CN106526108B - 一种猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗兔体效力检验方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验的方法，是用待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗免疫家兔，免疫21日龄后ELISA检测猪瘟病毒抗体水平或采用猪瘟脾淋苗静脉注射进行攻毒，当免疫兔至少4/5的猪瘟病毒抗体阻断率S/P≥60％或攻毒后至少4/5兔体无定型热反应，即可判为合格。本发明的疫苗兔体效力检验方法不仅能够检验猪瘟基因工程亚单位疫苗的保护效力，还更加稳定、简便、有效、节省时间和成本评价猪瘟基因工程亚单位疫苗的效力，弥补了现有技术的不足，对后期的大规模生产培养工艺优化具有积极的评价指导作用，更有利于指导猪瘟基因工程亚单位疫苗产品的临床应用，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗兔体效力检验方法
技术领域
本发明属于疫苗效果检测技术领域，具体涉及一种猪瘟基因工程亚单位疫苗的效力检验方法。
背景技术
猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界动物卫生组织(OIE)列为家畜A类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床以稽留高烧、皮肤和黏膜出现大量出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物疫病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪瘟兔化弱毒株(又称C株)疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪瘟在我国乃至世界范围内大规模的流行。猪瘟C株弱毒疫苗是目前国内外广泛使用的疫苗，其安全性和免疫效力已被社会认可，但其受母源抗体干扰，导致免疫失败的现象时有报道，接种此弱毒疫苗产生的抗体无法与野毒感染产生的抗体相区分，给免疫的制订和国家猪瘟防控净化也带来了巨大的挑战，制约着我国生猪及猪肉制品在非免疫国家和地区的贸易发展。
在猪瘟活疫苗的研究基础上，利用基因工程操作技术研制了新一代猪瘟基因工程亚单位疫苗。我们将CSFV E2基因抗原优势区(共596个氨基酸)整合到HEK-293细胞染色体基因组，获得的了稳定表达外源基因E2的HEK-293细胞株，该表达E2蛋白制备的亚单位疫苗提供的保护性和脾淋苗无差异，并且具有灭活疫苗的特征，能够和疫苗毒与野毒感染相区分，同时能区分HEK-293-E2和脾淋苗(包括野毒)的鉴别诊断方法已经建立。此疫苗一旦投入使用，不但可以通过抗体鉴别技术区分疫苗免疫动物和野毒感染动物，极大地促进CSFV的净化或根除，可提高猪的存活率，增加猪的存栏量和出栏量，对猪肉市场上相关畜产品的供应和稳定物价具有重要的意义。
疫苗效力是评价疫苗质量的关键指标，但是过去一直没有有效的对猪瘟基因工程亚单位疫苗进行效力检测的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验的方法，从而弥补现有技术的不足。
本发明的方法，是用待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗免疫家兔，免疫21日龄后ELISA检测猪瘟病毒抗体水平或采用猪瘟脾淋苗静脉注射进行攻毒，当免疫兔至少4/5的猪瘟病毒抗体阻断率S/P≥60％或攻毒后至少4/5兔体无定型热反应，即可判为合格。
其一种具体操作方法，包括如下的步骤：
1)分组及免疫接种：
选取体重为1.5～3kg健康易感家兔，从中挑选体温波动不大的随机分组，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和未免疫接种作为阴性对照组，而在实验组中接种待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗；
所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗为HEK-293-E2疫苗；
2)猪瘟病毒ELISA抗体检测
免疫后第21天，采集各组兔的血液，分离血清，检测该疫苗免后21天猪瘟病毒抗体水平；
3)检测结果判定：
当免疫兔至少4/5的猪瘟病毒抗体阻断率S/P≥60％时，判定疫苗合格；
另一种操作方法，其步骤如下：
1)分组及免疫接种：
选取体重为1.5～3kg健康易感家兔，从中挑选体温波动不大的随机分组，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和未免疫接种作为阴性对照组，而在实验组中接种待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗；
所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗为HEK-293-E2疫苗；
2)免疫后第21d攻毒实验
用无菌生理盐水将20头份猪瘟脾淋毒稀释成1头份/ml，注射给每组家兔，攻毒剂量为lml/只，攻毒前2天和攻毒当天上下午各测体温1次，24小时后，每隔6h测体温1次，连续测5d至体温恢复正常；
3)检测结果判定：
至少4/5数量的注射组兔体无定型热反应，即可判定疫苗效力为合格。
本发明的疫苗兔体效力检验方法不仅能够检验猪瘟基因工程亚单位疫苗的保护效力，还更加稳定、简便、有效、节省时间和成本评价猪瘟基因工程亚单位疫苗的效力，弥补了现有技术的不足，对后期的大规模生产培养工艺优化具有积极的评价指导作用，更有利于指导猪瘟基因工程亚单位疫苗产品的临床应用，具有广阔的市场应用前景。
具体实施方式
申请人利用猪瘟脾淋苗能够感染兔子引起兔体反应热这一特性，建立了一种用兔体检验猪瘟基因公测很难过亚单位疫苗效力的方法，保证了猪瘟基因工程亚单位疫苗效力评价的简便性和稳定性，同时大大节省了检验成本。该方法用小动物兔子代替了大动物猪，大大节省了生产检验成本；而且该检验方法使用的兔子均为SPF兔，其生产性能和质量标准较猪更加稳定，可以进行疫苗生产质量评价应用。
实施例1：兔体效力检验模型方法设计及步骤
1材料
1.1疫苗猪瘟基因工程亚单位疫苗(HEK-293-E2)，批号201403，由青岛易邦生物工程有限公司生产；猪瘟脾淋苗，批号201401批，20头份/ml，有效期至2015年6月，由青岛易邦生物工程有限公司生产。
1.2试验动物1.5～3.0kg SPF家兔购自青岛康大兔业生物科技有限公司。
1.4试剂盒猪瘟ELISA抗体检测试剂盒，购自IDEXX公司。
1.5体温计购自上海鹿得医疗器械贸易有限公司。
2试验设计
2.1分组及免疫接种方法选取体重为1.5～3kg健康易感家兔30只，购回后第3d，每隔6h测温1次，连续测3次，从30只兔子中挑选体温波动不大的25只，随机分成5组，每组5只，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和未免疫接种作为阴性对照组，按照下表1的方法进行免疫接种；自接种后第1d连续测3d。
表1疫苗免疫接种方法
2.2猪瘟病毒ELISA抗体检测
免疫后第21天，采集各组兔的血液，分离血清，按照猪瘟ELISA抗体检测试剂盒说明书，检测该疫苗免后21天猪瘟病毒抗体水平。
2.3攻毒试验
免疫后第21d攻毒，用无菌生理盐水将20头份猪瘟脾淋毒稀释成1头份/ml，通过耳静脉注射给每组家兔，攻毒剂量为lml/只，攻毒前2天和攻毒当天上下午各测体温1次，24小时后，每隔6h测体温1次，连续测5d至体温恢复正常。
3结果
3.1兔体效力检验方法结果
3.1.1兔体免疫前、后体温测定结果
按照2.1.1的方法进行实际测温，将实际测温情况绘制表格，从表3所测结果中可以看出，免疫前各组家兔体温波动不大；用HEK-293-E2(0.05、0.1、0.2ml/只)免疫组家兔体温在正常范围内，用猪瘟脾淋苗家兔出现兔体反应热(≥40.5℃)与常规猪瘟脾淋苗检测结果一致。详见表3。
3.1.2HEK-293-E2免疫家兔后ELISA猪瘟抗体检测结果
免疫第7、14、21天，采集的各组免疫兔血清ELISA检测猪瘟病毒抗体，将实际抗体检测情况绘制表格。从表格4可以看出，HEK-293-E2免后21日，0.05ml/只免疫组抗体阳性率为3/5；0.1ml/只、0.2ml/只和猪瘟脾淋苗免疫组抗体阳性率均为5/5；未免疫对照组抗体阳性率为0/5。详见表4。
3.1.3攻毒前、后体温测定结果
免疫第21天后，各组兔子用猪瘟脾淋苗进行攻毒，将实际测温情况绘制表格，从所测结果表5可以看出，攻毒前各组免疫兔体温在正常波动范围内(＜40.5℃)，攻毒后0.2ml免疫组(0/5)、0.1ml免疫组(0/5)和猪瘟脾淋苗组(0/5)均未出现定型热反应，0.05ml免疫组(2/5)出现定型热反应，未免疫对照组(5/5)出现定型热反应。详见表5。
表4免疫兔血清猪瘟病毒抗体ELISA检测结果
注“+”表示抗体阳性；“±”表示抗体可疑；“-”表示抗体阴性。
实施例2猪体效力检验方法设计及步骤
1材料
1.1疫苗猪瘟基因工程亚单位疫苗(HEK-293-E2)，批号201403，由青岛易邦生物工程有限公司生产；猪瘟脾淋苗，批号201401批，20头份/ml，有效期至2015年6月，由青岛易邦生物工程有限公司生产。
1.2试验动物2～5周龄健康易感仔猪，购于青岛平度胜利种猪场。
1.3攻毒毒株猪瘟石门系血毒，原始毒种购自中国兽医药品监察所，由青岛易邦生物工程有限公司扩繁、鉴定、提供。
1.4试剂盒猪瘟ELISA抗体检测试剂盒，购自IDEXX公司。
1.5体温计购自上海鹿得医疗器械贸易有限公司。
2试验方法
2.1分组及免疫接种方法选取2～5周龄健康断奶仔猪30头，购回后第3d上下午，各测温1次，连续测3d，从30头猪中挑选体温波动不大的25头，随机分成5组，每组5头，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和未免疫接种作为阴性对照组，按照下表2的方法进行免疫接种；同时上下午各测体温1次，连续测16d。
表2疫苗免疫接种方法
2.2猪瘟病毒ELISA抗体检测
分别于免前、首免第14、21天及二免后第7、14天，采集各组猪的血液，分离血清，按照猪瘟ELISA抗体检测试剂盒说明书，检测该疫苗免后猪瘟病毒抗体水平。
2.3攻毒试验
二免后14d攻毒，用猪瘟石门系强毒按照105LD50最小致死剂量/ml/头，通过颈部肌肉注射每组猪，攻毒剂量为lml/头，攻毒前2天和攻毒当天上下午各测体温1次，24小时后，每隔6h测体温1次，连续测16d。
3猪体效力检验方法结果
3.1猪体免疫前、后体温测定结果
按照2.2.1的方法进行实际测温，将实际测温情况绘制表格，从表6所测结果中可以看出，免疫前各组猪体温波动不大；用HEK-293-E2(0.05、0.1、0.2ml/只)和猪瘟脾淋苗免疫组猪体温均在正常范围内(＜40.5℃)，与常规猪瘟脾淋苗检测结果一致。
3.2HEK-293-E2免疫猪后ELISA猪瘟抗体检测结果
分别于免前、首免第14、21天及二免后7、14天，采集的各组免疫猪血清ELISA检测猪瘟病毒抗体，将实际抗体检测情况绘制表格，从表格7可以看出，
3.3猪体攻毒前、后体温测定结果
二免后第14天后，各组猪用猪瘟石门系血毒进行攻毒，按照105LD50最小致死剂量/ml/头，将攻毒前后实际测温情况绘制表格，从所测结果表5可以看出，攻毒前2天各组免疫猪体温在正常波动范围内(＜40.5℃)，攻毒后0.25ml免疫组(4/5)、0.5ml免疫组(5/5)和猪瘟脾淋苗组(0/5)均未出现热反应，0.125ml免疫组(1/5)出现热反应，未免疫对照组(5/5)出现热反应。详见表8。
表6免疫前后实际测温结果
表7免疫猪血清猪瘟病毒抗体ELISA检测结果
注“+”表示抗体阳性；“±”表示抗体可疑；“-”表示抗体阴性。
实施例3结果分析
1HEK-293-E2兔检验抗体水平与攻毒保护结果相关性分析
从HEK-293-E2免后21天的抗体水平与攻毒后定型热反应测定结果可以看出,未免疫阴性对照组和HEK-293-E2免疫(抗体阻断率S/P值≤34.7％)在攻毒后均出现定型热反应，猪瘟脾淋苗阳性对照组(抗体阻断率S/P≥60.7％)在攻毒后均未出现定型热反应。HEK-293-E2免疫兔能产生猪瘟病毒E2蛋白特异性抗体，且与免疫剂量呈正相关；抗体阻断率(S/P值)≥59.6％的猪在攻毒后均未出现定型热反应，表明能够抵抗猪瘟脾淋毒的攻击，攻毒保护与抗体水平呈明显正相关。详见表4、表5。
2HEK-293-E2猪检验抗体水平与攻毒保护结果相关性分析
从HEK-293-E2免后21天的抗体水平与攻毒后出现高热反应测定结果可以看出,未免疫阴性对照组和HEK-293-E2免疫(抗体阻断率S/P值＜34.7％)在攻毒后均出现高热反应；猪瘟脾淋苗阳性对照组(抗体阻断率S/P≥60.7％)在攻毒后均未出现高热反应。HEK-293-E2免疫猪产生猪瘟病毒E2蛋白特异性抗体，且与免疫剂量呈正相关；抗体阻断率(S/P值)≥68.0％在攻毒后均未出现高热反应，表明能够抵抗猪瘟石门系强毒的攻击，攻毒保护与抗体水平呈明显正相关。详见表7、表8。
3兔检验和猪检验结果的相关性分析
根据4.1兔检验分析的结果，免疫兔猪瘟抗体水平(S/P值≥59.6％)攻毒后保护，兔的最小免疫保护剂量为0.1ml/只；根据4.2猪检验分析的结果，免疫猪猪瘟抗体水平(S/P值≥68.0％)攻毒后保护，猪的最小免疫保护剂量为0.125ml/头。
本研究建立的猪瘟基因工程亚单位疫苗兔体效力检验模型方法和标准：采用0.2ml作为疫苗免疫最小保护剂量(兔和猪均能达到保护)，免疫1.5～3.0kg家兔，免后21日龄ELISA检测猪瘟病毒抗体水平或采用猪瘟脾淋苗静脉注射进行攻毒，当免疫兔至少4/5的猪瘟病毒抗体阻断率S/P≥60％或攻毒后至少4/5兔体无定型热反应，即可判为合格。
根据中华人民共和国兽用生物制品规程(2000版)和中华人民共和国兽药典(2010年版)规定现行的猪瘟疫苗效力检验主要依靠家兔或猪进行动物试验。因用猪进行检验成本太高、不易操作、耗时长，并且涉及猪瘟石门系强毒攻毒的生物安全风险问题，故在生产实际中多采用兔体定型热反应，兔检验法中兔易获取、生产性能稳定、无猪瘟病毒等外源病毒干扰，采用猪瘟弱毒疫苗攻毒生物安全风险低。同时，根据国家有关政策规定，能够用实验动物替代本动物的研究尽量不使用本动物的原则，本试验通过比较HEK-293-E2家兔效力检验体温反应热与ELISA抗体检测结果的相关性，给出了两种方法任选其一用于家兔效力检验的可行性，提高了检测结果的可靠性和可重复性。
该疫苗兔体效力检验模型方法和标准替代靶动物猪的检验方法，不仅能够检验HEK-293-E2的保护效力，还更加稳定、简便、有效、节省时间和成本评价猪瘟基因工程亚单位疫苗的效力，弥补了现有技术的不足，对后期的大规模生产培养工艺优化具有积极的评价指导作用，更有利于指导HEK-293-E2产品的临床应用，具有广阔的市场应用前景。

Claims (1)

1.一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验的方法，其特征在于，所述的方法是用待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗免疫家兔，免疫21日龄后ELISA检测猪瘟病毒抗体水平或采用猪瘟脾淋苗静脉注射进行攻毒，当免疫兔至少4/5的猪瘟病毒抗体阻断率S/P≥60％或攻毒后至少4/5兔体无定型热反应，即判为合格；
所述的方法包括如下的步骤：
1)分组及免疫接种：
选取体重为1.5～3kg健康易感家兔，从中挑选体温波动不大的随机分组，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和未免疫接种作为阴性对照组，而在实验组中接种待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗；
2)猪瘟病毒ELISA抗体检测
免疫后第21天，采集各组兔的血液，分离血清，检测该疫苗免后21天猪瘟病毒抗体水平；
3)检测结果判定：
当免疫兔至少4/5的猪瘟病毒抗体阻断率S/P≥60％时，判定疫苗合格；
所述的方法或包括如下的步骤：
1)分组及免疫接种：
选取体重为1.5～3kg健康易感家兔，从中挑选体温波动不大的随机分组，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和未免疫接种作为阴性对照组，而在实验组中接种待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗；
2)免疫后第21d攻毒实验
用无菌生理盐水将20头份猪瘟脾淋毒稀释成1头份/ml，注射给每组家兔，攻毒剂量为lml/只，攻毒前2天和攻毒当天上下午各测体温1次，24小时后，每隔6h测体温1次，连续测5d至体温恢复正常；
3)检测结果判定：
至少4/5数量的注射组兔体无定型热反应，即可判定疫苗效力为合格；
所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗为HEK-293-E2疫苗。
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GR01 Patent grant
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