CN107904209B - 一种h7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用，所述的单克隆抗体由杂交瘤细胞6B3分泌得到，该杂交瘤细胞已送至CCTCC保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204。所述的单克隆抗体效价高，特异性好，并且具有竞争效果，基于该单克隆抗体制备了H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒及检测方法，该方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，利用该试剂盒对样品进行测试，本方法与HI试验有99％以上的符合率，敏感性为98.7％，特异性为99.3％，相对HI试验，缩短了试验时间，操作步骤更简单，可快速检测样品中是否含有H7亚型禽流感抗体，适合应用于家禽养殖场是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的大批量检测。

Description

一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用
技术领域
本发明是属于临床免疫学技术领域，更具体地，涉及一种H7亚型禽流感病毒单克隆抗体及应用。
背景技术
H7亚型禽流感疫情自2013年出现以来一直没有得到有效的控制。虽然H7N9禽流感病毒还没有进化出人传人的能力，但是禽传人的事例时有发生。2016-2017冬春交接之际我国出现了第五次H7亚型禽流感爆发高峰，这次疫情比以前更为严重，表现为发病时间早和发病率高，并且病毒出现了耐药性突变和毒力增加的现象。针对H7亚型禽流感疫情现状，2017年6月初农业部办公厅发布在两广地区先行开展H7N9免疫工作，为两广地区及全国高效开展禽流感防控工作提供了坚强的技术保障。
H7亚型禽流感推广免疫之后，就面临免疫后抗体水平的监测。常规的检测禽流感抗体的方法是血凝抑制(HI)试验。HI试验对操作人员的专业素质要求较高，过程繁琐，对结果的判定也有较强的的主观性。因此，研制一种H7亚型禽流感抗体检测试剂盒对我们评价疫苗免疫效果以及及时监测鸡群抗体水平显得极为重要。
目前，关于H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的应用相继有报道，主要是在胶体金试纸条、间接免疫荧光、免疫组化等方面的应用，而具有竞争效果的单克隆抗体还未见报道。因此，需要提供一种简便、快速、敏感性高和特异性好，对H7亚型禽流感病毒有竞争效果的单克隆抗体检测试剂盒，为大规模临场检测提供便利。
发明内容
针对上述现有技术中的问题，以便于更简便、快速地对大量样品进行H7亚型禽流感病毒抗体的检测，本发明提供了一株分离的杂交瘤细胞株及由该杂交瘤细胞株分泌得到的抗H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体，该单克隆抗体效价高，特异性好，对H7亚型禽流感病毒抗体有竞争效果。
本发明的另一目的在于提供了所述杂交瘤细胞或单克隆抗体的应用，利用该杂交瘤细胞或单克隆抗体制备H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒具有特异性好，灵敏度高，快速准确的特点。
本发明的另一目的在于提供一种基于上述试剂盒的检测方法，用于H7亚型禽流感疫苗免疫效果的评价及鸡群抗体水平的监测。
本发明的上述目的是由以下技术方案予以实现的。
一株分离的杂交瘤细胞，所述的杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞6B3，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204，保藏于中国典型培养物保藏中心。
本发明所述的杂交瘤细胞株6B3的获得是利用灭活的H7-AIV抗原免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤技术建立抗H7-AIV单克隆抗体杂交瘤细胞库获得，并利用获得的单克隆抗体了建立H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，鉴定待测动物样本是否含有H7亚型禽流感病毒抗体。
杂交瘤细胞6B3在RPMI-1640完全培养基中，在含5％CO2，37℃条件下培养48小时，显微镜下观察，细胞生长良好，呈葡萄串状、集落浑圆透亮，符合杂交瘤细胞的培养特性。
对杂交瘤细胞6B3最高限制代次(F25代)的细胞进行传代稳定性检测，结果每代细胞均能稳定分泌特异性的单克隆抗体，抗体阳性率为100％，并且细胞培养上清的HI抗体效价均在27以上，说明该杂交瘤细胞具有稳定分泌抗体的能力。所述杂交瘤细胞株已于2017年10月17日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204，分类命名：杂交瘤细胞6B3，地址：中国武汉武汉大学。
本发明还提供了所述的杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体6B3。
本发明还提供了所述的杂交瘤细胞或所述的单克隆抗体在制备H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒中的应用。
本发明还提供了一种H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包含：包被抗原的酶标板和酶标记的所述单克隆抗体，所述抗原包被板的包被抗原为H7亚型血凝抑制试验抗原；所述单克隆抗体为所述的单克隆抗体6B3。
优选的，所述抗原的包被浓度为1:160。
优选的，所述试剂盒还包含：阴性对照、阳性对照、样品稀释液、底物液A、底物液B、洗涤液和终止液。
优选的，所述阴性对照为SPF鸡血清；所述阳性对照为H7亚型禽流感标准阳性血清；所述样品稀释液为0.01M PBS溶液中加入0.05％的Tween-20；所述底物液A为Na2HPO4·12H2O 14.60g，柠檬酸9.33g，30％的双氧水2ml，加去离子水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4后分装成10ml/瓶；所述底物液B为四甲基联苯胺(TMB)20.00mg、无水乙醇10.00ml，加去离子水溶解定容至1000ml，分装成10ml/瓶；所述洗涤液为0.01M PBS溶液中加入0.05％的Tween-20；所述终止液为0.25％的HF溶液。
基于所述的试剂盒进行H7亚型禽流感病毒抗体检测的方法，按照竞争ELISA检测方法进行检测，包括如下步骤：
S1.取出包被抗原的酶标板，用稀释好的洗涤液200μl/孔洗板1次后拍干；分别将稀释好的血清样品、阴性对照、阳性对照各取50μl与所述酶标抗体50μl同时加入到抗原包被板孔中，其中阴性对照、阳性对照各设2孔，待检样品设1孔，振荡混匀，置37℃下温育45分钟；
S2.弃去孔中的液体，每孔加入稀释好的洗涤液300μl，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗涤5次；
S3.每孔先加底物液A 50μl、再加底物液B 50μl，混匀，室温避光显色，每孔加入终止液50μl终止显色，混匀后测定OD450nm值；
S4.结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD450nm值应＞0.5，阳性对照孔平均OD450nm值应＜0.5；
S＝样品孔OD450nm值，N＝阴性对照孔平均OD450nm值，计算样品样品竞争率(1-S/N)值；
若竞争率＞0.4时判为阳性；若竞争率≤0.4时判为阴性。
与现有技术相比，本发明有益效果在于：本发明得到的单克隆抗体6B3，是首次得到的对H7亚型禽流感病毒有竞争效果的单抗，用其制备的腹水纯化后对H7-AIV的血凝抑制HI效价为18log2，ELISA效价高达4×105，用于制备的H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒，具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，本方法与HI试验有99％以上的符合率，敏感性为98.7％，特异性为99.3％，且操作步骤更简单，可快速检测样品中是否含有H7亚型禽流感抗体，适合应用于家禽养殖场是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的大批量检测。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下以具体实施条件为例对本发明方法进行进一步说明。
实施例1：杂交瘤细胞株6B3单克隆抗体的建立
1)动物免疫
取购自哈维科的H7标准抗原一瓶用500μL生理盐水重悬，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，皮下分点注射8周龄BALB/c小鼠200μL/只；2周、4周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再各免疫一次；6周后取相同剂量抗原腹腔注射，不加佐剂；4天后融合。
2)细胞融合
骨髓瘤细胞的准备 选择生长状态良好的SP2/0细胞，密度长至培养瓶底75％时弃上清，以不完全DMEM培养基洗涤一次后，用l0mL不完全DMEM培养基将细胞轻轻吹下。
脾淋巴细胞的准备 取加强免疫后4天的小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈椎脱臼致死小鼠，置75％酒精中10min，腹部朝上固定在超净台内的解剖板；无菌打开腹腔取出脾脏，用不完全DMEM培养基洗涤，去除多余结缔组织和脂肪；随后将脾脏转移到另一个盛有不完全DMEM培养基的平皿中。用研磨棒在细胞筛网上将脾脏磨碎，收集脾细胞悬液。
饲养细胞的制备 饲养细胞可在融合前一天晚上制备，方法如下：取一只成熟健康的ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，颈椎脱臼处死；置75％酒精中10min，固定四肢，剪开皮肤使腹膜暴露，用酒精棉球擦拭腹膜；用l0mL注射器，12#针头，吸取10mL HAT培养基小心注射到腹腔，持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入己准备好的容器中，计数并稀释后加入96孔细胞培养板中。
融合：将上述制备的脾细胞与骨髓瘤细胞混合于一支50mL的融合管中，1000g离心10min，弃上清。将融合管置于手掌中，轻轻摩擦底部，使两种细胞充分混匀；在37℃水浴中45s内缓慢加入1mL预热的PEG1500到融合管中，边加边轻轻摇匀；随即在90s内先慢后快滴加30mL 37℃预热的不完全DMEM培养基终止反应，37℃水浴中静置10min，1000g离心10min；弃上清，用60mL HAT培养基轻轻悬浮沉淀细胞，分装于已铺好饲养细胞的96孔细胞培养板，然后将培养板置37℃6％CO2培养箱内培养；5d后用新鲜的HAT培养基进行半换液；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取100μL细胞上清进行抗体检测。
3)杂交瘤细胞的筛选
以购自哈维科的H7标准抗原为检测抗原，采用间接ELISA和HI试验两种方法来筛选阳性克隆。
用方阵试验法确定检测抗原(本实施例所用抗原是购自哈维科的H7标准抗原为检测抗原)包被浓度，将标准抗原用包被缓冲液做梯度稀释，每行作一稀释度，100μL/孔包被酶标板，37℃包被2h；用PBST洗3遍，每次5min，拍干；加10％PBS稀释的小牛血清200μL/孔封闭，4℃封闭过夜，同上洗3遍；加入梯度稀释的阳性血清100μL/孔，37℃孵育1h，同上洗3遍；加入工作浓度(1：10000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG 50μL/孔，37℃孵育1h，同上洗3遍；加入TMB显色液50μL/孔，37℃作用10～15min；加入2M H2SO4 50μL/孔终止反应。测定OD450读值。按方阵确定好的抗原浓度1:100包被酶标板，-20℃保存备用。检测杂交瘤细胞上清的ELISA方法同上。免疫小鼠血清按方阵确定的浓度稀释后作为筛选时的阳性对照，做饲养细胞的ICR小鼠血清作为阴性对照，同时设立空白调零孔。HI试验筛选方法：该方法针对禽流感病毒H7亚型血凝素，筛选阳性的杂交瘤细胞进行克隆。将检出的阳性孔进行亚克隆(采用有限稀释法对ELISA检测为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化)，直到细胞株分泌的抗体能够稳定地与H7亚型禽流感病毒液发生特异性反应为止。经3次亚克隆共得到1株阳性的杂交瘤细胞系，命名为6B3。
该杂交瘤细胞株已于2017年10月17日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204，分类命名：杂交瘤细胞6B3，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：腹水的制备及效价测定
取10周龄的BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀释的处于对数生长期的杂交瘤细胞6B3，5×105个/只；待小鼠腹部明显隆起时，用16#针头从腹腔采集腹水，2500g离心10min，去除脂肪组织，吸取上清，-70℃保存备用。
腹水效价测定：采用间接ELISA和HI试验两种方法检测腹水效价，结果如下：
表1单克隆抗体腹水效价测定
Figure BDA0001457114130000061
亚类鉴定按单克隆抗体亚类试剂盒说明书介绍的方法进行，结果显示单抗6B3为IgG1亚类。
实施例3：杂交瘤细胞6B3稳定性鉴定
将所获得的杂交瘤细胞株6B3连续传代15代，用HI试验测定其细胞上清的效价，结果显示该细胞株能稳定分泌抗体，并且细胞培养上清的HI抗体效价均在27以上。
实施例4：6B3单抗特异性鉴定
取6B3杂交瘤细胞上清，采用HI试验和间接ELISA两种方法对禽流感病毒H7亚型血凝抑制试验抗原(H7-AIAg)、禽流感病毒H1亚型血凝抑制试验抗原(H1-AIAg)、禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验抗原(H5-AIAg)、禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验抗原(H9-AIAg)、新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、鸡产蛋下降综合征病毒(EDS-76)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)进行交叉试验，鉴定单抗的特异性。
结果显示：无论是采用ELISA方法还是HI试验，单抗6B3仅对H7亚型毒株(即上述的H7亚型血凝抑制试验抗原)具有良好的反应性，对H7亚型禽流感病毒以外的其他任何病毒均无反应，说明该株单抗为抗H7亚型禽流感的特异性单抗。
实施例5：H7亚型禽流感病毒的单克隆抗体的纯化
制备的单抗腹水采用Protein G亲和层析方法进行纯化，Protein G纯化方法如下：轻柔颠倒装有Protein G亲和树脂的容器数次以混合树脂使其完全悬浮。将适量Protein G树脂装入层析柱中，加入5mL的结合缓冲液平衡柱子。使用相同或者更多体积的结合缓冲液稀释单抗腹水，上样。上样后用10ml结合缓冲液洗柱子。结合缓冲液流尽后，用10mL的洗脱缓冲液洗脱抗体，收集洗脱产物。洗脱过程中实时检测洗脱液的pH值，及时用1MTris-Cl(pH 8.5)中和洗脱液，使含洗脱产物的洗脱液的pH为7.4。洗脱液装入透析袋，使用0.01M的Tris-Cl缓冲液(pH 7.4)4℃透析过夜，中途换液2～3次。纯化后单抗浓度及腹水效价见表2。
透析后单抗浓度为11.2mg/ml。纯化前的腹水有8ml，纯化后共得到150mg单抗，相当于每毫升腹水含有18毫克左右的单抗，这表明本发明筛选出的杂交瘤细胞株有很强的单抗分泌能力。用ELISA和HI试验两种方法检测纯化后的腹水效价，HI效价可达到218，ELISA效价表明抗体稀释到1：400000倍时仍为阳性，表明该抗体具有灵敏度高的特点。
实施例6：一种H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒的建立
1.酶标板的制备
通过方阵法确定H7亚型血凝抑制试验抗原(购自哈维科的H7亚型血凝抑制试验抗原)的包被浓度为1:160，在2-8℃包被14小时。弃去包被液，加入0.5％牛血清白蛋白(BSA)作为封闭液37℃封闭2小时。弃去封闭液，自然风干后抽真空包装成成品试剂盒包被抗原的酶标板。
2.试剂盒其他组分的配制
样品稀释液：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO4 0.2g，Tween-200.5ml,用去离子水定容至1000ml(pH＝7.4)；
酶标抗体的制备：将10mgHRP溶于2ml注射水中，呈棕红色，加入1ml浓度0.06M/LNaIO4，呈草绿色，4℃30min，加入0.16M/L乙二醇1ml终止反应，室温避光30min，溶液变成棕黄色，加入实施例5制备的浓度为11.2mg/ml的6B3抗体1ml，0.05M PH＝9.5CB中4℃透析过夜。吸出加5mg/ml NaBH4 0.4ml,4℃2h,加入等体积饱和硫酸铵，4℃30min，10000r/min5min,然后用2ml 20mM PH＝7.4PB重悬透析，收获酶标抗体4.5ml，加入等体积甘油，-20℃保存备用。按方阵法确定酶标抗体的工作浓度，浓度是0.02mg/ml。
底物液A：Na2HPO4·12H2O 14.60g，柠檬酸9.33g，30％的双氧水2ml，加去离子水溶解并定容至1000ml，调pH至5.0～5.4，分装，10ml/瓶。
底物液B：四甲基联苯胺(TMB)20.00mg、无水乙醇10.00ml，加去离子水溶解定容至1000ml，分装成10ml/瓶。
终止液：2.5ml氢氟酸(HF)加到900ml去离子水中，定容至1000ml，分装，10ml/瓶。
20倍浓缩洗涤液：NaCl 160g，KCl 4g，Na2HPO4·12H2O 58g，KH2PO4 4g，Tween-2010ml,用去离子水定容至1000ml(pH＝7.4)。
阳性对照：将购自哈维科的H7亚型禽流感标准阳性血清按比例稀释后作为阳性对照。
阴性对照：SPF鸡血清按比例稀释后作为阴性对照。
样品处理：取鸡全血，待血液凝固后4000转/分钟离心10分钟，收集上清。也可采集血液，待凝固后自然析出血清，要求血清清亮，无溶血。
洗涤液配制：使用前，将浓缩的洗涤液从试剂盒中取出，平衡至室温(20～25℃)，并摇动，在37℃水浴中加热5～10分钟使沉淀溶解，然后用蒸馏水作20倍稀释，混匀，稀释好的洗涤液在2～8℃可以存放7日。
样品初步稀释：将待检血清样品在血清稀释板中按1:10的比例稀释(例如：在血清稀释板中先加入90μl样品稀释液，再加10μl待检血清)，注意不能稀释对照，不同的样品要注意换吸头，样品在稀释过程中要充分混匀。
实施例7：一种H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒的检测方法
利用实施例6所述的试剂盒进行H7亚型禽流感病毒抗体检测的方法，包括如下步骤：
S1.取出包被抗原的酶标板，用稀释好的洗涤液200μl/孔洗板1次后拍干；分别将稀释好的血清样品、阴性对照、阳性对照各取50μl与所述酶标抗体50μl同时加入到抗原包被板孔中，其中阴性对照、阳性对照各设2孔，待检样品设1孔，振荡混匀，置37℃下温育45分钟；
S2.弃去孔中的液体，每孔加入稀释好的洗涤液300μl，弃去洗涤液，并在吸水纸上拍干，共计洗涤5次；
S3.每孔先加底物液A50μl、再加底物液B 50μl，混匀，室温避光显色，每孔加入终止液50μl终止显色，混匀后测定OD450nm值；
S4.结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD450nm值应＞0.5，阳性对照孔平均OD450nm值应＜0.5；
S＝样品孔OD450nm值，N＝阴性对照孔平均OD450nm值，计算样品样品竞争率(1-S/N)值；
若竞争率＞0.4时判为阳性；若竞争率≤0.4时判为阴性。
实施例8：H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒特异性试验
用本发明试剂盒分别对AIV-H5、AIV-H9、NDV、IBV、IBDV阳性血清进行检测，根据检测结果评价其特异性。结果表明，该试剂盒对AIV-H5、AIV-H9、NDV、IBV、IBDV阳性血清进行检测均无血清学交叉，见表2。
表2特异性试验结果
Figure BDA0001457114130000091
实施例9：H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒敏感性试验
选取10份阳性血清，倍比稀释后与HI试验同时检测，本发明试剂盒与HI试验敏感性一致，见表3。
表3敏感性试验结果
Figure BDA0001457114130000092
注：本发明试剂盒阳性对照OD450nm为0.140，阴性对照OD450nm为1.537。PI值≥40％为阳性，PI值＜40％为阴性。
HI效价≥24为阳性，HI效价＜24为阴性。
实施例10：H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒重复性试验
用3个批次的本发明试剂盒，取10份阳性血清和10份阴性血清进行测定，计算变异系数。重复性试验结果显示，变异系数小于15％，说明该试剂盒重复性良好，见表4。
表4批间重复性试验
Figure BDA0001457114130000101
Figure BDA0001457114130000111
注：本发明试剂盒阳性对照OD450nm为0.140，阴性对照OD450nm为1.537。PI值≥40％为阳性，PI值＜40％为阴性。
实施例11：H7亚型禽流感竞争ELISA抗体检测试剂盒与HI试验的对比
申请人用H7亚型禽流感抗体竞争ELISA检测试剂盒和HI试验两种方法同时检测150份采自临床的鸡血清，对比试验结果，计算符合率，见表5。符合率为99.3％，说明该试剂盒与HI试验符合率良好，适合在基层大规模检测中推广应用。
表5与HI试验符合率结果
Figure BDA0001457114130000112
本发明建立的H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测方法具有快速、稳定、特异性高、灵敏度高的特点，本方法与HI试验有99％以上的符合率，敏感性为98.7％，特异性为99.3％，且操作步骤更简单，可快速检测样品中是否含有H7亚型禽流感抗体，适合应用于家禽养殖场是否含有H7亚型禽流感病毒抗体的大批量检测。
以上详细描述了本发明的实施，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种H7亚型禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：包被H7亚型血凝抑制试验抗原的酶标板、酶标记的所述单克隆抗体6B3；
所述单克隆抗体6B3由杂交瘤细胞6B3分泌产生，所述的杂交瘤细胞命名为杂交瘤细胞6B3，保藏编号为：CCTCC NO：C2017204，保藏于中国典型培养物保藏中心。
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