CN106215184A - 一种h7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法 - Google Patents

一种h7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，具体步骤如下：（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建；（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救；（3）病毒扩增；（4）收集病毒颗粒；（5）病毒纯化；（6）半成品配制。本发明方法制备的活载体疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。

Description

一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法
技术领域
本发明涉及一种活载体疫苗毒种的制备方法，具体是一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法。
背景技术
流感是流行性感冒的简称，是由流感病毒引起的人兽共患传染性疾病，人感染后主要表现症状为高热、咳嗽、流涕、肌痛等，多数伴有严重的肺炎，严重者心、肾等多种脏器衰竭导致死亡，病死率很高；2013年4月以来发生的H7N9亚型流感，已对人、禽造成巨大威胁。目前，主要采用疫苗进行预防，所用疫苗包括病毒灭活疫苗、减毒疫苗、重组亚单位疫苗等。
流感病毒颗粒外膜由两型表面糖蛋白覆盖，一型为血细胞凝集素（即H），一型为神经氨酸酶（即N），H 又分16个亚型，N 分9个亚型。其中H7亚型禽流感病毒对于禽类主要流行亚型有H7N3亚型、H7N7亚型，以及2013年开始感染人的H7N9亚型。历史上发生过H7亚型病毒感染哺乳类（包括人）的病毒有H7N7、H7N3、H7N9和H7N2等抗原组合，早在20年前就曾感染过人类，主要引发结膜炎和轻微的流感样症状，偶尔也曾引发死亡病例，尚未见在人与人之间传播。H7N7亚型禽流感病毒及H7N9亚型流感对人禽均有巨大威胁。
现有技术中尚未见良好疗效的针对H7N9/H7N7亚型的粘膜免疫疫苗，更未有良好疗效的针对H7N9/H7N7亚型禽流感病毒的多表位粘膜免疫疫苗，面对可能的H7N9/H7N7亚型禽流感病毒的感染和流行，迫切需要一种新型、高效的疫苗来预防H7亚型禽流感。
发明内容
本发明的目的在于提供一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的制备方法，包括以下步骤：
（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建：将来自于A/Anhui/01/2013 的H7N9 亚型禽流感病毒株HA（简称AH-HA）及来自于A/Netherland//03的H7N7亚型禽流感病毒毒株HA（简称NL-HA）序列合成后，引物设计在5’端引入酶切位点，在3’端引入酶切位点。PCR扩增出目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用相应酶切位点进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态；测序正确后用特用酶进行酶切，并与线性化的pAd5进行同源重组，酶切及测序正确后保存，待转染重组；
（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染Trex 293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达；从而建立携带H7亚型禽流感重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；
（3）病毒扩增：
a、采用175cm2 培养瓶，每瓶各加入107 293细胞进行培养；
b、将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃ 培养90分钟，此时MOI 值约为25；
c、向培养瓶加入DMEM 至30ml/瓶，再培养48-72 小时，此时有3×1011～3×1012 个病毒，若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度；
（4）收集病毒颗粒：先收集培养瓶中被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM中，-20℃ /37℃冻融3次，离心沉淀细胞碎片，可得到病毒颗粒；
（5）病毒纯化：用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒颗粒，以10000g/min 的速度离心4小时，得到H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的原液；
（6）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，用腺病毒专用稀释液T101稀释，使携带不同H7亚型禽流感病毒HA复制缺陷型重组腺病毒达到1010vp/ml，即配制成H7亚型禽流感病毒活载体疫苗的半成品。
作为本发明进一步的方案：步骤（2）中，病毒扩大培养后获得的是复制缺陷型携带H7亚型禽流感病毒HA的重组腺病毒，该病毒接种机体后只转录翻译表达H7亚型禽流感病毒HA蛋白及腺病毒蛋白，但不具有核酸成分，不会复制产生下一代子病毒。
作为本发明进一步的方案：步骤（3）测定病毒滴度，采用MOI 测定。
作为本发明进一步的方案：步骤（3）在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液。
作为本发明进一步的方案：步骤（2）中抗原基因经过密码子优化，即选用真核细胞偏好的密码子。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法制备的活载体疫苗免疫原性强，抗原谱广，质量稳定，纯度高，安全性好，成本低，适合于大规模生产，具有较大的应用价值。
附图说明
图1为 H7N9/PR8AH（灭活疫苗）免疫3W SPF鸡 14d,21d,28d抗体水平（HI）。
图2为rAd-HA7AH免疫3W SPF鸡14d,21d,28d抗体水平（HI）。
图3为 rAd-HA7AH免疫3W SPF鸡14d,21d,28d抗体水平（HI）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本实施例中携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA的重组腺病毒活载体疫苗毒种的制备方法，包括以下步骤：构建携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA重组腺病毒载体，转染293细胞，救获重组病毒，重组病毒的传代扩增、建立携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA的重组腺病毒主代种子批毒种，从该种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种。即：NL-HA引物设计在5’端引入应该为HindIII酶切位点，在3’端引入应该为XbaI酶切。PCR扩增出NL-HA目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用Kpn I和Xho I进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态。测序正确后用BstZ17I和SgrAI酶切，并与pAd5进行同源重组。最后Pac I酶切线性化重组腺病毒质粒并转染至293细胞，拯救成功后进行扩增。
酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代。第2代以后的重组腺病毒感染293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡。传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达。从而建立携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；
病毒扩增：175cm2 培养瓶中，每瓶各加入107 293 细胞进行培养。将45ml 细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3 次混匀，37℃ 培养90 分钟。此时MOI 值约为25。加入DMEM 至30ml/瓶。再培养48-72小时，此时约有3×1011～3×1012 个病毒。若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度。如果要收集病毒颗粒，先收集被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM中。-20℃ /37℃ 冻融3 次，离心沉淀细胞碎片。此时5ml DMEM中3×1011～3×1012 个病毒颗粒，浓度为6×1010～6×1011vp/ml。然后测定病毒滴度，或者纯化病毒。在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液；
将上述制得的携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种用腺病毒稀释液T101稀释为为1010 vp/ml，接种于28日龄SPF鸡，分别于14/21/28天采血测血清中禽流感病毒抗体滴度。
所述携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA的重组腺病毒活载体疫苗毒种的实验方法为：
本实验利用实验室已有平台，快速制备H7亚型禽流感活载体疫苗，并免疫SPF鸡，观察疫苗的效果。
2.1材料
2.1.1分子克隆相关材料
2.2.1.1 菌株：Top10 E.Coli
2.2.1.2 NL-HA及AH-HA 基因
流感病毒A/Anhui/1/2013 (H7N9) HA7基因与A/Netherland//03 (H7N7) HA7基因来自GISAID流感数据库，参照数据库序列合成。
2.2.1.3 培养材料：无菌培养皿，LB培养基以及相应固体培养基配制方法见《分子克隆实验指南》。
2.1.2 试剂：各种限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自Takara及NEB公司；各种Taq酶及PCR相关试剂等购自Takara公司；DNA Marker购自Takara公司；质粒小量抽提试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自北京天根公司； NaCl、CsCl、EDTA、SDS、DMSO等常规化学试剂主要购自Sigma和广州化学试剂公司。引物及基因全合成、DNA测序由华大基因完成。
2.1.3 细胞培养及质粒转染相关材料。
2.1.3.1 细胞：293细胞（ATCC，美国）。
2.1.3.2 材料：DMEM高糖培养基（Gibco，美国），胎牛血清（FBS）（Hyclone，美国），100×青-链霉素（吉诺），1×PBS、胰酶（Gibco，美国），Opti-MEM（Gibco，美国），10cm细胞培养皿、6孔板、96孔板（Greiner Bio-One，德国），Lipotransfectiamine2000（Invitrogen，美国）
2.1.4 病毒纯化相关材料。
2.1.4.1 CsCl（Sigma，美国）
2.1.4.2 SDS（Sigma，美国）
2.1.5 实验动物：4周龄SPF鸡，肇庆大华农生物制品有限公司。
2.1.6 western blot主要试剂
山羊抗小鼠IgG抗体（博士得，武汉）；β-actin抗体购自（Sigma，美国）； PVDF膜购自（Bio-Rad，美国）
2.1.8 HI实验
1%的新鲜鸡血红细胞
2.1.9微量中和实验用试剂
TPCK-胰蛋白酶购自（Sigma，美国）；抗A型流感NP蛋白单抗购自（Virostat，美国）；BSA购自（Sigma，美国）
2.1.10 实验仪器
超级酶标仪：BIO-TEK 型号：synergy HT
DNA电泳槽：Bio-rad　　　　　 型号：mid-sub cell GT
紫外分光光度计：BECKMAN COULTER　 型号：DU520
凝胶成像系统：UVP　　　　　　　 型号：UVP GDS-8000PC
冷冻超速离心机：BECKMAN 型号：JKY05D03
超纯水系统：Millipore 型号：Milli-Q A10
倒置显微镜：OLYMPUS　　　　　　　 型号：CKX41-A32PH
二氧化碳培养箱：Thermo HEPA class100 型号：3111
生物安全柜：THERMO ELECTRON 型号：1287 A2
漩涡振荡器：基因公司 型号：VortZx-gZniZ2
DNA电泳仪：北京六一仪器厂　　　　　 　 型号：DYY-6C
电热恒温水槽：上海森信实验仪器厂　　　　型号：DK-8D
真空泵：绍兴市卫星医疗设备制造有限公司 型号：G560E
37℃摇床，37℃孵箱（Gilson, 法国）
鸡饲养隔离器：苏静仪器厂
2.2 方法
2.2.1 携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒种子毒的构建与建立。
构建携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体，转染293细胞，救获重组病毒，重组病毒的传代扩增、建立携带H7N7亚型禽流感病毒NL-HA的重组腺病毒主代种子批毒种，及携带H7N9亚型禽流感病毒AH-HA的重组腺病毒主代种子批毒种，从该种子批毒种中选择血凝效价高的毒种作为工作种子批建立毒种。
2.2.2 rAd-HA7AH、rAd-HA7NL重组腺病毒载体禽流感疫苗的免疫原性检测
2.2.2.1 SPF鸡分组（隔离器饲养，脚环编号）
表2-1
2.2.2.2 免疫与检测
按照实验分组情况，每组免疫SPF鸡5只（21日龄），免疫后14d、21d、28d采血，并进行HI检测。HI检测要求同时使用H7N9/PR8AH和H7N9抗原进行HI检测和MN检测。
按照实验分组情况，每组免疫SPF鸡5只（21日龄），免疫后14d、21d、28d采血，并进行HI检测。HI检测要求同时使用非疫苗免疫的毒株抗原进行HI检测。
微量中和实验（Microneutralization，MN）
按流感病毒操作规程进行，中和病毒用H7N9AH/PR8重组病毒。
2.3 结果
2.3.1 H7与H9/H5的交叉反应性
对使用Ad5-H7AH（活疫苗）、Ad5-H7NL（活疫苗）、H7N9/PR8AH（灭活疫苗）免疫21天龄SPF鸡后，第14采集的血清，与H5N1（Re-1/4/5/6）和H9N2抗原进行血凝抑制实验，结果表明：HI价均为0，即H7的HA所产生的抗体与H5N1（Re-1/4/5/6）和H9N2的抗原HA无任何交叉反应，均为0。
对使用H5（Re-6）和H9灭活疫苗免疫21天龄SPF鸡后，第14天采集的血清，与Ad5-H7AH（抗原）、Ad5-H7NL（抗原）、H7N9/PR8AH（抗原）进行血凝抑制实验，结果表明：HI价平均为0-0.5，即大华农公司生产H5（Re-6）和H9灭活疫苗的所产生的抗体与H7的抗原无任何交叉反应，均为0。
对使用H5（Re-6）和H9灭活疫苗免疫21天龄SPF鸡后，第14天采集的血清，与H5N1（Re-1/4/5/6）和H9N2抗原进行血凝抑制实验，结果表明：H9与H5毒株之间无任何交叉保护作用，但是不同H5N1（Re-1/4/5/6）毒株之间存在一定交叉保护作用，如表2-2。
表2-2
综上所述，H5、H9和H7之间无交叉凝集情况。
2.3.2 免疫后抗体效价（HI）：
2.3.2.1 H7N9 AH /PR8（灭活疫苗）免疫SPF鸡抗体水平如图1：
以剂量2^10 H7N9/PR8AH（灭活疫苗）免疫后28天HI效价达10log2；以剂量2^9 H7N9/PR8AH（灭活疫苗）免疫后28天HI效价达9log2；达到同类生物制品的标准，如图2。
以剂量2^1010rAd-HA7AH（活疫苗）免疫后28天HI效价达8log2；以剂量2^9 rAd-HA7AH（活疫苗）免疫后28天HI效价达7log2；达到同类生物制品的标准，如图3。
以剂量2^1010rAd-HA7NL（活疫苗）免疫后28天HI效价达7log2；以剂量2^109rAd-HA7NL（活疫苗）免疫后28天HI效价达6log2；较同剂量rAd-HA7AH低2log2，也能达到同类生物制品的标准。
2.4 小结
2.4.1 H5、H9和H7抗原之间无交叉凝集现象。
2.4.1不论是活疫苗组还是灭活疫苗组，高剂量组明显高于低剂量组，多数组别差异显著 (P<0.05)。SPF鸡免疫PR8-H7N9-AH灭活疫苗后，高剂量免疫组（group 3，HA价为210）明显高于低剂量组（group 2，HA价为29），在第14、21、28天，HI效价平均相差分别为1.4、2.5、3.0，但差异不显著(P<0.05)。
2.4.2 本发明实施例一与实施例二所使用的携带H7亚型禽流感病毒HA的重组腺病毒活载体疫苗rAd-HA7NL和rAd-HA7AH免疫4周六龄SPF鸡后，以2^1010rAd-HA7AH免疫后28天抗体效价最高，2^109rAd-HA7AH免疫后28天抗体效价为7log2，以剂量2^1010rAd-HA7NL（活疫苗）免疫后28天HI效价达7log2；以剂量2^109rAd-HA7NL（活疫苗）免疫后28天HI效价达6log2；较同剂量rAd-HA7AH低2log2，也能达到同类生物制品的标准。
2.4.3 在检测抗体效价中，使用抗原PR8-H7N9-AH检测HI最高，使用哈兽研H7抗原检测HI最低。可能是由于不同来源抗原位点不一样所造成，即不同来源毒株HA序列遗传变异差异所引起的。
2.4.3 活载体疫苗在28天时SPF鸡血清的HI价均大于6（除group 6之外）。符合常规合格疫苗的标准
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (5)

1.一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建：将来自于A/Anhui/01/2013 的H7N9 亚型禽流感病毒株HA（简称AH-HA）及来自于A/Netherland//03的H7N7亚型禽流感病毒毒株HA（简称NL-HA）序列合成后，引物设计在5’端引入酶切位点，在3’端引入酶切位点，PCR扩增出目的片段后，用1%琼脂糖凝胶电泳回收后用相应酶切位点进行酶切，与pGA1载体连接后转化Top10感受态；测序正确后用特用酶进行酶切，并与线性化的pAd5进行同源重组，酶切及测序正确后保存，待转染重组；
（2）携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救：酶切线性化重组腺病毒质粒、并转染至293细胞，定期观察有无细胞病变出现，大约在10天左右收集原代病毒液，反复冻融后传代；第2代以后的重组腺病毒感染Trex 293细胞后可以出现明显的病变，即细胞皱缩、变圆、脱落和死亡；传第3代病毒液感染293细胞，48 h后收集细胞，经western blot鉴定HA抗原均可以正确表达；从而建立携带H7亚型禽流感重组腺病毒活载体疫苗种子批毒种；
（3）病毒扩增：
a、采用175cm2 培养瓶，每瓶各加入107 293细胞进行培养；
b、将45ml细胞裂解液上清加入105ml DMEM混匀，从培养瓶中移去培养液，加入5ml 混合液感染细胞，十字形缓慢晃动3次混匀，37℃ 培养90分钟，此时MOI 值约为25；
c、向培养瓶加入DMEM 至30ml/瓶，再培养48-72 小时，此时有3×1011～3×1012 个病毒，若需要，进行MOI 测定估计病毒滴度；
（4）收集病毒颗粒：先收集培养瓶中被感染细胞，然后重悬在5ml DMEM中，-20℃ /37℃冻融3次，离心沉淀细胞碎片，可得到病毒颗粒；
（5）病毒纯化：用标准的氯化铯密度梯度离心法纯化病毒颗粒，以10000g/min 的速度离心4小时，得到H7亚型禽流感病毒基因工程活载体疫苗的原液；
（6）半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，用腺病毒专用稀释液T101稀释，使携带不同H7亚型禽流感病毒HA复制缺陷型重组腺病毒达到1010vp/ml，即配制成H7亚型禽流感病毒活载体疫苗的半成品。
2.根据权利要求1所述的H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，病毒扩大培养后获得的是复制缺陷型携带H7亚型禽流感病毒HA的重组腺病毒，该病毒接种机体后只转录翻译表达H7亚型禽流感病毒HA蛋白及腺病毒蛋白，但不具有核酸成分，不会复制产生下一代子病毒。
3.根据权利要求1所述的H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，步骤（3）测定病毒滴度，采用MOI 测定。
4.根据权利要求1所述的H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，步骤（3）在109 细胞中扩增病毒可获得大量病毒保存液。
5.根据权利要求1所述的H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法，其特征在于，步骤（2）中抗原基因经过密码子优化，即选用真核细胞偏好的密码子。
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