CN110804097B - 一种同时制备两种单克隆抗体的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时制备两种单克隆抗体的方法，所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞，同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。本发明这种以乙肝表面蛋白为载体的肺炎偶联物免疫后同时制备分别针对多糖与蛋白的单克隆细胞株细胞及特异性单抗的方法，节省了工作量，提高筛选效率，同时本发明提供的两种单抗具有特异性高，敏感度高及传代稳定性好的优势。

Description

一种同时制备两种单克隆抗体的方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体技术领域，尤其涉及一种同时制备两种单克隆抗体的方法。

背景技术

肺炎球菌和乙肝病毒是危害人类健康的两大病原微生物。针对肺炎球菌和乙肝病毒的 疫苗的成功上市为预防和控制该类疾病提供了有效手段。而在这两种疫苗研发和生产的过 程中需要通过对有效抗原成分的测定来进行质量控制。在抗原含量的检测上，目前，肺炎 疫苗的抗原含量主要采用化学基团法进行测定，通过化学基团的理论比例来判断其含量。 不能完全体现其生物活性。与传统的理化方法相比，利用抗原和抗体在体外特异性结合的 方法，对样品中的抗原进行定性或定量检测更具有特异性。而现有的肺炎血清国际标准品 是一种来自于人类的多抗血清，且数量有限，对不同的型别的适用情况需要进行实验摸索 及验证。因此，单克隆抗体由于针对抗原表位的唯一性已成为继多克隆抗体后更为敏感和 有效的手段而应用于抗原的检测中。

虽然，已有用偶联疫苗进行流脑多糖单克隆细胞株和抗体制备的研究报道，但并未见 同时将偶联蛋白单克隆细胞制备工作和多糖抗原单克隆细胞制备一起考虑的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种通知制备两种单克隆抗体的方法，本发明通过 一个实验能同时筛选出针对多糖和载体蛋白的单克隆抗体，节省了工作量，提高了筛选效 率。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种同时制备两种单克隆抗体的方法， 所述方法以33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原免疫小鼠，选取免疫后抗体 水平较高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，再通过33F肺炎多糖、乙肝表面蛋白以 及33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物作为抗原进行特异性筛选，获得杂交瘤细胞， 同时制备出特异性识别33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体。

进一步地，所述方法具体步骤如下：

步骤(1)将33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白的偶联物抗原与弗氏佐剂混匀后进行免 疫小鼠，最后一次免疫后7天于眼眦采血，分离血清，检测OD₄₅₀吸光值，筛选OD₄₅₀吸 光值最高的小鼠分离脾淋巴细胞用于后续融合；

步骤(2)将小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞混合，加入PEG4000进行细胞融合，融合后将细胞按有限稀释法稀释后接种于96孔培养板中，用含10％胎牛血清的HAT选择 培养基进行选择培养得到融合细胞；

步骤(3)融合细胞经有限稀释并培养至单层时，吸取细胞上清，对细胞上清初筛选用33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物进行细胞上清抗体效价检测，复筛再分别进行抗33F型肺炎多糖和抗乙肝表面蛋白的抗体效价检测，挑选阳性孔进行有限稀释后直至阳性率达到100％，分别选取抗33F肺炎多糖阳性孔和抗乙肝表面蛋白阳性孔中OD₄₅₀值最高的细胞进行扩大培养；

步骤(4)将筛选出的细胞株扩大培养后，制备小鼠腹水，并分别针对筛选出的细胞株做特异性鉴定，得到分别特异性识别33F型肺炎多糖和33F型肺炎多糖的单克隆抗体及相应的杂交瘤细胞株。

进一步地，所述33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物免疫小鼠时免疫过程如下：以 0天-14天-28天三针的方式进行免疫，免疫剂量为1μg/次·只，免疫部位为腹股沟皮下免疫。

进一步地，步骤(3)所述血清抗体检测过程如下：对细胞上清初筛选用33F型肺炎多糖与乙肝表面蛋白偶联物进行细胞上清抗体效价检测，复筛再分别进行抗33F型肺炎多糖和抗乙肝表面蛋白的抗体效价检测，初筛和复筛时将抗原稀释至50ng/ml包被酶标板，4℃过夜，洗涤后，用含脱脂奶粉的封闭液37℃封闭2h后，将小鼠血清10倍稀释后，按 每孔50μl加入后37℃孵育2h后洗板；每孔按1∶5000加入酶标二抗50μl，37℃孵育1h后 洗板；加入底物显色液进行显色并测定OD₄₅₀吸光值。

本发明还提供上述方法得到的杂交瘤细胞株，其中一株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗 体能够特异性识别33F肺炎多糖、33F肺炎多糖乙肝表面蛋白结合物及含有33F肺炎多糖 的结合疫苗；所述杂交瘤细胞株分类命名为杂交瘤细胞株WV-PN33F-01，保藏于中国典型 培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C2019169，保藏时间为2019年9月5日，保藏地址 为中国，武汉，武汉大学。

另外一株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够特异性识别乙肝表面蛋白、33F肺炎多 糖乙肝表面蛋白结合物及含有乙肝表面蛋白的结合疫苗；所述杂交瘤细胞株分类命名为杂 交瘤细胞株WV-HBV-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C2019168， 保藏时间为2019年9月5日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明特点之一在于：目前获得33F肺炎多糖和乙肝表面蛋白的单克隆抗体是采用融 合的细胞进行单克隆制备，通常以单一抗原制备单一单克隆细胞。如需要进行2种以上的 单克隆细胞，则需要用不同的抗原分别对小鼠进行免疫、细胞融合和筛选，存在工作量大， 流程复杂、时间较长的弊端。而且33F肺炎链球菌的荚膜多糖属于TI抗原，其诱导的体 液免疫抗体效价低且不产生免疫记忆。本发明通过采用33F型肺炎球菌多糖与乙肝表面蛋 白共价偶联的方式制备的偶联物，克服了纯化多糖在小鼠中免疫应答的不足，加强免疫后 能产生较高水平的血清抗体水平。而且本发明能够同时获得分别特异性识别33F肺炎多糖 和乙肝表面蛋白的单克隆抗体以及分泌抗体的杂交瘤细胞株，通过一个实验就能得到两种 分泌单克隆抗体的细胞株，提高了单抗细胞株的筛选效率，为细菌多糖疫苗特别是多价蛋 白偶联疫苗的单克隆细胞株的快速制备提供了一种更高效和更具有针对性的可能。

本发明特点之二在于：本发明制备得到的单克隆抗体特异性高，通用型好。以33F肺 炎荚膜多糖为例，在制备肺炎多糖-蛋白结合疫苗及多价结合疫苗过程中，多糖或蛋白的抗 原表面位点容易被覆盖，且多糖与不同载体蛋白结合时，被覆盖的抗原表面会点可能不同； 现有方法得到的单抗，可能无法特异性识别多种多糖蛋白结合物。本发明得到的杂交瘤细 胞株分泌的抗33F肺炎荚膜多糖单克隆抗体进行特异性鉴定，其不仅能识别33F肺炎荚膜 多糖，还能识别33F肺炎荚膜多糖与破伤风类毒素、白喉类毒素、白喉无毒变异体蛋白以 及乙肝表面蛋白的结合物，特异性高，通用性好。

本发明特点之三在于：本研究通过采用33F型肺炎球菌多糖与乙肝表面蛋白共价偶联 的方式制备的偶联物，克服了纯化多糖在小鼠中免疫应答的不足，同时，加强免疫后能产 生较高水平的血清抗体水平。实验初步表明，以1μg/0.2ml的多糖含量、腹股沟皮下注射、 间隔14天免疫3次的方式能诱导相对较高水平的抗体。相对于肌肉注射，皮下组织中有丰富的抗原提呈细胞，能更有效的刺激机体免疫系统，产生更多有特异性表型的B淋巴细胞，这为获得肺炎33F型和乙肝表面蛋白，特别是肺炎33F型的单克隆细胞株和抗体奠定 了基础。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明这种以乙肝表面蛋白为载体的肺 炎偶联物免疫后同时制备分别针对多糖与蛋白的单克隆细胞株细胞及特异性单抗的方法， 节省了工作量，提高筛选效率，为细菌多糖疫苗特别是多价蛋白偶联疫苗的单克隆细胞株 的快速制备提供了一种更高效和更具有针对性的可能。同时本发明提供的两种单抗具有特 异性高，敏感度高及传代稳定性好的优势。

本发明提供的杂交瘤细胞株保藏信息如下：

杂交瘤细胞株I：

分类命名为杂交瘤细胞株WV-PN33F-01；

保藏于中国典型培养物保藏中心；

保藏编号为CCTCC：C2019169

保藏时间为2019年9月5日

保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

杂交瘤细胞株II：

分类命名为杂交瘤细胞株WV-HBV-01；

保藏于中国典型培养物保藏中心；

保藏编号为CCTCC：C2019168；

保藏时间为2019年9月5日；

保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

附图说明

图1为Pn33Fps的McAb特异性鉴定结果；

图2为HBsAg的McAb特异性鉴定结果；

图3为Pn33Fps的Elisa的标准曲线；

图4为HbsAg的Elisa的标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局 限于以下技术方案。

实施例1

本实施例中Pn33Fps(33F肺炎球菌荚膜多糖)与HBs(乙肝表面蛋白)均来自云南沃森生物技术股份有限公司；Pn33Fps(10mg)标准品购自ATCC；HBsAg(11.5μg/0.5mL) 标准品购自中国食品药品检定研究院。BALB/c小鼠(SPF级)：6-8周龄雌性，13-16g，购 自北京维通利华实验动物技术有限公司(实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0006)；SP2/0 骨髓瘤细胞购自昆明动物研究所。聚乙二醇4000(PEG4000)、HAT选择培养基(H- Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)、吐 温-20、HRP标记羊抗鼠IgG均购自美国Sigma公司；RPMI-1640改良型培养基(赛默 飞公司，美国)；石蜡油(国药集团化学试剂有限公司，中国)；胎牛血清、新生牛血清均 购自美国Hyclone公司。本研究使用仪器设备及耗材：IX73倒置显微镜(OLYMPUS公 司，日本)，酶联检测仪(赛默飞公司，美国)；96孔细胞培养板、96孔酶标板购自美 国Costar公司。

抗原的来源

将Pn33Fps(33F肺炎荚膜多糖)加入溴化氰中并在2-8℃进行活化，然后加入己二酰 肼溶液(pH8.0±0.5)，2～8℃反应10～30min。超滤(压力0.1MPa)去除残余溴化氰，收集Pn33Fps的多糖衍生物，将其与HBsAg(乙肝表面蛋白原液)按体积比1∶0.5(v/v)混合， 加入碳二亚胺(EDAC)调pH至6.0±0.5，2～8℃反应2～4h后，采用柱色谱法进行纯化， 收集洗脱峰，除菌过滤后即为偶联物原液。

用经典的溴化氰活化法制备Pn33Fps_HBs偶联物原液后，对多糖含量、蛋白含量(中 国药典《2015版》通则0731第二法)、多糖蛋白比和内毒素含量(中国药典《2015版》 通则1143)及分子大小(中国药典《2015版》通则3419)进行了进行检测，检测结果如 表1所示。

表1.Pn33Fps_HBs偶联物的检测结果

动物的免疫及血清效价的测定

将抗原按1∶1(v/v)与弗氏佐剂(除首针为弗氏完全佐剂外，其余针均为弗氏不完全佐 剂)混匀后，每次每只注射0.2mL。最后一次免疫后7天于眼眦采血约500μl，分离血清用 于抗体效价的测定。将33F型多糖和HBsAg分别稀释至50ng/ml包被酶标板，4℃过夜。 洗涤后，用含脱脂奶粉的封闭液37℃封闭2h后，将小鼠血清10倍稀释后，按每孔50μl 加入后37℃孵育2h后洗板。每孔按1∶5000加入酶标二抗50μl，37℃孵育1h后洗板。加 入底物显色液进行显色并测定OD450吸光值，筛选OD450吸光值最高的小鼠分离脾淋巴 细胞用于后续融合。

细胞融合和培养

饲养细胞的制备用小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，于融合前一天制备。具体操作 如下：选取健康的BALB/c小鼠，摘眼球放血处死，浸泡于75％的酒精中5-10分钟，手提住小鼠尾巴，置于超净台无菌平皿中。用镊子提起小鼠腹部，用无菌剪沿两侧剪开皮肤， 充分暴露腹部。用酒精擦拭消毒后，用注射器取5mlRPMI培养基注入小鼠腹腔，且注射 器在腹腔内反复抽吸数次后，吸出腹腔内液体(内含巨噬细胞)，注入离心管内，1000r/min， 离心10min，弃上清。用5mlHAT培养基(H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin甲氨 喋呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为2×10⁵/mL。将细胞 悬液加入96孔培养板，每孔0.1ml，37℃，5％CO₂培养箱中培养。

骨髓瘤细胞的培养在融合前2周复苏骨髓瘤SP2/0细胞。从液氮罐取出细胞后迅速在37℃水浴中解冻，1500r/min离心8min，弃上清后用含20％胎牛血清的RPMI1640培 养基重悬，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，次日换液，连续培养3天待骨髓瘤细胞的活 性恢复后，扩大培养。用6个装有5ml培养基的培养瓶，接种骨髓瘤细胞，1周后再次接 种，使细胞处于对数生长期。融合前12h换液一次。融合当天，将细胞从瓶壁上轻轻吹下， 收集于50ml离心管内，1000r/min离心5-10min，弃上清，加入30ml培养基，同法离心一 次，然后重悬于10ml无血清的RPMI1640培养基中。加0.4％台酚蓝染液进行活细胞计数， 计数结果约4×10⁷个/ml。

脾淋巴细胞的制备取抗血清效价最高的小鼠，摘眼球放血处死，75％的乙醇消毒5-10 分钟，于无菌超净工作台上开腹取脾，置于盛有5ml培养基的平皿中，轻轻洗涤，并剥去 周围结缔组织。置于200目筛网上研磨，加入培养基冲洗过滤，使脾脏细胞充分洗出来，1500r/min离心5min，弃上清，用培养基重新悬浮，进行活细胞计数。

细胞融合将分离的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以(5-10)∶1的比例混合于50ml的离心 管中，1000r/min离心10min，弃上清，轻击管底，打散沉淀的细胞，置37℃水浴中预热，缓慢加入1mlPEG4000融合两种细胞，待融合完成后，加入15mlRPMI-1640培养基终止融 合，静置10min，1000r/min离心10min，弃上清，1％HAT和20％(体积比)胎牛血清的 RPMI1640改良型培养基重悬细胞融合物。将细胞悬液按150μl/孔加入96孔饲养细胞板中， 置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。5d后用含1％HAT的培养基半换液；10d后用1％HT (H-Hypoxanthine次黄嘌呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)的培养基换出HAT。待 培养至细胞覆盖孔底时，吸取细胞上清进行抗体检测。

杂交瘤细胞株的筛选、克隆

间接酶联免疫吸附(ELISA)实验操作用包被液将50ng/mL的抗原100μl/孔，4℃ 过夜包被96孔酶标板，次日用PBST洗涤液200μl/孔洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶封 闭，200μl/孔，37℃温箱，封闭1h，洗板5次，拍干；取细胞培养上清加入板内，每孔100 μl，37℃温箱，孵育1h，洗板5次，拍干；加入用0.01mol/L的pH 7.4PBS稀释的辣根过 氧化物酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗(1∶5000)，100μl/孔，37℃温育1h，洗板5次，拍干； 然后加入显色液，每孔100μl，避光显色10min，每孔加入终止液100μl，测定A₄₅₀值。

杂交瘤细胞株的筛选初筛，用Pn33Fps_HBs偶联物包被酶标板，按间接ELISA方法，对细胞培养上清进行检测，将阳性孔的克隆细胞有限稀释后继续进行培养。待培养至单层时对培养上清分别进行抗Pn33Fps和抗HBs的抗体效价检测。分别标出阳性孔，并再 次进行稀释克隆，直至所有孔均为阳性。分别选取anti-Pn33Fps和anti-HBsAg阳性孔中 A₄₅₀值最高的细胞进行扩大培养，用于冻存及单克隆抗体的制备。

杂交瘤细胞的冻存和复苏

杂交瘤细胞的冻存：待细胞长满培养瓶底80％-90％时，将细胞吹打至全部悬浮起来， 1500r/min，离心5min，弃上清，以细胞冻存液(30％胎牛血清、60％不完全RPMI1640培养液、10％DMSO)重悬细胞，调整其浓度为5×10⁶～1×10⁷个/mL，分装到冻存管内，1mL/ 管，置4℃1h后转移到-20℃放置1h，然后置-80℃1h，再转入液氮罐口悬挂过夜，最后侵 入液氮内长期保存。

杂交瘤细胞的复苏：从液氮罐取出冻存管，立刻放入37℃水浴中迅速融化，1000r/min 离心5min，弃上清，加入含10％小牛血清培养液重悬细胞，转入培养瓶，37℃，5％CO2培养箱中培养，次日还液，继续培养。

单克隆细胞的特异性试验

将筛选出的抗Pn33F的单克隆细胞株单克隆细胞培养至细胞单层后，取上清液进行特 异性检测。用肺炎PN33F、PN1、PN4、PN6B、PN9V、PN14、PN18C、PN19F、PN23F 多糖以及HBsAg以50ng/mL的浓度，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜。次日用PBST 洗涤液200μl/孔洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶封闭，200μl/孔，37℃温箱，封闭1h，洗 板5次，拍干；取细胞培养上清稀释100倍后加入板内，每孔100μ1，37℃温箱，孵育1h， 洗板5次，拍干；加入用0.01mol/L的pH 7.4PBS稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG 酶标二抗(1∶5000)，100μl/孔，37℃温育1h，洗板5次，拍干；然后加入显色液，每孔100 μl，避光显色10min，每孔加入终止液100μl，测定A₄₅₀值。每个样品做三个重复，最后结 果求取平均值，以A₄₅₀均值≥2.1*阴性A₄₅₀均值，判为阳性。结果显示本发明所筛选的 WV-PN33F-01(保藏编号为CCTCC：C2019169)和其他肺炎血清型均不产生交叉反应，同时也 不和HBsAg抗原产生交叉反应，具有很好的特异性。检测结果如表2所示。

表2 WV-PN33F-01杂交瘤细胞特异性试验(间接ELASA)结果

将筛选出的抗HBs的单克隆细胞株培养至细胞单层后，取上清液进行特异性检测。用 肺炎PN33F多糖、HAV以及HBsAg以50ng/mL的浓度，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃ 过夜。次日用PBST洗涤液200μl/孔洗板3次，拍干；用5％的脱脂奶封闭，200μl/孔，37℃ 温箱，封闭1h，洗板5次，拍干；取细胞培养上清稀释100倍后加入板内，每孔100μl， 37℃温箱，孵育1h，洗板5次，拍干；加入用0.01mol/L的pH 7.4PBS稀释的辣根过氧化 物酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗(1∶5000)，100μl/孔，37℃温育1h，洗板5次，拍干；然后 加入显色液，每孔100μl，避光显色10min，每孔加入终止液100μl，测定A₄₅₀值。每个样 品做三个重复，最后结果求取平均值，以A₄₅₀均值≥2.1*阴性A₄₅₀均值，判为阳性。结果显 示本发明所筛选的WV-HBV-01(保藏编号为CCTCC：C2019169)和HAV(甲型肝炎病毒抗 原)不产生交叉反应，同时也不和肺炎PN33F抗原产生交叉反应，具有很好的特异性，如 表3所示。

表3 WV-HBV-01杂交瘤细胞特异性试验(间接ELASA)结果

检测抗原	HBsAg	HAV	PN33F	阴性	2.1*阴性A<sub>450</sub>
						A<sub>450</sub>均值	2.6174	0.0571	0.0497	0.0467	0.0981
结果	+	-	-	-	/

小结：应用PN33F-HBsAg偶联物制备的WV-PN33F-01杂交瘤细胞分泌的单抗体现出了不 仅能和PN33F-HBsAg偶联物中的偶联的PN33F结合还能和未偶联的PN33F多糖结合的特 性，另一方面偶联物制备的WV-HBV-01杂交瘤细胞分泌的单抗体现出了不仅能和PN33F-HBsAg偶联物中的偶联的HBsAg结合还能和未偶联的HBsAg蛋白结合的特性提示 该单抗针对的单克隆位点在经过偶联后也未受到影响。

杂交瘤细胞传代过程中分泌抗体的稳定性测定

将杂交瘤细胞按每2-3天传一代，连续传代培养15代，用间接ELISA法分别检测3、5、10、150代细胞培养上清效价，每个浓度做3个重复，从而评价杂交瘤细胞在传代过程 中分泌抗体的稳定性，见表4。结果显示，WV-PN33F-01杂交瘤细胞在传代过程中效价稳 定在1∶1000，WV-HBV-01杂交瘤细胞在传代过程中效价稳定在1∶2000，说明该杂交瘤细 胞能稳定分泌抗体。

表4杂交瘤细胞传代培养上清A₄₅₀值

单克隆抗体亚类鉴别单克隆抗体IgG类/亚类鉴定试剂盒(购自赛尔维公司)，采用酶联免疫吸附法进行，实验结果见表5，本发明筛选的两株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体均属于IgG1类。

表5单抗IgG亚类A450检测值

	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG3	IgM	IgA
							WV-PN33F-01	1.2701	0.1233	0.2264	0.2195	0.1888	0.2176
WV-HBV-01	1.4532	0.3741	0.1176	0.3401	0.2836	0.1236
							阴性对照	0.0255	0.0661	0.0247	0.0313	0.0454	0.0637
阳性对照	1.3541	1.4912	1.619	1.4315	1.3562	1.3176

实施例2单克隆抗体(小鼠腹水)的制备

2.1小鼠预处理

取8周-10周的BALB/c小鼠3只，注射灭菌液体石蜡，0.5ml/只，7d后用于接种杂交瘤细胞。

2.2杂交瘤细胞的复苏，亚克隆和扩大培养

复苏按现有方法进行，培养过程中注意观察细胞数量及形态，亚克隆按有限稀释法进 行，复苏后经亚克隆的细胞阳性率为100％，结合显微镜下观察，挑选细胞形态较好的进 行扩大培养。

2.3小鼠接种杂交瘤细胞

待细胞长满板底80％～90％时将细胞吹打下来，1200r/min离心5min，弃上清，用RPMI-1640培养基悬浮细胞，计数，调整细胞数为5×10⁵～l×10⁶个/mL，腹腔注射一周前 预处理过的小鼠，0.5ml/只。注意每天观察小鼠的生长状态，约7-10天后，小鼠腹部明显 膨大时，用注射器抽取腹水，间隔1～2天可继续抽取，直至小鼠死亡。

2.4单克隆抗体的分离

每次抽取的腹水1200r/min离心5min，取上清，分装，-20℃保存，即为WV-A-01细胞株产生的本发明所述单克隆抗体。

实施例3竞争ELISA方法的建立及应用

采用间接ELISA方法确定了抗原和抗体工作浓度，即：Pn33Fps抗原包被浓度为每孔 50ng/0.1ml，抗体稀释度为1∶1000；HBsAg抗原包被浓度为每孔50ng/0.1ml，抗体稀释度为1∶2000。

使用上述抗原包被浓度和抗体稀释度进行竞争ELISA的检测，分别绘制Pn33F多糖标 准曲线(检测范围：40ng-5μg，回归方程：y＝-0.168ln(x)+1.5075)和HBs抗原标准曲线(检 测范围：8ng-1μg，回归方程：y＝-0.128ln(x)+0.9952)，两个标准曲线在检测范围内呈现 良好回归性，回归系数均大于0.99(图3和图4)。使用同样的方法分别对另外制备的3个批次的Pn33Fps和HBsAg样品进行检测，应用回归方程计算，结果显示3个批次样品回 收率在95％-105％之间，批间无显著差异(P值均＞0.05)(表6)。

表6

实施例4单克隆抗体与关联抗原的交叉鉴定

利用上述单克隆细胞制备的腹水型单克隆抗体对Pn33F_HBs、Pn33Fps、HBsAg、TT、CRM₁₉₇、Al(OH)₃六种不同抗原进行特异性检测。结果显示，由anti-Pn33F的单克隆细胞 株(WV-PN33F-01)诱导的单克隆抗体(Pn33F_McAb)对Pn33F_HBs和Pn33Fps具有较 高亲和力(

分别为0.7991和0.9129)，显著高于对

CRM₁₉₇

和

的亲和力；而由anti-HBsAg的单克隆细胞株(WV-HBV-01)诱导的单克隆抗体(HBs_McAb)对Pn33F_HBs和HBsAg 具有较高亲和力(

分别为0.7536和0.9549)，显著高于对

和

的亲和力。(见图1和图2)。

综上，本发明通过将单克隆细胞株免疫小鼠后制备的腹水单抗的ELISA实验初步证实 了本实验筛选到的33F型肺炎球菌多糖以及乙肝表面蛋白单抗可用于对应抗原成分的定性 和定量检测，且不与常见的佐剂或其它载体发生交叉反应。不仅适用于33F型肺炎球菌多 糖且适用于与33F型肺炎球菌多糖结合疫苗的抗原成分的定量检测。

Claims (2)

1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够特异性识别33F肺炎多糖、33F肺炎多糖乙肝表面蛋白结合物及含有33F肺炎多糖的结合疫苗；所述杂交瘤细胞株分类命名为杂交瘤细胞株WV-PN33F-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C2019169，保藏时间为2019年9月23日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

2.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体能够特异性识别乙肝表面蛋白、33F肺炎多糖乙肝表面蛋白结合物及含有乙肝表面蛋白的结合疫苗；所述杂交瘤细胞株分类命名为杂交瘤细胞株WV-HBV-01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC：C2019168，保藏时间为2019年9月23日，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

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