CN101533016A - 检测兔出血症病毒抗体的间接elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明检测兔出血症病毒(RHDV)抗体的ELISA试剂盒，属于生物技术领域。试剂盒采用杆状病毒表达系统表达的重组VP60衣壳蛋白作为包被抗原，依据间接ELISA原理检测家兔血清中兔出血症病毒的抗体，用于兔群中兔出血症疫苗免疫的血清学检测。试剂盒的核心物质包被抗原为杆状病毒表达系统表达的重组VP60衣壳蛋白，其具有与天然RHDV一样优良的抗原性，却没有RHDV潜在散毒的危险。应用本试剂盒检测血清样品，具有背景反应低，阴、阳性血清显色OD值对比明显的优点。本发明试剂盒生产成本低廉、可大量检测样品，而且特异性强、敏感性高，在兔出血症免疫监测等方面具有重要应用价值。

Description

检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA试剂盒

一 技术领域

本发明为检测兔出血症病毒(RHDV)抗体检测试剂盒，属于兽医生物技术领域。用于兔出血症病毒抗体的检测，以此监测兔群中兔出血症疫苗免疫状况，为兔出血症疫苗的免疫提供技术依据。

二 背景技术

兔出血症(RHD)，又称兔瘟，是由兔出血症病毒(RHDV)引起的一种以急性、高度传染性、大面积死亡为特征的兔传染病，感染兔通常48～72h死亡，主要特征为传染性极强、呼吸系统出血、肝坏死、脏器水肿、淤血和出血等变化，给全世界养兔业造成了巨大的经济损失。国际兽医局将该病列为B类传染病，我国农业部96号令颁布为二类疫病。

RHDV属杯状病毒，病毒粒子呈球型，为二十面体对称，无囊膜。病毒含有一条单股正链RNA，由7437个核苷酸组成，与一般的杯状病毒不同，RHDV只有2个开放阅读框架(ORF)，ORFI位于基因组5′端，从核苷酸10延伸至核苷酸7041，约占整个基因组的94％。RHDV的ORFI基因序列为：NH₂-P16-P23-2C解旋酶-P30-VPg-3C样蛋白酶-3D聚合酶-衣壳蛋白-COOH。衣壳蛋白是RHDV唯一的结构蛋白，称为VP60，其基因片段长度为1740bp，共编码580个氨基酸，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关。

目前，检测RHDV抗体的方法有血凝抑制法(HI)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。血凝抑制法(HI)因多种因素影响往往重复性不好，而以病毒作为包被抗原的ELISA，往往因病毒纯化不良等因素，易出现非特异性，而且用RHDV作为包被抗原存在潜在散毒的危险。本发明应用杆状病毒表达系统表达的VP60蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法，由于重组VP60蛋白具有与天然RHDV一样优良的抗原性，同时兔血清中不存在昆虫细胞相关蛋白的抗体，因此该间接ELISA方法具有背景反应低，阴阳性血清显色OD值对比明显，结果易判断的优点。本发明为检测兔出血症病毒(RHDV)抗体提供一种安全、特异、敏感、快速、操作简便、经济的试剂盒，为兔出血症免疫监测等方面提供技术手段和工具。

三 发明内容

技术问题

本发明的目的在于提供一种检测兔出血症病毒抗体的ELISA试剂盒，用于兔出血症病毒的抗体检测。该试剂盒以真核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制而成，具有高度的安全性、特异性、敏感性，操作简单、快速，可大量生产，检测成本低廉，适于推广。本发明可应用于养兔业中兔出血症抗体的免疫监测等。

技术方案

本发明的目的是以真核表达的重组蛋白为基础，通过酶联免疫技术研制一种检测兔出血症病毒抗体的试剂盒。首先是杆状病毒系统表达的重组蛋白及其含量测定；重组蛋白包被酶标板；间接ELISA最佳反应条件的确定；试剂盒的组装；试剂盒阻断试验、特异性、敏感性、重复性试验；初步应用；最终制备成检测兔出血症病毒抗体的试剂盒。

本发明采用的具体技术路线包括以下几个方面：

1 包被抗原重组VP60蛋白的制备方法

本发明应用杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60蛋白作为包被抗原。在本实验室的前期研究中，获得了高效表达RHDV衣壳蛋白(VP60蛋白)的重组杆状病毒，用重组杆状病毒感染昆虫细胞，经鉴定证明重组VP60蛋白具有很好的抗原性，从而为本发明打下良好的物质基础。在此基础上经过多次的实验验证建立了本发明中包被抗原的制备方法：

1)参照文献“兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果”.畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387.”中描述的方法，用重组病毒rAcV-Bac-VP60，感染Sf9昆虫细胞，感染后7天收集细胞及培养液；

2)将上述收集物于-20℃反复冻融三次，以10000rpm/min，离心10min，收集上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后，用血凝试验(HA)检测上清液中重组VP60蛋白的血凝效价为13log2，测得蛋白浓度为591mg/L，分装后于-20℃保存备用。

2 标准RHDV抗体阳性血清与标准RHDV抗体阴性血清的制备方法

在ELISA检测过程中，不同操作人员和不同的检测批次间会存在一定的误差，操作误差会导致检测样品OD值的误差，但待检样品OD值/标准阴性样品OD值可消除误差、准确反映检测结果，是优化的判定标准。本发明研制了标准RHDV抗体阳性血清与标准RHDV抗体阴性血清，用于检测条件的优化和检测结果的判定。

标准阳性血清的制备  取3月龄以上非免兔，用RHDV肝脏组织甲醛灭活疫苗通过肌肉注射接种2mL，21天后，同法免疫一次，再间隔14天，同法免疫一次，再间隔7天，同法免疫一次，最后一次免疫后6天采集兔耳缘静脉血，分离血清，并用血凝抑制试验检测其血凝抑制效价≧8(log2)，次日无菌心脏采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以0.5mL量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封，-20℃保存。

标准阴性血清的制备  取经检验合格的SPF兔，心脏采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封，-20℃保存。

3 ELISA检测板条的抗原包被剂量和包被方法

包被检测抗原的微孔板条是ELISA试剂盒的核心材料，包被抗原的剂量是一个重要的参数。抗原包被量过高会使检测样品产生较高的背景反应，抗原包被量过低又不能与样本中抗体的充分结合，从而产生假阳性和假阴性的结果。本发明通过方阵试验确定了包被抗原的最佳包被浓度选择为4.62μg/mL，每孔100μL。微孔板条的包被方法如下：

1)将重组RHDVVP60蛋白(血凝效价为13log2)用0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液进行1：2⁷，浓度为4.62μg/mL；

2)按100μL/孔将稀释的重组RHDV VP60蛋白包被96孔酶标板，置4℃包被过夜；

3)将包被了抗原的微孔板用PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗涤3次后，每次5min，最后一次拍干，以2％明胶封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h；

4)用PBST洗涤3次，室温晾干，每次5min，最后一次拍干，室温晾干，真空包装，置4℃保存。

4 上述试剂盒用于检测兔出血症抗体试剂盒的操作方法，包括

1)加入血清样品：被检血清用血清稀释液作1：100倍稀释，标准阳性血清和标准阴性血清用血清稀释液作1：200倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，于37℃下作用60min后，弃去反应孔中的液体；将每个孔用200μL的洗涤液充分清洗3～5次，每次持续5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体甩掉，最后一次甩掉洗涤液后，在纸巾上拍干，除去残留的液体；

2)每个反应孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用液，100μl/孔，37℃孵育90分钟，取出洗涤3～5次，每次5分钟；

3)每个反应孔中加入显色底物100μL，37℃避光作用10min；

4)终止反应：向每孔中加入50μL终止液2M的硫酸终止反应；

5)用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光度OD值；

6)以标准RHDV抗体阳性血清为参照计算样品与阳性血清的比值P/N的公式

即：

7)结果判定：

①阳性血清的OD₄₅₀≥0.321，且P/N≥2.1，试验结果才有效；

②如果血清样品OD₄₅₀值≤0.269，说明该血清样品为抗兔出血症病毒抗体阴性；

③如果血清样品OD₄₅₀值≥0.321，且P/N≥2.1，方可判血清样品为抗兔出血症病毒抗体阳性；

④如果血清样品1.5≤P/N<2.1，判定该血清样品为可疑。

有益效果

1 安全性好

国际兽医局将由兔出血症病毒引起的传染病列为B类传染病，我国农业部96号令颁布为二类疫病。以兔出血症病毒作为包被抗原建立的RHDV抗体检测的ELISA，存在潜在散毒的危险。本发明应用杆状病毒表达系统表达的VP60蛋白为包被抗原建立了间接ELISA方法。研究发现，杆状病毒作为基因表达载体，具有以下优点：①对哺乳动物细胞安全无毒。②由于杆状病毒具有高度的宿主特异性，杆状病毒仅感染无脊椎动物，使得杆状病毒DNA游离存在于哺乳动物细胞中而不与宿主细胞的基因发生整合，也不与细胞内存在的具有潜在缺陷的哺乳动物病毒基因进行重组，也不能“帮助”人体内的潜伏病毒，如腺病毒等进行复制。此外，杆状病毒也不会引起机体的免疫排斥反应。因此，对人类及其他畜禽均具有良好的生物安全性。

2 敏感性高、特异性好

本发明应用杆状病毒系统表达的重组VP60蛋白具有与天然RHDV一样优良的抗原性，以此重组蛋白作为包被抗原，在材料选择上具有新意。通过Western-blotting试验，证实重组VP60蛋白具有良好的反应原性，保证了检测试剂盒的高度敏感性。

特异性试验证明，该试剂盒能特异性地检测免疫家兔血清中的抗RHDV抗体，而与兔大肠杆菌抗体、兔多杀性巴氏杆菌抗体和兔支气管败血波氏杆菌抗体反应均呈阴性，从而表明该ELISA方法具有良好的特异性。

应用重组VP60蛋白为包被抗原建立检测RHDV抗体的间接ELISA方法对临床血清样品进行检测，同时与HI进行比较，试验证明，ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7％和76.0％，ELISA与HI的符合率为95.7％。说明本试剂盒在实际应用中具有良好的特异性和敏感性。

3 检测试剂盒可大量生产

目前，在检测RHDV抗体方面，应用较为广泛的是血凝抑制试验和全病毒RHDV作为包被抗原建立的ELISA方法。本发明使用的包被抗原为杆状病毒系统表达的重组VP60蛋白。研究发现，杆状病毒作为基因表达载体，具有以下优点：①表达效率高，与其他真核表达系统相比，杆状病毒系统可以高效地表达外源基因，表达量最高可达所感染细胞总蛋白量的50％。②表达产物具有活性，昆虫细胞对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的切除及磷酸化、糖基化等反应，表达产物具有很高的生物活性，其抗原性、免疫原性均与天然蛋白相似。因此重组VP60蛋白易于稳定、大量获得，重组VP60蛋白的批间质量易于控制、包被浓度易于确定，从而为RHDV抗体检测试剂盒的大量、稳定生产提供有力保证。

四 具体实施方式

1 包被抗原的制备和鉴定

1)用重组病毒rAcV-Bac-VP60(公知公用，参见“兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果”.畜牧兽医学报，2008，39(10)，1382～1387.)，感染Sf9昆虫细胞(购买于Invitrogen公司)，感染后7天收集细胞及培养液；

2)将上述收集物于-20℃反复冻融三次，以10000rpm/min，离心10min，收集上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后，用血凝试验(HA)检测上清液中重组VP60蛋白的血凝效价为13log2，测得蛋白浓度为591mg/L，分装后于-20℃保存备用；

3)应用蛋白电泳和Western-blotting鉴定重组VP60蛋白。重组VP60蛋白的分子量约为60kD，对RHDV阳性血清呈阳性反应；对阴性血清检测呈阴性反应；与兔大肠杆菌抗体、兔多杀性巴氏杆菌抗体和兔支气管败血波氏杆菌抗体无反应。

2 标准RHDV阳性血清与标准RHDV阴性血清的制备和鉴定

1)标准阳性血清的制备

取3月龄以上健康非免兔，用RHDV肝脏组织甲醛灭活疫苗通过肌肉注射接种2mL，21天后，同法免疫一次，再间隔14天，同法免疫一次，再间隔7天，同法免疫一次，最后一次免疫后6天采集兔耳缘静脉血，分离血清，并用血凝抑制试验检测其血凝抑制效价≧8(log2)，次日无菌心脏采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以0.5mL量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封，-20℃保存。

2)标准阴性血清的制备

取经检验合格的SPF兔，心脏采血，分离血清，并加万分之一的硫柳汞防腐。以0.5ml量分装于无菌玻璃瓶中，加塞密封，-20℃保存。

3 检测兔出血症病毒抗体间接ELISA的建立及其标准化

本发明所建立的以杆状病毒表达系统表达的RHDV VP60蛋白为包被抗原的检测RHDV抗体间接ELISA方法(VP60-ELISA)通过以下步骤实现：

3.1 方阵试验确定抗原包被浓度和血清稀释倍数

采用方阵滴定法(丘德新等。间接ELISA检测猪伪狂犬病血清抗体[J].中国兽医学报，2002，22(3)：149～151.)确定包被抗原和标准阳性、标准阴性血清的最佳工作浓度。取96孔ELISA板2块，将重组VP60蛋白(血凝效价为13log2)用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液进行倍比稀释至1：2¹²，自左向右依次分别加入1～12列，每个稀释度6个重复，每孔100μL，同时设置2个空白对照孔，每孔加100μL的包被液，置4℃包被过夜。取出后用PBST洗涤三次，每次持续5分钟。用以2％明胶封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h，洗涤同前。将标准阳性血清、标准阴性血清用PBST做1：100、1：200、1：400，自上而下分别A～F的反应孔中，每个稀释度12个重复，每孔100μL，空白对照孔每孔加100μLPBST，37℃作用1.5h，再用洗涤液洗板3次，每次5min。接着每孔中加入100μL1：2000稀释的HRP酶标羊抗兔IgG(KPL公司产品)，37℃作用1h，再用洗涤液洗板5次，每次5min。继而向每孔中加入100μL新鲜配制的TMBS(Amersco公司产品)-H₂O₂底物显色液，37℃避光显色10～15min，最后加入50μL2M H₂SO₄终止反应。在酶标仪上检测OD₄₅₀值。以阳性血清OD₄₅₀值接近1.0，阳性血清OD₄₅₀/阴性血清OD₄₅₀(P/N)的比值最大，且阴性血清OD₄₅₀值在0.1左右所在孔的抗原浓度和血清稀释液作为最佳抗原工作浓度和血清稀释度。确定最佳抗原工作浓度为4.62μg/mL，而血清最佳稀释倍数为1:200(表1)。

3.2封闭液

分别用PBST稀释的1％BSA和2％明胶作为封闭液，每个封闭液做两个重复，37℃作用2h，加1:200标准阳性血清、1:2000酶标羊抗兔IgG，结果表明，封闭液选用2％明胶效果最好(表2)。

3.3抗原抗体最佳作用时间

用pH7.4PBST将已知的阴、阳性血清做1:200稀释至最佳稀释倍数后，分别于37℃下作用30min、60min、90min和120min，在其它条件及操作方法相同的情况下，进行ELISA检测，观察OD₄₅₀值及P/N变化，以阳性血清OD值接近1.0，P/N值最大时为抗原抗体的最佳作用时间。结果表明抗原抗体的最佳作用时间为60min。

3.4酶标羊抗兔IgG的最佳稀释度和作用时间

应用抗原包被板对标准阴、阳性血清进行ELISA检测，在其它条件及操作方法相同的情况下，将辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG用pH7.4PBST从1：2000开始倍比稀释至1：16000，每个稀释度加4孔。按ELISA操作程序进行，比较其OD₄₅₀值差异；结果表明羊抗兔IgG最佳稀释度为1:4000(表3)。将酶标二抗做最佳稀释后，分别将作用时间调整为30min、60min、90min和120min进行ELISA测定，以阳性血清OD值接近1.0，P/N值最大时为酶标二抗的最佳作用时间。试验结果显示作用90min时效果最好。

3.5 底物作用时间

以上述经过确定的反应条件进行ELISA，加入底物后分别在37℃作用5min、10min、15min和20min终止反应，比较其OD₄₅₀值差异。结果表明以37℃作用10min为最佳显色时间。

3.6 间接ELISA操作程序

按以上各项所确定的优化条件进行操作，即得到本发明的最佳操作程序：取出已包被抗原并封闭好的ELISA板条，用稀释液将被检血清用血清稀释液作1：100倍稀释，标准阳性血清和标准阴性血清用血清稀释液作1：200倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，于37℃下作用60min后，弃去反应孔中的液体；将每个孔用200μL的洗涤液充分清洗3～5次，每次持续5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体甩掉，最后一次甩掉洗涤液后，在纸巾上拍干，除去残留的液体；每个反应孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用液，100μL/孔，37℃孵育90分钟，取出洗涤3～5次，每次5分钟；每个反应孔中加入显色底物100μL，37℃避光作用10min；向每孔中加入50μL终止液2M的硫酸终止反应；用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光度OD值，读值并计算和判定结果。

4 ELISA检测结果的判定标准

应用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒(VP60-ELISA)对150份经血凝抑制试验测定、已知阴、阳性的血清样品进行检测。以标准RHDV抗体阳性血清为参照计算P/N值，对这些血清数据经统计学分析，得到OD₄₅₀平均值X和标准差S。根据统计学原理，OD₄₅₀值≥X+3S时，判为阳性。OD₄₅₀值≤X+2S者判为阴性，介于二者之间者判为可疑。根据分析结果得出VP60-ELISA进行RHDV抗体检测的判定标准：

①阳性血清的OD₄₅₀≥0.321，且P/N≥2.1，试验结果才有效。否则，应进行重复试验。

②如果血清样品OD₄₅₀值≤0.269，说明该血清样品为抗兔出血症病毒抗体阴性；

③如果血清样品OD₄₅₀值≥0.321，且P/N≥2.1，方可判血清样品为抗兔出血症病毒抗体阳性。

④如果血清样品1.5≤P/N<2.1，判定该血清样品为可疑。

5 检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA试剂盒组装

1)ELISA板条：每个试剂盒装有2块锡箔真空包装的ELISA板，每块ELISA板含可拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板条，包被抗原为杆状病毒表达系统表达的VP60蛋白，规格为8孔×12条；

2)洗涤液和血清稀释液：10倍浓度的pH7.4PBST溶液150mL；

3)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用液1瓶，25mL/瓶；

4)底物显色液：A：浓度为0.1mol/L，pH为6.0的磷酸缓冲液(PB)100mL，加入1mL TMBS(10mg/mL)配制而成；B：3％H₂O₂ 10mL；A和B均需4℃密封、避光、保存；每10mL显色液A加B3％H₂O₂ 50μL混匀即用；

5)终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液100mL；

6)标准RHDV阳性血清：0.5mL；

7)标准RHDV阴性血清：0.5mL。

6 阻断试验

取RHDV阳性血清作1:200倍比稀释至1:6400，与等量重组VP60蛋白抗原(4.62μg/mL)混合，37℃作用24h，10000rpm/min离心10min，取上清，与未经抗原处理的阴、阳性血清一起，应用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒作ELISA检测。计算(N-P)/N值，若此值大于0.5，则判为阻断阳性。(N-P)/N＝(未阻断孔OD值-阻断孔OD值)/未阻断孔OD值。结果表明，阳性血清稀释度在1:200～1:3200范围内，重组VP60蛋白抗原处理血清的阻断抑制率为76.6％～96.9％，当血清稀释度在1∶6400时，其抑制率为100％(表4)，证明重组VP60蛋白抗原对血清抗体与包被抗原的结合有很强的抑制作用；包被抗原与血清抗体的结合是特异的。

7 特异性试验

用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒，分别加入兔出血症病毒阳性抗体、大肠杆菌抗体、巴氏杆菌抗体和兔支气管败血波氏杆菌(Bb)抗体进行检测，比较其OD_450nm值，以OD值≥0.321，P/N≥2.1判为阳性(+)、以P/N<2.1判为阴性(—)，试验结果显示特异性好(表5)。

8 敏感性试验

取RHDV肝脏甲醛灭活疫苗免疫血清10份，1:200倍比稀释至1:819200，用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒作ELISA测定。以OD值≥0.321，且P/N≥2.1作终点判定。试验结果显示血清的ELISA几何平均效价为1:204800(表6)。

9 重复性试验

应用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒取6份阳性血清在不同时间相同条件下，重复检测6次，观察OD值的变化。6次结果OD值变化较小，以OD值≥0.321，P/N≥2.1判为阳性(+)，检测结果完全相同(表7)。

10 临床样品检测

应用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒分别对江苏南京地区四家实验兔场和江苏盐城兔场的1127份临床血清样品用本研究建立的检测RHDV抗体的ELISA试剂盒和HI进行检测，计算阳性率和符合率。试验结果，ELISA与HI检测兔血清的RHDV抗体阳性率分别为84.7％(955/1127)和76.0％(857/1127)，ELISA与HI的符合率为95.7％(表8)。

表1 抗原和血清最适稀释度选择结果

注：P为RHDV阳性血清2个平行孔的OD₄₅₀平均值；

N为RHDV阴性血清2个平行孔的OD₄₅₀平均值。

表2 不同封闭液对标准阴、阳性血清检测结果的影响

表3 羊抗兔IgG最佳稀释度的确定

注：P为RHDV阳性血清4个平行孔的OD₄₅₀平均值；

N为RHDV阴性血清4个平行孔的OD₄₅₀平均值。

表4 ELISA阻断试验

注：N：未处理，T：处理，以上值为OD_450nm

表5 间接ELISA特异性试验结果

表6 间接ELISA敏感性试验结果

表7 间接ELISA重复性试验结果

表8 间接ELISA与HI检测结果的比较

Claims (4)

1.检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括，

1)ELISA板条：每个试剂盒装有2块锡箔真空包装的ELISA板，每块ELISA板含可拆卸的已包被抗原的ELISA微孔板条，包被抗原为杆状病毒表达系统表达的VP60蛋白，规格为8孔×12条；

2)洗涤液和血清稀释液：10倍浓度的pH7.4PBST溶液150mL；

3)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用液1瓶，25mL/瓶；

4)底物显色液：A：浓度为0.1mol/L，pH为6.0的磷酸缓冲液PB100mL，加入1mLTMBS 10mg/mL配制而成；B：体积比3％ H₂O₂ 10mL；A和B均需4℃密封、避光保存；每10mL显色液A加B3％ H₂O₂ 50μL混匀即用；

5)终止液：2mol/L的H₂SO₄溶液100mL；

6)标准RHDV阳性血清：0.5mL；

7)标准RHDV阴性血清：0.5mL。

2.根据权利要求1所述检测兔出血症病毒抗体间接ELISA试剂盒，其特征在于，包被抗原杆状病毒表达系统表达的VP60蛋白的制备方法为：

1)用重组病毒rAcV-Bac-VP60，感染Sf9昆虫细胞，感染后7天收集细胞及培养液；

2)将上述收集物于-20℃反复冻融三次，以10000rpm/min，离心10min，收集上清，将上清液用0.45μm滤膜过滤后，用血凝试验HA检测上清液的血凝效价，分装后于-20℃保存备用。

3.根据权利要求1或2所述检测兔出血症病毒抗体的间接ELISA试剂盒，其特征在于，ELISA微孔板条的包被抗原剂量和包被方法为：

1)将血凝效价为13log2的重组VP60蛋白用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液进行1：2⁷稀释；

2)按100μL/孔将稀释的重组VP60蛋白包被96孔微孔板，置4℃包被过夜；

3)将包被了抗原的微孔板用PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以质量比2％明胶封闭每孔，200μL/孔，37℃放置2h；

4)将封闭好的微孔板用PBST洗涤3次，每次5min，最后一次拍干，室温晾干，真空包装，置4℃保存。

4.权利要求1～3之一所述试剂盒用于检测兔出血症抗体试剂盒的操作方法，包括1)加入血清样品：被检血清用血清稀释液作1：100倍稀释，标准阳性血清和标准阴性血清用血清稀释液作1：200倍稀释后，按酶标板样品添加模式于每孔中加入100μL，于37℃下作用60min后，弃去反应孔中的液体；将每个孔用200μL的洗涤液充分清洗3～5次，每次持续5min，在每次洗涤后将反应孔中的液体甩掉，最后一次甩掉洗涤液后，在纸巾上拍干，除去残留的液体；

2)每个反应孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG使用液，100μl/孔，37℃孵育90分钟，取出洗涤3～5次，每次5分钟；

3)每个反应孔中加入显色底物100μL，37℃避光作用10min；

4)终止反应：向每孔中加入50μL终止液2M的硫酸终止反应；

5)用酶标仪测定OD值：在450nm波长下测定各孔吸光度OD值；

6)以标准RHDV抗体阳性血清为参照计算样品与阳性血清的比值P/N的公式即：

7)结果判定：

①阳性血清的OD₄₅₀≥0.321，且P/N≥2.1，试验结果才有效；

②如果血清样品OD₄₅₀值≤0.269，说明该血清样品为抗兔出血症病毒抗体阴性；

③如果血清样品OD₄₅₀值≥0.321，且P/N≥2.1，方可判血清样品为抗兔出血症病毒抗体阳性；

④如果血清样品1.5≤P/N<2.1，判定该血清样品为可疑。