CN111154728A

CN111154728A - 用于h7n9亚型禽流感病毒ha多肽竞争抑制elisa抗体检测的单克隆抗体及方法

Info

Publication number: CN111154728A
Application number: CN202010029846.3A
Authority: CN
Inventors: 彭大新; 陈素娟; 孙志豪; 秦涛; 刘秀梵
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2020-01-13
Filing date: 2020-01-13
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明属于免疫领域，涉及一种用于H7N9亚型禽流感病毒HA多肽竞争抑制ELISA抗体检测的单克隆抗体及方法。本发明公开了H7‑12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10(CCTCC No：C2019150)及其在H7N9亚型禽流感病毒HA多肽的竞争抑制ELISA抗体检测中的应用。本发明利用筛选到的单抗3G10作为竞争抗体建立一种竞争抑制ELISA方法，用来检测H7N9病毒感染血清抗体；因为H7N9灭活标记疫苗所产生的抗体中没有针对H7‑12的抗体，所以该方法又能作为标记疫苗配套的检测方法，用于区分临床上H7N9亚型AIV野毒感染血清和标记疫苗免疫血清，为H7N9亚型AIV的净化提供了技术支持。

Description

用于H7N9亚型禽流感病毒HA多肽竞争抑制ELISA抗体检测的单克隆抗体及方法

技术领域

本发明属于免疫领域，具体涉及一种基于H7N9亚型禽流感病毒HA多肽的竞争抑制ELISA抗体检测方法。

背景技术

目前禽流感抗体检测的常用方法主要包括血凝抑制(HI)试验和酶联免疫吸附试验(ELISA)。HI试验检测对象为阻断HA蛋白与受体结合的功能性抗体，而基于HA、NP、M或NS1蛋白的ELISA方法可以检测所有目的蛋白的抗体，在保留不同蛋白特异性的同时具有更高的灵敏性、良好的重复性、高通量、高效率、操作方便快捷，而且价格低廉等诸多优点，故大多数的DIVA疫苗均采用该技术作为配套的检测方法。

H7N9亚型禽流感是目前严重危害养禽业的疫病之一,并可引起人的感染和死亡,因此在公共卫生上也具有重要意义。为了从源头上消灭H7N9亚型禽流感，目前我国已开始在家禽使用H7N9亚型灭活疫苗并取得了良好的控制效果。为了评价H7N9亚型禽流感疫苗免疫的抗体水平，或未免疫禽群是否存在H7N9亚型禽流感病毒感染抗体，必须建立起H7N9亚型禽流感特异性抗体检测方法。目前禽流感抗体的检测方法很多,包括血凝抑制试验(HI),酶联免疫吸附试验(ELISA),琼脂扩散试验(AGID),免疫荧光试验和胶体金免疫层析技术，其中ELISA方法具有高灵敏性、良好的重复性、高通量、高效率、操作方便快捷的特点，在抗体检测方面应用广泛。

而基于HA、NP、M或NS1蛋白的ELISA方法可以检测所有目的蛋白的抗体，在保留不同蛋白特异性的同时，而且价格低廉等诸多优点，故大多数的DIVA疫苗均采用该技术作为配套的检测方法。

在前期工作中，我们研制的H7N9亚型AIV灭活标记疫苗，其配套的检测方法为多肽芯片检测技术，虽然该方法有较好的灵敏度和特异性，但多肽芯片相对成本较高，且需要特定的仪器和设备，故不适合临床上大量样品的检测。

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种区分H7N9亚型AI野毒感染血清和标记疫苗免疫血清的方法。是以H7-12肽制备单克隆抗体，经生物学特性鉴定后筛选出可用于竞争抑制ELISA的单克隆抗体，利用该酶标抗体建立竞争抑制ELISA，并进行优化和验证，利用于临床血清样品的检测，区分疫苗免疫的动物还是野毒株感染的动物，技术路线如图1所示。

本发明公开了H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10，其保藏编号是CCTCCNo：C2019150。

本发明还公开了所述的H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10在H7N9亚型禽流感病毒HA多肽的竞争抑制ELISA抗体检测中的应用。

本发明进一步提供了一种基于H7N9亚型禽流感病毒HA多肽的竞争抑制ELISA抗体检测方法，是以H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10分泌的单克隆抗体为酶标抗体，建立竞争抑制ELISA，进行临床血清样品的检测，区分疫苗免疫与野毒株感染的样品。

本发明利用筛选到的单抗3G10作为竞争抗体建立一种竞争抑制ELISA方法，用来检测H7N9病毒感染血清抗体；因为H7N9灭活标记疫苗所产生的抗体中没有针对H7-12的抗体，所以该方法又能作为标记疫苗配套的检测方法，用于区分临床上H7N9亚型AIV野毒感染血清和标记疫苗免疫血清，为H7N9亚型AIV的净化提供了技术支持。

附图说明

图1是本发明的技术路线流程图。

图2单抗腹水间接免疫荧光检测结果(10×20)。A:3G10；B:6G6；C:4C2；D:1G3；E:4D4；F:6D6；G:阳性对照。

图3是单抗腹水Western-blot检测结果。M:蛋白Marker；A:3G10；B:6G6；C:4C2；D:1G3；E:4D4；F:6D6；1:感染JD/17的CEF细胞；2:感染CHAH7/H3的CEF细胞。

图4是纯化后的单抗3G10 SDS-PAGE结果。M:蛋白Marker；1:纯化的单抗3G10。

本发明所述的单抗3G10于2019年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉大学)，分类命名为H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10，保藏编号为CCTCC No：C2019150。

具体实施方式

本发明中所涉及的生物材料如下：

H7-12多肽(序列为ADSEMDKLYERVKRQLRENA)、H7N9野生型毒株JD/17(CCTCCNO.V201862)及H7N9疫苗候选株cHA H7/H3，都已在CN109204070A中公开，为公知生物材料。

1单克隆抗体制备

1.1小鼠免疫

初次免疫，取50μg多肽偶联物(H7-12-BSA，溶于250μL生理盐水)与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，经皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠，分多点注射；3周后以相同方法使用弗氏不完全佐剂乳化的抗原再免疫一次；3周后采血测效价，如果效价较高，则取相同剂量抗原(不加佐剂)进行尾静脉加强免疫，3d后准备融合。

1.2偶联多肽最佳包被浓度和抗体稀释度

用加强免疫后小鼠的血清作为一抗，以方阵试验确定最佳抗原包被的浓度、抗体的稀释度，同时以非免疫ICR小鼠的血清作为阴性对照，并用PBS作为空白对照。将H7-12-BSA偶联多肽用包被缓冲液做系列稀释，每一列为一个稀释度，从1：2开始从左至右倍比稀释，第一列每孔浓度是20μg/mL，总共12列，100μL/孔包被酶标板，4℃包被过夜；用PBST洗涤3遍，每次5min，拍干酶标板；加封闭液200μL/孔，在37℃温箱放置2h，洗涤同上；加入阳性血清，从上至下1:100开始纵向倍比稀释，阴性对照孔加100μL阴性血清，空白对照孔加100μLPBS，37℃孵育1h，洗涤同上；加入1：8000稀释的羊抗鼠HRP-IgG二抗100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同上；加入避光保存的TMB底物显色液100μL/孔，37℃反应10min；加入2M H₂SO₄ 50μL/孔终止反应。测定孔内的OD₄₅₀。待确定H7-12-BSA偶联多肽的最佳包被浓度的前提下，为排除BSA的假阳性情况，故以BSA为抗原包被酶标板进行相同的方阵试验。取H7-12-BSA偶联多肽包被板中OD₄₅₀值大约为1的孔的浓度作为抗原的包被浓度，血清稀释度作为检测时的阳性血清稀释度。

方阵试验结果表明(表1，表2)，当H7-12-BSA偶联多肽以2.5μg/mL包被ELISA酶标板，阳性血清以1:800稀释时，此时OD₄₅₀为1.057，阴性值为0.094，P/N的值为11.24。与此同时，BSA以2.5μg/mL包被ELISA酶标板，OD₄₅₀为1.197，P/N的值为32.75。由此确定H7-12-BSA偶联多肽和BSA的最佳抗原包被浓度为2.5μg/mL。

表1.H7-12-BSA偶联多肽最佳稀释度确定

表2.BSA最佳稀释度确定

1.3融合

1.3.1饲养细胞的制备

融合前一天晚上制备饲养细胞：取一只成熟健康ICR小鼠，摘眼球采血作为阴性血清，脱颈椎处死；放入70％酒精里消毒10min，固定后，无菌打开腹腔，暴露腹膜，用16号针头的20mL注射器，吸取15mL HAT培养基注射到腹腔，注意不要戳到血管和组织，用镊子手持酒精棉球轻轻按摩小鼠腹部，反复抽吸腹腔内液体，可见注射器里培养基慢慢变黄，最后抽出液体，注入已准备好的装有HAT培养基的盐水瓶中，并置于冰水中降温。将含有饲养细胞的培养基分装至96孔细胞培养板中，每孔一滴，约含有2×10⁴细胞，加完饲养细胞后放置于细胞培养箱中。

1.3.2脾细胞的准备

BALB/c小鼠加强免疫3d后，进行小鼠摘眼球采血，作为阳性血清，脱颈椎处死，用75％酒精体表消毒10min，四肢固定在解剖台上；无菌打开腹腔取出脾脏，用DMEM培养基洗涤脾脏，用镊子小心去除其周围结缔组织；随后将脾脏转移到另一个含5mL DMEM培养基的平皿中。用研磨棒挤压研磨，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液并进行细胞计数。

1.3.3SP2/0细胞的准备

选择处于对数生长期的SP2/0细胞，待其长至75％时弃上清，用DMEM清洗一次后，再用10mL DMEM培养基将SP2/0细胞从瓶壁上轻轻吹下并进行细胞计数。

1.3.4细胞融合

将制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞按照2:1到5:1的比例在融合管中混匀，1000rpm4℃离心10min，弃去上清，并尽量吸干净，手掌轻轻摩擦管底，使沉淀细胞充分混匀；37℃水浴中60s内缓慢加入1mL预热的PEG1500，边加边摇匀；随后在90s内滴加30mL 37℃预热的DMEM，先慢后快，37℃水浴静置10min，然后1000rpm 4℃离心10min；弃上清，用30mL HAT培养基慢慢悬浮细胞，将其分装于前一天晚上做好的饲养细胞的96孔板中；96孔板置于37℃5％CO₂培养箱内培养；融合后5d后用HAT培养基换出一半液体；10d后全部换成HT培养基；待96孔板底部出现白色细胞团块或者细胞生长至孔底1/10时，吸取上清做抗体检测。

1.4杂交瘤细胞的筛选

1.4.1间接ELISA方法

采用间接ELISA方法对上清变黄或者底部出现细胞团块的面积占孔的1/10的孔均需进行检测。间接ELISA方法的具体步骤参考1.2，并根据方法1.2方阵试验中确定的最佳抗原包被量包被全板，将包被好的ELISA板每孔加入100μL杂交瘤细胞上清液作为待检一抗，以1.2中的小鼠血清分别作为阳性对照和阴性对照，并加入PBS作为空白对照。同时以BSA包被ELISA板作为对照板。每孔中的杂交瘤细胞上清液至少检测3次，检测结果为一直稳定在偶联多肽包被的ELISA板OD₄₅₀读值在1.0以上，BSA包被的ELISA板OD₄₅₀读值接近阴性的孔定为阳性疑似孔。

1.4.2间接免疫荧光试验(IFA)

在96孔板培养CEF细胞，待细胞长至80％后，弃去培养基，用PBS洗3次，每次5min。配制含1μg/mL TPCK胰酶的DMEM，并用此DMEM将JD/17和cHAH7/H3分别稀释到10^-3，然后将稀释后的病毒加入细胞中，100μL/孔，同时设未接毒的正常的CEF细胞作为阴性对照；培养12-15h后弃去培养基，用PBS洗涤3次，每次5min，注意轻轻摇晃，不能用力防止细胞脱落。用PBS洗涤3次，每次5min。再用-20℃预冷的甲醇4℃固定15min；用PBS洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干，将杂交瘤细胞上清分别同时加入到用JD/17和cHAH7/H3接毒的孔中，200μL/孔，37℃作用1.5h；PBS洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干，避光加入1:500稀释的羊抗鼠FITC-IgG，50μL/孔，作用1h；用PBS洗涤3次，每次5min，在吸水纸上拍干，在荧光显微镜下观察，若JD/17和cHAH7/H3接毒孔均出现特异性的亮绿色荧光则说明该单克隆抗体针对的表位是JD/17和cHAH7/H3共同表位，并非我们所要；若无特异性的亮绿色荧光则说明阴性；若JD/17接毒孔出现特异性的亮绿色荧光，而cHAH7/H3接毒孔无特异性的亮绿色荧光，则说明该单抗针对的是两个病毒的H7-12肽区域有差异的表位，也正是我们所需要的阳性孔。

1.5杂交瘤细胞的亚克隆

利用ELISA试验和IFA试验同时筛选ELISA效价较高、荧光强度较强的杂交瘤细胞孔，采用有限稀释法对其进行三次亚克隆。首先按照1.3.1的方法制备饲养细胞，分装到96孔细胞培养板的2～12列，每孔100μL，其中第一列不放饲养细胞；用HT培养基将阳性孔中的杂交瘤细胞吹下，吸取HT加入96孔细胞培养板的第一列第一孔内，将细胞在第一列从上至下进行倍比稀释；约5min后，在显微镜下观察计数，选取大约含有100个细胞的孔，吹匀孔里的细胞，加入含有6mL HT的离心管中，轻轻吹匀离心管中的细胞悬液，加入96孔细胞培养板的第2-4列，0.1mL/孔；继续加HT将细胞悬液补至6mL，混匀后将其加入96孔细胞培养板的5-8列，0.1mL/孔；加HT将细胞悬液补至4mL，混匀后将其加入96孔细胞培养板的9-12列，0.1mL/孔，将其放入37℃5％CO₂培养箱培养，从第5d开始观察96孔板并记录有一个杂交瘤细胞团块的孔，然后换出一半的培养基；待上清变黄后或细胞长满孔底1/10开始检测，检测方法同2.5；以这样的方法连续进行3次亚克隆，直到每个克隆孔上清均为阳性时可以定株。

1.6单抗腹水的制备

取5只健康经产的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL无菌液体石蜡。一周后，收集生长状态较好且处于对数生长期的杂交瘤细胞，室温下，1000rpm离心10min，弃掉上清，用提前预热的PBS重悬杂交瘤细胞，显微镜下计数备用。然后对每只小鼠腹腔注射PBS重悬的杂交瘤细胞5×10⁵个。大约一周后小鼠腹部会出现明显臌胀，此时用16号针头采集腹水，采集结束后1500rpm离心20min，去除油脂等其他杂蛋白，吸出上清分装到指形管中，最后放到-70℃冰箱保存备用。

1.7单抗腹水特性鉴定

1.7.1单抗腹水效价鉴定

取最佳抗原包被量包被ELISA板，将稀释的腹水作为一抗，将腹水从1：1000开始从左到右两倍倍比稀释，阴性对照的一抗则为以同样方法稀释的骨髓瘤细胞诱生的小鼠腹水，空白对照的一抗为PBS，测OD₄₅₀，腹水的效价即为P/N≥2.1时小鼠腹水的最大稀释倍数。以H7-12-BSA偶联多肽包被的酶标板分别测定相应腹水的效价，同时包被BSA作为对照。结果显示，6株单抗腹水的效价从1.28×10⁵～4.10×10⁶不等，具体见表3。

表3.单抗腹水效价

1.7.2单抗腹水亚型的鉴定

按照单克隆抗体亚类鉴定试剂盒说明书中介绍的方法进行。具体如下：取ELISA酶标板分别加入1:1000稀释的单抗腹水，每孔100μL，37℃孵育1h，PBST洗涤3次，每次5min；分别加入工作浓度羊抗鼠IgG2a、IgG1、IgG2b、IgG3、IgM、IgA亚类血清，每孔100μL，37℃孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；加入1:8000稀释的兔抗羊辣根过氧化物酶结合物100μL/孔，37℃孵育15min，PBST洗涤3次，每次5min；加TMB显色液100μL/孔，37℃避光显色10min；用2M H₂SO₄ 50μL/孔终止；测定OD₄₅₀值。以OD₄₅₀值最高的孔所加的亚类确定为单抗亚类。结果显示，3G10和6G6为IgG1亚类，4C2、1G3和6D6为IgG3，4D4为IgG2a(表4)。

表4.单抗亚类鉴定

1.8单抗特性鉴定

1.8.1单抗腹水间接免疫荧光检测结果

方法同1.4.2。在显微镜下观察感染15h后的CEF细胞。结果如图2所示，6株单抗对H7N9野生型毒株JD/17均有特异性荧光，而对H7N9疫苗候选株cHAH7/H3无特异性荧光。未接毒的CEF细胞在荧光显微镜下无荧光。其中，单抗3G10和6G6针对JD/17毒株的特异性荧光相对较强，这与单抗腹水效价测定的结果一致。这表明这6株单抗识别的表位均位于H7亚型和H3亚型在H7-12肽的差异氨基酸位点上。

1.8.2单抗腹水Western-blot检测结果

分别使用野生型H7N9毒株JD/17和H7N9疫苗候选株cHAH7/H3接种CEF细胞，收集细胞毒，对细胞毒蛋白制样并进行Western-blot试验。结果如图3，4C2、1G3、3G10、6G6、4D4和6D6单抗腹水作为一抗，6株单抗针对JD/17均在70KD左右有明显的特异性条带，而针对cHAH7/H3没有特异性条带，表明制备的这6株单抗均能与野生型H7N9毒株特异性结合，而不能与H7N9疫苗候选株结合，这也与间接免疫荧光试验的结果一致。

2筛选用于竞争抑制ELISA的单克隆抗体

将H7-12多肽作为包被抗原包被酶标板，浓度为50μg/mL,在37℃放置2h；弃掉包被液，每孔加200μL的PBST，洗涤3次，5min/次；加5％脱脂乳封闭液，37℃封闭2h；弃去封闭液，洗涤同上；在酶标板的前3排加入1:2稀释的JD/17感染血清，在后3排加入1：2稀释的cHAH7/H3免疫血清，100μL/孔，37℃孵育1h；孵育结束后，洗涤同上；将制备的6株单抗腹水稀释1：100倍，每一列加入一株单抗腹水，100μL/孔，37℃放置1h；结束后的酶标板同上述方法洗涤，加入工作浓度为1：8000的羊抗鼠HRP-IgG，100μL/孔，37℃放置1h；结束后的酶标板同上述方法洗涤，加入TMB底物显色液100μL/孔，室温反应10min；最后加入2M H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，测定每孔的OD₄₅₀。计算抑制率。抑制率(I)＝(1-OD₄₅₀ JD/17/OD₄₅₀ cHAH7/H3)×100％。选择抑制率最高的单抗作为后续建立竞争抑制ELISA的酶标单抗。

通过竞争抑制ELISA试验计算出6株单抗对H7N9亚型免疫血清抑制率。结果显示(表5)，这6株单抗的抑制率各不相同，从20.33％～50.82％不等。其中，单抗3G10的抑制率最高为50.82％，其次为6D6的49.27％。最终选择3G10作为竞争抑制ELISA的酶标单抗。

表5. 6株单克隆抗体对JD/17感染血清的抑制率

3单抗腹水纯化与酶标

腹水的处理：腹水10000rpm离心20min，去除杂质和沉淀取上清。然后按照金斯瑞公司的Protein G Resin说明书对处理好的腹水进行纯化，纯化后检验符合使用要求见图4，并将纯化好的单抗送金斯瑞公司进行辣根过氧化酶标记。

4竞争抑制ELISA操作程序

用方阵试验确定包被抗原及单抗最佳工作浓度。将公司合成的H7-12肽作为抗原，用包被液稀释至相应浓度，每孔100μL包被酶标板，在37℃放置2h；将包被的酶标板用PBST洗涤3遍，每次5min，在吸水纸上拍干；加入封闭液200μL/孔，37℃放置2h；将封闭结束的酶标板同上述方法洗涤后，加入用PBS稀释的H7亚型AIV JD/17感染血清和cHAH7/H3免疫血清，100μL/孔，37℃放置1h；孵育结束后的酶标板同上述方法洗涤；将酶标单抗3G10做适当稀释每孔100μL，37℃放置1h；孵育结束后的酶标板同上述方法洗涤；加入TMB底物显色液100μL/孔，室温反应10min；最后加入2M H₂SO₄ 50μL/孔终止反应，测定每孔的OD₄₅₀。计算抑制率，抑制率(I)＝(1-OD₄₅₀阳性值P/阴性值N)×100％。

5竞争抑制ELISA检测方法条件的优化

5.1包被抗原及酶标单抗最佳工作浓度的确定

H7-12肽用包被液稀释成100μg/mL到10μg/mL 10个梯度，100μL包被96孔酶标板，H7亚型AIV感染血清和JD-cHA/17免疫血清分别做1：2倍稀释，酶标单抗3G10做1：100、1：200、1：400和1：800倍稀释进行方阵试验滴定。计算抑制率，抑制率最大的为抗原包被浓度和酶标单抗最佳工作浓度。根据试验结果(表6)，选取多肽包被浓度50μg/mL、酶标单抗浓度为1：200为最佳，此时抑制率达到最高，为65.19％。

表6.方阵滴定结果

5.2血清稀释度的确定

根据以上试验结果，将H7-12肽用最佳稀释度包被酶标板，H7亚型AIV感染血清和cHAH7/H3免疫血清分别做1：1、1：2、1：4和1：8稀释，用最佳稀释度的酶标单抗3G10进行方阵滴定。计算抑制率，抑制率最大的为血清最佳稀释浓度。根据试验结果，选取血清1:4稀释为最佳稀释度，此时抑制率最高为66.67％(表7)。

表7.血清最适稀释度的选择

5.3最佳封闭液和最佳封闭时间的确定

在相同的反应条件下，分别以含有1％、2％和5％的脱脂乳，1％、2％和5％的BSA和60mL/L、80mL/L和100mL/L的小牛血清作为封闭液，每种封闭液分别作用30、60、90和120min，进行方阵滴定试验。计算抑制率，选取抑制率最大的一组作为最佳封闭液和封闭时间。结果如表8所示，37℃孵育90min时，抑制率最高为68.67％，故选择37℃孵育90min为最佳封闭时间。

表8最佳封闭时间的确定

5.4最佳封闭液的确定

按已确定的最佳条件进行试验，取1％、2％、5％的BSA，1％、2％、5％的脱脂乳和60mL/L、80mL/L和100mL/L的小牛血清作为封闭液进行封闭，计算抑制率(I％)。结果如表9所示，用80mL/L的小牛血清进行封闭，其抑制率最高为69.25％，为最佳封闭液。

表9.最佳封闭液的确定

5.5底物作用时间的确定

H7-12肽、血清和酶标单抗按优化的条件进行ELISA试验，加入底物TMB后，分别作用5、10、15和20min后终止反应，计算抑制率，选取抑制率最大时所用的时间为底物的最佳作用时间。结果如表10所示，避光显色10min后，抑制率最大为67.87％，故最佳显色时间为10min。

表10.最佳底物时间的确定

5.6竞争抑制ELISA阴阳性判断标准

用优化的竞争抑制ELISA方法对30份阴性血清进行检测，结果如表11所示，求得30份阴性血清抑制率的平均值(X)为8.17，标准差(SD)为4.03。取X+2SD为阴性临界值，为16.14％；X+3SD为阳性临界值，为20.23％。两者之间为可疑，需要重新检测。

表11.竞争抑制ELISA阴阳性判断标准

5.7交叉反应试验

用建立的竞争抑制ELISA方法同时检测H1、H3、H4、H5(RE-6、RE-7和RE-8)、H6、H9和H10阳性血清以及cHAH7/H3免疫血清，同时以H7感染血清和阴性血清作为对照，验证本方法的特异性。结果如表12所示，除H7亚型外的其他HA亚型血清抑制率均小于16％，判断为阴性。

表12.特异性试验结果

5.8广谱性试验

用建立的竞争抑制ELISA方法同时检测6株H7N9亚型AIV的免疫血清，结果如表13所示，6株H7N9 AIV免疫血清的抑制率为66.83％～72.76％，表明本方法可检测不同H7N9亚型AIV免疫血清，具有较好的广谱性。

表13.广谱性试验结果

5.9重复性试验

用同一批次包被的酶标板和不同批次包被的酶标板利用竞争抑制ELISA方法对6份血清进行检测，每个样品重复4次，计算血清抑制率的变异系数(CV＝S/X×100％，S：标准差，X：算术平均值)。结果如表14所示，批内变异系数在1.89％到6.06％之间，批间变异系数在1.80％至6.76％之间，均小于10％，说明该方法具有良好的批内和批间的重复性。

表14.批内批间重复性试验结果

Claims

1.H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10，其保藏编号是CCTCC No：C2019150。

2.权利要求1所述的H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10在H7N9亚型禽流感病毒HA多肽的竞争抑制ELISA抗体检测中的应用。

3.一种基于H7N9亚型禽流感病毒HA多肽的竞争抑制ELISA抗体检测方法，其特征在于，以权利要求1所述的H7-12多肽抗体单克隆抗体杂交瘤细胞株3G10分泌的单克隆抗体为酶标抗体，建立竞争抑制ELISA，进行临床血清样品的检测，区分疫苗免疫与野毒株感染的样品。