CN110498853A - 抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体。本发明还公开了检测鸭生长迟缓病毒抗体的试剂盒及上述单克隆抗体在制备诊断鸭生长迟缓病毒病的产品中的应用。本发明检测鸭生长迟缓病毒抗体的试剂盒，具有良好的特异性和敏感性，适用于鸭生长迟缓病毒病流行病学调查和疾病诊断，具有很好的应用前景。

Description

抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及免疫化学技术领域，尤其涉及一种抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体、杂交瘤细胞株、以及应用该单克隆抗体检测鸭生长迟缓病毒特异性抗体的阻断ELISA试剂盒。

背景技术

随着我国养殖业的迅速发展，动物传染病不断爆发，不仅给养殖业造成严重的影响，给我国的经济造成巨大的损失，更给动物生命以及人类健康带来严峻的威胁。近年来我国出现了一种以发病鸭精神萎靡、站立不稳、生长发育迟缓为主要特征的新发传染性疾病。该新发疫病的易感动物为樱桃谷鸭，发病日龄主要集中在10～25日龄，少数鸭群于5～14日龄也有发病的症状。该病一年四季均可发生流行，发病率不高，由早期的0.1％～0.5％逐步提升至现在的10％～15％。

该新发病最初是通过采集现地发病鸭的实质性器官，经过病毒分离培养和分子生物学手段等方法，分离出的一株未知病毒，经电子显微镜观察发现该病毒粒子直径在70～100nm之间，有囊膜包裹，经核酸鉴定，确定该病毒为一种新型病毒，并命名为鸭生长迟缓病毒(SHuk2株)。

虽然该病不致死鸭子，但是能引起鸭子生长缓慢，残次率升高，造成巨大的经济损失。因此建立一种针对该新发疫病的快速检测方法，确定该病临床感染情况及在宿主体内的分布情况，为该疾病的预防控制提供技术支持，显得十分重要。

发明内容

本发明要解决目前没有特异性针对鸭生长迟缓病毒的抗体检测方法的技术问题，提供一种抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体可用于特异、灵敏地检测鸭生长迟缓病毒。

此外，还需要提供一种应用上述单克隆抗体检测鸭生长迟缓病毒抗体的试剂盒。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:

在本发明的一个方面，提供了一种一种抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体。

优选的，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO：C2018101的杂交瘤细胞株产生。

在本发明的另一方面，还提供了一种产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。优选的，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2018101。

在本发明的另一方面，还提供了一种检测鸭生长迟缓病毒抗体的试剂盒，包含上述单克隆抗体。

优选的，本发明试剂盒还包含ELISA酶标板、鸭生长迟缓病毒抗原、酶标二抗、显色液、阳性对照血清、阴性对照血清。

优选的，所述抗原的最佳包被浓度为1:400倍稀释；所述待测血清的最佳稀释倍数为1:10，待测血清的作用时间最佳为37℃1h；所述单克隆抗体的工作浓度优选为1:20稀释。

所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

用纯化的灭活鸭生长迟缓病毒抗原包被ELISA酶标板；

将待测血清与包被抗原作用后，依次加入权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗和显色液；

利用酶标仪读取吸光度值OD_450nm,并按公式：阻断率PI(％)＝1-待测血清的OD_450nm/阴性对照血清的OD_450nm×100％，计算待测血清的抑制率，得检测结果。

所述试剂盒检测结果的判定标准为：当PI≥26.0％时判该待测血清为鸭生长迟缓病毒抗体阳性；当PI≤17.9％时判该待测血清为鸭生长迟缓病毒抗体阴性；当17.9％<PI<26.0％时判该待测血清为可疑，需重复检测1次，若重复检测结果低于26.0％，则判为鸭生长迟缓病毒抗体阴性。

在本发明的另一方面，还提供了上述单克隆抗体在制备诊断鸭生长迟缓病毒病的产品中的应用。

在本发明的另一方面，还提供了上述杂交瘤细胞株在制备诊断鸭生长迟缓病毒病的产品中的应用。

本发明抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体，以及应用该单克隆抗体检测鸭生长迟缓病毒抗体的阻断ELISA试剂盒，具有良好的特异性和敏感性，适用于鸭生长迟缓病毒病流行病学调查和疾病诊断，具有很好的应用前景。

本发明分泌单克隆抗体的抗鸭生长迟缓病毒小鼠杂交瘤细胞株2E5，已于2018年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO.C2018101。

具体实施方式

下列实施例中，未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件，如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G.塞德曼等主编，马学军,舒跃龙的译.北京：科学出版社，2004)中所述的方法进行。

本发明以引起鸭生长迟缓病毒毒株SHuk2病毒为抗原免疫小鼠，利用淋巴细胞杂交瘤技术，筛选获得2株能够稳定分泌抗该病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株(2E5和3-6G)，并且该两株单抗均可以中和鸭生长迟缓病毒株SHuk2株。在此基础上，利用特异性单抗2E5和SHuk2病毒抗原建立了检测这种病毒抗体的阻断ELISA方法，并确定了抗原和抗体的最适条件。对316份阴性血清检测结果进行统计学分析，确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥26.0％时判为抗体阳性，PI≤17.9％时判定抗体阴性，17.9％<PI<26.0％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于26.0％，则判为抗体阴性。应用该方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒、Ⅲ型鸭肝炎病毒、禽流感病毒、鸭瘟病毒、鸭呼肠孤病毒、新型鸭呼肠孤病毒、番鸭呼肠孤病毒、鸭坦布苏病毒阳性血清和4份鸭阴性质控血清检测，结果证明该方法具有良好的特异性和敏感性，可用于鸭生长迟缓病毒病流行病学调查和疾病诊断。

实施例1鸭生长迟缓病毒SHuk2株单克隆抗体的制备及鉴定

1.材料和方法

1.1病毒、细胞株及血清SHuk2病毒由本实验室分离、保存；小鼠骨髓瘤细胞株(SP2/0)由本实验室保存；阴、阳性质控血清由本实验室保存；鸭SHuk2病毒阳性血清和阴性血清由本实验室制备、保存。

1.2实验动物6周龄和8～12周龄雌性BALB/c小鼠，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.3主要试剂弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和HRP羊抗鼠IgG购自Sigma公司；PEG1500、HAT、HT购自Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清GIBCO公司；TMB显色液购自武汉博士德公司。

1.4病毒抗原的制备将SHuk2病毒接种于9日龄的SPF鸡胚的尿囊腔中(弃去12小时内死亡的胚)，并收集死亡鸡胚的尿囊液，并经0.2％甲醛灭活。将鸡胚尿囊液在4℃下以7500rpm离心30分钟，弃去沉淀，取上清10000rpm高速离心1小时，再次弃去沉淀，取上清32000rpm超速离心5小时，弃去上清，沉淀用PBS(pH 7.4)溶解后，通过20％、40％、60％蔗糖的梯度离心，然后收集40％～60％蔗糖层之间的白色条带，进行脱糖取沉淀，最后病毒沉淀用PBS悬浮，用作免疫抗原或包被抗原。

1.5间接ELISA方法的建立采用方阵滴定法确定间接ELISA方法中包被抗原和阳性的最佳浓度。将纯化的SHuk2抗原、鼠阳性血清和阴性血清分别作2倍倍比稀释，选择OD_450nm值在1.0左右，且P/N值最大的抗原和血清浓度作为其最佳工作浓度。

1.6小鼠免疫以及抗体检测新发病毒单克隆抗体的制备：参照刘玉斌等的方法(刘玉斌.动物免疫学试验技术[M].长春:吉林科学技术出版社,1989,46-54；徐高原.猪乙型脑炎与伪狂犬病二价基因工程疫苗研究[D].武汉:华中农业大学,2005.)，用纯化的SHuk2病毒与等量的弗氏完全佐剂乳化后，经腹部和背部进行皮下多点接种6周龄的雌性BALB/c小鼠，200ul/只；每隔2周，用纯化的SHuk2抗原加入等量弗氏不完全佐剂乳化，分别进行第2次和第3次免疫，免疫剂量和首免相同；三免后的2周，皮下注射相同剂量的不加佐剂的SHuk2病毒，进行加强免疫。当小鼠的抗体效价达到1:10⁴以上的时候，取抗体效价最高的小鼠脾脏用于细胞融合。

1.7细胞融合和筛选在加强免疫后第三天，按常规淋巴细胞杂交瘤技术(徐志凯.实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版)将小鼠的脾细胞分离，使用50％PEG与SP2/0细胞融合。将融合的细胞接种在96孔板中，在次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)选择性培养基下培养。待杂交瘤细胞长至孔板底部的面积的1/4～3/4时，通过上述1.5所述的间接ELISA检测融合细胞分泌的单克隆抗体。杂交瘤细胞需要在96孔板中亚克隆3次。

1.8单克隆抗体腹水的制备和效价测定参照文献(周珍辉,陈万荣,周育森,等.鸭肝炎病毒现场分离株单克隆抗体的研制[J].湖南农业大学学报,2011,37(1):78-81；徐志凯实用单克隆抗体技术[M].西安:陕西科学技术出版社,1992,55-68.)，取8～12周龄BALB/c小鼠，每只腹腔注射0.5ml灭菌液体石蜡，7～10天后腹腔注入3×10⁶个杂交瘤细胞，注射后7～10天可见小鼠腹部明显膨大，采取腹水，12000rpm离心10min，收集上清液，并用建立的ELISA方法检测腹水的抗体效价，-80℃保存备用。

1.9单克隆抗体中和活性的测定用固定病毒稀释抗体的方法进行病毒中和试验，检测单抗的中和活性。将杂交瘤细胞培养上清液和腹水经56℃灭活30min，10倍稀释后进行2倍倍比稀释，分别与含有100ELD₅₀的SHuk2病毒等体积混合，置37℃作用1h，经尿囊腔接种9日龄鸡胚；同时设抗SHuk2鼠阳性血清及SP2/0细胞培养上清分别作为阳性和阴性对照。能够抑制50％病毒增殖的抗体最高稀释倍数定为抗体中和效价。

2.结果

2.1细胞融合和杂交瘤细胞的建立利用淋巴细胞杂交瘤细胞技术，通过间接ELISA方法对融合孔细胞进行筛选、鉴定和亚克隆纯化，共获得2株能够稳定分泌抗鸭生长迟缓病毒(SHuk2株)的杂交瘤细胞，分别将其命名为1-5和3-6G。其中，抗鸭生长迟缓病毒小鼠杂交瘤细胞株2E5已于2018年5月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学保藏中心)，保藏号为CCTCC NO.C2018101。

2.2杂交瘤细胞上清和腹水效价的测定将阳性杂交瘤细胞培养上清和腹水分别进行10倍系列稀释，用建立的间接ELISA方法测定OD_450nm值；同时设立鼠阳性和阴性血清对照。P/N值≥2.1时单抗的最大稀释度即为其抗体效价(表1)。

表1杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价

2.3单抗中和活性的测定中和试验结果表明，获得的两种单抗均具有中和SHuk2病毒的活性。1-5单抗细胞培养上清的中和抗体效价达1:40，腹水中和抗体效价达1:80。3-6G单抗细胞培养上清的中和抗体效价达1:40，腹水中和抗体效价达1:40。

实施例2检测鸭生长迟缓病毒抗体的阻断ELISA方法的建立

1.阻断ELISA方法的建立

抗原包被的浓度和单克隆抗体1-5的最佳稀释度是通过棋盘滴定来确定。条件优化之后的ELISA板用约400倍稀释的纯化病毒包被，在pH为9.6的0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液中4℃温育过夜。抗原包被板用含有0.05％Tween-20，pH为7.4的PBS洗涤，非特异性结合位点用200uL封闭缓冲液(含5％脱脂乳的PBS)在37℃封闭1小时。血清样品用PBS稀释2倍、5倍、10倍、20倍稀释，每块板都含有阳性和阴性对照。向每个孔中加入稀释的血清样品100uL在37℃温育1小时。然后用PBST洗涤3次，再与McAb1-5在37℃温育1小时。用PBST冲洗孔3次后，加入与HRP缀合的山羊抗小鼠IgG，在室温下孵育1小时。之后再用PBST冲洗3次，再加入100uL TMB，并在室温下温育8分钟。然后通过加入50ul的2mol·L^－1硫酸终止反应。在450nm测量光密度值，并且用公式：阻断率PI(％)＝1-测试血清的OD_450nm/阴性对照血清的OD_450nm×100％。

判断标准的确立：使用316份来自没有感染SHuk2病毒的鸭血清样本，用于确定阳性和阴性血清样品之间的临界值。临界值确定为阴性血清PI的平均值+2倍或3倍标准偏差，这将确保95％或99％阴性血清样品的PI的值落在该范围内。

2.阻断ELISA反应条件的确定

2.1抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的确定将SHuk2纯化病毒分别以1:200、1:400、1:800、1:1600稀释进行包被，阳性血清与阴性血清分别以1:2、1:5、1:10、1:20稀释进行阻断ELISA试验，各个稀释度包被病毒与被检血清的OD_450nm值和阻断率见表2。从表2的结果可以看出纯化病毒400倍稀释进行包被，血清10倍稀释作为被检对象时，阳性和阴性血清的OD_450nm值都比较理想，阻断率比较高。因此，纯化病毒的包被浓度为1:400、被检血清的工作浓度为1:10。

表2抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度的选择

注：“P”代表阳性血清；“N”代表阴性血清；“PI”代表阻断率。

2.2待检血清作用时间的确定使用最佳条件包被和封闭板ELISA板后，加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用1h、1.5h和2h，对阴阳性血清进行阻断ELISA试验，各个时间阴阳性血清阻断结果见表3。从表3的结果可以看出，血清作用时间为1h时，阳性血清的阻断率最高，阻断效果最好，所以选择1h为最佳血清作用时间。

表3血清最佳作用时间选择

2.3单克隆抗体工作浓度的确定使用最佳条件包被和封闭板ELISA板后，加入最佳稀释浓度的阴阳性血清，37℃分别作用1h，将单克隆抗体1-5进行1:10、1:20、1:40和1:80倍稀释后进行阻断ELISA试验，阻断结果见表4。从表4的结果可以看出，1-5单抗进行20倍稀释的时候，阻断效果最好，所以选择1:20作为单抗最佳稀释浓度。

表4单抗(腹水)最佳稀释浓度的选择

2.4阻断ELISA判定标准的确定对316份实验室制备的阴性鸭血清样品进行阻断ELISA检测，经统计学分析，计算出血清样品的平均阻断率(X)为1.9％，标准差(S)为8.0％，X+2S＝17.9％，X+3S＝26.0％；当PI≥26.0％时判该血清为鸭生长迟缓病毒抗体阳性，PI≤17.9％时判为该血清抗体阴性，17.9％<PI<26.0％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于26.0％则判为血清抗体阴性。

实施例3特异性和敏感性试验

1.方法

1.1特异性试验采用建立的检测方法对Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHAV-Ⅰ，编号N1)、Ⅲ型鸭肝炎病毒(DHAV-Ⅲ，编号N2)、禽流感病毒(AIV，编号N3)、鸭瘟病毒(DEV，编号N4)、鸭呼肠孤病毒(DRV，编号N5)、新型鸭呼肠孤病毒(NDRV，编号N6)、番鸭呼肠孤病毒(MDRV，编号N7)、鸭坦布苏病毒(DTMUV，编号N8)阳性血清和4份鸭阴性质控血清(编号N9-N12)1:10稀释进行检测，根据PI值确定其特异性。

1.2敏感性试验将鸭生长迟缓病毒毒株SHuk2病毒阳性血清做1:10～1:1280倍比稀释，用建立的方法进行检测，根据实验结果计算PI值确定其敏感性。

2.结果

2.1特异性检验在特异性检验中，阴、阳性对照血清的检测结果符合判定标准，因此检测结果可信。12份特异性阴性质控血清的PI值均小于17.9％，所以判定为阴性(见表5)。

表5阻断ELISA特异性试验结果

注：“+”表示抗体阳性，“—”表示抗体阴性。

2.2敏感性检验将SHuk2病毒阳性血清做1:10～1:1280倍比稀释，用建立的方法进行检测。结果显示：1:40倍稀释后仍可检测为阳性(PI值≥26.0％)，而1:80倍稀释的阳性血清检测结果为阴性(PI值≤17.9％)(见表6)。

表6阻断ELISA敏感性试验结果

注：“+”表示抗体阳性，“—”表示抗体阴性。

实施例4检测鸭生长迟缓病毒特异性抗体的阻断ELISA(b-ELISA)试剂盒的组成

1、试剂盒的组成

按表7所列的试剂盒内容，装配成试剂盒，组装后置于相应条件保存。

表7鸭生长迟缓病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒内容

2、本发明试剂盒的使用方法：

1)使用步骤

A将待测血清、阴性及阳性对照血清用抗体稀释液稀释10倍备用，每孔100微升加入抗原包被中，37℃孵育1小时。1×洗涤液洗涤3次，每次3min，方法同上；

B将单克隆抗体用抗体稀释液稀释20×，每孔100μL单抗，37℃孵育1h，洗涤3次；

C每孔加入用抗体稀释液稀释到1×的HRP-抗鼠IgG 100μL，37℃1h，洗涤3次；

D每孔加入TMB底物显色液100μL，室温避光显色10min；

E每孔加入终止液50uL，酶标仪读取吸光度值OD_450nm,计算抑制率，抑制率(％)＝(阴性对照的吸光度值-待测血清的吸光度值)/阴性对照的吸光度值×100％。

2)检测结果的判定及分析

当PI≥26.0％时判该血清为鸭生长迟缓病毒抗体阳性，PI≤17.9％时判为该血清抗体阴性，17.9％<PI<26.0％时判为可疑，需重复检测1次，如果仍低于26.0％则判为血清抗体阴性。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种抗鸭生长迟缓病毒的单克隆抗体。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CCTCCNO：C2018101的杂交瘤细胞株产生。

3.一种产生权利要求1所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株，其特征在于，该杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC NO：C2018101。

5.一种检测鸭生长迟缓病毒抗体的试剂盒，包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包含ELISA酶标板、鸭生长迟缓病毒抗原、酶标二抗、显色液、阳性对照血清、阴性对照血清。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：

用纯化的灭活鸭生长迟缓病毒抗原包被ELISA酶标板；

将待测血清与包被抗原作用后，依次加入权利要求1或2所述的单克隆抗体、酶标二抗和显色液；

利用酶标仪读取吸光度值OD_450nm,并按公式：阻断率PI(％)＝1-待测血清的OD_450nm/阴性对照血清的OD_450nm×100％，计算待测血清的抑制率，得检测结果。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测结果的判定标准为：当PI≥26.0％时判该待测血清为鸭生长迟缓病毒抗体阳性；当PI≤17.9％时判该待测血清为鸭生长迟缓病毒抗体阴性；当17.9％<PI<26.0％时判该待测血清为可疑，需重复检测1次，若重复检测结果低于26.0％，则判为鸭生长迟缓病毒抗体阴性。

9.权利要求1或2所述单克隆抗体在制备诊断鸭生长迟缓病毒病的产品中的应用。

10.权利要求3或4所述杂交瘤细胞株在制备诊断鸭生长迟缓病毒病的产品中的应用。