CN107290541A - 一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断elisa试剂盒及其应用 - Google Patents

一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断elisa试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒及其应用，涉及兽用诊断制品领域。该评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，包括：检测板、VP60 VLPs溶液、抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。本发明还提供采用所述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法。本发明试剂盒，原料易得、操作简单、耗时短、灵敏度较高、结果准确、直观容易判断。

Description

一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒 及其应用
技术领域
本发明涉及兽用诊断制品，具体涉及一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)是兔病毒性出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)又称兔瘟的病原，是一种严重威胁家兔产业发展的高传播性、高致死性病毒，病程一般为48-72小时。该病于1984年首先在中国报道，随后迅速在全球大部分地区流行，造成数以亿计的家兔和野兔死亡，给全球的兔产业和生态造成巨大损失和破坏。1989年,世界动物卫生组织(OIE)将该病正式列为B类传染病，我国将其列为二类传染病。
目前，对兔病毒性出血症灭活疫苗效力评价方法为经典的血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test，HI)，所用到的血为人的“O”型红细胞，由于“O”型红细胞难以获得，使得试验难以开展，HI难以应用于大量样本的检测，此外，通过HI试验筛选和测定抗体，血清样品需要进行白陶土等的处理，对血凝价的判定，4单位HA的标定，试验用PBS液pH控制等，整个试验过程对操作者的要求相对较高，试验的周期较长，结果的人为因素影响较大、灵敏度较低。
发明内容
本发的目的是提供一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，该试剂盒原料易得、操作简单、耗时短、灵敏度较高、结果准确、直观容易判断。
本发明还提供采用上述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，包括：检测板、VP60VLPs溶液、抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；
所述检测板是采用H(type-2)-PAA-biotin包被的96孔高结合力亲和素化酶标反应板；
所述VP60VLPs是兔出血症病毒VP60蛋白形成的病毒样颗粒；
在本发明中，所述VP60VLPs溶液采用如下方法制备：将重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60采用Sf9细胞进行培养，然后采用蔗糖密度梯度离心法纯化获得。
优选的技术方案中，H(type-2)-PAA-biotin的包被浓度为1.5-3.5μg/mL；所述VP60VLPs溶液的浓度为1-3μg/mL
优选的技术方案中，所述96孔高结合力亲和素化酶标反应板在包被后采用4-6％脱脂乳溶液封闭后得到所述检测板。
在本发明中，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清和显色液；
所述样品稀释液为PBS缓冲液；
所述洗涤液是含有0.05％吐温-20的PBS缓冲液；
所述终止液为2M的硫酸水溶液；
标准阳性血清：采用兔病毒性出血症疫苗免疫SPF兔，取HI效价＞26的兔血清，作为标准阳性血清；
标准阴性血清：SPF兔血清。
优选的技术方案中，所述VP60VLPs溶液浓度为1-3μg/mL。
本发明还提供采用所述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法，包括如下步骤：
1)将100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别与100μL浓度为2μg/mL的VP60VLPs溶液混合，37℃孵育1.5h，得到待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液；
2)在检测板的待检血清孔、阳性对照孔、阴性对照孔中分别加入100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液，37℃孵育1.5h，采用洗涤液洗涤；
3)将单克隆抗体1B8，加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗涤液洗涤；
4)加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗涤液洗涤；
5)加显色液，100μL/孔，避光反应10min进行显色；
6)每孔加入50μL终止液；
7)采用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光值OD450nm，按照如下公式计算阻断率PI：
阻断率PI＝(阴性对照孔OD450nm-待检血清孔OD450nm)/阴性对照孔OD450nm×100％；
判定标准如下：当阻断率PI≥30.99％时判定为血清阳性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后可以保护病毒攻击；当PI≤25.3％时，判定为血清抗体阴性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击；当25.3％＜PI＜30.99％时判定为可疑，重复检测一次，如果PI仍然低于30.99％则判定为血清抗体阴性，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击。
本发明采用商品化的HBGAs作为包被抗原，利用纯化的杆状病毒表达的VP60VLPs与待检血清进行中和反应，将中和反应后的样本加至包被抗原孔内，加入抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8，进行反应，然后与辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG抗体(HRP标记的羊抗鼠IgG抗体)反应，最后通过TMB显色。本发明试剂盒的有益效果：
(1)与HI相比，本发明试剂盒不需要人“O”型红细胞，材料容易获得，制备简单，成本低；
(2)本发明试剂盒操作简单，耗时短，检测结果的稳定性优于HI方法，所用试剂稳定可控，重复性好。
(3)本发明试剂盒灵敏度高，对血清总量要求低，1:100倍稀释的血清可用于试验检测，与HI相比，灵敏度高出100倍。
(4)本发明试剂盒特异性好，可准确判定阴、阳性结果，对阴性结果具有更加准确的数值判定。
(5)本发明试剂盒判定直观，利用血清抗体阻断病毒粒子VLPs与HBGAs结合的原理，建立的该阻断ELISA方法，对阴阳性结果的判定，更加直观。
附图说明
图1是VP60蛋白表达和纯化的SDS-PAGE电泳，M：蛋白质Marker；1:感染野生型杆状病毒的Sf9细胞对照；2：感染重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60的Sf9细胞混合物；3：纯化后重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60表达的VP60蛋白。
图2是VP60蛋白表达和纯化的Western blot鉴定，1:感染野生型杆状病毒的Sf9细胞对照；2：感染重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60的Sf9细胞混合物；3：纯化后重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60表达的VP60蛋白。
图3是VP60VLPs的鉴定，其中a:纯化后重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60表达的VP60蛋白；b:感染野生型杆状病毒的Sf9细胞对照。
具体实施方式
实施例1阻断ELISA方法中最佳反应条件的选择
1、组织血型抗原最佳包被浓度和VP60VLPs最佳反应浓度的选择
以下TBST、洗涤液、HRP标记的二抗、终止液和显色液、样品稀释液组成同本实施例标题12。VP60VLPs溶液、单克隆抗体1B8(即抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8)制备方法同本实施例标题12。5％脱脂乳溶液，溶质为脱脂乳粉，溶剂为洗涤液。H(type-2)-PAA-biotin购买来源同本实施例标题12。
按照棋盘法进行，以TBST将组织血型抗原(H(type-2)-PAA-biotin)稀释至1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml，包被96孔高结合力亲和素化酶标反应板，4℃包被过夜，洗涤液洗涤5次，每次5min；5％脱脂乳溶液封闭，200μL/孔，37℃孵育2h，洗涤液洗涤5次，每次5min。用样品稀释液稀释VP60VLPs溶液至浓度为0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml，加入高结合力亲和素化酶标反应板，37℃孵育1.5h，洗涤液洗涤5次，每次5min；将单克隆抗体1B8(样品稀释液按照稀释度为1:1000稀释)加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，每次5min；加HRP标记的二抗(样品稀释液按照稀释度为1:5 000稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，每次5min；加显色液，100μL/孔，避光8-15min，显色；加终止液，50μL/孔，终止反应；酶标仪上450nm波长测OD450nm值。结果见表1。结果表明，组织血型抗原最佳包被浓度为2.5μg/ml，VP60VLPs的最佳使用浓度为2μg/ml。
表1组织血型抗原最佳包被浓度和VP60VLPs最佳反应浓度的选择
2、血清最佳稀释度的选择
以TBST将组织血型抗原稀释至2.5μg/ml，包被96孔高结合力亲和素化酶标反应板，4℃包被过夜，洗涤液洗涤5次，每次5min；5％脱脂乳溶液封闭，200μL/孔，37℃孵育2h，洗涤液洗涤5次，每次5min。将标准阳性血清和标准阴性血清(同标题12中)分别进行1:50、1:100、1:200、1:400稀释与2.0μg/ml的VP60VLPs溶液，在EP管中37℃孵育1.5h，混合液加入酶标板中，100μL/孔，各3孔重复，37℃孵育1.5h，洗涤液洗涤5次，每次5min；将单克隆抗体1B8(样品稀释液按照1:1000倍稀释)加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，每次5min；加HRP标记的二抗(1:5 000)，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，每次5min；加显色液，100μL/孔，避光8-15min，显色；加终止液，50μL/孔，终止反应；酶标仪上450nm波长测OD450nm，取平均值，按照以下公式计算阳性血清的阻断率，阻断率(PI)＝(阴性血清组OD450nm-待检血清组OD450nm)/阴性血清组OD450nm×100％。选择阻断率最高的反应条件作为阻断ELISA最佳血清稀释度的反应条件，结果见表2。结果表明血清最佳稀释度为1:100。
表2血清最佳稀释度的选择
3、封闭液的选择
以TBST稀释组织血型抗原并包被在96孔高结合力亲和素化酶标反应板上，4℃过夜包被，洗涤后，分别以5％(质量百分含量)脱脂乳溶液(溶质是脱脂奶粉)、1％BSA(质量百分含量)溶液、2％明胶质量百分含量溶液(溶剂均是洗涤液)的洗涤液封闭，37℃孵育2h。将标准阳性血清和标准阴性血清分别进行1:100稀释与2.0μg/ml的VP60VLPs溶液，在EP管中37℃孵育1.5h，按照100μL/孔加入混合液，各3孔重复，37℃孵育1.5h，洗涤液洗涤5次，每次5min；将1B8单克隆抗体(样品稀释液按照稀释度1:1000稀释)加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，每次5min；加HRP标记的二抗(样品稀释液按照稀释度1:5 000稀释)，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤液洗涤5次，每次5min；加显色液，100μL/孔，避光8-15min，显色；加终止液，50μL/孔，终止反应；酶标仪上450nm波长测OD450nm值，取平均值，按照以下公式计算阳性血清的阻断率，阻断率(PI)＝(阴性血清组OD450nm-待检血清组OD450nm)/阴性血清组OD450nm×100％。选择阻断率最高的反应条件作为阻断ELISA最佳血清稀释度的反应条件，结果见表3。结果表明5％脱脂乳溶液为最佳封闭液。
表3封闭液的选择
4、封闭时间的选择
利用5％脱脂乳溶液进行封闭，考察封闭时间分别为37℃1h，37℃2h，37℃3h，其余实验步骤按照本实施例中标题3中的方法进行。计算各条件下阳性血清阻断率，以选择合适的封闭时间。结果见表4，最佳封闭时间为37℃2h。
表4封闭时间的选择
5、待检血清与VP60VLPs孵育时间的选择
酶标板按照最佳条件包被、封闭后，EP管中待检血清与VP60VLPs孵育，孵育条件为37℃0.5、1.0、1.5和2.0h，孵育结束后将混合物加入酶标板中，其他步骤同实施例中3的方法进行，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择最佳的孵育时间。结果见表5，待检血清最佳作用时间为37℃1.5h。
表5待检血清与VP60VLPs孵育时间的选择
6、待检血清与VP60VLPs混合物加入酶标板后作用时间的选择
酶标板按照最佳条件包被、封闭后，加入与VP60VLPs在37℃孵育1.5h后的待检血清，37℃孵育0.5、1.0、1.5和2.0h，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择最佳的作用时间。结果见表6，待检血清最佳作用时间为37℃1.5h。
表6待检血清与VP60VLPs混合物加入酶标板后作用时间的选择
7、单抗工作浓度的选择
酶标板按照最佳条件包被、封闭后，酶标板中加入与VP60VLPs在37℃孵育1.5h后的待检血清，37℃孵育1.5h，洗涤后，加入单抗1B8(6.5mg/ml)，单抗稀释度分别为1:500、1:1000、1:2000，其他步骤同实施例中3的方案进行，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择最佳的单抗稀释度。结果见表7，单抗最佳稀释度为1:1000。
表7单抗工作浓度的选择
8、单抗工作时间的选择
按照标题7确定的最佳反应条件，仅改变单抗1B837℃作用时间为0.5、1.0、1.5、2h，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择最佳的作用时间。结果见表8，单抗最佳工作时间为37℃1h。
表8单抗工作时间的选择
9、酶标二抗工作浓度的选择
按照标题8确定的最佳反应条件，仅改变酶标二抗的浓度(初始浓度为1mg/ml，酶标二抗采用洗涤液按照稀释度为1:5000、1:10000、1:15000和1:20000进行稀释)，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择最佳的稀释度作为酶标二抗的工作浓度。结果见表9，结果表明，酶标二抗的最佳稀释度为1:5000。
表9酶标二抗工作浓度的选择
10、酶标二抗工作时间的选择
按照标题9确定的最佳反应条件，仅改变酶标二抗加入酶标板后的作用时间(在37℃分别作用0.5、1.0和1.5h)，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，比较各组阳性血清的阻断率，以选择酶标二抗最佳的作用时间。结果见表10，酶标二抗的最佳作用时间为1.0h。
表10酶标二抗工作时间的选择
11、显色液最佳反应时间的选择
按照标题10确定的最佳反应条件，仅改变显色液反应时间(37℃分别作用5min、10min和15min)，对标准阴阳性血清进行阻断ELISA测定，计算各组阳性血清阻断率，确定最佳底物作用时间。结果见表11，显色液最佳作用时间为10min。
表11显色液最佳反应时间的选择
12.评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒的组成
根据本实施例以上实验确定了评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒的组成，具体包括：检测板、VP60VLPs溶液、抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8、HRP标记的二抗、样品稀释液、洗涤液、标准阳性血清、标准阴性血清、终止液和显色液。
(1)检测板
配制TBST缓冲液：取8.8g NaCl，25mL浓度为20mM、pH 7.5的Tris-HCl缓冲液，1gBSA和500μL Tween-20溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L。
配制样品稀释液(PBS缓冲液)：取8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9gNa2HPO4·12H2O和0.2g KH2PO4溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L。
配制洗涤液(PBST缓冲液)：取8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2gKH2PO4和500μL Tween-20溶于去离子水，然后用去离子水定容1L。
配制封闭液(5％脱脂乳溶液)：溶质为脱脂奶粉，溶剂为洗涤液，脱脂奶粉在封闭液中的质量百分含量为5％。
用TBST缓冲液将H(type-2)-PAA-biotin(购自美国GlycoTech公司，货号：01-034。)稀释至2.5μg/mL，100μL/孔，包被96孔高结合力亲和素化酶标反应板(购自Pierce公司，货号#15508)，4℃孵育至少8小时，洗涤液洗涤5次，每次5min；采用5％脱脂乳溶液封闭，200μL/孔，37℃孵育2h，洗涤液洗涤5次，每次5min，得到检测板。
(2)VP60VLPs溶液
VP60VLPs是兔出血症病毒皖阜株的VP60蛋白形成的病毒样颗粒。VP60VLPs溶液浓度为2μg/mL。
VP60VLPs溶液采用如下方法制备：将重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60(王芳，胡波，任雪枫，等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J].畜牧兽医学报，2008，39(10)：1382-1387.)采用Sf9细胞进行培养，当细胞出现明显病变后，收获细胞培养物，离心收集细胞沉淀，用PBS缓冲液重悬，超声裂解细胞，5 000g离心15min收集上清，采用蔗糖密度梯度离心方法纯化获得VP60VLPs溶液。蔗糖密度梯度离心方法的步骤如下：将超声裂解细胞离心后获取的上清液20 000g离心30min后取上清液，再以100000g超速离心2h，溶解沉淀，获得病毒粗制样品。在超速离心管中加入5mL病毒粗制样品，随后在离心管中，用长针头从底部往上依次加入30％、40％、50％的蔗糖溶液。11 0000g离心2.5h，在30％与40％的蔗糖溶液之间都有一条明亮的带，用长针头将该带吸取出来，即为VP60VLPs溶液，定量并利用SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果如图1和2所示，可以看到兔出血症病毒的VP60蛋白被成功表达。图3证明了纯化后的VP60蛋白形成了病毒样颗粒。
(3)抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8
抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8，即抗RHDV VLPs的单克隆抗体1B8，缩写为单克隆抗体1B8，浓度为6.5mg/ml。
采用分泌抗RHDV VLPs的单克隆抗体细胞株1B8(宋艳华，胡波，范志宇等.RHDVVLPs单克隆抗体的制备及其识别表位的初步定位,华北农学报,2015,30(5):65-70.)制备单克隆抗体1B8。利用抗体纯化试剂盒Hitrap Protein G HP(美国GE Healthcare)对单抗进行纯化。
(4)HRP标记的羊抗鼠IgG抗体
HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号IH-0031，浓度为1.0mg/ml。
(5)样品稀释液(PBS缓冲液)
配制PBS缓冲液：取8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4.12H2O和0.2g KH2PO4溶于去离子水，然后用去离子水定容至1L。
(6)洗涤液
配制洗涤液(PBST缓冲液)：取8.0g NaCl、0.2g KCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2gKH2PO4和500μL Tween-20溶于去离子水，然后用去离子水定容1L。
(7)终止液
终止液为2M的硫酸水溶液。
(8)显色液
显色液为单组分TMB显色液，购自湖州英创生物科技有限公司，货号：TMB-s-001。
(9)标准阳性血清、标准阴性血清
标准阴性血清：取SPF兔血清作为标准阴性血清。
标准阳性血清：采用重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60灭活疫苗(重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60的Sf 9细胞培养物灭活后所得，灭活前血凝效价为28)和兔病毒性出血症灭活疫苗(南京天邦生物科技有限公司，批号：159157)分别对2只SPF兔进行免疫。免疫方式均为颈部皮下免疫，共免疫四次。首次免疫剂量为2ml；以后每隔两周免疫一次，免疫剂量均为1ml。心脏采血，将收集的血清在37℃温箱中放置30min，3 000g离心5min，收集上清，各血清的HI效价均大于27。将两种疫苗免疫后得到的血清混合均匀，作为标准阳性血清。-20℃保存备用。
13试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的方法
采用标题12中试剂盒(简称为本发明试剂盒)评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的方法，包括如下步骤：
(1)将待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别用样品稀释液按照稀释度为1:100进行稀释，然后各取100μL分别与100μL、浓度为2μg/mL VP60VLPs溶液在EP管中37℃孵育1.5h，得到待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液；
(2)在检测板的待检血清孔、阳性对照孔、阴性对照孔中分别加入100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液，37℃孵育1.5h，采用洗涤液洗涤5次，每次5min；
(3)将单克隆抗体1B8利用样品稀释液按照稀释度为1:1000进行稀释，然后加入检测板中，100μL/孔，37℃孵育1h，采用洗涤液洗涤5次，每次5min；
(4)HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，利用样品稀释液按照稀释度为1:5 000进行稀释，按照100μL/孔加入检测板中，37℃孵育1h，采用洗涤液洗涤5次，每次5min；
(5)加入单组分TMB显色液，100μL/孔，避光反应10min进行显色；
(6)每孔加入50μL终止液；
(7)采用酶标仪检测各孔在450nm波长处的吸光值OD450nm。当阳性对照孔OD450nm值≤0.3，阴性对照孔OD450nm值≥0.8，试验成立；按照如下公式计算阻断率PI：
阻断率PI＝(阴性对照孔OD450nm-待检血清孔OD450nm)/阴性对照孔OD450nm×100％。
14、临界值的确定
根据文献报道(薛家宾，杨龙圣，徐为中等，免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平和保护率的影响[J]，2006,6:327-329.)，将HI效价≤22的血清作为阴性血清。
本发明试剂盒临界值的确定方法如下：重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60灭活疫苗免疫后兔场采集血清，取HI效价＝21或22的血清100份，采用本发明试剂盒及标题13中方法检测阻断率。结果经统计学分析，计算血清样品的平均阻断率(X)为13.92％，标准差(S)为5.69％。X+2S＝25.3％；X+3S＝30.99％。因此，判定标准如下：当阻断率PI≥30.99％时判定为血清阳性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后可以保护病毒攻击；当PI小于等于25.3％时，判定为血清抗体阴性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击；当25.3％＜PI＜30.99％时判定为可疑，重复检测一次，如果仍然低于30.99％则判定为血清抗体阴性，即兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击。
15、本发明试剂盒的重复性试验
使用相同批次和不同批次试剂盒，检测经HI方法(中华人民共和国农业行业标准，NY/T572-2016)测定分别为阴性、弱阳性、强阳性的3份血清样品，按照标题13中检测方法进行批内和批间重复性试验，计算变异系数。结果见表12。结果表明3份血清在批内和批间试验中的变异系数均小于3％，证明本发明试剂盒检测结果具有良好的重复性。
表12本发明试剂盒的重复性试验结果
16、本发明试剂盒与HI检验复合率试验
分别自重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60灭活疫苗和兔病毒性出血症灭活疫苗(南京天邦生物科技有限公司，批号：159157)免疫后的兔场采集血清，选择HI效价≥23的血清50份，利用本发明试剂盒采用阻断ELISA方法进行检测，结果所有血清的阻断率均＞30.99％，判定该疫苗免疫后可以保护病毒攻击，与HI检测结果一致；证明本发明试剂盒的相对敏感性为100％。
另外分别自重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60灭活疫苗和兔病毒性出血症灭活疫苗(南京天邦生物科技有限公司，批号：159157)免疫后兔场采集血清，选择HI效价≤22的血清50份，利用本发明试剂盒采用阻断ELISA方法检测，结果50份血清检测结果均显示阴性，阻断率均＜30.99％，判定为血清抗体阴性反应，表明兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击，与HI检测结果一致。结果证明本发明试剂盒相对特异性为100％。
17、本发明试剂盒的特异性反应试验
采用本发明试剂盒按照标题13中检测方法对已知兔巴氏杆菌、波氏杆菌、魏氏梭菌、轮状病毒阳性血清进行检测，同时设置兔病毒性出血症标准阳性血清对照，结果见表13。结果表明，除兔出血症病毒阳性血清为阳性反应外，其他几种病原的阳性血清均为阴性反应，证明本发明试剂盒可以特异性的检测兔出血症病毒抗体，与其他兔病原无交叉反应。
表13本发明试剂盒的交叉反应试验结果

Claims (6)

1.一种评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，包括：检测板、VP60VLPs溶液、抗兔出血症病毒单克隆抗体1B8和HRP标记的羊抗鼠IgG抗体；
所述检测板是采用H（type-2）-PAA-biotin包被的96孔高结合力亲和素化酶标反应板；
所述VP60 VLPs是兔出血症病毒VP60蛋白形成的病毒样颗粒。
2.根据权利要求1所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述VP60 VLPs溶液采用如下方法制备：将重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60采用Sf9细胞进行培养，然后采用蔗糖密度梯度离心法纯化获得。
3.根据权利要求1或2所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于H（type-2）-PAA-biotin的包被浓度为1.5-3.5μg/mL；所述VP60 VLPs溶液的浓度为1-3μg/mL。
4.根据权利要求3所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述96孔高结合力亲和素化酶标反应板在包被后采用4-6%脱脂乳溶液封闭后得到所述检测板。
5.根据权利要求4所述评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、终止液、标准阳性血清、标准阴性血清和显色液；
所述样品稀释液为PBS缓冲液；
所述洗涤液是含有0.05%吐温-20的PBS缓冲液；
所述终止液为2M的硫酸水溶液；
标准阳性血清：采用兔病毒性出血症疫苗免疫SPF兔，取HI效价＞26的兔血清，作为标准阳性血清；
标准阴性血清：SPF兔血清。
6.采用权利要求1所述试剂盒评价兔病毒性出血症疫苗免疫效力的阻断ELISA方法，包括如下步骤：
1）将100μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清分别与100μL浓度为2 μg/mL的VP60VLPs溶液混合，37℃孵育1.5 h，得到待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液；
2）在检测板的待检血清孔、阳性对照孔、阴性对照孔中分别加入100 μL待检血清、标准阳性血清、标准阴性血清的预处理液，37℃孵育1.5 h，采用洗涤液洗涤；
3）将单克隆抗体1B8，加入酶标板中，100 μL /孔，37℃孵育1 h，采用洗涤液洗涤；
4）加HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，100 μL /孔，37℃孵育1 h，采用洗涤液洗涤（PBST洗涤5次，每次5 min）；
5）加显色液，100 μL /孔，避光反应10min进行显色；
6）每孔加入50 μL终止液；
7）采用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光值OD450nm，按照如下公式计算阻断率PI：
阻断率PI=(阴性对照孔OD450nm-待检血清孔OD450nm) /阴性对照孔OD450nm 100%；
判定标准如下：当阻断率PI≥30.99%时判定为血清阳性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后可以保护病毒攻击；当PI≤25.3%时，判定为血清抗体阴性反应，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击；当25.3%＜PI＜30.99%时判定为可疑，重复检测一次，如果PI仍然低于30.99%则判定为血清抗体阴性，兔病毒性出血症疫苗免疫后不能保护病毒的攻击。
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