CN104498438A - 一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒，本发明获得了分泌西尼罗病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.8508，所得到的西尼罗病毒单克隆抗体具有灵敏度好、特异性强、效价高等优点，可用于鉴定待测病毒是否为西尼罗病毒，鉴定待测样本是否含有西尼罗病毒。所述单克隆抗体可用于制备西尼罗病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。

Description

一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术，涉及一种西尼罗病毒单克隆抗体及试剂盒。

背景技术

西尼罗病毒(West Nile Virus,WNV)属于黄病毒科黄病毒属的虫媒病毒，通过蚊子的叮咬感染人、鸟、马、家禽等多种动物。1999年前，西尼罗病主要分布在非洲、中东、欧洲、西亚/中亚，1999年后，主要分布在北美，是一种严重威胁人类健康的病毒性传染病，成为全球公共卫生安全问题的关注点。该病严重感染病例能引起致死性脑膜炎或脑炎。2012年美国38个州报告了人类感染案例，至少有1118个案例报告，其中41个死亡报告。

鸟类是西尼罗病毒的自然贮藏宿主，传染源主要为鸟类和处于病毒血症期的带毒动物。蚊子叮咬是该病传播的最主要途径。蚊子通过交叉叮咬传染源和易感动物而传播该病，鸟类的迁徙也可导致该病的扩散。到目前为止，我国还没有发现西尼罗病毒感染病例，也没有在动物体内发现西尼罗病毒。但是，我国有很多地方夏天潮湿、炎热，一些地方洪水泛滥，具备蚊虫大量滋生的条件；而且与我国相邻的俄罗斯和中/西亚多国均出现过该病疫情，随着中国与世界其他国家之间的贸易、旅游、人员往来日益频繁，和鸟类迁徙的影响，我国仍然面对着西尼罗病毒的威胁。目前尚无针对西尼罗病毒的特效治疗药物，早期发现和及时扑灭疫情是控制西尼罗病毒传播的主要措施。因此，我国需要有效的WNV检测试剂盒检测方法，建立WNV检测体系，以防止西尼罗病毒的传入和流行。

西尼罗病毒的检测可以用敏感的细胞进行病毒分离，但是分离到的病毒需要使用其他方法进行进一步鉴定，而且病毒分离所需时间长、工作量大，硬件要求和专业知识要求高，不适用于规模化、现场检测。随着分子生物学的发展与应用，运用分子生物学技术进行WNV检测的方法越来越多，尤其是基于聚合酶链式反应(PCR)的反转录(RT-)PCR，实时荧光RT-PCR。但是该方法需要昂贵且专业的仪器设备，尤其是实时荧光RT-PCR，所用耗材也价格不菲，操作也是需要经过专业培训的人员才能胜任，而且样品及操作容易出现污染而造成假阳性。而基于抗体的捕获ELISA、胶体金试纸条等方法可以快速、灵敏地检测WNV病毒，适于在监测系统中应用和现地检测。因此，目前亟需有效的WNV检测方法。

发明内容

根据上述领域的需求和不足，本发明提供一种灵敏度好、特异性强的西尼罗病毒WNV的单克隆抗体，本发明单克隆抗体可以应用于检测西尼罗病毒。

一株杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.8508，所述杂交瘤细胞株的获得是通过将重组表达的西尼罗病毒囊膜蛋白E蛋白纯化后免疫小鼠，取免疫小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，后对上述细胞进行培养，进一步亚克隆，筛选出一株针对西尼罗病毒(WNV)的单克隆抗体，及分泌这些单克隆抗体的杂交瘤细胞，纯化并保藏。

一种西尼罗病毒单克隆抗体，由上述杂交瘤细胞株分泌而得。

上述单克隆抗体在检测西尼罗病毒中的应用。

一种用于检测西尼罗病毒的反应载体，其特征在于，所述反应载体上直接或间接包被有上述单克隆抗体。

一种检测西尼罗病毒的试剂盒，其特征在于，包含有上述的反应载体。所述反应载体是基于免疫反应原理的检测仪器，可以是荧光化学检测板、酶联免疫检测板等，本发明实施例优选的是酶标板。

一种检测西尼罗病毒的胶体金试剂盒，其特征在于，在金标纤维垫上包被有胶体金标记的抗WNV的单克隆抗体，即Au-McAb；检测线上包被有兔抗WNV多抗，即WNV-Pc；检测时，当样本中存在WNV，则与Au-McAb形成复合物，进而与检测线的WNV-Pc结合，显色。

本发明试剂盒可以用于鉴定西尼罗病毒，辅助鉴定待测病毒是否为西尼罗病毒以及辅助鉴定待测植物样本是否感染西尼罗病毒。

本发明提供的单克隆抗体用于检测西尼罗病毒，具有特异性好、敏感性强、效价高等优点。本发明研制的西尼罗病毒单克隆抗体可用于研制西尼罗病毒的免疫学诊断试剂，如酶联诊断试剂，胶体金免疫试纸条等。

本发明酶联免疫检测试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的西尼罗病毒抗原。先在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被兔抗西尼罗病毒的多克隆抗体，当加入的样品中含有西尼罗病毒时，微孔中预包被的多克隆抗体能将其捕获，随后加入的酶标单克隆抗体与之结合，然后通过酶催化底物的显示程度来判断结果。当标本中不含西尼罗病毒时，底物不会显色。可检测的标本包括血液、血清、动物组织等待检测物的研磨液等。

本发明胶体金试剂盒是采用胶体金免疫层析技术研制的双抗体夹心法检测西尼罗病毒(以下简称WNV)的新一代诊断试剂，可检测血液、血清、脑脊液或组织等标本中是否含有WNV。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需要任何附加试剂，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30min。

本试剂盒分别在硝酸纤维素膜上用兔抗WNV多抗(即WNV-Pc)包被检测线，用葡萄球菌A蛋白(即SPA)包被对照线；在标记物垫上用胶体金标记抗WNV的单克隆抗体(即Au-McAc)。检测时，如果样本中存在WNV，则与Au-McAb形成复合物，在层析作用下，沿膜层析至检测线，并与WNV-Pc形成的肉眼可见的紫红色检测线；而未结合WNV的Au-McAb继续层析至对照线，与SPA结合也形成肉眼可见的紫红色对照线。如果样本中无WNV，则只有一条紫红色对照线。

本发明单克隆抗体具有如下优点：

1.特异性好、敏感性强、效价高；

2.可用于基于免疫反应的检测西尼罗病毒的试剂及试剂盒；

3.能应用于各地进行西尼罗病毒的检测；

4.应用本发明单克隆抗体并且基于免疫反应的试剂盒灵敏特异，快速方便。

杂交瘤细胞保藏信息：

杂交瘤细胞株名称：西尼罗病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株WNV 4B3

菌株分类：小鼠杂交瘤细胞系

保藏编号为：CGMCC No.8508

保藏日期：2013年11月20日

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

附图说明：

图1为WNV-E基因扩增图；

图2为PET-32a中的表达情况图；

图3为重组蛋白的Western Blot鉴定图；

图4为腹水效价测定图；

图5为本发明胶体金试剂盒检测结果示意图。

具体实施方式：

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

本发明实验材料的来源：

生物材料：

西尼罗病毒(WNV)E蛋白，西尼罗病毒(WNV)，日本脑炎病毒JEV，圣路易斯脑炎病毒(SLEV)，黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)

申请人声明，除西尼罗病毒(WNV)，日本脑炎病毒JEV，圣路易斯脑炎病毒(SLEV)，黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)相关材料、检测需在有相关资质实验室(中国动物疫病预防控制中心、中国疾病预防控制中心)进行外，其他生物材料均在申请人实验室有保存，自申请日起二十年内可向公众发放用于验证试验。

试剂的来源及规格：

实施例1、西尼罗病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，单克隆抗体和多克隆抗体的制备

1.西尼罗病毒(WNV)囊膜E蛋白的重组表达和纯化。

为了表达重组的WNV E蛋白，人工合成了E蛋白结构域III的核酸序列(编码E蛋白296～415位氨基酸的核酸序列)。根据西尼罗河病毒E蛋白基因设计引物，上游引物为5'-AGCTCGAGCATGCAGTTGAAGGGAACAACCTATG-3'，同时引入Xho I酶切位点，下游引物为：5'-TTTGGATCCTTACGCTCCTTTGAGGGTGG-3'，同时BamHI酶切位点。以人工合成的WNV-E基因序列为模板，克隆目的基因。PCR扩增程序：94℃4min，94℃30s，50℃30s，72℃30s，35个循环，72℃10min。扩增产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收目的片段(如图1)。回收产物与pGEM-T-Easy载体连接。以PCR方法鉴定重组质粒，阳性克隆并命名为pGEM-T-E-III质粒。阳性pGEM-T-E-III质粒用XhoI和BamHI双酶切，回收目的基因，连接至经同样双酶切的原核表达载体PET-32a(+)中；转化到BL21(DE3)感受态细胞中。用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒，将重组质粒命名为PET-32a-E-III。将质粒转化入原核表达菌BL21中，37℃诱导表达后，经SDS-PAGE方法检测，表达蛋白占菌体总蛋白的40％左右(图2)。收集菌体，超声破碎后，10000g离心15min，收集包涵体沉淀。在溶解包涵体之前用2M尿素在50mM Tris(pH7.0-8.5左右)1mM EDTA溶液洗涤。包涵体洗涤后用盐酸胍(8M)溶解，装入透析袋后进行低温缓慢透析复性24h。复性后重组蛋白用SDS-PAGE方法检测纯度大于95％。经Western Blot鉴定，结果表明纯化的西尼罗河E蛋白分子量约为31kDa左右，与WNV阳性血清反应，具有很好的抗原反应活性(图3)

2.多克隆抗体的制备

将纯化的西尼罗病毒(WNV)E蛋白稀释至1.5ml与1.5ml完全弗氏佐剂等体积混合乳化，乳化后采用后腿肌肉多点注射方法对家兔进行免疫。第2～4次用同样剂量的重组E蛋白(269ug/kg)加等体积不完全弗氏佐剂乳化，用后腿肌肉多点注射方法免疫，每次免疫间隔2-4周。第4次免疫后2周，用300ug/只重组蛋白稀释至2ml经腹腔注射进行加强免疫。加强免疫后1周采血，使用间接ELISA法检测多克隆抗体效价，结果为1：320 000。

3.小鼠免疫：

将纯化的西尼罗病毒(WNV)E蛋白按100ug/只的剂量稀释至50ul与完全弗氏佐剂等体积混合乳化，经颈背部皮下多点注射8周龄的BALB/C小鼠，每只注射100ul。首次免疫后3周、6周，分别用200ug/只的剂量稀释至50ul与不完全弗氏佐剂等体积混合乳化，进行再次免疫。融合前采血，检测小鼠血清效价，小鼠血清效价大于1:100 000则进行加强免疫。加强免疫采用150ul纯化重组E蛋白(50ug/只)直接注射小鼠腹腔，3d后处死小鼠取脾细胞进行融合。

4.细胞融合：

将上述免疫小鼠脾脏细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞相融合。先将脾脏无菌取出，研磨为脾细胞悬液，然后与对数生长期的SP2/0小鼠骨髓瘤细胞以10:1比例混合，1 000r/min离心5min，弃上清，经PEG1500作用1min，将两种细胞融合，融合后的细胞液1 000r/min离心5min，重悬于含HAT Media suplement(50×)Hybri-Max，γ-irradiated(sigma)和20％FetalBovine Serum(威正华通)的完全培养基，100ul/孔，加入有饲养细胞的96孔培养板中，置二氧化碳培养箱中培养。

5.杂交瘤细胞的筛选：

融合后，将上述细胞于96孔细胞板上培养，每天观察细胞生长情况，待培养孔中杂交瘤细胞克隆增至几百个时，吸取细胞上清原液用间接ELISA方法进行检测，用纯化的重组WNVE蛋白结构域Ⅲ融合蛋白作为筛选用阳性抗原，用以相同表达系统表达制备的水泡性口炎病毒重组核衣壳蛋白纯化产物作为筛选用对照抗原，同时对每份待检培养上清进行平行检测。对检测特异性抗体阳性孔的细胞稀释到1×10⁵个/ml，进一步亚克隆至阳性率达100％。

6.筛选结果：

获得一株针对西尼罗病毒(WNV)E的单克隆抗体，及分泌这些单克隆抗体的杂交瘤细胞，并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，其保藏号为：CGMCC No.8508。

7.杂交瘤的培养：

选择BALB/C小鼠，每只腹腔内注射灭菌液体石蜡0.5mL；14～18d后，每只小鼠腹腔注射0.5mL细胞数为1～2×10⁵个/mL接种扩增培养的稳定杂交瘤细胞。植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9^#针头穿刺腹腔，采集腹水离心，去除油脂和沉淀收集上清液，-30℃保存。

8.单克隆抗体的纯化：

上述腹水先用50％的辛酸/硫酸铵沉淀处理，然后用20mM磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.2)透析，之后用DEAE柱在HPLC下纯化，得到纯化的单克隆抗体，经SDS-PAGE鉴定，和蛋白浓度测定，纯化的单克隆抗体浓度为0.23ug/ml。该方法获得的纯化单克隆抗体浓度不高，故改用以下方法进行优化，在腹水单抗中加入适量鹿角胶和CaCl₂除去油脂类杂质和部分杂蛋白，12000rpm离心30min，上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，加入等体积PBS缓冲液，用Protein G Sepharose 4B层析柱分离纯化，收集蛋白洗脱峰，以PH7.2的PBS透析过夜，用截留分子量为30KD的滤膜超滤浓缩，-30℃保存。紫外分光光度计测其蛋白含量，SDS-PAGE进行纯度鉴定浓度为1.59mg/ml。

实施例2：西尼罗病毒单克隆抗体腹水的效价测定

1、采用间接ELISA方法测定西尼罗病毒单克隆抗体腹水效价。

具体方法为：

1)用1μg/mL浓度的纯化西尼罗病毒E蛋白包被酶标板，4℃冰箱过夜，洗酶标板。

2)用含2.5％BSA的磷酸盐缓冲液封板，37℃，30min，洗酶标板。

3)加入按照一定比例稀释的腹水抗体溶液，37℃，2h。洗酶标板。

4)加入1：1000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗小鼠抗体，37℃，2h。洗酶标板。

5)加入底物溶液，37℃，待颜色合适时(5-15min)用酶标仪在450nm处读取OD值。

如图4所示，本发明实施例1的腹水抗体效价为1.024×10⁷(见图4)。说明西尼罗病毒单克隆抗体腹水效价很高。

实施例3：西尼罗病毒单克隆抗体腹水特异性测定

1、单克隆抗体免疫球蛋白类及亚类的鉴定

1、按照Southern Biotech公司试剂盒操作说明书

(1)包被:把试剂盒中提供的抗体用pH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至浓度为5～10μg/Ml100μ/孔，4℃过夜；

(2)洗涤:用含0.05％Tween-20的PBS洗板3次，拍干；

(3)封闭:加入含1％牛血清白蛋白的PBST 200μL/孔，37℃孵育1h，以封闭未包被的活性位点；洗涤同上；

(4)加样:加入实例1杂交瘤培养上清100μL/孔，置于酶标板于37℃孵育1h；洗涤同上；

(5)加酶:用含1％牛血清白蛋白的PBST稀释碱性磷酸酶标记的免疫球蛋白类、亚类、重链及轻链至适当浓度加入酶标孔中，100μL/孔，37℃孵育1h；洗涤同上；

(6)显色:将底物稀释至lmg/mL(试剂盒提供的5mg片剂加入5mL底物缓冲液)加入反应孔中，100μL/孔，显色10～20min时于酶联免疫检测仪测定其405nm处的OD值。

结果显示本发明单克隆抗体亚型为IgG1、kappa链。

2、用间接ELISA方法检测西尼罗病毒单克隆抗体腹水特异性

西尼罗病毒与日本脑炎病毒(JEV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)有较高的交叉反应，为测定西尼罗病毒单克隆抗体的特异性，检测了其与WNV同属病毒JEV等是否有交叉反应。检测方法详见实例2(西尼罗病毒单克隆抗体腹水效价的测定)。检测时将第1步中的西尼罗病毒E蛋白替换为西尼罗病毒(WNV)、日本脑炎病毒(JEV)及其E蛋白、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、黄热病毒(YFV)和登革热病毒(DENV)，其余步骤及所使用试剂、反应条件不变，就可分别检测腹水与相应病毒是否具有交叉反应。检测结果如表2所展示，西尼罗病毒单克隆抗体能特异结合WNV病毒，而与JEV、SLEV、YFV和DENV均没有交叉反应，这说明我们制备的西尼罗病毒单克隆抗体能特异性识别西尼罗病毒。

表2单克隆抗体特异性测定

实施例4：西尼罗病毒抗原检测试剂盒(酶联免疫法，ELISA)

1、酶标板的制备：

在试剂盒的聚乙烯微孔板条上预包被兔抗西尼罗病毒的多克隆抗体，多克隆抗体(1.5ug/mL)包被使用10mM磷酸盐碳酸盐缓冲液(PB，pH7.4)，在4℃下包被过夜；然后使用PBST(10mM PBS+0.05％Tween20)洗涤一两次，拍干后再加入封闭液(10mM PBS+2％牛血清白蛋白，BSA)，37℃封闭2小时，再拍干，在相对湿度35％以下，室温经过18～24小时晾干后，真空抽干包装成成品试剂盒酶标板。

2、试剂盒其他成分的配置：

A)酶标试剂：应用HRP快速标记试剂盒，将5mg/ml的抗体溶液于50mM酸盐缓冲液(pH9.6，25℃)中4℃透析过夜，换液2～3次。1ml超纯水加入过碘酸钠管中充分混匀后取45ul加入到溶好的HRP溶液(0.4ml的超纯水加入HRP管中充分混匀)，边加边混匀，室温暗置反应20分钟。取乙二醇40ul加入到上述溶液中充分混匀后室温暗置反应30分钟。将上述氧化好的HRP溶液加入到西尼罗病毒单克隆抗体溶液中，充分混匀，室温透析交联2.5小时。从透析袋中取出溶液置于棕色玻璃瓶中，加NaB H₄溶液80ul，置4℃避光反应2小时，每隔30分钟轻摇一次。还原完毕的抗体-HRP溶液置于10mM磷酸盐溶液中4℃透析过夜，换液3～4次，第一次换液时间间隔2小时。收获标记好的西尼罗病毒单克隆抗体-HRP溶液，纯化后的将标记单克隆抗体稀释至0.2mg/ml，分装后备用。

B)阳性对照：将西尼罗重组E蛋白稀释至1ug/ml，作为阳性对照。

C)阴性对照：样品研磨缓冲液做阴性对照。

D)底物液A：四甲基联苯胺溶液

E)底物液B：过氧化脲溶液

F)终止液：1M硫酸

G)浓缩洗涤液：20×PBST

H)封板膜：2张

I)自封袋：1个

J)说明书：1份

3、检测过程：

A)配液：将50ml浓缩液(20倍)用蒸馏水或去离子水稀释至1000ml备用。

B)编号：将样品对应微孔板按序编号，每板应设阴性对照3孔，阳性对照2孔和空白对照1孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同)。

C)样品处理及加样：

取待检测组织，加入3倍体积的磷酸盐缓冲液(pH7.2)匀浆，3000r/min离心10min，吸取上清检测，或者加入待检测动物血清、血浆样品，每孔加100ul进行反应。

每次检测均需要设置阴阳性对照孔，每孔加100ul对照液。

D)孵育：用封口膜封板后置微量振荡器上中等速度室温(25～28℃)振荡60min。

E)洗涤：小心揭掉封板膜，用洗板机洗涤5遍，最后一次尽量拍干。

F)加酶：分别在相应孔中加入酶标试剂100ul。

G)孵育：用封口膜封板后，置37℃温育30min。

H)重复步骤E。

I)显色：每孔加入显色剂A、B液各50ul，轻轻振荡混匀，37℃避光显色30min。

J)测定：每孔加终止液1滴(50ul)，轻轻振荡混匀，用酶标仪单波长450nm(需设空白对照孔)或双波长450nm/630nm测定各孔OD值。

4、结果判定：

A)阴性对照的正常范围：正常情况下，阴性对照孔≤0.1(阴性对照孔OD值若大于0.1应舍弃，如果所有阴性对照孔OD值都大于0.1，应重复实验。若阴性对照孔小于0.03，则按0.03计算)。

B)阳性对照的正常范围：正常情况下，阳性对照孔OD值≥0.5。

C)临界值计算：阴性对照孔OD值+0.15

D)阳性判定：样品OD值≥临界值者为西尼罗病毒抗原反应阳性。

E)阴性判定：样品OD值＜临界值者为西尼罗病毒抗原反应阴性。

本发明酶联免疫检测试剂盒使用双抗体夹心法检测标本中的西尼罗病毒抗原。本发明试剂盒可检测的标本包括动物血清、血浆、组织等多种待检测物的研磨液，用于西尼罗病毒的快速检测，并且具有灵敏性好，特异性强，效价高的特点，同时，该试剂盒操作简便，结果判断较客观，结果的重复性和可靠性稳定。

实施例5：快速检测西尼罗病毒抗原的胶体金试剂盒

1、本发明应用于胶体金试剂盒的制备

1)配制包被液

用20mM PBS对葡萄球菌A蛋白(即SPA)和兔抗WNV多抗(即WNV-Pc)进行稀释，将葡萄球菌A蛋白(即SPA)配制成2mg/ml，兔抗WNV多抗(即WNV-Pc)配制成0.3mg/ml，分别用于硝酸纤维素膜上C、T线的包被。

2)试剂的包被

硝酸纤维膜上包被葡萄球菌A蛋白(即SPA)和兔抗WNV多抗(即WNV-Pc)：将葡萄球菌A蛋白(即SPA)和兔抗WNV多抗(即WNV-Pc)用包被机分别包被于T线和C线，C、T线之间的间距为4.0mm，C、T线宽度为0.8mm，包被速度为40mm/s。干燥时间为6小时，温度为30℃，湿度≤35％。

3)胶体金标记的WNV的单克隆抗体(即Au-McAc)的制备

取40nm的胶体金溶液，按终浓度8-12μl/ml加入0.2M K₂CO₃，加入WNV单克隆抗体(即Au-McAc)制备成特定浓度，放置室温反应15-30分钟，然后按终浓度20μl/ml加入20％BSA的溶液，用于饱和游离的胶体金。10000rpm离心30分钟，除去上清液中未结合的蛋白质。用1/10体积的0.5M硼酸溶液(含1％Tween、5％蔗糖、1％水解BSA、1％水解酪蛋白、0.1％PVA)复溶沉淀的胶体金标记原液。工作溶液采用上述0.5M硼酸溶液稀释，浓度为原液的10-20％。

4)金标纤维层的标记：

将胶体金标记的WNV的单克隆抗体(即Au-McAc)溶液，铺于30×30cm玻璃纤维垫上，加液量为35ml/张，干燥时间为6小时，温度为30℃，湿度≤35％。

5)试纸条的组装：

将塑料板平放在操作台上，贴上双面胶带；

撕掉双面胶带衬纸，在距塑料板上端30mm处贴上已包被有葡萄球菌A蛋白和兔抗WNV多抗的硝酸纤维素膜；

将粗纤维吸水纸压硝酸纤维素膜上端2mm贴上，上端与塑料板上端取齐；

将小无纺布压硝酸纤维素膜下端0.5mm处贴上；

将金标垫取齐压于小无纺布上面；

将玻璃纤维垫压于金标垫上约一半，下端距塑料板下端2mm处贴上；

将大无纺布与金标垫上端取齐，下端与塑料板下端取齐贴上；

将箭头胶带压硝酸纤维素膜1.5-2mm贴上；

将手持端胶带压粗纤维吸水纸贴上。

2、试剂盒组成：

本试剂盒是将试纸条、塑料滴管、干燥剂用铝箔袋密闭包装而成，另附说明书1份。试剂盒是用WNV-Pc、SPA包被的硝酸纤维素反应膜、胶体金标记的Au-McAc、样品垫、吸收垫等组装制成。

3、检测操作过程：

A)样品处理及加样：

取待检测组织，加入3倍体积的磷酸盐缓冲液(pH7.2)匀浆，3000r/min离心10min，吸取上清检测，或者加待检测动物血清、血浆样品进行检测。

B)将试纸条平置于桌面，在加样孔用塑料滴管垂直滴入2～3滴，室温条件下避免潮湿。

4、结果判定：20-30min内观察结果。

出现两条红色线，判定为阳性：只出现对照线，判定为阴性；不出现或只出现一条检测线，都判定为无效，结果参见图5。

5、本发明胶体金试剂盒的优点

本发明试剂盒采用胶体金免疫层析技术研制的双抗体夹心法检测西尼罗病毒的新一代诊断试剂，可检测动物血清、血浆、组织等多种待检测物的研磨液等标本中是否含有WNV。本品设计精巧，一次性使用，操作简便、安全、可靠、无污染，自带质控对照，不需要任何附加试剂、仪器，显示结果明确，反应迅速，整个操作时间仅需30min，具有灵敏度高，特异性好，检测时间短的特点，尤其适合于现场检测，推广应用范围广，可用于农业质检、工商质检、出入境质检，食品加工生产企业、出口企业及其他领域。

本发明实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

Claims (6)

1.一株杂交瘤细胞株，其保藏号为CGMCC No.8508。

2.一种西尼罗病毒单克隆抗体，由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌而得。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在检测西尼罗病毒中的应用。

4.一种用于检测西尼罗病毒的反应载体，其特征在于，所述反应载体直接或间接包被有权利要求2所述单克隆抗体。

5.一种检测西尼罗病毒的试剂盒，其特征在于，包含有权利要求4所述的反应载体。

6.一种检测西尼罗病毒的胶体金试剂盒，其特征在于，在金标纤维垫上包被有胶体金标记的权利要求2所述的单克隆抗体，即Au-McAb；检测线上包被有兔抗西尼罗病毒多抗，即WNV-Pc；检测时，当样本中存在西尼罗病毒，则与Au-McAb形成复合物，进而与检测线的WNV-Pc结合，显色。