CN111394315A - 表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系 - Google Patents

表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系及其制备方法，属于转基因技术领域。本发明的方法步骤简述如下：1)重组质粒构建；2)脂质体转染Marc145细胞；3)嘌呤霉素筛选；4)无血清培养基悬浮培养驯化。本发明的方法制备得到的细胞系对猪繁殖与呼吸综合征病毒十分敏感，可用于扩增繁殖大量的猪繁殖与呼吸综合征病毒病毒，成本较低，在疫苗生产实践中具有良好的应用前景。

Description

表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系
技术领域
本发明属于转基因技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的猪流行性疾病，其主要症状为怀孕母猪的繁殖障碍和肺部炎症。1996年该病传入中国，在全国各地爆发并流行，由于PRRSV遗传变异重组快，如今该病成为世界性重大疾病，给养猪造成了非常大的经济损失。
PRRSV分类上属于套式目病毒动脉炎病毒科动脉炎病毒属，是由囊膜的正链RNA病毒。PRRSV粒子呈球形，直径约为50～65nm，核衣壳为二十面体对称，直径约为30～35nm，PRRSV由很严格的细胞嗜性，主要侵染单核/巨噬细胞。猪肺泡巨噬细胞(PAM)是PRRSV最主要的靶细胞，但是PAM细胞不适合传代培养PRRSV，目前PRRSV疫苗所用的病毒都来自于非洲绿猴肾细胞Marc145培养，但是Marc145细胞培养的PRRSV病毒效价低，而且只能贴壁或者微载体悬浮培养，对PRRSV放大生产和成本控制的要求很高。
发明内容
为了得到一种成本低廉且能大量生产PRRSV的细胞系，本发明提供了如下技术方案：
一种表达猪CD163和CD169、且能在无血清培养基中悬浮培养的Marc145细胞系的制备方法，包括如下步骤：
1)重组质粒构建：将CD169基因连接到PB513B载体上，得PB513B-CD169质粒，再将CD163基因连接到PB513B-CD169质粒上，得PB513B-CD169-CD163质粒；
2)转染Marc145细胞：使用脂质体3000转染试剂将PB513B-CD163-CD169质粒与转座酶质粒(携带转座酶基因的质粒)一起转染到Marc145细胞内，在含有10％(v/v)的胎牛血清的DMEM培养基培养；
3)嘌呤霉素筛选：用含有嘌呤霉素和10％(v/v)胎牛血清DMEM培养基筛选转基因细胞；
4)培养驯化：将转基因细胞进行传代培养，培养基中的胎牛血清浓度逐代降低，并最终使用无血清培养基进行悬浮培养。
如前述的制备方法，步骤3)具体是用含有2μg/mL嘌呤霉素和10％(v/v)胎牛血清DMEM培养基筛选转基因细胞。
和/或，步骤4)中的培养驯化方法是：首先在含10％(v/v)胎牛血清的MEM培养基培养两代，再换到含5％胎牛血清的BD004培养基中培养一代，再换到含2％胎牛血清的BD004培养基中培养一代，再用胰酶消化Marc145细胞使脱离培养皿，转移到CDMarc145259无血清悬浮培养基悬浮培养2代以上。
如前述的制备方法，步骤1)中CD163基因是使用序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物扩增cDNA，得到产物后，再用序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物扩增得到；
所述cDNA是由猪肺泡巨噬细胞总RNA反转录得到的。
如前述的制备方法，步骤1)中CD169基因是使用序列如SEQ ID NO.3～4所示的引物扩增cDNA，得到产物后，再用序列如SEQ ID NO.5～6所示的引物扩增得到；
所述cDNA是由猪肺泡巨噬细胞总RNA反转录得到的。
如前述的制备方法，步骤1)中CD169被连接在PB513B载体的XbalI和BamHI限制性酶切位点之间。
如前述的制备方法，步骤1)中CD163被连接在PB513B载体的NotI限制性酶切位点处。
如前述的制备方法，步骤2)中所述转座酶质粒是PiggyBac SuperTransposase(武汉淼灵生物科技有限公司，Cat#P0179)。
如前述的制备方法，步骤2)中PB513B-CD163-CD169质粒与转座酶质粒的质量比是2：1。
前述方法制备得到的细胞系。
前述细胞系在培养猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
本发明的有益效果如下：
1)极大地提高了Marc145细胞对PRRSV的易感性，使前者能作为大量繁殖后者的优良宿主。实验表明，接毒30小时后病毒的TCID50可达到8.0。
2)本发明的Marc145细胞系能够脱离微载体实现悬浮培养，且培养基无需添加血清，大大减少了生产成本。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1：PB513B-CD169-CD163转基因载体结构示意图。
图2：PCR鉴定转基因Marc145细胞；M.1kb DNA标准分子量；1.PB513B-CD169-CD163转基因载体质粒；2.转基因Marc145细胞基因组DNA；3.未转基因Marc145细胞基因组DNA；4.转基因Marc145细胞总RNA逆转录的cDNA；5.未转基因Marc145细胞总RNA逆转录的cDNA。
图3：荧光显微镜检测转基因Marc145细胞。
具体实施方式
实施例1本发明表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系的构建和鉴定
一、获取CD163和CD169基因
1.通过NCBI网站查找CD163(序列号：EU016226.1)和CD169(序列号：AF509585.1)基因的mRNA序列。设计引物序列CD163F(SEQ ID NO.1)和CD163R(SEQ ID NO.2)用于扩增CD163序列；引物序列CD169F(SEQ ID NO.3)和CD169R(SEQ ID NO.4)。
2.取2mL培养的猪原代肺泡巨噬细胞，使用天根生化科技(北京)有限公司的动物组织总RNA提取试剂盒(DP431)提取总RNA，然后再用RT-PCR试剂盒(天根生化：KR118)反转录成cDNA。
3.以获得的cDNA为模板，分别用引物CD163F(SEQ ID NO.1)和CD163R(SEQ IDNO.2)PCR扩增CD163基因，CD169F(SEQ ID NO.3)和CD169R(SEQ ID NO.4)PCR扩增CD169基因分子。
PCR体系如下：
Figure BDA0002411171100000031
Figure BDA0002411171100000041
PCR程序如下：94℃,2min；94℃,15s,60℃,15s,72℃,90s,25个循环；72℃，5min。
二、构建表达CD163和CD169的转基因载体
1.将CD169基因克隆连接到PB513B载体上
1)PCR扩增回收CD169基因分子
设计PCR引物PBCD169F(SEQ ID NO.5)和PBCD169R(SEQ ID NO.6)，扩增CD169基因，PCR体系如下：
Figure BDA0002411171100000042
PCR程序如下：94℃,2min；94℃,15s,60℃,15s,72℃,90s,25个循环；72℃，5min。
将获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用天根生化科技有限公司的超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP208)进行胶回收纯化CD169DNA分子。
2)酶切PB513B载体并纯化回收
用XbalI和BamHI限制性内切酶酶切PB513B载体，酶切体系如下：
40μl PB513B质粒(100ng/μl)
2μlXbaI
2μlBamHI
6μl超纯水
37℃酶切3小时，然后加入6XDNA上样缓冲液，进行1％凝胶电泳，100V恒压进行电泳15min，然后纯化回收DNA片段，然后用天根生化科技有限公司的超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP208)进行胶回收纯化酶切的PB513B载体片段。
3)连接
将获得的CD169基因片段和酶切回收的PB513B载体片段通过EasyGeno快速重组克隆试剂盒连接，连接体系如下：
Figure BDA0002411171100000051
50℃温育15min，然后放置冰上，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。转化步骤如下：
取50μL大肠杆菌感受态细胞，加入适量质粒(体积不得超过5μL)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；加400μLLB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min；取50-100μL涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
4)筛选，测序确认
从培养皿上挑起若干个单菌落到5mLLB培养基中过夜培养，通过质粒提取试剂盒提起质粒，然后酶切进行鉴定，获得的质粒命名为PB513B-CD169,最后送测序公司测序确认序列正确。
2.将CD163基因连接到PB513B-CD169质粒
1)PCR扩增CD163基因分子
设计PCR引物PBCD163F(SEQ ID NO.7)和PBCD163R(SEQ ID NO.8)，扩增CD163基因，PCR体系如下：
Figure BDA0002411171100000052
PCR程序如下：94℃,2min；94℃,15s,60℃,15s,72℃,90s,25个循环；72℃，5min。
将获得的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用天根生化科技有限公司的超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP208)进行胶回收纯化CD163DNA分子。
2)NotI酶切质粒PB513B-CD169
用NotI酶切质粒PB513B-CD169，体系如下：
40μlPB513B-CD169质粒(100ng/μl)
2μlNotI
8μl超纯水
37℃酶切3小时，然后加入6XDNA上样缓冲液，进行1％凝胶电泳，100V恒压进行电泳15min，然后纯化回收DNA片段，然后用天根生化科技有限公司的超薄琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP208)进行胶回收纯化酶切的PB513B-CD169载体片段。
3)连接CD163分子和载体PB513B-CD169
将获得的CD163基因片段和酶切回收的PB513B-CD169载体片段通过EasyGeno快速重组克隆试剂盒连接，连接体系如下：
Figure BDA0002411171100000061
3.感受态转化和验证序列
50℃温育15min，然后放置冰上，转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞中。转化步骤如下：
取50μL大肠杆菌感受态细胞，加入适量质粒(体积不得超过5μL)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；加400μLLB培养基，于37℃摇床慢摇振荡培养45-60min；取50-100μL涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的LB固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
从培养皿上挑起若干个单菌落到5mLLB培养基中过夜培养，通过质粒提取试剂盒提起质粒，然后酶切进行鉴定，获得的质粒命名为PB513B-CD169-CD163(结构如图1所示),最后送测序公司测序确认序列正确。
4.提取去内毒素的质粒
经测序确认正确的质粒PB513B-CD169-CD163还需要用去内毒素质粒提取试剂盒(DP118,天根生化)提取无内毒素的质粒DNA，因为内毒素会影响之后的细胞转基因实验。
三、转染Marc145细胞
1.嘌呤霉素筛选浓度确定
将50万个Marc145细胞加入24孔板的孔中，然后分别加入1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL和10μg/mL的嘌呤霉素，每天观察细胞的生长情况。可知，2μg/mL的嘌呤霉素在3天内杀死全部细胞，因此2μg/mL的嘌呤霉素浓度选为筛选浓度。
2.PB513B-CD163-CD169质粒转染Marc145细胞
在1.5mLEP管中，将PB513B-CD163-CD169质粒(2μg)与1μg转座酶质粒(PiggyBacSuperTransposase，武汉淼灵生物科技有限公司，Cat#P0179)一起加到100微升脂质体3000的缓冲液中，轻轻混匀，然后加入8微升脂质体3000转染试剂，混匀，室温放置15分钟，然后将质粒与转染试剂的混合溶液加入在六孔板中的Marc145细胞里，轻轻混匀，在37度培养箱(含5％CO2)中静置培养4小时后，换入含有10％胎牛血清的DMEM培养基。
3.嘌呤霉素筛选转染的细胞；
转基因的Marc145细胞培养48小时后，换含有2μg/mL的嘌呤霉素DMEM培养基(含10％胎牛血清)继续培养直至所有未转基因细胞死亡。
4.克隆筛选细胞
将获得的转基因Marc145细胞用胰酶消化下来，稀释到10个细胞/mL，然后取100微升加入到96孔板中培养，显微镜观察96孔板中的细胞，确定只有单个细胞的培养孔并记录，每3天更换培养基直至细胞长满96孔板。
5.悬浮驯化
将获得的转基因Marc145细胞首先在MEM培养基(加10％胎牛血清)培养两代，然后换到BD004培养基(甘肃健顺生物技术有限公司)(含5％胎牛血清)培养一代，再换到BD004培养基(含2％胎牛血清)培养一代，之后用胰酶将转基因Marc145细胞消化下来，测得细胞活性在95％以上，然后转到CDMarc145259无血清悬浮培养基(甘肃健顺生物技术有限公司)中进行悬浮培养，悬浮培养两代至细胞活性95％以上。
四、转基因细胞鉴定
取1mL悬浮的转基因Marc145细胞，用基因组提取试剂盒(天根生化科技有限公司：DP304-02)和RNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司：DP430)分别提取基因组DNA和细胞总RNA，其中总RNA用逆转录酶反转录成cDNA,然后分别用引物CD169F和CD169R PCR鉴定CD169基因，引物CD163F和CD163RPCR鉴定CD163转基因及基因表达情况(图2)，并且用绿色荧光显微镜观察转基因Marc145细胞转基因表达(图3)。
五、猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSVTB-PX株在转基因悬浮Marc145细胞上的增殖
1.细胞准备
一般长满细胞的75T细胞瓶总细胞量为(1.3/1.4)×107，接毒前可1:2.5传代，7×106cells/75T。补加10％血清的培养基至20ml，37℃、5％CO2培养箱内培养16～24h，待细胞长满瓶底95％备用。(75T指75T细胞培养瓶，下同)
2.感染接毒
1)取出病毒液(已知毒液效价)置于冰上融化；
2)吸弃细胞瓶内培养液，加入5ml含0.5％血清的DMEM维持液，按0.3moi(如PFU107.0/ml，细胞数7×106cells/75T(长满按照即1×107cells/75T计算)，病毒剂量Xml，此时moi＝PFU/总细胞数即0.3＝107.0X/107，X＝0.33ml)加入待培养的种毒液；置于37℃、5％CO2培养箱内感作，每20min轻轻晃动培养瓶，使病毒粒子尽可能散布于细胞表面，90-120min后加入15ml含0.5％血清的DMEM维持液，置于37℃、5％CO2培养箱培养45h～72h，至70％～80％细胞病变漂浮。
3.病毒收获
显微镜下观察大部分细胞脱落，CPE达80％以上即可收获病毒液(收获细胞上清)；3000rpm/min，离心处理20min，取上清于-80℃保存。
4.病毒液TCID50测定
1)细胞消化：选择将生长状态良好的Marc145细胞，吸弃掉培养基，加入1ml胰酶/25T(3ml/75T)，置于37℃培养箱进行消化，注意随时观察(一般1～2min)，吸弃胰酶，盖上盖子轻拍细胞瓶可见细胞呈沙粒状脱落(若细胞未脱落，可将细胞瓶重新放回37℃培养箱继续消化)。
2)细胞铺板：用含10％新生牛血清的DMEM悬浮细胞，按3×105/mL细胞浓度均匀铺于96孔细胞培养板，每孔0.1ml；置于37℃、5％CO2培养箱培养至细胞长满孔底90％～95％，约16h～24h。
3)样品稀释与接种：根据样品数量准备灭菌1.5ml EP管，由左向右排成一行置于管架，分别加入0.9ml含2％胎牛血清的DMEM稀释细胞；取待检病毒样品0.1ml做10倍系列稀释，准备10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10等多个稀释度样品。
4)接种病毒：弃去96孔板的DMEM培养液，选取适宜的稀释梯度作为接种材料，每一个稀释度接种6孔，每孔接种0.1ml，同时设立阴性对照(2％胎牛血清的DMEM)和阳性对照(接种病毒前先每孔悬空补加0.1ml2％胎牛血清的DMEM，使每孔终体积0.2ml，置37.0℃、5％CO2培养箱中继续培养96h～120h)。
5)结果记录及计算：接毒培养后，每天在显微镜下观察细胞病变情况；详细记录，并根据细胞病变情况按Reed-Muench法(计算检品的病毒含量(TCID50)。结果显示转基因Marc145细胞接毒30小时后病毒含量最高，能达到TCID50＝9.5；而未转基因的Marc145细胞测得的最高TCID50只有7.5(见表1)。
表1 Marc145细胞及转基因改造的Marc145细胞培养的PRRSV病毒在不同时间收获的病毒繁殖效价(TCID50)
Figure BDA0002411171100000091
本发明通过将CD163和CD169构建到Marc145细胞系，并对其进行无血清和悬浮培养驯化，能够得到一种对PRRSV敏感的无血清悬浮培养细胞系。该细胞系能够克服现有技术中PRRSV培养细胞的低敏感性、不适合传代、依赖血清、无法悬浮培养的缺点，能显著提高PRRSV的产量和生产效率，具有十分良好的应用前景。
说明书涉及的序列：
SEQ ID NO.1：
5’-CACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTACATGAAAACTCT-3’
SEQ ID NO.2：
5′-TCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTGAGGGATT-3′
SEQ ID NO.3：
5′-CACCATGGACTTCCTGCTCCTGCTCCTC-3′
SEQ ID NO.4：
5′-TCAGACTGTGCTTTTCACAGACTGTGTGTTTTCACAGAG-3′
SEQ ID NO.5：
5’-GTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGAATGGACTTCCTGCTCCTGCTCCTC-3′
SEQ ID NO.6：
5’-GCAGATCCTTCGCGGCCGCGTCAGACTGTGCTTTTCACAGACTGT-3’
SEQ ID NO.7：
5’-AGTCTGTGAAAAGCACAGTCCGCGGGAGTCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCA-3′
SEQ ID NO.8：
5’-GAGCGATCGCAGATCCTTCGCTCATTGTACTTCAGAGTGGTCTCCTGAGG-3′
SEQUENCE LISTING
<110> 成都天邦生物制品有限公司
史记生物技术(南京)有限公司
马鞍山史记动物健康管理有限公司
<120> 表达猪CD163和CD169分子的悬浮Marc145细胞系
<130> GY768-2019P018650CC
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
caccatggac aaactcagaa tggtgctaca tgaaaactct 40
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcattgtact tcagagtggt ctcctgaggg att 33
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tcattgtact tcagagtggt ctcctgaggg att 33
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcagactgtg cttttcacag actgtgtgtt ttcacagag 39
<210> 5
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gttttgacct ccatagaaga ttctagaatg gacttcctgc tcctgctcct c 51
<210> 6
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcagatcctt cgcggccgcg tcagactgtg cttttcacag actgt 45
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
agtctgtgaa aagcacagtc cgcgggagtc gcggaagcgg agctactaac ttca 54
<210> 8
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagcgatcgc agatccttcg ctcattgtac ttcagagtgg tctcctgagg 50

Claims (10)

1.一种表达猪CD163和CD169、且能在无血清培养基中悬浮培养的Marc145细胞系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)重组质粒构建：将CD169基因连接到PB513B载体上，得PB513B-CD169质粒，再将CD163基因连接到PB513B-CD169质粒上，得PB513B-CD169-CD163质粒；
2)转染Marc145细胞：使用脂质体3000转染试剂将PB513B-CD163-CD169质粒与转座酶质粒一起转染到Marc145细胞内，在含有10％(v/v)的胎牛血清的DMEM培养基培养；
3)嘌呤霉素筛选：用含有嘌呤霉素和10％(v/v)胎牛血清DMEM培养基筛选转基因细胞；
4)培养驯化：将转基因细胞进行传代培养，培养基中的胎牛血清浓度逐代降低，并最终使用无血清培养基进行悬浮培养。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤3)具体是用含有2μg/mL嘌呤霉素和10％(v/v)胎牛血清DMEM培养基筛选转基因细胞；
和/或，步骤4)中的培养驯化方法是：首先在含10％(v/v)胎牛血清的MEM培养基培养两代，再换到含5％胎牛血清的BD004培养基中培养一代，再换到含2％胎牛血清的BD004培养基中培养一代，再用胰酶消化Marc145细胞使脱离培养皿，转移到CD Marc145 259无血清悬浮培养基悬浮培养2代以上。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中CD163基因是使用序列如SEQ ID NO.1～2所示的引物扩增cDNA，得到产物后，再用序列如SEQ ID NO.7～8所示的引物扩增得到；
所述cDNA是由猪肺泡巨噬细胞总RNA反转录得到的。
4.权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中CD169基因是使用序列如SEQ ID NO.3～4所示的引物扩增cDNA，得到产物后，再用序列如SEQ ID NO.5～6所示的引物扩增得到；
所述cDNA是由猪肺泡巨噬细胞总RNA反转录得到的。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中CD169被连接在PB513B载体的XbalI和BamHI限制性酶切位点之间。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
步骤1)中CD163被连接在PB513B载体的NotI限制性酶切位点处。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述转座酶质粒是PiggyBacSuperTransposase。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
步骤2)中PB513B-CD163-CD169质粒与转座酶质粒的质量比是2：1。
9.权利要求1～8任一所述方法制备得到的细胞系。
10.权利要求9所述细胞系在培养猪繁殖与呼吸综合征病毒中的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694575A (zh) * 2023-08-02 2023-09-05 上海澳斯康生物制药有限公司 悬浮培养Marc145细胞的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190313615A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-17 The Curators Of The University Of Missouri Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)
CN110373379A (zh) * 2019-07-25 2019-10-25 北京鼎持生物技术有限公司 一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190313615A1 (en) * 2018-04-17 2019-10-17 The Curators Of The University Of Missouri Methods for protecting porcine fetuses from infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus (prrsv)
CN110373379A (zh) * 2019-07-25 2019-10-25 北京鼎持生物技术有限公司 一种Marc-145全悬浮细胞直接培养猪蓝耳病病毒疫苗的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
吴香菊: "稳定高效表达猪CD163的MARC-145细胞系的构建及其应用" *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694575A (zh) * 2023-08-02 2023-09-05 上海澳斯康生物制药有限公司 悬浮培养Marc145细胞的方法
CN116694575B (zh) * 2023-08-02 2023-12-01 上海澳斯康生物制药有限公司 悬浮培养Marc145细胞的方法

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