CN104940957A - 一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及建立一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法模型，本方法采用生产性能和质量稳定的SPF兔作为载体，按照rAd-E0-E2免疫兔体后14天，用猪瘟脾淋苗作为攻毒用毒株攻毒后连续3天监测兔体反应热，根据兔体出现定型热情况(≥40.5℃)评价该疫苗的保护效力，建立了rAd-E0-E2兔体效力检验方法模型。该方法建立过程中，通过对免疫组和对照组的体温监测、兔脾脏/体重指数比、脾脏组织切片观察、RT-PCR检测和猪瘟脾淋病毒分离鉴定，确定以上结果显示的rAd-E0-E2免疫保护效果一致，并最终确定采用相对简便易行的体温监测的方法进行评价。

Description

一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗效力检验方法。

背景技术

猪瘟(CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国面对这样烈性的染病一般都是采用疫苗和疫苗接种来提前预防，降低发病率和死亡率。猪瘟疫苗的发展经历了早期的灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗。目前广泛使用的是弱毒疫苗，我国批准使用的弱毒疫苗是由中国兽医药品监察所研制的猪瘟兔化弱毒疫苗。长期以来，猪瘟兔化弱毒疫苗的普遍使用，使CSFV野毒株及兔化弱毒抗原发生了变异，出现了慢性感染、隐性感染等非典型流行形式，很难区分猪群中的疫苗免疫猪和野毒感染猪，致使疫情难以控制，或造成免疫失败，这不但影响猪群中猪瘟的净化,而且给出口造成障碍。为此，研制更安全、更高效可以进行鉴别诊断的新型基因工程标记疫苗是全世界养猪业的迫切要求。

本实验室从pMD18-T-E0质粒、pMD18-T-E2质粒中扩增编码E0、E2基因,构建重组腺病毒穿梭质粒pAd Track-E0、pAd Track-E2。通过PET32a载体将E0和E2基因串联，形成PET-E0-E2，然后再将E0-E2克隆到腺病毒穿梭载体上得到重组腺病毒穿梭质粒pAd Track-E0-E2，转化到大肠杆菌BJ5183感受态细胞中，得到重组腺病毒骨架载体pAd Easy-E0-E2，转染人胚胎肾细胞(HEK293)，获得了含有目的基因的重组腺病毒(rAd-E0-E2)。

疫苗效力是评价疫苗质量的关键指标。生物制品研发、生产企业由于生产疫苗批次的不同，常常会导致最小免疫剂量有所差异。因此，对于每一种新研发出的疫苗有必要建立一种有针对性的配套检测该疫苗最小免疫剂量的方法。rAd-E0-E2作为本实验室最新研发的基因工程活载体疫苗，鉴于其没有一个更加稳定、简便、节省成本的疫苗效力评价标准。为此，我们建立了一种用于rAd-E0-E2的兔体效检模型，并确定其评价标准：将SPF兔接种10倍梯度稀释的rAd-E0-E2，14d后用猪瘟脾淋毒(1头份)攻毒，通过攻毒兔的体温变化、脾重/体重指数比(％)、脾脏病理组织变化、RT-PCR和IFA等评价方法共同判断rAd-E0-E2在兔体的免疫保护效力。该方法用小动物兔子代替了大动物猪，大大节省了生产检验成本；而且该检验方法使用的兔子均为SPF兔(无外源病毒和抗体干扰)，其生产性能和质量标准较猪更加稳定，可以进行疫苗生产质量评价应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验的方法,该 方法主要按照如下步骤：

1.rAd-E0-E2冻干疫苗按照不同的稀释梯度(10^7.0、10^6.0、10^5.0IFU/ml)免疫兔体后第14天，用猪瘟脾淋毒(1头份)接种兔的耳缘静脉攻毒，于攻毒后连续3天每6h检测兔体反应热；

2.攻毒后第3天剖杀兔，称兔体重和脾脏重量，计算兔脾脏/体重指数比；

3.将兔脾脏放于10％福尔马林固定、做组织切片，显微镜观察兔脾病理学变化；

4.将兔脾称取1g提取脾脏总RNA,采用RT-PCR方法检测猪瘟脾淋毒的存留情况；

5.将兔脾组织低温下研磨，通过0.22um滤膜过虑除菌，滤液接种ST细胞，盲传3代后，进行IFA鉴定是否有猪瘟脾淋毒感染细胞；

6.判定方法：当兔体温均＜40.5℃、兔脾脏/体重指数比mean≤0.055％、兔脾组织显微观察未出现充淤血、RT-PCR均检测不到猪瘟脾淋毒基因存留和IFA病毒分离均为阴性同时成立时，判为该疫苗保护兔体免受猪瘟脾淋毒的攻击；当其中任何一项检测均不在此范围内时，判为该疫苗未能保护兔免受猪瘟脾淋毒的攻击。

通过此方法来评价该疫苗的保护效力和最小免疫剂量为10^7.0IFU/ml，建立了rAd-E0-E2兔体效力检验方法，可以更加稳定、简便、节省成本的评价该疫苗的免疫效力，从而弥补现有技术的不足。

附图说明

图1：免疫前、后体温测定及结果图，

图2：攻毒前、后体温测定及结果图，

图3：攻毒后脾重/体重指数比图，

图4：攻毒后脾脏病理变化图。

具体实施方式

实施例1：新型猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验方法的建立

1.1试验用毒、疫苗、试验动物

猪瘟重组腺病毒疫苗(rAd-E0-E2，≥2×10^7.0IFU/瓶，测定方法详见专利：张恒，范根成，杜元钊，等.一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗病毒含量测定方法[P].中华人民共和国国家知识产权局.CN 104535764 A,2015.04.22)，由青岛易邦生物工程有限公司技术中心冻干保存；猪瘟活疫苗(兔源)简称猪瘟脾淋毒，批号201401，20头份/瓶，由本公司冻干苗车间生产；1.5～3kg健康易感家兔购自青岛康大。

1.2免疫方法及免疫前、后体温测定及结果

体重为1.5～3kg健康易感家兔28只，购回后第3d上下午，各测温1次，连续测3d，从28只兔子中挑选体温波动不大的20只，随机分成5组，每组4只，采用猪瘟脾淋毒作为阳性对照组和生理盐水作为阴性对照组，按照下表1进行免疫接种；同时上下午各测体温1次，连续测3d，测温结果详见图1。

表1 免疫接种

1.3攻毒前、后体温测定及结果

免疫后第14d攻毒，用无菌生理盐水将每头份猪瘟脾淋毒稀释150倍，通过耳静脉注射给每组家兔，攻毒剂量为lml/只，攻毒前2天和攻毒当天上下午各测体温1次，24小时后，每隔6h测体温1次，连续测3d至体温恢复正常。结果详见图2。

1.4攻毒后脾重/体重指数比 

将攻毒后体温恢复正常的家兔称重、剖杀取脾脏称重，计算脾重/体重百分比(％)，通过说明不同稀释度的rAd-E0-E2和猪瘟脾淋毒免疫保护组与未保护对照组组的差异是否显著(P＜0.05)；经脾重/体重指数比分析发现，10^7.0IFU组与10^5.0IFU组、10^7.0IFU组与对照组差异显著(P<0.05)；猪瘟脾淋苗组与10^5.0IFU组、猪瘟脾淋苗组与对照组异显著(P<0.05)；然而，10^7.0IFU组与10^6.0IFU组、10^7.0IFU组与猪瘟脾淋苗组、10^6.0IFU组与10^5.0IFU组、10^6.0IFU组与猪瘟脾淋苗组、10^6.0IFU组与对照组、10^5.0IFU组与对照组差异不显著(P>0.05)。(详见图3)。

1.5攻毒后脾脏病理变化

将脾脏做病理组织切片，观察脾脏的病理变化。将攻毒后体温趋于正常的兔子解剖，取脾脏做石蜡切片，显微镜下观看脾脏病理组织变化(图4A-F)。10^7.0IFU组(图4-A)攻毒后脾组织切片未见充血、淤血；10^6.0IFU组(图4-B)攻毒后脾组织切片未见充血、淤血，而10^6.0IFU组(图4-C)攻毒后脾组织切片充血、淤血严重；10^5.0IFU组(图4-D)攻毒后脾组织切片充血、淤血严重；猪瘟脾淋苗组(图4-E)攻毒后脾组织切片未见充血、淤血；对照组(图4-F)攻毒后脾组织切片充血、淤血严重。详见图4。

1.6 RT-PCR检测脾脏中猪瘟脾淋毒

取各组家兔脾脏用匀浆器充分研磨，提取RNA，进行RT-PCR检测脾脏中的猪瘟脾淋疫苗毒存留情况，进一步证明了rAd-E0-E2的免疫保护情况。

1.6脾脏中猪瘟脾淋毒分离鉴定

取各组家兔脾脏加PBS低温下充分研磨，组织悬液离心后经0.22um滤器过滤，将猪睾丸细胞系(ST)铺平于6孔板中，当细胞长到80％单层时，接种细胞悬液，48h后将rAd-E0-E2感染的ST细胞用冷丙酮固定10min,同时用猪瘟病毒阳性血清作一抗，37℃作用2h,应用PBS洗涤后加荧光标记的抗猪IgG,，37℃作用1h,PBS洗涤后，吹干，加入缓冲甘油，于荧光显微镜下检测，进一步证明了rAd-E0-E2的免疫保护情况。

根据1.3-1.6检测结果的相关性，最终确定兔体免疫攻毒后以上5种方法来评价rAd-E0-E2疫苗的免疫保护效果，方法简便、准确、可靠。因此，我们按照rAd-E0-E2免疫兔体后14天，用猪瘟脾淋毒作为攻毒用毒株攻毒后3天监测兔体反应热、兔脾脏/体重指数比、脾脏组织切片观察、RT-PCR检测和猪瘟脾淋病毒分离鉴定等方法中一种来评价该疫苗的保护效力，建立了rAd-E0-E2兔体效力检验方法。

实施例2：兔体效力检验方法确定rAd-E0-E2最小免疫剂量 

根据实施例1建立的兔体效力检验方法对rAd-E0-E2进行最小免疫剂量确定，步骤如下：

2.1免疫接种方法按照步骤1.2中表1方法进行免疫接种。

2.2免疫方法及免疫前、后实际测温结果免疫前、免疫后分别连续3d上下午各测一次体温。

2.3 rAd-E0-E2对免疫兔的保护作用

攻毒后原倍(10^7.0IFU)免疫兔和猪瘟脾淋毒免疫兔体温均＜40.5℃未出现定型热反应、兔脾脏/体重指数比mean≤0.055％、脾脏组织切片观察均未出现充淤血、RT-PCR检测和猪瘟脾淋病毒分离鉴定均4/4阴性；10倍(10^6.0IFU)免疫兔3/4出现定型热反应、兔脾脏/体重指数比3/4相对较大、脾脏组织切片观察3/4出现充淤血、RT-PCR检测和猪瘟脾淋病毒分离鉴定均3/4阴性；而对照组和100倍(10^5.0IFU)家兔全部出现定型热反应、脾脏/体重指数比相对较大、脾脏组织切片观察出现充淤血、RT-PCR检测和猪瘟脾淋病毒分离鉴定均阳性。详见表2。

表2 冻干疫苗不同稀释度免疫兔体后攻毒五种评价方法比较保护结果

根据以上结果的一致性确定rAd-E0-E2最小免疫剂量为10^6.0IFU/头份。

实施例3：兔体效检方法对3批冻干rAd-E0-E2疫苗效力评价 

取3批次冻干rAd-E0-E2疫苗(效价≥2×10^7.0IFU/瓶)，分别命名为冻干疫苗1、冻干疫苗2和冻干疫苗3。将此3批次疫苗按照1.2中表1方法进行免疫接种，并采用具体实施例1中建立的效检模型五种评价方法进行比较检测，结果如表3～5所示。根据比较检测结果，证明3批次冻干疫苗效价相对稳定，进一步确定该疫苗最小免疫剂量均在10^7.0IFU保护，并进一步证明该兔体效检方法的稳定性。

表3 冻干疫苗1不同稀释度免疫兔体后攻毒五种评价方法比较保护结果

表4 冻干疫苗2不同稀释度免疫兔体攻毒保护结果

表5 冻干疫苗3不同稀释度免疫兔体攻毒保护结果

实施例4：rAd-E0-E2在猪体上的免疫保护效果验证

4.1猪瘟抗体ELISA检测及结果 

将rAd-E0-E2按照10^7.0IFU/头份剂量免疫3～5健康断奶仔猪15头，同时设生理盐水对照组5头。于免后14日，进行猪瘟抗体ELISA检测，结果免疫组15头猪抗体全为阳性，对照组5头猪均为阴性，具体结果详见表6。

表6 rAd-E0-E2免后14天ELISA抗体结果

4.2猪瘟强毒攻毒保护试验进行猪瘟石门系血毒进行攻毒验证，结果免疫组15头猪均获得保护，而对照组5头猪于攻毒后7-14天观察期内全部死亡，表现猪瘟典型症状，出现精神沉郁、食欲不振；解剖出现脾梗死，全身淋巴结充血、淤血，膀胱内壁、肠系膜、喉头针尖状出血。

以上结果表明，用兔体效力检验模型确定的10^7.0IFU/头份最小免疫剂量适合临床上猪场免疫应用，且与猪体的保护相关性密切，完全可以作为该rAd-E0-E2疫苗的效力检验评价标准和生产应用。

Claims (1)

1.一种猪瘟病毒基因重组腺病毒载体疫苗兔体效力检验的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：

1)冻干疫苗按照不同的稀释梯度免疫兔体后第14天，用猪瘟脾淋毒接种兔的耳缘静脉攻毒，于攻毒后连续3天每6h检测兔体反应热；

2)攻毒后第3天剖杀兔，称兔体重和脾脏重量，计算兔脾脏/体重指数比；

3)将兔脾脏放于10％福尔马林固定、做组织切片，显微镜观察兔脾病理学变化；

4)将兔脾称取1g提取脾脏总RNA,采用RT-PCR方法检测猪瘟脾淋毒的存留情况；

5)将兔脾组织低温下研磨，通过0.22um滤膜过虑除菌，滤液接种ST细胞，盲传3代后，进行IFA鉴定是否有猪瘟脾淋毒感染细胞；

6)判定方法：当兔体温均＜40.5℃、兔脾脏/体重指数比mean≤0.055％、兔脾组织显微观察未出现充淤血、RT-PCR均检测不到猪瘟脾淋毒基因存留和IFA病毒分离均为阴性同时成立时，判为该疫苗保护兔体免受猪瘟脾淋毒的攻击；当其中任何一项检测均不在此范围内时，判为该疫苗未能保护兔免受猪瘟脾淋毒的攻击。