CN115353564B - 鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab及其检测试剂盒和应用 - Google Patents

鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab及其检测试剂盒和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII‑Mab及其检测试剂盒和应用；该单克隆抗体是由保藏编号为CCTCC NO：C2022176的杂交瘤细胞株DTMUV‑Mab‑6A7所分泌得到。单抗作为检测抗体的阻断ELISA，建立检测试剂盒，该试剂盒能特异性地识别DTMUV阳性血清，而与其它鸭中常见病毒抗体阳性血清无交叉反应；重复性实验表明，批间和批内的变异系数均小于10％；敏感性结果显示该方法的检测限度可达1：1280，且与间接ELISA的符合率为79.198％，与IFA的符合率为82.707％，符合率为100％；表明该试剂盒在临床应用中具有良好的可行性。

Description

鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab及其检测试剂盒和应用
技术领域
本发明涉及免疫学检测领域，具体涉及一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab及其检测试剂盒和应用。
背景技术
鸭坦布苏病毒(DTMUV)是黄病毒科黄病毒属的新成员，主要引起蛋鸭的产蛋量急剧下降以及雏鸭的病毒性脑炎。2010年DTMUV在我国福建、浙江等沿海地区的鸭群中首次爆发，随后迅速蔓延至我国大部分水禽养殖地区，这给中国水禽产业造成了巨大的经济损失。建立快速、灵敏、特异性高的DTMUV血清学诊断方法是防控该病的快速传播和评价疫苗免疫效果的重要手段。
酶联免疫吸附实验用于血清检测不仅快速而且灵敏，可以进行高通量的检测，是较为传统且普遍使用的一种方式。姬希文等应用全病毒包被，建立了间接ELISA检测方法，但使用全病毒包被可能由于抗原不易纯化且抗原含量不多等缺点；孙敏华等研究者表达了坦布苏病毒NS1蛋白，建立了检测鸭血清中鸭坦布苏病毒抗体的间接ELISA方法；间接ELISA由于易受到蛋白与二抗的纯度影响，而增加了检测结果非特异性的可能，有研究者，建立了阻断ELISA的检测方法，其使用全病毒包被，使用纯化的抗体作为阻断抗体，与中和实验相比，该方法敏感性高。多数研究者通常使用不具有中和活性的单抗以检测血清IgG的含量，且鸭坦布苏病毒E蛋白是诱导产生中和抗体的主要蛋白，而E蛋白其中一个结构域EDIII被认为是产生中和抗体的主要结构域，且是抗原表位富集区。由于EDIII区域的特殊，其被广泛的应用到血清学诊断方法与抗体治疗领域，并且由于鸭坦布苏病毒其EDIII具有保守性，将其用作血清学诊断方法可避免在检测过程中忽视来自其他地理区域的黄病毒感染。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab及其检测试剂盒和应用。本发明使用真核表达纯化的蛋白DTMUV EDIII作为包被抗原，使用具有中和活性的单克隆抗体作为阻断抗体，以探究其检测血清中和抗体的可能性，将其作为所建立的间接ELISA方法的对比方法，也为后续疫苗研发的抗体检测奠定基础。
为实现上述目的，本发明所设计一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab，它是由保藏编号为CCTCC NO：C2022176的杂交瘤细胞株DTMUV-Mab-6A7所分泌得到。
分泌上述鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab的杂交瘤细胞株DTMUV-Mab-6A7，于2022年6月16日送交至湖北省武汉市武汉大学，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C2022176。
本发明还提供了一种上述鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab在制备检测鸭坦布苏病毒血清抗体试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述测试剂盒包括上述的鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab。
进一步地，所述检测试剂盒还包括DTMUV-EDIII蛋白、鸭坦布苏病毒标准阴阳性血清、酶标二抗、包被缓冲液、洗涤缓冲液、TMB显色液、终止液、封闭液。
本发明还提供了一种上述的鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
(1)包被抗原：用包被缓冲液将纯化的DTMUV-EDIII蛋白稀释至0.25μg/mL，向微孔中每孔加100μL，4℃过夜进行包被，甩掉孔内液体(尽量拍干孔里面的液体)，洗涤三次，每次5min；
(2)封闭：用洗涤液PBST配制1％BSA作为封闭液，每孔200μL，37℃孵育60min；甩掉孔内液体，逐个孔加满洗涤缓冲液200μL，静置5min，甩掉孔内液体，拍干，洗涤缓冲液洗三次；
(3)孵育一抗：将待测血清稀释至1：20，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干；
(4)加单克隆抗体：鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab稀释至0.5μg/mL，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干；
(5)酶标抗抗体：先用稀释液将酶标二抗HRP-Polyclonal Goat Anti Mouse IgG稀释至1：7500，每孔加入100μL，置37℃，60min，然后洗涤，拍干；
(6)加显色液：每孔加显色液TMB 50μL，置37℃，5min；
(7)终止反应：每孔加2M H2SO4终止液50μL；
(8)判定结果：酶标仪上测定OD450nm值，根据阴阳性对照判定结果。
本发明的有益效果：
1.本发明采用真核表达系统表达和纯化了DTMUV-EDⅢ蛋白，该结构域为诱导中和抗体的优势表位区域，且真核表达蛋白更接近于天然蛋白质，使用该蛋白进行免疫小鼠更容易产生高特异性高效价的中和抗体。
2.本发明经血清中和实验筛选到的单克隆抗体，具有较强的特异性和中和活性，中和效价可达28。
3.本发明使用中和抗体作为阻断抗体建立阻断ELISA方法，该方法可用于检测血清中的中和抗体。
综上所述：本发明通过采用293T真核表达系统表达和纯化了DTMUV-EDIII蛋白，通过免疫小鼠成功制备了33株单克隆抗体，采用血清中和实验筛选到了3株中和抗体，该抗体具有较强的特异性和中和活性，中和效价可达28。使用制备的单抗建立了一种以纯化的DTMUV-EDIII蛋白作为包被抗原，鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab作为检测抗体的阻断ELISA的试剂盒，该试剂盒能特异性地识别DTMUV阳性血清，而与其它鸭中常见病毒抗体阳性血清无交叉反应；重复性实验表明，批间和批内的变异系数均小于10％；敏感性结果显示该方法的检测限度可达1：1280，且与间接ELISA的符合率为79.198％，与IFA的符合率为82.707％，而阻断ELISA的检测结果与血清中和实验所检测的24份血清的符合率为100％。表明该试剂盒在临床应用中具有良好的可行性。
附图说明
图1为DTMUV-EDIII蛋白表达与纯化的鉴定图；
图中，A为DTMUV-EDIII蛋白表达与纯化的SDS-PAGE鉴定图
B为DTMUV-EDIII蛋白表达与纯化的WB鉴定图
M1：标准分子质量蛋白 1.2.3.4：DTMUV-EDIII protein；
M2：预染蛋白marker 1：DTMUV-EDIII protein；
图2为阳性杂交瘤的筛选图；
图中，A为间接ELISA筛选阳性克隆图，B为中和抗体的筛选图；
图3为Western Blot检测单克隆抗体特异性图；
图4为IFA检测单克隆抗体特异性；
图5为单克隆抗体中和效价的测定图；
图6为单克隆抗体饱和浓度测定图；
图7为阻断单克隆抗体的筛选图；
图8为阴阳临界值的确定图；
图9为方法特异性检验图；
图10为方法敏感性检验图；
图11为阻断ELISA与血清中和实验检测结果分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。
实施例1杂交瘤细胞株DTMUV-Mab-6A7的制备
1.毒株、细胞、血清和实验动物
毒株：鸭坦布苏病毒DTMUV-MC(GenBank number：KX452096)毒株由胡薛英老师馈赠，本实验室保存。鸭坦布苏病毒DTMUV-WH2014株(GenBank number：KY235382)、DTMUV-GA(GenBank number：MK907880)、DTMUV-CHN-YC(GenBank number：MN966680)、DTMUV-CHN-JL(GenBank number：MN966679)由本实验室保存。
细胞：人胚肾细胞(HEK-293T)、仓鼠肾成纤维细胞(BHK-21)由本实验室保存。
血清：鸭坦布苏阳性血清由本实验室制备，鸭坦布苏临床血清样品由本实验室收集。鸭坦布苏阴性血清、鸭坦布苏临床血清样品、鸭瘟病毒(DPV)、鸭新城疫(DPMV)、番鸭细小病毒(MPV)、番鸭腺病毒3型(DADV-3)、鸭呼肠孤(DRV)、鸭病毒性肝炎(DHAV)等阳性血清由上海兽医研究所馈赠。
实验动物：5～6周龄BALB/c雌性实验小鼠购自湖北省实验动物研究中心。
2.DTMUV-EDIII蛋白的制备纯化
转染前，将形态良好、生长旺盛的HEK-293T细胞接种到10cm培养皿中，配制细胞转染液，加入无血清培养基OPTI-MEM，然后加入质粒PCD5-DTMUV-EDIII-mfc，按质粒：PEI＝1：6或1：3的比例加入PEI(聚乙烯亚胺)，向皿中加入配好的体系，培养5～6h后，吸弃转染混合液，加10mL/皿真核表达培养基继续在培养箱中培养6d。而后使用Protein A Sepharose进行蛋白纯化，纯化经SDS-PAGE与WB鉴定，该蛋白纯度较高且为特异性的鸭坦布苏病毒蛋白，即为DTMUV-EDIII蛋白(图1)。
3.动物免疫
选取四至六周龄的健康雌性BALB/c小鼠，采用皮下多点注射的方式进行免疫，免疫体积为0.2mL/点。根据DTMUV-EDIII蛋白浓度和最终免疫剂量，取适量上述蛋白与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，随后通过皮下注射进行首免。取适量蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混匀进行乳化，随后进行二免，两周后，断尾采血，分离血清。利用间接ELISA方法检测血清抗体效价(如果血清抗体效价未达到细胞融合条件，则需要进行第三次免疫，方法同第二次免疫)。
4.阳性杂交瘤细胞株的建立
按常规方法制备小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养层细胞，脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)按5∶1的比例在融合剂PEG4000作用下融合，经间接ELISA筛选抗体分泌阳性的杂交瘤细胞，按有限稀释法进行克隆。
结果：细胞融合后，经阳性克隆的间接ELISA方法筛选，共筛选到33株杂交瘤。经中和实验筛选到3株杂交瘤具有中和活性(图2)。
经阻断ELISA预实验对该三株中和抗体筛选，以期选择一株最适合用于阻断ELISA使用的抗体，最终确定为6A7株(图7)；将上述制备得到的杂交瘤细胞株DTMUV-Mab-6A7于2022年6月16日送交至湖北省武汉市武汉大学，中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：C2022176。
实施例2
鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab，包括以下步骤：
将0.5mL灭菌的石蜡油注射小鼠腹腔，一周后再注入106个杂交瘤细胞DTMUV-Mab-6A7，7-10天后，小鼠腹部的腹水极度膨胀时抽取腹水，该腹水中含有大量的坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab，分装备用。
上述鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab的测定：
1.单克隆抗体EDIII-Mab效价测定
运用间接ELISA方法对三种抗体效价进行测定，筛选到的三株血清中和效价分别为DTMUV-9D3株抗体效价为1：100，DTMUV-2G1株效价为1：409600，DTMUV-6A7株(即为单克隆抗体EDIII-Mab)效价为1：204800(见表1)，因此，可以确定所制备的三株中和抗体其中两株具有很高的抗体效价，有利于提高ELISA方法的敏感度。
表1抗体效价检测结果
2.单克隆抗体EDIII-Mab的IFA与WB鉴定
DEF细胞接种到6cm细胞培养皿中，待细胞长至80％～90％时，接毒DTMUV-MC，设置12h、24h两个时间段进行收样，用2×LBA裂解液处理细胞。
通过Western Blot检测DTMUV-EDIII蛋白单抗特异性，结果显示该抗体具有良好的特异性。(见图3)
BHK-21细胞接种24孔板，细胞长至80％～90％时，分别接毒DTMUV-MC、DTMUV-GA、DTMUV-CHN-YC、DTMUV-CHN-JL、DTMUV-WH2014进行IFA检测，结果显示该抗体均能特异性识别现有毒株。(见图4)
3.中和效价的测定
通过对抗体进行梯度稀释，运用血清中和实验的方法，测定抗体的中和效价，以能保护50％细胞不发生病变的抗体最高稀释倍数作为抗体的中和效价。
结果显示，抗体中和效价分别是9D3株效价为23，2G1株效价为28，6A7株效价为28。(见图5)。
4.阻断单克隆抗体的筛选
为了筛选到阻断效果最佳的单克隆抗体，通过用阻断ELISA的方法检测已知阴性与阳性血清，对制备的三株单克隆抗体进行筛选。将单抗统一稀释到1μg/mL，10份阳性血清与12份阴性血清均以1：100进行稀释。
结果显示，6A7抗体株阴阳性血清的阻断率差值最大，且阳性血清的阻断率最高(见图7)，因此，选择6A7抗体株作为阻断抗体。
由以上结果可知，所制备的中和抗体具有良好的特异性且均能特异性识别现有毒株，表明该抗体适合用于相关实验方法的建立，而该中和抗体的制备可为以后对中和抗体表位研究及疾病的抗体治疗奠定基础。通过对三株抗体的筛选，特异性检验、中和效价测定、阻断ELISA预实验筛选实验等确定DTMUV-6A7株(即为单克隆抗体EDIII-Mab)为最佳抗体株，为建立单克隆抗体EDIII-Mab建立抗体检测方法奠定基础。
实施例3
利用上述单克隆抗体EDIII-Mab建立抗体检测方法的条件
1.蛋白包被浓度和检测样品稀释度的最优条件
将抗原浓度与血清稀释度分别倍比稀释，通过方阵滴定确定最佳浓度。将蛋白DTMUV-EIII稀释为4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL共6个浓度梯度，同时，分别将SPF阴性血清与病毒阳性血清由1：10开始进行2倍倍比稀释。
方阵滴定结果显示，当阳性血清的平均OD450nm值为0.121，阴性血清的平均OD450nm值为0.873，PI值最大(见图9)，因此，最佳蛋白包被浓度为0.25μg/ml，最佳血清稀释度为1：20。
表2蛋白包被浓度和检测样品稀释度的最优条件
2.最佳单克隆抗体浓度的确定
将单抗进行浓度倍比稀释，以确定最佳浓度。结果显示，PI值最大时的抗体浓度为0.5μg/mL，即为最佳的单抗浓度(见表3)。
表3最佳单克隆抗体浓度的确定
3.封闭液的确定
为了确定最佳的封闭液，设置封闭液条件为1％BSA、2％BSA、5％脱脂奶。结果显示，PI值最大时的封闭液为1％BSA，即为最佳封闭液(见表4)。
表4封闭液的确定
4.封闭时间的确定
为确定最佳封闭时间，设置条件为37℃，60min、37℃，90min、37℃，120min。结果显示，PI值最大时的封闭时间为37℃，60min，即为最佳封闭时间(见表5)。
表5封闭时间的确定
5.血清一抗反应时间的确定
为了确定最佳的血清反应时间，设置37℃，60min、37℃，90min、37℃，120min三种血清反应时间。结果显示，PI值最大时的反应时间为37℃，60min，即其为最适的一抗反应时间(见表6)。
表6血清一抗反应时间的确定
6.单克隆抗体反应时间的确定
单克隆抗体反应时间分别设置为37℃，60min、37℃，90min和37℃，120min，结果显示，PI值最大时的单克隆抗体反应时间为37℃，60min，即为最佳单克隆抗体反应时间(见表7)。
表7单克隆抗体反应时间的确定
7.酶标二抗浓度与反应时间的确定
采用方阵滴定的方式，酶标二抗反应时间分别设置为37℃，30min、37℃，60min和37℃，90min，酶标二抗浓度分别设置为1：5000，1：7500，1：10000。结果显示，PI值最大时，酶标二抗反应时间为37℃，60min，酶标二抗浓度1：7500，即为最适的酶标二抗浓度与反应时间(见表8)。
表8酶标二抗浓度与反应时间的确定
8.底物反应时间的确定
底物反应时间分别设置为37℃，5min、37℃，10min和37℃，15min。结果显示，PI值最大时的底物反应时间为37℃，5min，即为最佳底物反应时间(见表9)。
表9底物反应时间的确定
9.阴阳临界值的确定
为确定方法的阴阳临界值，检测已确定为阴性的31份鸭血清，通过计算其平均PI值与标准差，确定阴阳临界值。结果显示，平均PI值为3.509％，标准差为3.717％，阴阳临界值＝平均OD450nm值+3×标准差＝14.659％(见图8和表10)。
表10阴阳临界值的确定
由上可知：鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括DTMUV-EDIII蛋白0.25ug/mL、单克隆抗体EDIII-Mab0.5ug/mL、鸭坦布苏病毒标准阴阳性血清1：20稀释、酶标二抗1：7500稀释、包被缓冲液(pH9.6)、洗涤缓冲液(pH7.4PBST)、TMB显色液、终止液20％H2SO4、1％BSA。
上述试剂盒进行DTMUV阻断ELISA抗体检测方法的建立
(1)包被抗原：用包被缓冲液将纯化抗原DTMUV-EIII稀释至0.25μg/mL，向微孔中每孔加100μL，4℃过夜进行包被。甩掉孔内液体(尽量拍干孔里面的液体)，洗涤三次，每次5min。
(2)封闭：用洗涤液PBST配制1％BSA作为封闭液，每孔200μL，37℃孵育60min。甩掉孔内液体，逐个孔加满洗涤缓冲液200μL，静置5min，甩掉孔内液体，拍干，洗涤缓冲液洗三次。
(3)孵育一抗：将待测血清稀释至1：20，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干。
(4)加单克隆抗体：单克隆抗体稀释至0.5μg/mL，向微孔中每孔加100μL，37℃，孵育60min，同样洗涤三次，每次5min，拍干。
(5)酶标抗抗体：先用稀释液将酶标二抗HRP-Polyclonal Goat Anti Mouse IgG稀释至1：7500，每孔加入100μL，置37℃，60min，然后洗涤，拍干。
(6)加显色液：每孔加显色液TMB 50μL，置37℃，5min。
(7)终止反应：每孔加2M H2SO4终止液50μL。
(8)判定结果：酶标仪上测定OD450nm值，根据阴阳性对照判定结果。
上述试剂盒的检测方法的检验
1.方法特异性检验
为了确定阻断ELISA检测方法是否特异性识别鸭坦布苏病毒抗体，检测了八种鸭中其它病毒阳性血清。结果显示，其它病毒阳性血清的阻断率均明显低于阴阳临界值，判断为阴性(见图9)，因此该方法不与其它病毒阳性血清产生交叉反应，具有良好的特异性。
2.方法敏感性检验
通过将阴阳性血清从1：10开始进行倍比稀释，测得每个稀释度下的OD450nm值，完成对阻断ELISA方法的敏感性检验。结果显示，当血清稀释至1：1280，仍为阳性，当血清稀释至1：2560时，为阴性，因此，该方法的对血清的检测限度可达到1：1280(见图10)。
3.批间、批内重复性检验
为了确认所建立的阻断ELISA的方法具有可重复性，选取已知为阴阳性的血清进行检测。最终检测数据显示，批间变异系数为0.861％～9.692％，批间变异系数为1.759％～8.529％，批间批内实验结果显示，该方法具有良好的重复性(见表11)。
表11批间、批内重复性检验
实施例4
对鸭场收集的399份鸭临床血清样品进行检测，进而完成对该方法的符合率检验。分别将阻断ELISA检测结果与IFA检测结果、间接ELISA的检测结果进行符合率分析，同时与血清中和实验所检测的24份血清结果进行比较。结果显示，阻断ELISA与间接ELISA符合率为79.198％(见表12)，阻断ELISA与IFA符合率为82.707％(见表13)，与血清中和实验相比，符合率为100％(见图11)。
表12阻断ELISA与间接ELISA的检测结果分析
表13阻断ELISA与IFA检测结果分析
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab，其特征在于：它是由保藏编号为CCTCCNO：C2022176的杂交瘤细胞株DTMUV-Mab-6A7所分泌得到。
2.分泌鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab的杂交瘤细胞株DTMUV-Mab-6A7，其保藏编号为CCTCC NO：C2022176。
3.一种权利要求1所述鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab在制备检测鸭坦布苏病毒血清抗体试剂盒中的应用。
4.一种鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包括权利要求1所述的鸭坦布苏病毒单克隆抗体EDIII-Mab。
5.根据权利要求4所述的鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒还包括DTMUV-EDIII蛋白、鸭坦布苏病毒标准阴阳性血清、酶标二抗、包被缓冲液、洗涤缓冲液、TMB显色液、终止液、封闭液。
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