CN104109206A - 鸭坦布苏病毒单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了鸭坦布苏病毒单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用，本发明以鸭坦布苏病毒DTMUV-JXSP细胞毒株作为免疫原制备获得单克隆抗体，包括由保藏号为CGMCCNO:8104、CGMCCNO:8107及CGMCCNO:8106分泌的单抗，以其中保藏号为CGMCCNO:8106的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3B4作为一抗包被酶标板，以及以保藏号为CGMCCNO:8107的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3F2并经酶标记作为酶标二抗，组建成双抗夹心检测试剂盒，其具有良好的灵敏度和特异性。本发明为鸭坦布苏病毒的大批量临床检测提供了有效手段。

Description

鸭坦布苏病毒单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及动物病毒学与免疫学技术领域。具体涉及一种鸭坦布苏病毒特异性单克隆抗体的制备，包含该单克隆抗体的鸭坦布苏病毒抗原检测ELISA试剂盒的制备，以及其在鸭坦布苏病毒抗原检测中的应用。

背景技术

2010年4月以来，我国浙江、江苏、山东、河北、北京等省市先后出现以产蛋鸭产蛋量急剧下降为主要特征的疾病。该病的主要临床症状是各个日龄的产蛋鸭突然出现群体性产蛋下降，甚至绝产。产蛋鸭发病后出现长时间（40～60天）的产蛋率低下，恢复后所产种蛋的孵化率和受精率出现下降。由于继发感染、或者药物治疗和饲养管理等因素致死亡率达到1%～15%，部分鸭场产蛋鸭的死亡率达到20%，发病鸭恢复产蛋后采食量下降约10%。同时由于免疫系统的病变，继发细菌感染，商品肉鸭感染后出现最高约30～80%的死淘率，而且产品的合格率明显降低。该病传播迅速且范围广泛，蛋鸭、种鸭和肉鸭均可以感染发病。据估计，此病已经给我国的养鸭业造成数十亿元的直接经济损失。同时，由于种鸭发病，雏鸭供应急剧下降，导致雏鸭价格升至10元以上，在推高鸭蛋价格的同时，也推高了肉鸭的价格，给消费者和社会管理造成消费压力，对公众健康及畜牧业的发展也造成了严重的影响。

研究证实引起本病的病原属于黄病毒科中的成员，是在我国东南部地区新发现的一种虫媒性黄病毒属病毒，随着病原学研究的深入，该病毒被确诊为一种新型的黄病毒-鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus ，DTMUV）。该病毒为单股正链RNA病毒，病毒粒子大小为55nm。由于黄病毒属病毒所致疾病可以通过蚊或蜱等吸血媒介传播，大多为人畜共患疾病，并缺乏有效的治疗、预防和控制措施，因而容易导致严重的公共卫生问题，对疾病的预防和控制工作提出了严峻的挑战。以登革病毒、乙型脑炎病毒以及西尼罗病毒等为代表的黄病毒疫源地的扩大，更引起了世界各国的关注和担忧。新分离到的这种鸭黄病毒或许对人或其他动物具有潜在危害，对该病毒的研究工作对于公共卫生防控方面具有较为重要的意义。

目前鸭新型黄病毒病的检测主要依赖于临床症状的判断及病毒的分离和分子生物学的方法，但这些方法检测周期长、操作繁琐、对实验条件要求严格，同时也不适用于临床的大规模检测。由于本发明中所研究的鸭坦布苏病毒的感染属于新发传染病，对该病毒的生物学特性、致病机制等的研究尚处于起步阶段，目前仍缺少有效的疫苗免疫和预防控制措施，而迄今应用酶联免疫吸附实验对鸭黄病毒抗原进行检测的方法也少有报道，这就使得无法在最快的时间内对该病做出检测。为此，我们拟建立一种快速检测鸭坦布苏病毒抗原的双抗体夹心ELISA方法，对鸭组织样品中是否存在该病原进行定量检测，这对于该病的检测及防控将具有重要的指导意义。鉴于近两年来，该病对养鸭业的巨大影响，此发明对我国养鸭业的持续健康发展、公共卫生防控也将具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种特异性强的鸭坦布苏病毒单克隆抗体；

本发明的第二个目的在于提供分泌上述检测鸭坦布苏病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞系。

本发明的第三个目的在于提供一种用于检测鸭坦布苏病毒抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

首先本发明提供一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体，其是以鸭坦布苏病毒DTMUV-JXSP细胞毒株作为免疫原制备获得。通过筛选获得效价高、特异性好的单克隆抗体，其分别由保藏号为CGMCC NO:8104、CGMCC NO:8107或CGMCC NO:8106的杂交瘤细胞分泌。

鸭坦布苏病毒单克隆抗体可按如下方法制备： 

1）利用的鸭坦布苏病毒DTMUV-JXSP细胞毒株作为免疫原，纯化后免疫Balb/c小鼠，并采血，用间接ELISA方法检测血清效价，选择血清效价高的Balb/c小鼠进行加强免疫，并从该小鼠体内制备得到免疫脾细胞；

2）制备骨髓瘤细胞（SP2/0）悬浮液并注射Balb/c 小鼠，待小鼠长出实体瘤后制备骨髓瘤细胞，将骨髓瘤细胞与步骤1）所述的免疫脾细胞进行融合，制备出杂交瘤细胞，检测筛选效价高的杂交瘤细胞株并进行克隆扩大培养；

3）将步骤2）所述的建株后的杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液后腹腔注射小鼠，收集小鼠腹水，纯化后即得到鸭坦布苏病毒单克隆抗体。

通过大量筛选工作意外获得三株效价高、特异性好的单克隆抗体杂交瘤细胞株（1D4、3F2和3B4），杂交瘤细胞株于2013年8月26日送交北京市中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏，三株杂交瘤细胞的保藏编号分别为CGMCC NO:8104，CGMCC NO:8107，CGMCC NO:8106。

进一步，本发明提供用于检测鸭坦布苏病毒抗原的检测试剂盒，其包括上述单克隆抗体，还可包括阳性标准品、阴性标准品、洗涤液、样品稀释液、底物液A、底物液B和终止液中的一种或多种。

本发明用辣根过氧化物酶标记制备的三株单克隆抗体，并通过交叉配对实验，研究发现保藏号为CGMCC NO:8106杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3B4反应最佳，最终确定了以3B4株作为包被一抗，以酶标记单抗3F2株作为二抗来建立反应体系。实验结果表明，这样的配对组合在与抗原结合时具有最好的反应特性，从而大大提高了整个反应体系的敏感性和特异性。

据此，优选的检测试剂盒其包括以保藏号为CGMCC NO:8106的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3B4作为一抗包被的酶标板，以及以保藏号为CGMCC NO:8107的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3F2作为二抗并经过酶标记的酶标抗体。所述酶标抗体的标记酶可以是辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等，所述阳性标准品为鸭坦布苏病毒DTMUV抗原，所述阴性标准品为BHK细胞蛋白。

所述洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液可采用如下配置：

洗涤液：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O 1.42g，KCl 0.2g，Tween20 0.5mL，加双蒸水至1000mL；

样品稀释液：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O 1.42g，KCl 0.2g，BSA 10g，加双蒸水至1000mL；

底物液A：3, 3’, 5’, 5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B ：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

本发明试剂盒的检测分析原理是：利用抗原与抗体特异性结合的原理，包被于酶标板上的鸭坦布苏病毒单克隆抗体（一抗）和辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体（二抗）均具有与坦布苏病毒抗原发生特异性结合的特性。若待检测样品中含有病毒抗原，则该抗原就会与包被抗体发生特异性结合，随后加入的酶标二抗也会与抗原结合，形成了双抗体夹心结构，当加入底物后，显色反应深，用酶标仪检测的OD值高；反之，若待检测样品中没有坦布苏病毒抗原时，则不能形成双抗体夹心，所测得的OD值低，显色反应浅。所以，根据显色程度深浅以及所测定的OD值即可对待检测样品中是否含有鸭坦布苏病毒抗原做出定性或定量的判定。

本发明的有益效果是：

1、构建了检测鸭坦布苏病毒抗原的双抗体夹心ELISA试剂盒，为该病毒的抗原检测奠定了一定的基础。目前，该种新发鸭黄病毒属疾病感染呈现出了上升趋势，而国内外仍缺少检测该病的有效方法和预防措施。本发明则为临床上鸭坦布苏病毒的抗原监测提供了一种有效工具，为临床上该种疾病的大规模检测提供了一定的参考。

2、建立的鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法具有快速、简便的特点，使用该方法所制备的ELISA试剂盒检测迅速、特异性强、灵敏度高、检测时间短，同时不需要精密的仪器设备，是一种面向基层并适用于临床大批量检测的有效方法。

附图说明

图1：本发明制备的单克隆抗体特异性鉴定试验结果。其中A为阳性血清对照，B为阴性血清对照，C为阴性细胞上清对照，D为单抗3B4间接免疫荧光试验结果，E为单抗3F2间接免疫荧光试验结果，F为单抗1D4间接免疫荧光试验结果。

图2：本发明制备的单克隆抗体与DPV、DRV、EDS76V、DHV DTMUV抗原交叉反应鉴定结果。其中A为单抗3B4反应结果，B为单抗3F2反应结果，C为单抗1D4反应结果。

图3：本发明建立的双抗体夹心ELISA方法敏感性试验结果。

具体实施方式

以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的修改或润饰均属于本发明的范围。

实施例1  鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备及鉴定

本发明通过大量筛选工作意外获得三株效价高、特异性好的杂交瘤细胞株，分别命名为鸭坦布苏病毒单克隆抗体杂交瘤细胞1D4、3F2和3B4，并于2013年8月26日送交北京市中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）保藏（地址： 北京市朝阳区大屯路甲 3 号， 中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为杂交瘤细胞，其保藏号分别为CGMCC NO:8104，CGMCC NO:8107，CGMCC NO:8106。以下就该三株单克隆抗体的获得及检测作详细描述。

．鸭坦布苏病毒抗原的制备

1.1病毒的制备

取DTMUV-JXSP株病毒在BHK-21细胞上繁殖制备抗原。接种病毒后每天观察，待产生90%细胞病变后反复冻融三次，收集病毒液，并用噬斑计数法测得病毒毒价为8.5×10⁶pfu/m。

1.2 病毒抗原的纯化

收获的病毒液经高速离心后获得上清，沉淀用部分上清重悬后超声裂解，裂解液再按上述方法高速离心。将两次的上清液混合后再次超速离心，沉淀中即含有待纯化病毒，将该沉淀用无菌PBS溶解并再次超声裂解，用20%和50%的蔗糖进行密度梯度离心，获得了纯化的DTMUV蛋白抗原，分装保存于-80℃。

单克隆抗体的制备及鉴定

2.1免疫脾细胞及骨髓瘤细胞的制备

将纯化的全病毒蛋白抗原免疫8周龄的雌性Balb/c小鼠。每次免疫2 周后采血用间接ELISA 检测动物产生的抗体滴度，至少间隔一个月后，选择抗体滴度高的Balb/c 小鼠加强免疫后眼眶放血处死，分离制备免疫脾细胞；同时用骨髓瘤细胞（SP2/0）悬浮液注射Balb/c 小鼠，待9－10 天实体瘤生长后，处死小鼠并分离制备出活化的骨髓瘤细胞 。

2.2 杂交瘤细胞株的建立

将步骤2.1所述的免疫脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，待融合的细胞克隆生长到覆盖细胞板孔底1/2时，用建立好的间接ELISA 方法对所有有细胞克隆生长的培养孔上清进行检测，将检测为阳性孔的细胞进行亚克隆和扩大培养。阴性孔2天之后再一次检测，重复一次，若仍为阴性则弃掉。将阳性克隆进行扩大培养和亚克隆，得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

2.3 单克隆抗体的大量制备和效价测定

选择经产BABL/c 或10周以上的雌性BABL/c小鼠，腹腔注射灭菌的液体石蜡油0.5Ml/ 只。选择处于对数生长期的杂交瘤细胞，将其轻轻的吹下来，1000rpm离心10min，弃上清，用PBS重新悬浮，计数备用，每只小鼠腹腔注射5×10⁵-1×10⁶个杂交瘤细胞，经7-10天后，可见小鼠腹部明显增大，采集腹水，将小鼠腹水3000rpm 离心10min ，收集上清，-20℃保存备用，此腹水中即含有大量的鸭坦布苏病毒单克隆抗体。利用辛酸-饱和硫酸铵法对腹水进行纯化，用间接ELISA方法测定1D4、3F2、3B4这三株单克隆抗体的效价分别为1:2.048×10⁶、1.024×10⁶和5.12×10⁵。

2.4 单克隆抗体的特异性分析

用鸭坦布苏病毒DTMUV株感染BHK-21细胞，通过筛选的阳性杂交瘤细胞上清进行间接免疫荧光检测，同时设置阳性小鼠血清对照、阴性小鼠血清对照、SP2/0细胞上清对照。结果显示获得的三株单克隆抗体对DTMUV感染的BHK-21细胞均有较强的荧光，说明本发明制备的单克隆具有较好的特异性，结果见图1。

2.5 单克隆抗体亚型鉴定

使用IsoQuick ^TMStrips and Kits for Mouse Monoclonal Isotyping 试剂盒对三株单克隆抗体的亚型进行鉴定，三株单克隆抗体的鉴定结果均为IgG1亚类，轻链均为Kappa型。

2.6 抗原交叉反应的鉴定

分别用鸭肝炎病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭减蛋综合征病毒、鸭瘟病毒作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA实验，检测单抗与这些抗原是否有交叉反应。实验结果表明三株单抗与其它几种病毒抗原反应的OD₄₅₀值均远小于阳性对照及阴阳临界值，说明三株单抗与其它几种病毒抗原无交叉反应，结果见图2。

酶标单抗的制备

采用改良的过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的抗体，具体步骤包括：

①将5mg辣根过氧化物酶溶于0.5mL蒸馏水中，加入新配制的0.06mol/L NaIO40.5mL，混匀置冰箱作用30min；

②待溶液呈绿色时取出加入0.16mol/L乙二醇0.5mL，室温放置30min，使氧化反应终止；

③加蛋白浓度为5mg/mL的纯化抗体蛋白水溶液1mL，混匀后装于透析袋用0.05 mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，并在磁力搅拌器上缓慢搅拌，使蛋白质与酶充分结合；

④加0.2mL 5mg/mL的硼氢化钠，置冰箱2h，将酶标二抗还原为稳定的结合物；

⑤加入等体积饱和硫酸铵，冰箱放置 30min，离心留沉淀并用少量0.02 mol/L pH7.4 PBS溶解，装入透析袋，充分透析，以除去硫酸铵；

⑥离心除去沉淀，加PBS至5mL，再加入50%的甘油-20℃保存备用。

实施例2  鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

1. 鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测方法的建立

1）包被：用0.05mol/LPH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗DTMUV 的单克隆抗体100μL/孔，4℃包被过夜；

2）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

3）封闭：加入封闭液即样品稀释液，200μL/孔，37℃封闭2h；

4）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

5）加抗原：抗原用样品稀释液作适当的稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；

6）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

7）加酶标单抗：于反应孔内加入辣根过氧化物酶标记的抗体，100μL/孔，37℃孵育50min；

8）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

9）加底物：每孔中先加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，避光显色5-15min；

10）加终止液：每孔中加入终止液 50μl，酶标仪测定各孔OD450值。

最佳实验条件的确定

2.1 包被单抗与酶标单抗的最佳配对实验

分别以本发明制备的三株鸭坦布苏病毒单克隆抗体3B4、3F2、1D4（1μg/mL）作为包被抗体包被96孔酶标板，加入阳性对照（10μg/mL的鸭坦布苏病毒DTMUV抗原）和阴性对照（10μg/mL的BHK细胞蛋白）作为待检，同时将这三株单抗分别用辣根过氧化物酶标记后进行1：2000、1：1000、1：800倍稀释，按照上述ELISA步骤进行操作，根据OD₄₅₀确定包被单抗和酶标单抗的最佳配对组合。结果显示，以3B4作为包被单抗与酶标记单抗3F2配对时，所获得的OD450值最佳，因此，本发明确定了以3B4株作为包被一抗，以酶标记单抗3F2株作为二抗来建立反应体系。结果见表1。

表1 捕获单抗与酶标单抗的配对实验

注：- 表示无结果

2.2 包被单抗与酶标单抗的最佳工作浓度的确定

以最佳抗DTMUV的包被单抗3B4和HRP标记的抗DTMUV的酶标单抗3F2为组合，将3B4按照0.25-8μg/mL进行稀释包被酶标板，加入标准阳性对照（10μg/mL的DTMUV抗原）和标准阴性对照（10μg/mL的BHK细胞蛋白）作为样品待检，分别把酶标单抗按照1：500、1：1000、1：2000、1：4000进行稀释，按照上述ELISA步骤进行实验，通过方阵法确定包被单抗3B4的的最佳包被浓度为1μg/mL，酶标单抗3F2的的最佳工作浓度为1：2000，结果见表2。

表2 捕获单抗与酶标单抗最佳工作浓度的选择

注：（+）表示阳性血清，（-）表示阴性血清

3. 标准曲线的建立（灵敏度和可测范围）

将抗原按照80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL、0.156μg/mL进行稀释，按照建立的双抗体夹心ELISA方法进行检测，建立标准曲线。结果表明，应用本方法所能检测到的抗原浓度范围为1.25～40μg/mL，阴阳临界值=阴性样本平均值+3SD=0.474+3×0.0025=0.055 (图3A) ，抗原量在0.5125-20μg/mL之间时有良好的线性关系(图3B)。

重复性实验

将抗原依次按照20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL进行稀释，按照上述ELISA实验操作步骤进行批间和批内重复性实验。每份样品批内和批间实验都重复检测10次，并计算标准偏差及变异系数。从表3和表4计算得出，标准差和变异系数均较小，说明本发明所建立的双抗夹心ELISA抗原检测方法具有良好的重复性。

表3 批内重复性实验

表4 批间重复性实验

5. 特异性实验

按照上述建立的双抗夹心ELISA方法分别检测H9N2、H5N2、DRV、DPV、 DRV 、DHV 、EDS₇₆V尿囊液抗原，同时设标准阴阳性对照，以评价本方法的特异性。结果显示，用本发明所建立的双抗夹心ELISA方法检测的6种病毒抗原的OD450值均低于阴阳临界值，即检测结果均为阴性，说明本方法特异性良好，结果见表5。

表5 双抗夹心ELISA方法特异性鉴定结果

实施例3  鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒的组装

1.ELISA试剂盒组装：

 96孔酶标板，包被有抗鸭坦布苏病毒的单克隆抗体3B4；

 标准阳性对照：坦布苏病毒DTMUV抗原；

 标准阴性对照：BHK细胞蛋白；

⑷ 辣根过氧化物酶标记的抗体3F2；

⑸ 洗涤液：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O 1.42g，KCl 0.2g，Tween20 0.5mL，加双蒸水至1000mL；

⑹ 样品稀释液（即封闭液）：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄ ^.12H₂O 1.42g，KCl 0.2g，BSA 10g，加双蒸水至1000ml；

⑺ 底物液A：3, 3’, 5’, 5-四甲基联苯二胺（TMB）200mg，无水乙醇100ml，加双蒸水至1000ml；

⑻ 底物液B ：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%过氧化氢尿素6.4ml，加双蒸水至1000ml，调节pH至5.0～5.4；

⑼ 终止液：2mol/L硫酸溶液。

酶标板的制备

用包被液将3B4株单克隆抗体稀释至1μg/mL，每孔加100μl，4℃过夜，倾去孔内液体，用洗涤液洗4次，拍干，然后用封闭液封闭，37℃孵育2小时，倾去孔内封闭液，洗涤液洗涤4次，拍干，用铝膜真空封闭保存、备用。

实施例4 鸭坦布苏病毒双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的测定程序

1. 样品稀释

待检样品及标准对照品的稀释：将待检测样品及试剂盒中提供的标准阳性、标准阴性对照品用样品稀释液稀释10倍后使用。

测定步骤

1）包被：用0.05mol/L pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗DTMUV 的单克隆抗体100μL/孔，37℃包被2小时+4℃包被过夜；

2）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

3）封闭：加入封闭液即样品稀释液，200μL/孔，37℃封闭2h；

4）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

5）加抗原：待检测抗原样品用样品稀释液进行10倍稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；

6）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

7）加酶标单抗：于反应孔内加入辣根过氧化物酶标记的抗体，100μL/孔，37℃孵育50min；

8）洗涤：甩干板孔中液体，用洗涤液洗涤四次，每次4min；

9）加底物：每孔中先加入底物液A 50μl，再加入底物液B 50μl，避光显色5-15min；

10）加终止液：每孔中加入终止液 50μl，酶标仪测定各孔OD450值。

结果判断

根据阴阳性临界值的计算方法，即阴阳临界值=阴性样本OD450的平均值+3SD=0.474+3×0.0025=0.055，以0.055作为临界值，样品的检测值≥0.055时判定为阳性，样品的检测值＜0.055时判定为阴性。

实施例5 鸭坦布苏病毒双抗夹心ELISA抗原检测试剂盒的初步应用

将已测定毒价为8.7×10⁵ pfu/mL的鸭坦布苏病毒进行梯度稀释，采用本发明制备的双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒对稀释后的病毒抗原进行检测，借以评价该试剂盒的初步应用效果。结果显示，本发明所建立的ELISA方法可以检测到1.09×10⁴pfu/100μL稀释的病毒抗原，检测灵敏，敏感度是可以达到常规ELISA试剂盒的要求的。结果见表6。

表6 双抗夹心ELISA方法检测鸭坦布苏病毒结果

Claims (5)

1.鸭坦布苏病毒单克隆抗体，其特征在于，它们是分别由保藏号为CGMCC NO:8104，CGMCC NO:8107或CGMCC NO:8106的杂交瘤细胞株所分泌的。

2.分泌鸭坦布苏病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号分别为CGMCC NO:8104，CGMCC NO:8107或CGMCC NO:8106。

3.包含权利要求1所述的单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的酶标抗体的鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒。

4.一种鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒，其特征在于，以保藏号为CGMCC NO:8106的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3B4作为一抗包被酶标板，以保藏号为CGMCC NO:8107的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体3F2经过辣根过氧化物酶标记后作为第二抗体，以鸭坦布苏病毒DTMUV抗原作为标准阳性对照，以BHK细胞蛋白作为标准阴性对照，该试剂盒还包括洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液中的一种或多种，其中所述的洗涤液，样品稀释液，底物液A、底物液B和终止液的组分及配比如下：

洗涤液：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.42g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5mL，加双蒸水至1000mL；

样品稀释液：NaCl 0.8g，KH₂PO₄ 0.27g，Na₂HPO₄·12H₂O 1.42g，KCl 0.2g，BSA 10g，加双蒸水至1000mL；

底物液A：3, 3’, 5’, 5-四甲基联苯二胺200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL；

底物液B ：Na₂HPO₄ 14.6g，柠檬酸9.3g，0.75%浓度的过氧化氢尿素6.4mL，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0～5.4；

终止液：2mol/L硫酸溶液。

5.权利要求1所述的单克隆抗体在制备鸭坦布苏病毒双抗体夹心ELISA抗原检测试剂盒中的应用。