CN110172096A - 一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法 - Google Patents

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冯军
吕娟容
陈志胜
池仕红
刘嘉明
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria

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Abstract

本公开提供了一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，所述方法的具体步骤包括：(1)扩大培养鸭疫里氏杆菌，甲醛灭活，然后利用PBS配置悬液，完成抗原制备；(2)将新制备的抗原与弗氏完全佐剂混合均匀搅拌4h至其乳化，然后皮下注射小鼠，免疫两周后，将新制备的抗原与弗氏不完全佐剂混合均匀搅拌4h至其乳化，再次皮下注射小鼠，免疫一周后获得免疫小鼠，其检测抗体效价为1：6400；(3)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合；(4)将步骤(3)中的融合细胞进行阳性筛选及克隆化。所述的方法通过提高免疫效果以提高抗体效价来进而减少免疫次数，从而达到了节省时间及材料的效果。

Description

一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法
技术领域
本公开涉及生物技术领域，具体涉及一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法。
背景技术
鸭疫里氏杆菌属里氏杆菌属，原名鸭疫巴氏杆菌，是家鸭、鹅、火鸡及其他家禽和野禽的一种急性、接触性的、败血性传染病，又称为新鸭病、鸭败血病、鸭疫综合症、鸭疫败血症和鸭染性浆膜炎。鸭疫里氏杆菌感染发病率可达10％-60％，死亡率为30％-90％，是造成养鸭业经济损失严重的传染病之一。
我国养鸭众多，鸭疫里氏杆菌病几乎在每个养殖场均有发生，一年四季出现，没有明显的季节性；药物治疗效果不确实，往往用药即停止，停药又发病，导致疾病反复发生。而且鸭疫里氏杆菌病对很多药物具有耐药性，这导致养殖户随意加大药物用量，形成恶性循环，对环境造成严重污染，食品安全得不到保障。与此同时，鸭只死亡经常发生，养殖户的效益大大降低。
单克隆抗体治疗疾病具有特异性高、针对性强、效果确实等优点，因此，可作为一种有效治疗鸭疫里氏杆菌病的技术，目前比较成熟的制备单克隆抗体方法有以下几种：(1)抗原特异性的B淋巴细胞杂交瘤技术；(2)人-鼠嵌合抗体制备技术；(3)噬菌体展示技术获得的抗原特异性人源性抗体；(4)转基因小鼠制备的人mAbs；(5)核糖体展示技术。杂交瘤法操作方便，对技术、设备要求低，经济实际，使其成为目前制备单克隆抗最常用的的方法。抗原特异性的B淋巴细胞杂交瘤技术，常规步骤为(1)免疫动物；(2)制备杂交瘤细胞；(3)杂交瘤细胞的克隆化。在免疫动物的步骤中常规的免疫程序，通常需要每隔2周免疫1次，免疫4次后抗体的效价才能达到标准，然后3天再进行杂交瘤的制备，所以这种具有耗时长的缺陷。
发明内容
本公开的目的是提供一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，以快速的获得鸭疫里氏杆菌单克隆抗体。
为实现上述目的，技术方案如下：
一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其具体步骤包括：
(1)扩大培养鸭疫里氏杆菌，甲醛灭活，然后利用PBS配置悬液，完成抗原制备；
(2)将新制备的抗原与弗氏完全佐剂混合均匀搅拌4h至其乳化，然后皮下注射小鼠，免疫两周后，将新制备的抗原与弗氏不完全佐剂混合均匀搅拌4h至其乳化，再次皮下注射小鼠，免疫一周后获得免疫小鼠，其检测抗体效价为1：6400；
(3)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合；
(4)将步骤(3)中的融合细胞进行阳性筛选及克隆化。
所述步骤(1)中甲醛浓度为2％-5％，灭火时间为6-24h，悬液的浓度为109cFU/mL。
所述步骤(2)中抗原与弗氏完全佐剂的混合比例为1：1，抗原与弗氏不完全佐剂的混合比例为1：1，皮下注射的部位为：腋下、颈部、脾脏部或足垫，注射抗原的量为0.2mL，所述抗体效价的检测方法为间接Elisa。
所述步骤(3)中脾细胞与SP2/0细胞混合的比例为10：1，细胞的融合方法为PEG细胞融合法。
所述步骤(4)中阳性筛选的方法为间接Elisa，克隆方法为有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞团显微操作法或荧光激活细胞分类仪分离法。
本公开的有益效果是：提供了一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，所述方法中将菌悬液与弗氏佐剂均匀混合4h，这样能够使其混合物充分乳化，从而将菌液充分的包裹在佐剂中，从而将其注射到动物体内后能够有很好的免疫效果，所以本公开所述的方法通过提高免疫效果以提高抗体效价进而减少免疫次数，从而达到了节省时间及材料的效果。
附图说明
图1为抗体效价检测图。
具体实施方式
以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。
实施例1一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备
1.材料
1.1材料
小鼠骨髓瘤细胞SP2/0购自上海细胞库；6周BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。
1.2试剂
弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、PEG 1500、DMSO、单克隆抗体亚类鉴定试剂盒、购自Sigma公司、100倍HT储存液、50倍HAT储存液购自Gibco公司；青链霉素、1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自BI公司；其他有关试剂为国产分析纯。脱脂奶粉购自德国BD公司；羊抗鼠HRP-IgG、SDS-PAGE凝胶、TMB显色液、ELC超敏发光液均购自索莱宝公司。
1.3培养基及液体试剂配置
1.3.1培养基
HT培养基：20mL胎牛血清，1mL青链霉素溶液，1mL HT储存液，78mL1640培养基，4℃保存。
HAT培养基：20mL胎牛血清，1mL青链霉素溶液，2mL HT储存液，77mL 1640培养基，4℃保存。
PBS:KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，加蒸馏水至1000mL,高压后4℃保存。
1.3.2 Elisa相关试剂
洗涤液(PBST):KH2PO4 0.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，NaCl 8.0g，0.5mLTween-20，加超纯水至1000mL。
包被液：取0.2mol/L NaHCO3 17mL，0.2mol/L Na2CO3 8mL，加75mL蒸馏水，调PH至9.6。
封闭液：10g脱脂奶粉溶于洗涤液，以洗涤液定容至100mL。
酶标抗体稀释液：4％小牛血清PBS。
显色液：索莱宝单份TMB显色液。
终止液：(2M H2SO4)浓硫酸11.1mL、蒸馏水88.9mL蒸馏水。
2.实验方法
(1)抗原制备
从临床发病鸭分离鸭疫里氏杆菌，保存菌种，扩大培养鸭疫里氏杆菌，5％甲醛灭活细菌(甲醛易分解，不稳定，保存与细菌的灭活都需要避光、阴凉处进行)，用PBS配置为浓度109cFU/mL的悬液，完成抗原制备；
(2)免疫动物
将抗原菌液与弗氏完全佐剂1：1混合充分乳化，取0.2mL皮下注射Balb/C雌性小鼠，2周后，将抗原菌液与弗氏不完全佐剂1：1混合充分乳化，取0.2mL皮下注射小鼠，免疫7天后采血取血清间接Elisa法检测抗体效价，效价达到1：6400为标准；
(3)制备融合细胞
将达到效价的小鼠处死，无菌取脾细胞，与SP2/0细胞以10：1的比例混合，1000rpm离心10min，去上清，松散混匀细胞沉淀，37℃缓慢滴入预温的融合剂PEG 4000，震荡摇匀，静置10min，缓慢滴入30mL预温的1640培养基，1000rpm离心10min，去上清，用预温的HAT培养基悬起细胞，吹打均匀，分装在铺有饲养层的96孔板，转入5％CO2培养箱培养。三天后观察细胞，直到细胞长到板底面积的1/10；
(4)融合细胞的阳性筛选及克隆化
将上述融合细胞上清进行间接Elisa检测，检测为阳性的进行细胞亚克隆，克隆方法为有限稀释法：以HT培养基，调整细胞浓度为5个/孔，扩大培养直到细胞长到板底面积的1/10，间接Elisa检测细胞上清，对阳性孔再次亚克隆。经过连续3-5次的亚克隆，将最后三次检测结果为阳性的杂交瘤细胞进行扩大培养，定株。
其中间接Elisa法：包被抗原为血液上清或细胞上清，包被液为PH 9.6碳酸盐缓冲液，二抗为羊抗鼠IgG-HRP，显色液为TMB，终止液为2M H2SO4，阴性对照为未免疫的小鼠血清，判定标准为阳性结果的OD450值＞2倍阴性结果的OD450值。
3.抗体效价的结果分析
免疫10只小鼠，取血清抗体效价最高的两只小鼠进行融合，经间接Elisa检测，血清抗体效价最高的两只小鼠，抗体效价结果如图1，显示分别达到5.12×104、2.56×104。

Claims (9)

1.一种鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述方法的具体步骤包括：
(1)扩大培养鸭疫里氏杆菌，甲醛灭活，然后利用PBS配置悬液，完成抗原制备；
(2)将新制备的抗原与弗氏完全佐剂混合均匀搅拌4h至其乳化，然后皮下注射小鼠，免疫两周后，将新制备的抗原与弗氏不完全佐剂混合均匀搅拌4h至其乳化，再次皮下注射小鼠，免疫一周后获得免疫小鼠，其检测抗体效价为1：6400；
(3)取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行细胞融合；
(4)将步骤(3)中的融合细胞进行阳性筛选及克隆化。
2.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中甲醛浓度为2％-5％，灭活时间为6-24h。
3.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中悬液的浓度为109cFU/mL。
4.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中抗原与弗氏完全佐剂的混合比例为1：1，抗原与弗氏不完全佐剂的混合比例为1：1。
5.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中皮下注射的部位为：腋下、颈部、脾脏部或足垫，注射的量为0.2mL。
6.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中抗体效价的检测方法为间接Elisa。
7.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中脾细胞与SP2/0细胞混合的比例为10：1，细胞的融合方法为PEG细胞融合法。
8.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中阳性筛选的方法为间接Elisa。
9.根据权利要求书1中所述的鸭疫里氏杆菌单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中克隆方法为有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞团显微操作法或荧光激活细胞分类仪分离法。
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