CN105277696A - 兔出血症病毒双抗夹心elisa检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种兔出血症病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒及使用方法，所述试剂盒及方法是基于单克隆抗体9H9实现的，所述9H9通过如下方法筛选得到：免疫原制备、阳性杂交瘤细胞建株、腹水制备与纯化即得7株单克隆抗体4A5，5B7，6F6，9H9，11D4，15C3，16F2；对所述7株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对，即得适用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的包被抗体9H9、酶标抗体HRP-9H9。用本发明技术方案进行检测无交叉反应；操作简便、敏感性高、可避免因体内抗体滴度低而出现漏检现象；特异性高，适于大规模检测。

Description

兔出血症病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒及使用方法

技术领域

本发明属于动物病毒性疾病的检测和诊断试剂研究领域，具体涉及兔出血症病毒抗原的双抗夹心ELISA检测试剂盒及使用该试剂盒的检测方法。

背景技术

兔出血症(RHD)俗称“兔瘟”，又称“兔出血性肺炎”、“兔病毒性败血症”，是由兔血症病毒(RHDV)引起的一种急性、烈性、高度接触性和致死性传染病。本病潜伏期短、发病迅速、死亡率高，对易感兔的致死率打动90％以上，病死率高达100％。RHDV属于杯状病毒科，兔病毒属，该病毒科还包括水疱疹病毒属，札幌病毒属和诺瓦克病毒属，目前为止发现的RHDV毒株均为同一血清型，且与其他三个属均无交叉反应。该基因组为单股正链RNA分子，是兔群疾病中一种重要病原。目前认为该病只感染兔且可感染各种品种的兔，但对不同年龄的兔感染差异很大，一般来说生长期和成年兔极易感染，90日龄以下的幼兔感染率很低。

兔病毒性出血症发病时，病兔会出现体温升高、食欲不振等症状，临死前抽搐、尖叫、鼻孔出血，死后尸体呈角弓反张。病毒主要侵袭兔肝脏、脾脏和肺，病死兔解剖可发现肝脏出血坏死，脾脏肿大，肺部和气管水肿出血等明显病变。由RHDV致病机理研究可知，病毒进入机体后，感染血管组织内单核细胞并诱发其凋亡，导致血管内凝血，进而形成纤维性栓塞，使体内实质性脏器出血，缺氧，最终坏死，最后，感染兔会因为体内各种脏器功能性衰竭而死亡。

该病于1984年首先在我国江苏爆发，但经过调查发现，在1984年前的澳大利亚健康兔血清中就能检测到RHDV的抗体，说明在该病被发现之前澳大利亚就存在非致病的兔出血症病毒。该病流行三十年间，以蔓延至我国大部分地区，另外在美洲、欧洲和东南亚等世界范围内均有流行，已有四十多个国家出现了该病的报道，由于RHD传播迅速，毒力强，一旦发病，往往造成兔群全覆灭，给养兔业造成了巨大的经济损失。

目前该病的血清学诊断方法为传统的人“O”型红细胞的血凝抑制试验。但由于感染兔组织和血液中含毒量低，常常不足以产生血凝现象，检测率低，经检索，“在先申请201410267882.8公开了一种兔病毒性出血症病毒RT-LAMP检测方法，但是该方法敏感性差，尽管恒温扩增不需要PCR仪器，但结果显示大多数LAMP实验仍然需要PCR仪器保温，另外由于没有封闭系统，容易污染造成假阳性；在先申请CN201310052271公开了一种兔出血症病毒RT-PCR检测方法，在先申请CN200610042409公开了一种兔病毒性出血症病毒荧光定量检测方法，这两种方法操作简单，检测率高，敏感但是这些技术都需要专用的PCR仪、荧光PCR仪等特殊仪器设备，限制了在基层和普通实验室检测工作的开展。另外尽管之前也有针对RHDV特异性抗体的间接ELISA诊断试剂盒的研制，但市场上稳定高效简便的商品化检测试剂盒仍然极少，另外受感染兔有时表现耐受免疫，体内抗体滴度低等现象，因此，针对抗原检测的诊断方法更具有实际意义。

双抗夹心ELISA检测方法由于其高效、敏感、特异性，而且操作简单、适宜于基层和大批样品检测等特点，已经成为国内外动物疫病常用的疾病诊断技术。尽管目前双抗夹心ELISA已应用于牛病毒性腹泻病毒，甲型H1N1猪流感病毒等多种病院的检测，但是由于应用于建立双抗夹心ELISA方法的抗体多为一种单抗与一种多抗，而多抗效价低，敏感性差，假阳性高，并且不稳定，之前报道的实验室制备的针对VP60单克隆抗体之间没有良好的配对反应，因此该技术未应用于RHDV的检测。随着我国养兔业越来越发达，养殖规模不断扩大，建立一种良好稳定而且快速的适合于基层和临床检测RHDV的方法势在必行，我们期望通过制备一种稳定，敏感性高的检测RHDV的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、灵敏度高、特异性强、低成本、适应大规模检测的单克隆抗体介导的双抗夹心ELISA方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

第一方面，本发明提供一种适用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的单克隆抗体9H9，通过如下方法筛选得到：

免疫原制备：纯化的VP60蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，制备免疫原，免疫小鼠；

阳性杂交瘤细胞制备：取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；

单克隆抗体：阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得7株单克隆抗体4A5，5B7，6F6，9H9，11D4，15C3，16F2；对所述7株单克隆抗体进行HRP标记；

夹心抗体配对：对所述7株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对，即得适用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的包被抗体9H9、酶标抗体HRP-9H9。

第二方面，本发明提供一种基于所述单克隆抗体9H9的用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的建立包括：

所述配对的包被抗体9H9和酶标抗体HRP-9H9最佳工作浓度、最适包被条件、最适封闭剂、最适封闭条件、酶标二抗稀释液组分、酶标抗体最适作用时间、底物作用时间及双抗夹心ELISA方法临界值的确定，选取最适参数的组合，即可。

优选地，所述包被抗体9H9和酶标抗体HRP-9H9的工作浓度分别为5μg/ml、0.5μg/ml。

优选地，所述最适包被条件为37℃、2h后4℃过夜。

优选地，所述最适封闭剂为1％的明胶。

优选地，所述最适封闭条件为37℃、2h。

优选地，所述酶标二抗稀释液的组分为含体积分数为10％FBS(小牛血清)的pH7.4的磷酸盐缓冲液。

优选地，所述酶标抗体最适作用时间为37℃、1h。

优选地，所述底物作用时间为37℃、15min。

优选地，所述临界值为0.35。

第三方面，本发明提供一种基于单克隆抗体9H9的双抗夹心ELISA试剂盒，包括洗涤液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照，包被抗体9H9的酶标板、酶标抗体HRP-9H9。

优选地，所述的洗涤液，溶剂为pH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液(PBS)，溶质及其在所述洗涤液中的浓度为：Tween-200.05％；

所述的显色液为TMB显色液；

所述的终止液是2mol/L的H₂SO₄溶液；

所述的阳性对照是阳性兔肝脏研磨液；

所述的阴性对照是阴性兔肝脏研磨液。

本发明的试剂盒中的包被抗体和酶标抗体均为抗VP60蛋白单克隆抗体9H9。

第四方面，本发明提供一种所述双抗夹心ELISA试剂盒的使用方法，包括：

包被：用磷酸缓冲液对所述包被抗体9H9进行稀释，然后将其加之酶标板中包被，洗涤、甩干；

封闭：向所述酶标板中加入封闭剂进行封闭，洗涤、甩干；

加待检样品：再向所述酶标板中加入待检样品，反应后洗涤、甩干；

加入酶标抗体HRP-9H9：向所述酶标板中加入酶标抗体HRP-9H9，反应后洗涤、甩干；

加显色液：加入显色液孵育；

终止：加入终止液，终止反应；

检测：在酶标仪上读取OD450值。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1.本发明所采用包被抗体和酶标抗体均为针对VP60特异性单克隆抗体，相比多克隆抗体，更敏感，特异性更强，与其他病毒均无交叉反应；

2.本发明提供封闭后的酶标板，方法简便，不需要特殊仪器，根据反应颜色即可以初步判断样品是否为阳性，适合于基层兽医使用；

3.本发明快速，灵敏，三个小时即可以得到检测结果，不耽误治疗时间；

4.由于双抗夹心ELISA方法检测的是RHDV抗原，可避免因体内抗体滴度低而出现漏检现象，检测准确率高。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为SDS-PAGE分析VP60蛋白表达纯化及酶切；

其中，1为蛋白质Marker，2为未诱导菌体蛋白，3为纯化的重组VP60蛋白，4为酶切后的重组VP60蛋白，5是纯化后的VP60蛋白；

图2为Westernblot分析VP60蛋白的表达纯化及酶切；

其中，1为未诱导菌体蛋白，2为纯化的重组VP60蛋白，3为酶切后的重组VP60蛋白，4和5为纯化后的VP60蛋白。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供七株兔出血症病毒单抗，其制备方法如下：

步骤一，纯化的VP60蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，制备免疫原，免疫BALB/c小鼠；

步骤二，取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选分析抗VP60蛋白的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞；

步骤三，阳性杂交瘤细胞亚克隆建株、腹水制备与纯化。

在单抗制备中所涉耗材及制备参数均为现有技术。

实施例1：兔出血症病毒单克隆抗体(McAb)9H9研制与检测

1.1实验方法

1.1免疫原的制备

利用RT-PCR技术扩增RHDV衣壳蛋白(aa1-aa580)基因序列，将其亚克隆于pSMK原核表达载体(含His标签和SUMO标签)构建pSMK-VP60重组表达载体，转化至BL21-Condonplus(DE3)-RIL感受态细胞，经IPTG诱导后，表达的重组RHDV衣壳蛋白部分以可溶形式存在，纯化的可溶性重组RHDV衣壳蛋白通过与特异性SUMO蛋白酶酶切后形成VLPs，检测显示VLPs与RHDV兔阳性血清特异结合。见图1，图2。

1.2小鼠免疫

以大腿皮下和肌肉注射法用VP60VLPs免疫6周龄BALB/c小鼠，每只小鼠每次多点肌肉注射100μg，每隔两周免疫一次，共免疫六次，第一次用完全弗氏佐剂等量混合，其余几次用不完全弗氏佐剂等量混合，首次免疫后14天断尾采血检测小鼠血清效价，效价达到1.6×10⁵，并于融合前3d加强免疫。

1.3细胞融合及阳性杂交瘤细胞株筛选

加强免疫后3天的小鼠眼球采血，分离血清留作阳性对照，无菌取出小鼠脾脏(足垫免疫小鼠无菌取出腘淋巴结)，用注射器吸取1640培养基反复冲洗脾脏以制备脾细胞悬液(或者用注射器研磨腘淋巴结制备细胞悬液)，将1.0×10⁸个免疫小鼠脾细胞与2.0×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞混合均匀，在37℃水浴下与50％PEG1000进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加入含20％胎牛血清的HAT-1640培养液中，加入事先铺好饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100ul，放入37℃、5％CO₂培养箱中培养，并分别于第4天、7天和10天，根据细胞生长状况补加或更换HAT培养基，待克隆细胞生长至孔底1/4面积以上时，用间接ELISA法检测上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并选择阳性高，细胞生长状态好的孔，采用有限稀释法进行克隆，然后扩大培养、冻存，连续克隆化三次以上，直到所有的克隆细胞孔都为阳性为止，最后获得七株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株，命名为4A5，5B7，6F6，9H9,11D4，15C3，16F2。

1.4有限稀释法的具体步骤

将ELISA检测为阳性孔中加入200ul培养液，把吹打下来；吸取100ul于96孔板A1孔中(提前在A1-A12孔中加100ul培养液)，做倍比稀释，选择约100个/孔的孔内细胞于6ml培养液中混匀(100个/6ml)；将此细胞混合液以100ul/孔(即1.7个/孔)加入新的96孔板中(总共加A-C排，共36孔)；在剩余的细胞液中补加2.4ml培养液，混匀，将此细胞培养液以100ul/孔(即0.8个/孔)加入新的96孔板中(总共加D-F排，共36孔)；在剩余的细胞液中补加1.2ml培养液，混匀，将此细胞培养液以100ul/孔(即0.5个/孔)加入新的96孔板中(总共加G-H排，共24孔)；培养7-10天，观察，取单个克隆生长的阳性孔再重复以上操作进行亚克隆。

1.5腹水的制备

选用10-12周龄BALB/c小鼠5只，每只腹腔注射液体石蜡0.3mL，8天后，将培养的杂交瘤细胞以1000r/min离心5min，弃去上清液，杂交瘤细胞用无血清的培养液悬浮，每只小鼠腹腔注射1×10⁶细胞。接种杂交瘤细胞7天后，每日观察小鼠腹水的生成情况，待小鼠腹部膨胀明显时收集腹水，3000rpm离心10min以去除脂肪层和细胞层等杂质，收集中间澄清层，于-80℃保存备用。

1.6辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水

具体操作如下：

腹水加2倍体积的醋酸缓冲液(0.06mol/L，PH5.0)，用1mol/LHCl调PH至4.8，逐滴加入辛酸(11ul/ml稀释腹水)，边加边搅拌，30min内完成，4℃静置2h，10000g离心30min，弃沉淀。上清加入1/10体积的PBS(0.01mol/L)，用1mol/LNaOH调PH至7.2。4℃下加入硫酸铵(0.277g/ml)至45％饱和，搅拌30min，10000g离心30min。弃上清，将沉淀溶于适量0.01mol/LPBS中，4℃透析过夜，然后分装-80℃保存备用。纯化后的腹水即作为单抗成品。

1.7单克隆抗体亚型的测定

具体操作如下：

用0.1MNaHCO₃(pH8.6)将兔抗鼠IgG1，IgG2b，IgG3和IgG2a，IgGM抗体分别按1:1000和1:5000稀释后，按照100μL/孔加入酶标板，每个样品两个重复，4℃包被过夜。PBST洗涤三次后甩干，加入已1:1000稀释的纯化后的七株单克隆抗体并设空白对照，37℃孵育1个小时；PBST洗涤3次后，甩干；按1:5000加入HRP-兔抗鼠IgG单克隆抗体，每孔100μL，37℃孵育1个小时；PBST洗涤3次后，加入100μLTMB显色液，37℃避光作用15min，并用2M硫酸终止，酶标仪读取OD450值。结果显示，除了6F6的抗体亚类为IgG2a外，其他单抗的亚类都为IgG1。

1.8间接ELISA方法测单抗效价

具体操作如下:

(1)用检测原VP60包被酶标板，4℃过夜；

(2)PBST洗涤3次，甩干；

(3)纯化后的腹水从5千倍开始倍比稀释，同时设定阴性对照，阴性对照为注射骨髓瘤细胞产生的腹水。每个浓度设定2个重复孔，37℃孵育1h；

(4)PBST洗涤3次，甩干；

(5)每孔加入100ul辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗(1:5000倍稀释)，37℃孵育1h；

(6)PBST洗涤3次，甩干；

(7)每孔加入100ulTMB底物溶液，37℃显色15min，加入50ul终止液，酶标仪读值记录结果。

1.9辣根过氧化物酶标记单克隆抗体

具体操作如下：用超纯水配制辣根过氧化物酶(HRP,RZ≥3.0)溶液，加入0.06M过碘酸钠溶液4℃避光1小时，加入160mM乙二醇，室温反应30分钟，加入PH4.4的醋酸缓冲液2～8℃透析过夜，换液两次。将纯化的单克隆抗体加入上述活化的酶中，转移至透析袋，于0.05mMPH9.6的碳酸缓冲液中透析，4℃搅拌过夜(换液两次)。透析液吸至离心管中，加新配的0.05M硼氢化钠溶液，4℃反应2小时。加入等量的饱和硫酸铵溶液4℃30分钟，4℃离心20分钟,弃上清，沥干。将沉淀溶于少量PBS，装入透析袋中，对0.02MPBS(PH7.4)透析，4℃过夜。将透析液中液体吸至离心管中，离心，取上清。

实施例2：双抗夹心ELISA方法的建立

2.1单克隆抗体与酶标单克隆抗体的配对

具体操作如下：

包被抗体：按100μl/孔包被1：100稀释上述纯化的腹水，37℃水浴2h；

封闭：1％明胶200μl/孔，37℃水浴封闭2h；

按100μl/孔加入1:10稀释的兔阳性肝脏处理液和阴性肝脏研磨液，37℃水浴作用1h后PBST冲洗数次；

按100μl/孔加入梯度稀释酶标抗体，37℃水浴作用1h后PBST洗涤三次，每次5min；

按100μl/孔加入TMB显色液室温作用15min；

按50μl/孔加入2M硫酸终止反应，OD450读值；见表1。结果显示单克隆抗体9H9与HRP-9H9配对效果最好。

表1HRP-9H9与七株单克隆抗体配对情况

结果显示：9H9与HRP-9H9配对效果最好。

2.2单抗最佳包被浓度和酶标单抗最佳工作浓度的确定

采用棋盘滴定法确定单抗最佳包被浓度和酶标，二抗最佳稀释度。单抗9H9用包被液(pH9.6的碳酸盐缓冲液)分别稀释成20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL，纵向加入酶标板，100μL/孔，4℃包被过夜。PBST洗涤后用1％明胶37℃封闭2h，PBST洗涤后，加100μL待检样品(阳性肝脏研磨液)，同时设立阴性对照，37℃孵育1h，PBST洗涤拍干；横向加入系列稀释的酶标二抗(2mg/ml)，稀释倍数分别为1:1000，1:2000，1:4000,1:8000，每个稀释度2个重复，100μL/孔，37℃孵育1h。洗涤后，每孔加入100μLTMB底物溶液，37℃孵育15min，按50μL/孔加入2MH₂SO₄后酶标仪读值。选择吸光度为1.0左右时的单抗包被浓度和酶标多抗稀释度为最佳的单抗工作浓度为5μg/ml和酶标抗体HRP-9H9工作浓度0.5μg/ml。

2.3最适包被条件的确定

包被条件分为4组，第1组：4℃包被过夜；第2组：37℃包被2h+4℃过夜；第3组：37℃包被2h；第4组：37℃1h。洗涤后于37℃用1％明胶分别封闭2h,洗涤后加入一定浓度的阳性样品和阴性样品，洗涤后加入酶标二抗，37℃孵育1h，最后根据P/N值确定最佳包被时间，第2组：37℃2h+4℃过夜。

2.4最适封闭剂的确定

最佳单抗包被浓度37℃包被2h，洗涤后分别用1％明胶，1％BSA，5％脱脂乳，1％小牛血清封闭，100μL/孔，37℃封闭1h，根据P/N值确定最适封闭剂为1％的明胶。所述％的单位为g/ml。

2.5最适封闭条件得到确定

最佳单抗包被浓度37℃包被2h后4℃过夜，用最适封闭剂封闭，封闭时间分为4组。第1组：37℃，30min；第2组：37℃，1h；第3组：37℃，2h；第4组：4℃过夜。根据P/N值确定最佳封闭条件：37℃，2h。

2.6酶标二抗稀释液的确定

最佳单抗包被浓度37℃包被2h，用最适封闭剂及封闭时间封闭。酶标抗体稀释液一共分成6组，第1组：0.01M的PBS；第2组：PBST(0.01M的PBS,含tween-200.05％)；第3组：PBS+1％BSA；第4组：PBST+1％BSA；第5组：PBS+10％FBS；第6组：PBST+10％FBS，根据P/N值确定最适酶标多抗稀释液为含体积分数为10％FBS(小牛血清)的pH7.4的磷酸盐缓冲液。

2.7酶标抗体最适作用时间的确定

最佳单抗包被浓度37℃包被2h，用最适封闭剂及封闭时间封闭，最适抗体稀释液稀释酶标抗体。37℃条件下作用时间一共分成4组。第1组：30min；第2组：1h；第3组:1.5h；第4组：2h，根据P/N值确定样品与酶标抗体作用时间，第2组：1h。

2.8底物作用时间的确定

最佳单抗包被浓度37℃包被2h，用最适封闭剂及封闭时间封闭，最适抗体稀释液稀释样品及酶标抗体，作用最佳时间后，底物作用时间分成4组。第1组：10min；第2组：15min；第3组：20min；第4组：30min，根据P/N值确定最佳底物作用时间，第2组：15min。

2.9双抗夹心ELISA方法临界值的确定

建立的双抗夹心ELISA方法检测10份假定无RHDV感染的兔肝脏研磨液，计算其平均值(mean)与标准差(SD)，以检测血清的OD450≥mean+3SD定位阴、阳性肝脏研磨液临界值，经计算得出临界值为0.35，即当待测样本的OD450≥0.35时，可判断为阳性。

3.0优化后的RHDV双抗夹心ELISA检测方法的操作

(1)抗RHDV的单克隆抗体9H92μg/ml包被酶标板，100μL/孔，37℃包被2h；

(2)0.1％的PBST洗涤3次，每次5min；

(3)新鲜配置的1％明胶封闭剂，100μL/孔，37℃封闭1h；

(4)0.1％的PBST洗涤3次，每次5min；

(5)适当稀释的待检样品与HRP标记的单克隆抗体9H9，各100μL/孔，37℃封闭1h；

(6)0.1％的PBST洗涤3次，每次5min；

(7)加入TMB底物溶液，100μL/孔，37℃孵育15min，

(8)加入2M硫酸终止反应，50μL/孔，酶标仪测定OD₄₅₀值，

(9)根据OD450值判断样品是否为RHDV阳性。

兔出血症病毒双抗夹心ELISA检测试剂盒的组装

试剂盒包括：封闭后的包被有单克隆抗体9H9的酶标板，辣根过氧化物没标记的9H9，酶标抗体稀释液(含10％小牛血清的PBST溶液)、TMB底物溶液和终止液(2MH₂SO₄溶液)，阳性对照和阴性对照溶液。

应用：46份来自江苏、山东、安徽兔场疑似RHDV感染病兔肝脏，进行组织研磨，同时用RT-PCR和本发明的双抗夹心ELISA方法进行检测。

经RT-PCR检测(RHDV-VP60保守片段的PCR扩增)，结果检出19份为阳性；用本发明的双抗夹心ELISA检测，检出18份阳性样品，其检测结果与RT-PCR的符合率达94.7％，预示着该方法可以可于RHDV的特异性诊断，但操作简单，时间短等特性使双抗夹心ELISA方法更适用于基层兽医以及大批量检测时使用。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (7)

1.一种适用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的单克隆抗体9H9，其特征在于，通过如下方法筛选得到：

免疫原制备：纯化的VP60蛋白与弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，制备免疫原，免疫小鼠；

阳性杂交瘤细胞制备：取免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，间接ELISA筛选得阳性杂交瘤细胞；

单克隆抗体：阳性杂交瘤细胞亚克隆建株，腹水制备、纯化，即得7株单克隆抗体4A5，5B7，6F6，9H9，11D4，15C3，16F2；对所述7株单克隆抗体进行HRP标记；

夹心抗体配对：对所述7株单克隆抗体进行包被抗体与酶标抗体配对，即得适用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的包被抗体9H9、酶标抗体HRP-9H9。

2.一种基于权利要求1所述单克隆抗体9H9的用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的建立，其特征在于，包括：

所述配对的包被抗体9H9和酶标抗体HRP-9H9最适工作浓度、最适包被条件、最适封闭剂、最适封闭条件、酶标二抗稀释液组分、酶标抗体最适作用时间、底物作用时间及双抗夹心ELISA方法临界值的确定，选取最适参数的组合，即可。

3.根据权利要求2所述单克隆抗体9H9的用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的建立，其特征在于，所述包被抗体9H9和酶标抗体HRP-9H9的最适工作浓度分别为5μg/ml、0.5μg/ml；所述最适包被条件为37℃、2h后4℃过夜；所述最适封闭条件为37℃、2h；所述酶标抗体最适作用条件为37℃、1h；所述底物作用条件为37℃、15min；所述临界值为0.35。

4.根据权利要求2所述单克隆抗体9H9的用于检测兔出血症病毒的双抗夹心ELISA方法的建立，其特征在于，所述最适封闭剂为1％的明胶；

所述酶标二抗稀释液的组分为含体积分数为10％小牛血清的pH7.4的磷酸盐缓冲液。

5.一种基于权利要求1所述单克隆抗体9H9的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括洗涤液、显色液、终止液、阳性对照、阴性对照、包被抗体的酶标板和酶标抗体，其中，所述包被抗体和酶标抗体均为单克隆抗体9H9。

6.根据权利要求5所述单克隆抗体9H9的双抗夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的洗涤液的溶剂为pH7.4、0.01mol/L的磷酸缓冲液，溶质及其在所述洗涤液中的浓度为Tween-200.05％；

所述的显色液为TMB显色液；

所述的终止液是2mol/L的H₂SO₄溶液；

所述的阳性对照是阳性兔肝脏研磨液；

所述的阴性对照是阴性兔肝脏研磨液。

7.一种根据权利要求5或6所述双抗夹心ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于，包括：

包被：用磷酸缓冲液对所述包被抗体9H9进行稀释，然后将其加之酶标板中包被，洗涤、甩干；

封闭：向所述酶标板中加入封闭剂进行封闭，洗涤、甩干；

加待检样品：再向所述酶标板中加入待检样品，反应后洗涤、甩干；

加入酶标抗体HRP-9H9：向所述酶标板中加入酶标抗体HRP-9H9，反应后洗涤、甩干；

加显色液：加入显色液孵育；

终止：加入终止液，终止反应；

检测：在酶标仪上读取OD450值。