中，再加人20 μL病毒原液，吹吸10~15次，为5^-1，如此依次稀释至5^-8；

3）取出24孔板，弃旧培养基，取200 μL含0.5% FBS的MEM培养液加入每个孔中，再加入已稀释的病毒液25 μL，选择梯度为5^-3~5^-8；

4）37℃培养4 h后，换完全培养基（MEM+10%FBS），继续培养48 h；

5）荧光显微镜下观察荧光信号，并计算滴定度。

6.权利要求2或3所述方法，其中慢病毒转导步骤为：

1）将Vero细胞按照1×10⁴个/mL的密度培养于96孔细胞培养板中，培养12h后；

2）弃培养基，加入20 μL Dilution Medium（DMEM+0.5% FBS+8 μg/mL polybrene）稀释的慢病毒毒液（MOI=10）；

3）感染6~8 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h。

7.权利要求2或3所述方法，其中稳定细胞系筛选步骤为：

1）将细胞消化后转至10 cm² 培养皿中培养，72 h后更换为含有嘌呤霉素（10 μg/mL）的培养基对转导的细胞进行筛选；

2）每2 天更换一次含有嘌呤霉素的培养基直到长出细胞克隆；

3）挑选的一个直径>0.5 mm 的细胞克隆，消化后采用有限稀释法在96孔板继续筛选；

4）制备饲养细胞悬液，调节细胞数在1～5×10³个/ml；

5）取130个细胞放入6.5 ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞/ml，100μl/孔加A、B、C三排为每孔2个细胞；余下2.9 ml细胞悬液补加2.9 ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数为10个/ml，100 μl/孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞；余下2.2 ml细胞悬液补加2.2 ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个/ml，100 μl/孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞；

6）培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200 μl/孔；

7）第8～9天时，肉眼可见细胞克隆。

8.权利要求2或3所述方法，其中Vero-pAPN细胞筛选、培养以及保藏条件：

1）筛选培养基成分：

MEM培养液；

10%胎牛血清；

10 μg/mL 嘌呤霉素；

2）细胞培养基成分：

MEM培养液；

10% 胎牛血清；

5 μg/mL 嘌呤霉素；

3）细胞系的保藏：

保藏液：含10%FBS的MEM：DMSO=9：1

保藏条件：液氮冻存。