CN104178505A - 一种表达猪瘟病毒e2基因重组病毒及制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用，本发明根据密码子的偏爱性，将人工合成CSFV2.1型免疫原性基因E2基因和1.1型E2基因分别置于杆状病毒pH和p10启动子下表达，获得了一种重组杆状病毒，CCTCCNO:V201338，提高了外源基因的表达量。本发明的重组杆状病毒所表达E2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日本大白兔和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受猪瘟病毒的攻击，同时可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物，利于猪场猪瘟病毒的根除和净化。

Description

一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用

技术领域

本发明属于兽医生物技术领域。本发明涉及一种重组杆状病毒毒株的构建方法。具体涉及一种表达猪瘟病毒E2基因的重组杆状病毒Ac-CSE12的制备方法及其在预防猪瘟感染的亚单位疫苗中的应用。利用本发明的重组病毒表达人工修饰的猪瘟病毒E2基因，可以用于制备安全的猪瘟病毒亚单位疫苗。

背景技术

猪瘟是(Classical swine fever,CSF)是由黄病毒科瘟病毒属猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种高度接触性、出血性和致死性传染病。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。当前猪瘟在我国很多猪场流行，临床上表现为早产、流产、死胎、木乃伊胎及猪生产能力下降等。同时该病与伪狂犬病、圆环病毒感染相关疾病等多重感染和混合感染常常发生。但却没有有效的治疗药物，只能使用疫苗来免疫动物，达到预防疾病的目的。E2蛋白是诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原主要成分，可以抵抗强毒的攻毒保护实验(Weiland et al.,1990；Greise et al.，1990；Dong et al.,2006；Chen et al.,2011；Llilianne Gangesa et al.,2012)，是构建猪瘟新型基因工程疫苗的首选靶蛋白。利用CSFV E2蛋白制备的亚单位疫苗没有非结构蛋白，可以利用检测Erns蛋白的抗体来区分疫苗免疫和野毒感染猪群。目前，猪瘟的流行形势十分复杂。我国流行的猪瘟病毒基因亚型较多，包括2.1，2.2，2.3和1.1亚型；在1994年的台湾也出现基因3型的猪瘟病毒；其中基因2.1(尤其2.1b)亚型在我国广泛流行(涂长春，2004；Weihuan Fang et al.,2007；Luo Y et al.,2014)。尽管猪瘟兔化弱毒疫苗能有效的预防不同基因亚型病毒的感染，但是猪瘟仍在部分区域呈流行态势，并存在代毒与免疫临床发病现象。猪瘟作为我国优先防治的一类动物传染病，仍迫切需要便于鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗以及配套的诊断试剂。

近年来，杆状病毒表达载体因其具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效率高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点,已经在表达载体上占了主导的地位(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。利用杆状病毒表达载体同时表达CSFV 2.1型和1.1型的E2蛋白，制备亚单位疫苗，能同时预防I群和II群猪瘟病毒感染，也利于与野毒感染进行鉴别诊断。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合cDNA基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一个目的是提供一种转移载体pFastBac2E2，该载体分别含有1个拷贝CSFV 2.1型和1.1型免疫原性基因E2基因的cDNA序列。

本发明还有一个目的就是提供一种表达猪瘟病毒E2蛋白的重组杆状病毒，该毒株被命名为Ac-CSE12，属于杆状病毒(Baculovirus)，该病毒含有CSFV 2.1型和1.1型免疫原性基因E2，该病毒于2013年9月9日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:V201338，分类命名：重组杆状病毒Recominant Autographa californicamultiple Nucleopolyhedrovirus Ac-CSE12，地址：中国武汉武汉大学。

本发明还有一个目的是提供了一种猪瘟病毒重组杆状病毒Ac-CSE12的制备方法，该方法简单易行，适合大规模生产。

本发明还有一个目的是提供了一种猪瘟重组杆状病毒Ac-CSE12在制备亚单位疫苗中的应用，将该病毒免疫日本大白兔后可诱导机体产生特异性免疫反应，并能免受1.1型和2.1型的CSFV的攻击。重组杆状病毒表达E2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。

更详细的技术方案见《具体实施方式》所述。

本发明的有益效果是：

1.本发明根据密码子的偏爱性，人工修饰合成了CSFV QZ-07毒株的免疫原性基因E2，提高了这些基因在杆状病毒中表达水平。

2.本发明是将人工合成CSFV 2.1型免疫原性基因E2基因和1.1型E2基因分别置于杆状病毒pH和p10启动子下表达，提高了外源基因的表达量。

3.本发明的重组杆状病毒所表达E2蛋白制备亚单位疫苗，免疫日本大白兔和猪后，可诱导机体产生特异性免疫反应，并免受猪瘟病毒的攻击。

4.本发明的重组杆状病毒表达E2蛋白制备亚单位疫苗免疫动物后，可以通过鉴别诊断区分疫苗免疫和野毒感染动物。

附图说明

图1为一种杆状病毒载体pFastBac2E2的酶切鉴定图谱。

M：5000bp DNA Marker；1:pFastBac2E2/BgLII酶切；2:pFastBac2E2/NHeI酶切

图2为一种重组杆粒rBac-CSE12PCR鉴定示意图。

鉴定正确的杆状病毒转移载体pFastBac2E2转化DH10Bac，蓝白斑筛选获得阳性菌落，提取杆粒rBac-CSE12进行PCR鉴定的电泳图片。

水：阴性对照M:15000bp；1、7:阴性对照M:15000bp DNA Marker；2：M13上游引物和2.1E2下游引物扩增(3800bp)；3～6：M13引物扩增(4800bp)

图3为一种Western blot分析杆状病毒Ac-CSE12蛋白表达的示意图；

1：杆状病毒Ac-CSE12感染sf9细胞；2：为感染的sf9细胞

图4为一种间接免疫荧光分析杆状病毒Ac-CSE12蛋白表达的示意图；

a：观察红荧光，b：绿荧光，c：观察细胞核，d：a-c合在一起的图片

图5为重组杆状病毒Ac-CSE12表达E2蛋白的western blot定量分析

M：marker；1-3：CSFV E2蛋白；4-7：为倍比稀释的His标签蛋白(4：112μg/mL；5：56μg/mL；6：28μg/mL；7：14μg/Ml)；

图6重组杆状病毒Ac-CSF12表达外源蛋白的稳定性分析

M：蛋白marker；1：F15代Ac-CSF12；2：F12代Ac-CSF12；3：F9代Ac-CSF12；4：F6代Ac-CSF12；5：F3代Ac-CSF12；6：F1代Ac-CSF12

图7为日本长耳大白兔免疫后不同时间抗CSFV的阻断ELISA示意图

重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫日本大白兔后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV的阻断ELISA抗体水平。

图8为日本长耳大白兔免疫后不同时间抗CSFV 1.1和2.1基因型病毒中和试验结果图

重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫日本大白兔后0、14、28和42天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV石门毒株(1.1基因型)和HZ07毒株(2.1基因型)中和抗体水平。

A:抗CSFV石门毒株(1.1基因型)的中和抗体水平；B:抗CSFV HZ07毒株的中和抗体水平。

图9为猪免疫后不同时间抗CSFV的阻断ELISA抗体示意图

重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫猪后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV的阻断ELISA抗体水平。

图10为猪免疫后不同时间抗CSFV E0的ELISA抗体示意图

重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗、猪瘟兔化弱毒疫苗以及细胞对照免疫猪后0、14、28、42和56天采集血清，检测不同时间血清中抗CSFV E0的ELISA抗体水平。

图11猪体攻毒后不同时间的体温统计图

攻毒后每天测定猪的体温，结果表明猪瘟病毒兔化弱毒疫苗阳性组体温没有升高，重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组猪体的体温在攻毒后6天时有所升高，而细胞阴性对照组出现典型的高热反应。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所述实际，如未特别说明，均为商业化或是已公开的试剂材料。

实施例1：

一种表达CSFV的免疫原性基因E2基因重组杆状病毒Ac-CSE12的构建

(一)、重组杆状病毒Ac-CSE12的构建

1、CSFV主要免疫原性基因E2的获得

参照CSFV QZ-07分离株(2.1型猪瘟病毒)E2基因序列(GenBank No.FJ456876)，根据杆状病毒密码子的偏爱性人工合成1222bp的E2基因序列，该序列克隆入载体pUC-18(Invitrogen公司)中获得重组质粒pUC-57-2.1-E2。

以质粒pMD-18T-CSFV-E2(含有猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株HCLV的E2基因，硕士生：谭华菊；导师：钱平；华中农业大学2009年硕士论文：BVDV E2基因重组猪瘟病毒的构建与猪IRF3/7克隆表达的研究)为模板，利用引物1.1E2-GZF和1.1E2-GZR(1.1E2-GZF：5’-TTTTGGATCCACCATGCGGCTAGCCTGCAAG-3’；1.1E2-GZR：5’-TTTGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCTGCGAAGTAATCT-3’)扩增993bp的E2基因，并在E2基因的C端引入6his序列作为标签。通过引物在基因片段的上下游引入BamHI和NotI酶切位点。将该片段连入pMD-18T载体，命名为pMD-18T-1.1E2。

2、杆状病毒转移载体pFastBac2E2的构建

以杆状病毒通用载体pFastBac^TMdual(Invitrogen公司)为骨架，通过BamHI和Not I分别酶切pFastBac^TMdual和pMD-18T-1.1E2，回收后进行连接构建质粒pFastBac-1.1E2。以pUC-57-2.1-E2(上海生工生物公司合成)为模板，利用引物2.1E2-GZF和2.1E2-GZR(2.1E2-GZF(XhoI)：5’-TTTGCTAGCCACCATGCTCGAGTTAACCAGCGGCGAGT-3’；2.1E2-GZR(KpnI)5’-TTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCATGCGCCCCTTCCTGCT-3’)，扩增2.1E2基因，同时在C端引入6his标签序列，PCR产物通过XhoI和KpnI酶切后克隆入pFastBac-1.1E2的相应位点，获得转移质粒pFastBac-1.1E2-2.1E2(命名为pFastBac2E2)。通过BgLII和NHeI分别单酶切鉴定pFastBac2E2，结果显示BgLII单酶切后有3600bp，2000bp，1324bp和500bp四条片段，NHeI单酶切后有7102bp和322bp两条片段，大小与预期结果一致，表明转移质粒pFastBac2E2构建成功，酶切鉴定结果如图1所示，其包含有SEQ ID NO.1所示的融合基因序列，该序列编码的蛋白质为SEQ ID NO.2所示。

3、重组病毒杆状病毒Ac-CSE12的构建

(1)重组杆粒Ac-CSE12的获得与鉴定

取3.0μL pFastBac2E2与100μL DH10Bac大肠杆菌感受态细胞(GiBCO BRL公司产品)混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴进行热激，然后冰浴2min，加入900μL LB液体培养基(氯化钠浓度为10％)，37℃振摇培养4h，按10-1、10-2、10-3稀释后，各取100μL涂布于含有三抗(卡那霉素、庆大霉素和四环素)高盐LB平板，使用浓度按Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作说明书(Invitrogen公司)，37℃培养24-48h，通过蓝白斑筛选、纯化阳性菌落，提取重组杆粒rBac-CSE12，通过两对PCR引物扩增鉴定：M13上游引物(M13F)和2.1E2-GZF下游引物(M13R)，M13上游引物(M13F)和M13下游引物(M13R)。

M13F：5’-CCCAGTCACGACGACGTTGTAAAACG-3’；

M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；

2.1E2-GZR：5-TTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCATGCGCCCCTTCCTGCT-3

其PCR扩增体系如下：

按95℃作用3分钟；然后94℃作用30秒分钟，56℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟的反应条件在PCR仪上进行扩增。将扩增的PCR产物经1.0％(重量/体积，w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳，结果表明能够扩增出4800bp和3800bp的两条特异目的条带，大小与预期一致，表明CSFV E2基因片段在大肠杆菌中已成功重组入杆状病毒基因组中(图2)。

(2)重组杆状病毒Ac-CSE12获得

无菌挑取含重组杆粒rBac-CSE12的阳性菌落于高盐LB液体培养基中，培养至细菌对数生长期时收集菌体，用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA,25mmol/L Tris-Cl(pH8.0))重悬，加入0.3mL溶液II(0.2mol/L NaOH,1％SDS,现用现配)轻微混匀，室温静置5min，缓慢加入0.3mL溶液III(3mol/L的乙酸钾，pH5.0)混匀，冰浴5-10min，14000r/min离心10min，上清加到0.5mL异丙醇中，混匀冰浴5～10min，室温14000r/min离心15min，75％乙醇洗涤沉淀，干燥后溶于40μL TE中，分装于4℃保存1-2周或-80℃长期保存，避免反复冻融。

利用脂质体介导转染法(按Invitrogen公司Bac-to-Bac Baculovirus Expression System操作说明书操作)，将筛选纯化后的重组杆粒rBac-CSE12经Reagent转染sf9细胞(购自武汉大学中国典型物保藏中心)中，于28℃培养，转染后96h放置荧光显微镜观察细胞病变情况，收集细胞上清即获得重组杆状病毒Ac-CSE12，置于-80℃保存。该病毒已于2013年9月8日送至中国典型微生物保藏中心进行保藏，分类命名：重组杆状病毒(Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus)Ac-CSE12；保藏编号：CCTCC V201338。地址：中国武汉武汉大学。

此重组杆病毒Ac-CSE12具有与亲本毒株苜蓿银蚊夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)相同的形态学特性和培养特性。

(二)、重组杆状病毒Ac-CSE12外源基因表达的检测

1、Westerning blot分析检测外源基因的表达

将sf9细胞接种6孔细胞培养板，待细胞长成80-90％单层时，用1.0MOI Ac-CSE12接种sf9细胞，待90％以上的sf9细胞发生病变时收集细胞并超声波裂解。样品经SDS-PAGE电泳后转移至纤维素膜，以HIS单克隆抗体(Sigma)为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗进行Western-blotting检测CSFV E2基因的表达。结果显示Ac-CSE12感染的细胞样品中有两条特异条带：45KDa条带，大小与1.1型CSFV E2蛋白一致，50KDa条带大小与2.1型CSFV E2蛋白一致；而sf9细胞对照组都无此特异条带，表明插入的猪瘟病毒1.1和2.1基因型的E2基因均得到有效表达且具有很好的免疫活性，结果如图3所示。

2、间接免疫荧光鉴定外源基因的表达

重组杆状病毒Ac-CSE12按照1.0MOI感染复数的剂量接种sf9细胞，48h后进行间接免疫荧光检测E2基因的表达。His单克隆抗体为一抗(购自Sigma公司)，CY3-羊抗鼠IgG为二抗(购自Sigma公司)，最后放置共聚焦荧光显微镜下观察。结果表明Ac-CSE12感染的sf9细胞中有很强的红色荧光信号，而正常sf9细胞没有任何红色荧光信号，表明重组杆状病毒能有效表达E2蛋白，结果如图4所示。

3、重组杆状病毒Ac-CSE12表达外源蛋白的定量分析

将经检测正确的F4代Ac-CSE12种毒以1.0MOI毒量接种悬浮sf9细胞，感染后在84h收集细胞，加入裂解液并冻融3次。CSFV E2蛋白的定量以His标签蛋白为标准蛋白进行western-blot定量分析，结果显示表达CSFV E2蛋白的浓度约为43微克每毫升(μg/mL)(图5)。

4、重组杆状病毒Ac-CSE12表达外源蛋白表达稳定性检测

将Ac-CSE12从F4代依次传代至F15代，收集每代病毒感染细胞悬液。取F1、F3、F6、F9、F12和F15代感染细胞悬液，以His单克隆抗体(Sigma)为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG(Sigma)为二抗进行Western-blotting检测CSFV E2基因表达稳定性。结果显示：Ac-CSE12在F15代以前均能稳定表达外源E2蛋白，15代以后表达量有所下降(如图6)。

实施例2：

本发明的重组杆状病毒Ac-CSE12制备的亚单位疫苗与免疫效力实验

1、本发明的重组杆状病毒Ac-CSE12制备的亚单位疫苗

以实施例1获得的重组杆状病毒Ac-CSE12，按照1.0MOI的感染复数剂量接种悬浮培养的昆虫细胞High Five^TM(购自Invitrogen公司)，72h后收集细胞及上清，通过细胞破碎仪处理，离心除去细胞碎片，测定蛋白浓度后与206佐剂(购自SEPPIC公司)乳化制备成亚疫苗，使其每毫升中CSFV E2蛋白含量为40微克，用于以下实施例，放置4℃存储。

2、本发明的重组杆状病毒Ac-CSE12制备的亚单位疫苗技术指标的检验

(1)物理形状

外观本品为乳白色均匀乳剂。

剂型为双向剂型(水包油包水)，取一清洁吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，水面和水内都有。

粘度用出口内径为1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右的室温下，令其垂直流出，在8秒钟内流出0.5mL，是合格的。

(2)无菌检验

按照《中国兽药典》附录169-171页进行，结果表明没有细菌生长。

(3)安全检验

接种16-18克左右的小白鼠5只，每只皮下注射0.3ml，观察14天，结果表明该疫苗对小鼠时安全的。

接种1.5-2kg健康家兔2只，每只臀部皮下注射5ml，观察14天，结果显示该疫苗对家兔是安全的，无不良反应。

3、重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗对兔的免疫效力实验

为了评价上述制备亚单位疫苗的免疫效力，购买2.5斤体重的雌性日本大白兔12只(购自武汉大学动物实验中心)，随机分成3组，每组2只。其中sf9细胞阴性对照组2头，商品化猪瘟兔化弱毒疫苗阳性组2只，重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗实验组4只。其中实验组按照每只兔免疫40微克CSFV E2抗原，细胞对照组以细胞总蛋白40微克的剂量颈部肌肉注射2ml，3周后加强免疫一次。猪瘟兔化弱毒商品苗组按照100RID₅₀剂量，耳静脉注射免疫一次。首免后14，28，42，56天进行耳静脉采血，评价其免疫效果。首免后56天，以100RID₅₀剂量的猪瘟兔化弱毒株细胞毒进行耳静脉注射攻毒。攻毒后每6小时测量一次体温，连续观察5天，根据兔体是否出现定型热反应判断攻毒保护效果。体温观察后解剖兔子，取脾脏组织并提取RNA，根据文献(硕士论文：研究生：赵建军；导师：仇华吉；鉴别猪瘟病毒野毒株和兔化弱毒疫苗株的复合实时荧光定量RT-PCR方法的建立于评价；2007)合成定量引物，用荧光定量PCR检测病毒拷贝数含量。

阻断ELISA方法(货号：99-43220；购自美国IDEXX公司)检测血清中抗CSFV的抗体水平，结果表明重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组在一免后14天，28天的ELISA抗体较高，抗体阻断率达到75％，并且与商品化的疫苗免疫组抗体相当。加强免疫后能产生更高水平的ELISA阻断抗体，与商品化的疫苗免疫组抗体水平相当(如图7所示)。

为了进一步评价重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗对猪瘟病毒1.1和2.1基因型病毒的抵抗力，通过微量血清中和试验检测免疫后不同时间点的血清对猪瘟1.1基因型病毒(石门毒株)(第233页；D.L.Jiang,W.J.Gong,R.C.Li,G.H.Liu,Y.F.Hu,M.Ge,S.Q.Wang,X.L.Yu,C.Tu。Phylogenetic analysis using E2 gene of classical swine fever virus reveals a new subgenotype in China.Infect.,Genet.Evol.,2013(17),231–238)和猪瘟2.1基因型病毒(HZ1-07毒株)(第57页，基因登录号EF683627；含有猪瘟病毒兔化弱毒疫苗株HCLV的E2基因，博士生：陈宁；导师：方维焕；浙江大学2009年博士论文：携带流行性毒株E2基因的重组猪瘟病毒C株的拯救与鉴定)的中和能力。试验结果显示免疫后14天，猪瘟病毒商业疫苗和猪瘟亚单位疫苗免疫组均可以刺激机体产生针对猪瘟病毒石门毒株和HZ-07毒株中和抗体，加强免疫后中和抗体水平明显呈上升趋势，猪瘟商业疫苗的优于亚单位疫苗组(如图8所示)。42天时，猪瘟病毒商业疫苗和猪瘟亚单位疫苗免疫组针对猪瘟病毒石门毒株的中和抗体均达到约2⁸，对HZ1-07毒株的中和抗体分别为2⁶和2⁴。

攻毒前两天和攻毒后分别测量兔子体温，测定定型热反应(如表1所示)，结果表明猪瘟病毒兔化弱毒疫苗阳性组和重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组均没有出现定型热反应，而细胞对照组出现定型热反应(定型热反应：攻毒后体温升高，超过基础体温1℃以上，且持续超过18小时判断为定型热)。荧光定量PCR检测病毒拷贝数含量的结果表明，只有阴性对照组中4只兔体内检测到一定量的拷贝数，而猪瘟病毒兔化弱毒疫苗和重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗免疫组均没有均未能检测到病毒的拷贝数(如表2所示)。兔体免疫效力试验结果表明重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗免疫兔体后，能完全保护100RID₅₀剂量的猪瘟兔化弱毒株细胞毒的攻毒。

4、重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗对猪的免疫原性实验

为了进一步评价上述制备亚单位疫苗对本动物猪的免疫效力，选取约2月龄猪瘟阴性的猪12头，随机分成3组，每组4头。其中细胞对照组和实验组按照每头猪免疫40微克抗原的剂量，颈部肌肉注射2毫升，3周后加强免疫一次。猪瘟兔化弱毒商品苗组按照厂家说明书进行，每头猪免疫1头份，颈部肌肉注射，3周后加强免疫一次。首免后14，28，42天进行前腔静脉采血，评价其免疫效果。首免后42d，以1毫升猪瘟病毒血毒进行颈部肌肉注射攻毒。攻毒后每天测量一次体温，连续观察14天。每隔3天采血，通过荧光定量PCR检测病毒拷贝数含量。

猪免疫后不同时间点采血，用美国IDEXX公司猪瘟阻断ELISA试剂盒检测血清中猪瘟抗体水平，如图9所示，在免疫后28天时，重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组的ELISA抗体较高，抗体阻断率达到75％。免疫56天时重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组的ELISA抗体较高，抗体阻断率达到86％，并且与商品化的疫苗免疫组抗体相当(如图9所示)。

同时用猪瘟病毒E0蛋白包被ELISA酶联反应板建立的ELISA方法(硕士论文：研究生：戴佩华；导师：钱平；猪瘟病毒E0-ELISA抗体检测方法的初步建立及应用；2014)检测血清中E0抗体水平(如图10所示)。结果显示免疫后，猪瘟病毒兔化弱毒疫苗阳性组的E0抗体水平持续上升，而阴性对照组和猪瘟亚单位疫苗组均没有E0抗体的产生，表明猪瘟亚单位疫苗的免疫猪体后，可以通过E0抗体水平的检测进行疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断。

首免后42天攻毒并每天测定猪的体温，结果表明猪瘟病毒兔化弱毒疫苗阳性组体温没有升高，重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组在攻毒后5天体温正常，到6天时体温有所升高，而细胞阴性对照组出现典型的高热反应(如图11所示)。荧光定量PCR检测病毒拷贝数含量的结果表明，猪瘟病毒兔化弱毒疫苗阳性组没有检测到猪瘟病毒拷贝数，细胞阴性对照组在攻毒后3天即可检测到猪瘟病毒拷贝数，而重组杆状病毒Ac-CSE12亚单位疫苗试验组在攻毒前期检测不到病毒拷贝数，但攻毒后期可检测到一定量的猪瘟病毒拷贝数(如表3所示)。

猪瘟病毒的E0蛋白是重要保护性抗原，它能诱导机体产生一定的抗体水平，所以针对猪瘟病毒E0抗体水平的检测在对该病的监测中扮演着重要的角色。由于猪瘟商业化疫苗是利用兔体弱化的猪瘟病毒毒株制备的弱毒疫苗，所以不论是利用猪瘟商业化疫苗还是猪瘟野毒感染猪群后均可以产生针对E0蛋白的抗体。而本研究制备的猪瘟亚单位疫苗免疫机体后产生的是针对猪瘟病毒E2蛋白的抗体，所以没有E0蛋白的抗体。通过E0抗体的检测可以将猪瘟亚单位疫苗免疫猪群和野毒感染猪群进行区分，利于猪场猪瘟病毒的根除和净化。

表1：攻毒后兔子定型热反应表1

ND(not detectable)：没有检测到

表3：实时荧光定量RT-PCR检测攻毒后猪体血液中内猪瘟病毒RNA含量

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明范围内。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  华中农业大学

 

<120>  一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用

 

<130>  一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒及制备方法与应用

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.1

 

<210>  1

<211>  2484

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

atgcgcccct tcctgctgcg cgccgctcag ctcctggctc tgctggccct ggctctctcc     60

 

accgaggccc ctagcctctc cgccgaaact agatcttcct gtaaggaaga ctacaggtat    120

 

gccatctctt ccaccaacga ggtcggtcct ctaggtgctg aaggtctcac caccacctgg    180

 

cgcgagtata gccacggtct ccagctcgat gacggtactg tcagggccat ttgcactgct    240

 

ggttccttca aggttattgc actcaacgtg gtcagtcgcc gctacctggc atccctgcac    300

 

aagagggctc tgcccacctc cgtcacattc gaactcctat tcgatggtac tagcccagca    360

 

attgaggaga tgggcgatga cttcggcttc ggcctgtgcc ctctcgacac aaccccagtg    420

 

gtcaagggca agtacaacac cactctactg aacggtagcg ctttctacct agtctgccca    480

 

atcggctgga cgggtgtcat cgagtgcacg gcagtgagcc ccacaaccct ccgtacagaa    540

 

gtggtgaaga ccttcaagcg cgagaagcct ttcccacaca gagtggattg cgtgaccact    600

 

atcgtcgaga aggaggacct gttctactgc aagtggggcg gtaactggac atgtgtgaag    660

 

ggcaaccctg tgacctacat gggtggccaa gtcaagcaat gcaggtggtg cggtttcgac    720

 

ttcaaggagc ctgatggtct cccacactac cccatcggca agtgcatcct agcaaacgag    780

 

acgggttaca gggtcgtgga ttccacagac tgtaacagag atggcgtcgt tatcagcact    840

 

gagggcgaac acgagtgcct gattggcgac accaccgtca aggtgcacgc tctggatggc    900

 

agactgggtc ctatgccttg ccgtcccaag gagatcgcct ctagcgctgg tcctgtcagg    960

 

aagacttcct gtaccttcaa ctacaccaag gcactacgca acaagtatta cgagcccagg   1020

 

gacagctact tccagcaata catgctcaag ggcgagtacc aatactggtt cgacctggac   1080

 

gtgactgacc accacacaga ctacttcgct gaattcgtgg tcctcgtggt cgtggcacta   1140

 

ctgggcggta ggtacgtcct gtggctaatc gtgacctata tcgttctaac agagcaactc   1200

 

gccgctggtt aactcgagag gtgtcgagtg attgtaaata aaatgtaatt tacagtatag   1260

 

tattttaatt aatatacaaa tgatttgata ataattctta tttaactata atatattgtg   1320

 

ttgggttgaa ttaaaggtcc gtatactccg gaatattaat agatcatgga gataattaaa   1380

 

atgataacca tctcgcaaat aaataagtat tttactgttt tcgtaacagt tttgtaataa   1440

 

aaaaacctat aaatattccg gattattcat accgtcccac catcgggcgc gcggctagcc   1500

 

tgcaaggaag attacaggta cgcactatcg tcaaccaatg agatagggct actcggggcc   1560

 

ggaggtctca ctaccacctg ggaagaatac agccacgatt tgcaactgaa tgacgggacc   1620

 

gttaaggcca tttgcgtggc aggttccttt aaagtcacag cacttaatgt ggtcagtagg   1680

 

aggtatttgg catcattgca taagggggct ttactcactt ccgtgacatt cgagctcctg   1740

 

ttcgacggga ccaacccatc aaccgaagaa atgggagatg acttcgggtt cgggctgtgc   1800

 

ccgtttgata cgagtcctgt tgtcaaggga aagtacaata caaccttgtt gaacggtagt   1860

 

gctttctacc ttgtctgccc aatagggtgg acgggtgtta tagagtgcac agcagtgagc   1920

 

ccaacaactc tgagaacaga agtggtaaag accttcagga gagagaagcc tttcccacac   1980

 

agaatggatt gtgtgaccac cacagtggaa aatgaagatc tattctactg taagttgggg   2040

 

ggcaactgga catgtgtgaa aggtgaacca gtggtctaca caggggggca agtaaaacaa   2100

 

tgcaaatggt gtggcttcga cttcaacgag cctgacggac tcccacacta ccccataggt   2160

 

aagtgcattt tggcaaatga gacaggttac agaatagtag attcaacgga ctgtaacaga   2220

 

gatggcgttg taatcagcgc agaggggagt catgagtgct tgatcggcaa cacaactgtc   2280

 

aaggtgcatg catcagatga gagactgggc cctatgccat gcagacctaa agagattgtc   2340

 

tctagtgcag gacctgtaag gaaaacttcc tgtacattca actacgcaaa aactttgaag   2400

 

aacaagtact atgagcccag ggacagctac ttccagcaat atatgctcaa gggcgagtat   2460

 

cagtactggt ttgacctgga cgtg                                          2484

 

 

<210>  2

<211>  826

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  2

 

Met Arg Pro Phe Leu Leu Arg Ala Ala Gln Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1               5                   10                  15     

 

 

Leu Ala Leu Ser Thr Glu Ala Pro Ser Leu Ser Ala Glu Thr Arg Ser

            20                  25                  30          

 

 

Ser Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu Val

        35                  40                  45             

 

 

Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr Thr Trp Arg Glu Tyr Ser

    50                  55                  60                  

 

 

His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val Arg Ala Ile Cys Thr Ala

65                  70                  75                  80 

 

 

Gly Ser Phe Lys Val Ile Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr Leu

                85                  90                  95     

 

 

Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu Leu

            100                 105                 110        

 

 

Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu Glu Met Gly Asp Asp Phe

        115                 120                 125            

 

 

Gly Phe Gly Leu Cys Pro Leu Asp Thr Thr Pro Val Val Lys Gly Lys

    130                 135                 140                

 

 

Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys Pro

145                 150                 155                 160

 

 

Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr

                165                 170                 175    

 

 

Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys Arg Glu Lys Pro Phe Pro

            180                 185                 190        

 

 

His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Ile Val Glu Lys Glu Asp Leu Phe

        195                 200                 205            

 

 

Tyr Cys Lys Trp Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Asn Pro Val

    210                 215                 220                

 

 

Thr Tyr Met Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe Asp

225                 230                 235                 240

 

 

Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Ile

                245                 250                 255    

 

 

Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val Val Asp Ser Thr Asp Cys Asn

            260                 265                 270        

 

 

Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Glu His Glu Cys Leu Ile

        275                 280                 285            

 

 

Gly Asp Thr Thr Val Lys Val His Ala Leu Asp Gly Arg Leu Gly Pro

    290                 295                 300                

 

 

Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Ala Ser Ser Ala Gly Pro Val Arg

305                 310                 315                 320

 

 

Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys Ala Leu Arg Asn Lys Tyr

                325                 330                 335    

 

 

Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly Glu

            340                 345                 350        

 

 

Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp His His Thr Asp Tyr

        355                 360                 365            

 

 

Phe Ala Glu Phe Val Val Leu Val Val Val Ala Leu Leu Gly Gly Arg

    370                 375                 380                

 

 

Tyr Val Leu Trp Leu Ile Val Thr Tyr Ile Val Leu Thr Glu Gln Leu

385                 390                 395                 400

 

 

Ala Ala Gly Glx Leu Glu Arg Arg Val Ile Val Asn Lys Met Glx Phe

                405                 410                 415    

 

 

Thr Val Glx Tyr Phe Asn Glx Tyr Thr Asn Asp Leu Ile Ile Ile Leu

            420                 425                 430        

 

 

Ile Glx Leu Glx Tyr Ile Val Leu Gly Glx Ile Lys Gly Pro Tyr Thr

        435                 440                 445             

 

 

Pro Glu Tyr Glx Glx Ile Met Glu Ile Ile Lys Met Ile Thr Ile Ser

    450                 455                 460                

 

 

Gln Ile Asn Lys Tyr Phe Thr Val Phe Val Thr Val Leu Glx Glx Lys

465                 470                 475                 480

 

 

Asn Leu Glx Ile Phe Arg Ile Ile His Thr Val Pro Pro Ser Gly Arg

                485                 490                 495    

 

 

Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Leu Ser Ser Thr Asn Glu

            500                 505                 510        

 

 

Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Glu Glu Tyr

        515                 520                 525            

 

 

Ser His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val

    530                 535                 540                

 

 

Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr

545                 550                 555                 560

 

 

Leu Ala Ser Leu His Lys Gly Ala Leu Leu Thr Ser Val Thr Phe Glu

                565                 570                 575    

 

 

Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp

            580                 585                 590        

 

 

Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly

        595                 600                 605            

 

 

Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys

    610                 615                 620                

 

 

Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr

625                 630                 635                 640

 

 

Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Glu Lys Pro Phe

                645                 650                 655    

 

 

Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu

            660                 665                 670        

 

 

Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro

        675                 680                 685             

 

 

Val Val Tyr Thr Gly Gly Gln Val Lys Gln Cys Lys Trp Cys Gly Phe

    690                 695                 700                

 

 

Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys

705                 710                 715                 720

 

 

Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys

                725                 730                 735    

 

 

Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Ala Glu Gly Ser His Glu Cys Leu

            740                 745                 750        

 

 

Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly

        755                 760                 765            

 

 

Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val

    770                 775                 780                

 

 

Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn Lys

785                 790                 795                 800

 

 

Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly

                805                 810                 815    

 

 

Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val

            820                 825    

 

 

Claims (7)

1.一种包含了人工修饰合成的猪瘟病毒2.1型E2基因和1.1型E2基因的融合cDNA基因序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其序列为SEQ ID NO.2所示。

3.包含权利要求1所述基因的杆状病毒转移载体pFastBac2E2。

4.权利要求3所述杆状病毒转移载体pFastBac2E2的制备方法，具体如下：

1）.CSFV主要免疫原性基因E2的获得

参照CSFV QZ-07分离株E2基因序列，根据杆状病毒密码子的偏爱性人工合成1222bp 的E2基因序列，该序列克隆入载体pUC-18中获得重组质粒pUC-57-2.1-E2；

以质粒pMD-18T-CSFV-E2为模板，利用引物1.1E2-GZF： 5’-TTTTGGATCCACCATGCGGCTAGCCTGCAAG-3’ ；1.1E2-GZR：5’-TTTGCGGCCGCTTAGTGATGGTGATGGTGATGTTCTGCGAAGTAATCT-3’扩增993bp的E2基因，并在E2基因的C端引入6his序列作为标签；通过引物在基因片段的上下游引入BamHI和NotI酶切位点；将该片段连入pMD-18T载体，命名为pMD-18T-1.1E2；

2）.杆状病毒转移载体pFastBac2E2的构建

以杆状病毒通用载体pFastBacTMdual为骨架，通过BamHI和Not I分别酶切pFastBacTMdual和pMD-18T-1.1E2，回收后进行连接构建质粒pFastBac-1.1E2；以pUC-57-2.1-E2为模板，利用引物2.1E2-GZF(XhoI)： 5’-TTTGCTAGCCACCATGCTCGAGTTAACCAGCGGCGAGT-3’；2.1E2-GZR(KpnI) 5’-TTTGGTACCTTAATGATGATGATGATGATGCCACCATGCGCCCCTTCCTGCT-3’扩增2.1E2基因，同时在C端引入6his标签序列，PCR产物通过XhoI和KpnI酶切后克隆入pFastBac-1.1E2的相应位点，获得转移质粒pFastBac-1.1E2-2.1E2，即得。

5.一种表达猪瘟病毒E2基因重组病毒，其特征在于：重组杆状病毒Recominant Autographa californica multiple Nucleopolyhedrovirus Ac-CSE12，CCTCC NO:V201338。

6.权利要求4所述的重组病毒在制备猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

7.权利要求4所述的重组病毒在制备疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断试剂的应用。