CN105203757B - 一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条 - Google Patents

一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板，所述的底板一端设置有样品垫，样品垫的一端通过金标垫与硝酸纤维素膜相连接，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相连接，所述的金标垫上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体——胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的检测区和一条包被羊抗鼠二抗的对照区，采用这种结构的试纸条具有特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，应用范围广等优点，能广泛应用于基层对于坦布苏病毒的检测。

Description

一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条
技术领域
本发明涉及预防兽医学检验领域，具体涉及了一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条。
背景技术
坦布苏病毒感染是我国于2010年新发生的一种传染性疾病，2010年春夏之交，江浙地区突然出现鸭产蛋下降，之后迅速波及福建、广东、广西、安徽、江苏、江西、河南、山东、河北和北京等地的鸭场，经过病原分离和系统的实验室诊断，该病的病原为黄病毒属中的坦布苏病毒(Tembusu virus，TMUV)。
本病夏秋季发生更严重，蛋鸭、肉鸭生产区均有发生；本病危害多个品种，包括蛋鸭中的绍兴鸭、缙云麻鸭、山麻鸭、金定鸭、康贝尔鸭、台湾白改鸭，肉种鸭中的樱桃谷鸭和北京鸭，野鸭等；该病发病率高，死亡率较低，一般在5％以下，有继发感染时也可高达30％。10～25日龄肉鸭和产蛋鸭更易感。鹅、鸡也有发病的报道。该病一年四季均可发生，但夏秋季节多发，冬季也能发生。雏鸭、育成鸭感染该病后以病毒性脑炎为特征，病鸭瘫痪，站立不稳，行走时双脚向外叉开、呈八字脚、头部振颤、走路时容易翻滚、腹部朝上、两腿呈游泳状挣扎。病鸭腹泻，排白绿稀便，有的还排褐色粪便，脱水、蹼干燥。严重病例者采食困难，痉挛倒地不起，两腿向后踢蹬最后衰竭死亡。产蛋鸭以产蛋下降为特征，鸭突然发病，大群鸭精神尚好，采食下降，粪便稀薄、变绿。产蛋鸭采食量突然下降，较正常鸭采食下降约40％～50％，体温升高，精神沉郁，排绿色稀便，部分鸭瘫痪，个别鸭出现精神沉郁，流泪，喙出血等症状。2～3天后，产蛋量急剧下降，在1～2周内，产蛋率从80％～90％或90％以上下降至10％以下，每日降幅可达5％～20％，30～35天后产蛋率逐渐恢复。因此，该病造成了养禽业巨大的经济损失，严重影响和制约了养禽业的发展。
坦布苏病毒的基因组核酸为单股正链RNA，其分子量大小约为10.5Kb左右，病毒的基因组长度为10990个核苷酸。黄病毒基因组是由5’非编码区(5’non-coding region，NCR)，3’非编码区(3’untranslated region，UTR)及一个开放性阅读框(open readingframe，ORF)组成。病毒的基因组开放阅读框(ORF)编码一个多聚蛋白，由3426个氨基酸构成，可以裂解为3个结构蛋白(E、C、M蛋白)和7个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5)。黄病毒基因组RNA具有感染性，并且携带所有遗传信息，在病毒复制增殖的过程中，具有mRNA作用。因此该病毒基因组既可以复制下一代RNA，也可以翻译出该病毒的蛋白。坦布苏E蛋白为黄病毒主要的结构蛋白，其在病毒吸附、组装及病毒与被侵染宿主的细胞膜融合过程中起到重要的作用；E蛋白也是黄病毒的主要抗原，含有多种类型的抗原表位，这些抗原表位可以诱发机体产生保护性的免疫应答，并使机体产生中和性抗体。
目前，针对鸭坦布苏病毒已建立的检测方法主要是分子生物学检测方法，如套式RT-PCR、LAMP、地高辛、荧光定量PCR等方法；血清学方法诸如间接ELISA和双抗体夹心ELISA方法检测坦布苏病毒的相关报道。虽然普通的分子生物学检测方法检测特异性较好，诊断灵敏度高，但是耗时时间甚长，耗材昂贵，不适合基层检测。血清学检测方法较分子生物学方法耗时较短，操作较为简便，但由于其存在较大的非特异性而容易存在假阳性问题，从而影响对疾病的诊断，因此，迫切需要研发一种更简便、快速地对大量样品进行TMUV的检测的方法。
发明内容
针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板，所述的底板一端设置有样品垫，样品垫的一端通过金标垫与硝酸纤维素膜相连接，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相连接，所述 的金标垫上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体——胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的检测区和一条包被羊抗鼠二抗的对照区，采用这种结构的试纸条具有特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，应用范围广等优点，能广泛应用于基层对于样品的检测。
本发明所采用的具体技术方案是：
发明人首先获得了抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3和C12D1，其中抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3和C12D1是分别通过杂交瘤细胞(CCTCC C201546)和(CCTCCC201547)获得的；
所述的杂交瘤细胞是通过纯化的坦布苏病毒E蛋白作为免疫抗原免疫的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞采用PEG融合法进行细胞融合以及后续有限稀释法亚克隆所获得的；
利用上述的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3，发明人将其与胶体金混合制备获得了抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3—胶体金标记物，并将其作为包被物制备获得了金标垫；
同时发明人利用抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1包被于检测区，羊抗鼠二抗包被于对照区；
利用上述的金标垫、检测区和对照区，发明人进一步的设计并制造了对应的试纸条，所述试纸条包括PVC底板，所述的底板一端设置有样品垫，样品垫的一端通过金标垫与硝酸纤维素膜相连接，硝酸纤维素膜的另一端与吸水垫相连接，所述的金标垫上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3—胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜上设置有一条包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1的检测区和一条包被羊抗鼠二抗的对照区。
与现有技术相比，本发明的试纸条中采用了抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体—胶体金标记物和抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体对样品进行检测，特异性高，且操作简便、快速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，较之现有采用的各种检测方法更加快捷，且不需要特殊仪器设备，更适合于基层临床样品检测。
利用上述的试纸条，可用来检测鸭泄殖腔内容物或喉头粘液等可能含有坦布苏病毒的样品，将上述样品用试纸条进行检测，当检测区和对照区均出现红色条带时，证明样品感染了坦布苏病毒；若仅有对照区出现红色条带，则证明样品未感染坦布苏病毒；若没有红色条带出现，则考虑该试纸条失效。
综上所述，采用这种结构的试纸条具有特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，减少投资和检测成本，应用范围广等优点，能广泛应用于基层对于样品的检测。
保藏信息
保藏时间：2015年7月12日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC
保藏编号：CCTCC NO：C201546
保藏单位地址：中国武汉大学
分类命名:杂交瘤细胞株A12D3
保藏时间：2015年7月12日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心 CCTCC
保藏编号：CCTCC NO：C201547
保藏单位地址：中国武汉大学
分类命名:杂交瘤细胞株A12D1
附图说明
图1为本发明所述试纸条的结构示意图；
图中1为样品垫，2为金标垫，3为检测区，4为对照区，5为硝酸纤维素膜，6为吸水垫，7为PVC底板；
图2为不同稀释度的坦布苏病毒尿囊液检测结果灰度图，
其中1:1，1:10,1:50,1:100,1:1000分别为病毒尿囊液稀释度，下面的红线为检测区红线。
具体实施方式
实施例1
一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板7，所述的底板7一端设置有样品垫1，样品垫1的一端通过金标垫2与硝酸纤维素膜5相连接，硝酸纤维素膜5的另一端与吸水垫6相连接，所述的金标垫2上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3—胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜5上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1的检测区3和一条包被羊抗鼠二抗的对照区4。
实施例2抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的制备
(1)E蛋白表达纯化
采用常规方法从病鸭体内分离坦布苏病毒，通过构建大肠杆菌原核表达载体表达坦布苏病毒E蛋白，并利用尿素法纯化E蛋白；
(2)动物免疫
采用(1)中得到的纯化的E蛋白作为免疫抗原免疫6周龄雌性BALB/c小 鼠，100μg/只。第一次免疫采用弗氏完全佐剂与抗原比例1:1(体积比)乳化，第二、三次免疫采用弗氏不完全佐剂与抗原比例1:1(体积比)乳化，三次免疫方式均为腹腔注射，免疫周期间隔为14天；
(3)细胞融合和亚克隆化
第三次免疫后7天，采用尾部静脉采血法检测抗体效价并建立单抗筛选E-ELISA方法。通过测定效价，选择抗体效价在5×103以上的小鼠，细胞融合之前3天用0.9％的生理盐水稀释的E蛋白到200μg/ml，进行加强免疫，剂量为100μg/只；三天后，将小鼠眼眶采血后致死小鼠，并将其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞采用PEG融合法进行细胞融合；待融合细胞长满96孔培养板底部面积1/3时，采用建立的筛选E-ELISA方法筛选阳性克隆细胞，对筛选出的细胞采用有限稀释法进行亚克隆化，亚克隆化2—3次检测后，达到阳性率100％，即可得到阳性杂交瘤细胞，所获得的阳性杂交瘤细胞为两株，其生物保藏编号分别为(CCTCCC201546)和(CCTCC C201547)，分别分泌抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3和C12D1。
(4)单克隆抗体的制备与纯化
采用腹水制备法大量制备单克隆抗体。给小鼠腹腔注射杂交瘤细胞前7天，腹腔注射灭菌的液体石蜡，0.5ml/只。对筛选出的杂交瘤细胞株进行大量培养后，对细胞进行计数，调整到1×106个/0.5ml,每只小鼠注射0.5ml用0.9％生理盐水稀释的细胞数量达到1×106个，待小鼠腹部明显膨大后，抽取小鼠的腹水，并采用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化小鼠的腹水，即可得到所需单克隆抗体A12D3和C12D1。所获单克隆抗体置于-20℃保存。
利用正辛酸——饱和硫酸铵法纯化收获的单克隆抗体。取离心后的腹水1.5ml与3ml的0.06mol/L PH为4.8的醋酸盐缓冲液混合，室温充分搅拌10min 后，逐滴缓慢加入正辛酸33μl/ml腹水，边加入边搅拌，室温搅拌30min，4℃静置2h，使其反应完全。4℃12000r/min离心30min后，弃去沉淀。而后利用0.1mol/L的氢氧化钠调节溶液的PH到7.4。在磁力搅拌器的作用下缓缓向溶液中加入饱和的硫酸铵溶液(饱和硫酸铵的终体积不超过总体积的45％)，待溶液出现白色浑浊时，停止滴加，室温搅拌30min，放置于4℃静置5h。4℃12000r/min离心30min后，弃去上清。沉淀用2ml 0.01mol/L PH为7.4的Tris-Cl溶液重悬后加入到合适的透析袋中，用0.01mol/L PH为7.4的Tris-Cl溶液做透析缓冲液进行室温透析36h，期间每12h更换一次透析缓冲液。透析结束后吸取透析袋中的液体加入到2ml离心管中即为纯化好的单克隆抗体A12D3和C12D1。
纯化后的单克隆抗体用紫外光分光光度计将样品用0.9％生理盐水稀释10倍后在OD260nm和OD280nm的光吸收值下测量纯化蛋白的浓度,利用下述计算公式:蛋白质浓度(mg/mL)＝(1.45OD280-0.74OD260)×10，计算得到纯化好的单克隆抗体的浓度为1.4mg/mL。(OD280和OD260分别是蛋白质溶液在280nm和260nm波长下的光吸收值。
实施例3抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体——胶体金标记物制备
(1)胶体金的制备
用新制的超纯水将1％的氯金酸稀释成0.01％(质量百分含量)，加入到已经硅化处理过的100ml的锥形瓶中，用微波炉加热煮沸。而后准确吸取2.0ml 1％的柠檬酸三钠缓慢加入到锥形瓶中，振荡均匀后，继续加热直到溶液由黑色变为灰色后变为红色，取出。冷却到室温之后用新制的超纯水恢复到原体积后，加入适量的0.02％的NaN3后，可经一次性灭菌滤器过滤后，放置于4℃保存。 新制的合格的胶体金溶液应该是外观纯净、稳定、透亮、无沉淀物和漂浮物的溶液。制备好后，置于电镜下观察，选择适宜直径的胶体金颗粒。
(2)抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体——胶体金标记物的制备
在磁力搅拌器的搅拌下，用0.2mol/L的碳酸钾调整胶体金溶液的PH到8.5，按照每毫升胶体金的溶液加入1:15稀释的抗体的标准加入抗坦布苏病毒E蛋白的单克隆抗体(A12D3)，加入时应缓慢逐滴加入，速度不宜过快，防止标记不均匀。避光搅拌20min后，加入10％牛血清白蛋白(BSA)，使其溶液终浓度达到1％。继续搅拌30min后，加入一定量的10％PEG20000使其终浓度达到0.2％，继续搅拌10min后，取出放置于4℃保存。
静置一段时间后，将上述溶液于1500r/min低速离心1h,弃去沉淀；再将上清液以15000r/min 4℃离心1h,弃去上清；将剩余的沉淀以初始体积大小的含有1％BSA，0.05％PEG20000和2％蔗糖的0.01M pH8.0的PBS溶液溶解，然后继续上述步骤，反复重复冲洗3次，最后的沉淀溶解于1/10初始体积的1％BSA，0.05％PEG20000和2％蔗糖的0.01M pH8.0的PBS溶液中，放置于4℃保存，并利用电镜观察标记效果。
上述的有关溶液配方如下：
10％牛血清白蛋白(BSA)：10g的牛血清白蛋白(BSA)加入到100mL的超纯水中。
10％PEG20000：10g的PEG20000加入到100mL的超纯水中。
10％蔗糖溶液：10g的蔗糖固体溶解于100mL的超纯水中。
1％BSA，0.05％PEG20000和2％蔗糖的0.01M pH8.0PBS溶液：3mL 10％BSA溶液，15μL 10％PEG20000溶液，6mL的10％蔗糖溶液加入到21mL0.01M pH8.0PBS溶液中。
上述溶液配置好后均用一次性灭菌的0.22μm滤器过滤后方可使用。
实施例4试纸条的制备
金标垫的制备
将GL0194型玻璃纤维素膜浸入到封闭液①中于37℃浸泡1h，用洗涤液清洗3次，然后通风干燥后，剪成0.5cm宽的长条，用铺金法将实施例3中制备好的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体——胶体金标记物均匀的包被于该玻璃纤维素膜上置于37℃作用1h，4℃通风冻干，真空包装，置于4℃保存。
上述的封闭液①配方如下：30mL的10％牛血清白蛋白(BSA)，150μL 10％PEG20000溶液，60mL的10％蔗糖溶液加入到200mL的0.01mol/L的PBS中，然后用上述PBS定容到300mL。
洗涤液配方如下：150μL Tween-20加入到300mL的0.01mol/L的PBS中。上述溶液配置好后均用一次性灭菌的0.22μm滤器过滤后方可使用；
样品垫的制备
将GL-b01型样品垫浸泡于封闭液②中于37℃浸泡1h，用洗涤液清洗3次，然后通风干燥后，裁剪成0.5cm宽的长条，真空包装，置于4℃保存。
上述的封闭液②配方如下：30mL的10％牛血清白蛋白(BSA)，150μL Tween-20，加入到250mL的0.01mol/L的PBS中，然后用上述PBS定容到300mL。洗涤液配方如下：150μLTween-20加入到300mL的0.01mol/L的PBS中。
上述溶液配置好后均用一次性灭菌的0.22μm滤器过滤后方可使用。
硝酸纤维素膜的处理
将Millipore 135型硝酸纤维素膜浸入甲醇中浸泡10min后，通风干燥后，置于4℃保存。对用甲醇处理过的硝酸纤维素膜浸泡于封闭液②中于37℃浸泡 1h，并用洗涤液冲洗3次，放置于低温风干。
用含有2％蔗糖溶液的PBST溶液将将腹水纯化制备的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1按1:1(体积比)稀释，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上作为检测区(T线)，按照1μL/cm进行点膜，检测区靠近样品垫端；用PBST溶液将羊抗鼠二抗1:5(体积比)稀释，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上作为对照区(C线)，按照1μL/cm进行点膜，对照区靠近吸水垫端。检测区和对照区的间隔为0.5cm。制备好后放置于37℃烘干，包装备用。
上述的封闭液②配方如下：30mL的10％牛血清白蛋白(BSA)，150μL Tween-20，加入到250mL的0.01mol/L的PBS中，然后用上述PBS定容到300mL。
上述溶液配置好后均用一次性灭菌的0.22μm滤器过滤后方可使用。
将上述获得的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫按照顺序依次粘附在PVC底板上，均裁剪成0.5cm宽的小条，密闭封装即可，具体结构如下：
包括PVC底板7，所述的底板7一端设置有样品垫1，样品垫1的一端通过金标垫2与硝酸纤维素膜5相连接，硝酸纤维素膜5的另一端与吸水垫6相连接，所述的金标垫2上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体—胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜5上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的检测区3和一条包被羊抗鼠二抗的对照区4。
试验例1
1、特异性试验
将鸭坦布苏病毒、鸭副黏病毒、鸭流感病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒等病毒滴加到加样区进行检测。试验结果(表1)表明，鸭坦布苏病毒样品检测区和对照区均出现红线，而鸭副黏病毒、鸭流感病毒、鸭瘟病毒、
鸭圆环病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒样品均在对照区出现红线，检测区不出现红线。
这表明，鸭副黏病毒、鸭流感病毒、鸭瘟病毒、鸭圆环病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒
与本试纸条无交叉反应，显示出本试纸条具有良好的特异性。
表1本发明试纸条特异性试验结果
注：“+”表示出现红色反应；“-”表示无红色反应
敏感性试验
将坦布苏病毒阳性尿囊液分别按照1:10、1:50、1:100、1:1000稀释，用本发明的试纸条分别检测观察试验结果。如图2所示可见1:100稀释的尿囊液检测区仍可显示红色，而1:1000稀释病毒尿囊液检测区不显示红色。说明本发明的试纸条最低可检测的病毒浓度为1:100，敏感性较高。
重复性试验
将鸭坦布苏病毒标准品分别稀释到20、40、80μg/mL三个不同浓度的样品溶液，以及阴性样品用本发明的试纸条进行检测，每个浓度设定3个重复，利用三个批次配制成的试纸条进行检测，检测结果完全一致，证明本发明的试纸条检测结果稳定可靠，具有良好的重复性。
稳定性试验
将同一批次制备出的试纸条置于室温下，并与生产日期后的当天、1个月、3个月、6个月、8个月对坦布苏病毒标准品进行检测。结果表明，置于室温下6个月之内，检测区和对照区均可显示红色，说明本发明的试纸条可以在室温下保存6个月，具有较长的保存时间。
试验例2
通过收集2013-2014年度，发病疑似为鸭坦布苏病病毒的病料50份，经山东农业大学实验室RT-PCR检测为鸭坦布苏病毒感染阳性。
发明人采集病死鸭的大脑、卵泡等组织，利用本发明制备的胶体金试纸条进行相关检测，检测结果阳性的为50份，与经实验室检测的RT-PCR方法检测完全一致，证明本发明所提供的试纸条不需要任何的设备，就可以进行临床样本的检测，且特异性强，操作简便、快速，结果显示直观、准确，能广泛应用于基层对于鸭坦布苏病毒病的检测。

Claims (2)

1.一种快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条，包括PVC底板(7)，所述的底板(7)一端设置有样品垫(1)，样品垫(1)的一端通过金标垫(2)与硝酸纤维素膜(5)相连接，硝酸纤维素膜(5)的另一端与吸水垫(6)相连接，所述的金标垫(2)上包被有抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体-胶体金标记物，所述的硝酸纤维素膜(5)上设置有一条包抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体的检测区(3)和一条包被羊抗鼠二抗的对照区(4)，其特征在于：
所述金标垫(2)上包被的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体-胶体金标记物中的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体为A12D3；
所述检测区(3)上的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体为C12D1；
所述的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3是通过生物保藏编号：CCTCC C201546的杂交瘤细胞分泌获得的；
所述的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1是通过生物保藏编号：CCTCC C201547的杂交瘤细胞分泌获得的。
2.制备权利要求1所述快速诊断坦布苏病毒的胶体金试纸条的方法，其特征在于：具体步骤如下：
1)在硝酸纤维素膜的不同位置上分别包被抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体和羊抗鼠IgG二抗，分别形成检测区和对照区；具体步骤为：将抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体C12D1溶液按1:1的体积比稀释后按照1μl/cm的用量喷于硝酸纤维素膜上作为检测区，将羊抗鼠IgG二抗按1:5的体积比稀释后按照1μl/cm的用量喷于检测区下方的硝酸纤维素膜上作为对照区，置于37℃下烘干干燥，从而制备得到检测区和对照区；
2)金标垫的制备，具体步骤为：以柠檬酸钠还原法制备金溶液，即在100ml 沸腾的0.01％的体积比氯金酸水溶液中加入2ml的质量分数为10％柠檬三钠溶液，获得直径在20nm的胶体金；
通过预混的方式以0.2mol/l的K2CO3溶液调节上述获得的胶体金pH至8.5，以将待标记的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体A12D3按照1:15的体积比加入到上述调整pH之后的胶体金溶液中，标记20min后，得到抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体-胶体金标记物溶液，再向上述抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体-胶体金标记物溶液中加入质量分数为10％的BSA水溶液，至BSA的终浓度为1％，后继续搅拌30min，加入质量分数为10％的PEG20000，至PEG20000终浓度为0.2％；继续搅拌10min后，4℃、2000rpm离心30min，除去未结合的胶体金颗粒，4℃、15000rpm离心1h，弃上清液，获得初步纯化的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体-胶体金标记物；将上述纯化后的抗坦布苏病毒E蛋白单克隆抗体-胶体金标记物用铺金法均匀的包被于金标垫上置于37℃作用1h，4℃通风冻干，真空包装，置于4℃保存；
3)采用现有工艺和设备组装即得目标试纸条。
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