CN113801854B - 分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(European type Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,EU‑type PRRSV)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其应用，还公开了由该杂交瘤细胞系分泌的抗欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的特异性单克隆抗体及竞争ELISA方法的建立。该杂交瘤细胞系命名为EU1，其微生物保藏号是：CGMCC NO.23019。本发明的杂交瘤细胞系能够稳定分泌特异性识别EU‑type PRRSV的单克隆抗体，可用于特异性针对EU‑type PRRSV的竞争ELISA方法的建立。本发明的EU1杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体可以用于制备竞争法抗体诊断试剂盒，基于EU1建立的抗体鉴别诊断试剂盒可以区分EU‑type PRRSV和其它类型PRRSV的感染。

Description

分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂 交瘤细胞系及其应用

技术领域

本发明涉及单克隆抗体杂交瘤细胞系及其分泌的特异性单克隆抗体，尤其是涉及分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系及其分泌的特异性单克隆抗体，还涉及鉴别诊断欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的抗体竞争ELISA方法，本发明属于生物医药领域。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndromevirus,PRRSV)引起的以母猪流产和仔猪呼吸道症状为主要特征的急性传染病。1996年，我国首次报道PRRSV CH-1a株，随后5系PRRSV(BJ-4株)、8系PRRSV(JXA1株)、3系PRRSV(QYYZ株)、1系PRRSV(类NADC30 PRRSV和类NADC34 PRRSV)在我国陆续被报道。2006年，我国报道出现了欧洲型PRRSV BJEU06-1株，随后又报道了多株欧洲型(European type，EU-type)PRRSV，但目前我国的欧洲型PRRSV均属于西欧1型。

目前存在多种PRRSV抗体检测试剂盒，它们主要针对广谱性PRRSV抗体，目前尚没有效果好的特异性检测EU-type PRRSV抗体的方法，因此，EU-type PRRSV在我国的感染情况尚不清楚。我们用分子筛纯化后的EU-type PRRSV ZD1株反复免疫小鼠，以期制备特异性识别EU-type PRRSV的杂交瘤细胞系，并用该杂交瘤细胞系分泌的特异性单克隆抗体制成特异性识别EU-type PRRSV抗体的竞争ELISA试剂盒。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种能够分泌特异性识别EU-type PRRSV的杂交瘤细胞系，该细胞系可以稳定分泌单克隆抗体EU1。

本发明的目的之二是提供一种用单克隆抗体EU1制备的特异性识别EU-typePRRSV抗体的竞争ELISA试剂盒及其检测方法。

本发明的上述目的分别通过以下技术方案实现：

本发明筛选得到的一株分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述的杂交瘤细胞系命名为EU1，分类命名为鼠单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.23019，保藏时间为2021年8月4日。

由所述的杂交瘤细胞系分泌产生的特异性针对欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了所述的单克隆抗体在制备检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。

更进一步的，本发明还提出了一种用于鉴别诊断欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的抗体竞争ELISA试剂盒，所述的试剂盒中含有所述的单克隆抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包括灭活的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒包被的ELISA板、HRP标记的羊抗鼠IgG、封闭液、洗涤液、稀释液、显色液以及终止液。

其中，优选的，所述的试剂盒用于鉴别诊断欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染时，按照以下步骤进行：

(1)抗原包被：以纯化灭活的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒包被ELISA板，4℃过夜；

(2)封闭：取出包被好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干；加入300μl/孔封闭液，置37℃恒温培养箱孵育2h；从温箱中取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干；

(3)待检血清及一抗孵育：将待检血清与EU1单克隆抗体1：1混合后加入ELISA板，每孔加入100μl，同时设阳性血清和阴性血清做对照，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干；

(4)二抗孵育：将HRP标记的羊抗鼠IgG用PBST做10000倍稀释，每孔加入100μl，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干；

(5)底物显色：加入底物TMB进行显色，每孔加入100μl，置37℃恒温培养箱避光作用15min；

(6)终止反应：每孔加入50μl 2M H₂SO₄进行终止，酶标仪450nm处测量吸光度A值；

(7)计算血清抑制率：血清抑制率(％)＝(阴性对照OD450nm值-待检血清OD450nm值)/阴性对照OD450nm值×100％。

其中，优选的，纯化灭活的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒包被ELISA板的包被浓度为455ng/孔，封闭液为1％w/v BSA。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明公开了分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(EU-type PRRSV，Type 1)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系EU1及其竞争ELISA方法的建立。本发明的EU1杂交瘤细胞系能够稳定分泌特异性识别EU-type PRRSV的单克隆抗体，可用于特异性针对EU-typePRRSV的竞争ELISA方法建立。本发明的EU1杂交瘤细胞系及其分泌的单克隆抗体可以用于制备竞争法抗体诊断试剂盒，基于EU1建立的抗体鉴别诊断试剂盒可以区分EU-type PRRSV和其它类型PRRSV的感染。

附图说明

图1为小鼠免疫效果鉴定；

图2为单克隆抗体亚克隆后的IFA结果；

图3为单克隆抗体EU1与各类型PRRSV的IFA反应结果；

图4为单克隆抗体EU1的纯化结果；

图5为阴阳性样品临界值分析；

图6为EU-C-ELISA特异性试验结果；

图7为EU-C-ELISA与市售欧洲型PRRSV ELISA试剂盒特异性比较；

图8为EU-C-ELISA与市售PRRSV ELISA试剂盒敏感性比较。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1特异性识别EU-type PRRSV的单克隆抗体制备

1材料

1.1病毒、细胞和实验动物

用于免疫的病毒抗原为ZD1株。用于免疫荧光进行单抗特异性分析的毒株包括：HuN4-F112株(HP-PRRSV，Lineage 8)、CH-1R株(经典毒株，Lineage 8)、SD-R株(类NADC30PRRSV，Lineage 1)、LNTZJ1341(类NADC34 PRRSV，Lineage 1)、HNTZJ1714(类QYYZ PRRSV，Lineage 3)、RespPRRS MLV株(经典美洲型毒株，Lineage 5)、ZD1株(欧洲株)、DV株(欧洲株)、HBL株(欧洲株)。非洲绿猴肾细胞Marc-145、SP2/0骨髓瘤细胞为本实验室保存；清洁级雌性BALB/c小鼠购自维通利华公司。

1.2主要试剂

融合剂PEG/DMSO(Mw，1450)、HAT盐(50x)、HT盐(50x)、FITC标记的羊抗鼠IgG、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司；HRP标记的羊抗鼠IgG购自索莱宝公司；DMSO购自Ameresco公司；DMEM购自Gibco公司；进口优级胎牛血清(PAA)购自西班牙Nalgene公司；96孔细胞培养板购自加拿大JET Biochemical公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotech公司。

2方法

2.1单克隆抗体制备

2.1.1小鼠免疫

(1)免疫原的制备与纯化

将EU-type PRRSV ZD1株接种长满单层的Marc-145细胞，待80％以上细胞出现病变后，取培养细胞的上清液，4℃10000rpm/min离心50min，收集上清，随后4℃35000rpm/min超离4h。离心后弃去上清，用PBS将沉淀溶解重悬，PBS重悬沉淀后再次低速离心，收集上清通过分子筛纯化病毒，再将收集的液体进行超滤浓缩利用BCA测其蛋白含量并储存在-80℃中备用。

(2)免疫

取上述纯化后的EU-type PRRSV ZD1株作为免疫原，100μg/100ul加等体积弗氏完全佐剂，充分乳化后经腹部皮下注射6周龄雌性BALB/c小鼠；2周后进行第2次免疫，佐剂为弗氏不完全佐剂；2周后，以不加佐剂的等量抗原进行第3次免疫。在3免1周后，用EP管采集小鼠尾静脉血，并进行血清分离。利用无菌PBS对小鼠血清进行倍比稀释，IFA方法检测免疫情况，并以阴性鼠血清作为阴性对照，以实验室保存EU-type PRRSV单克隆抗体2C6作为阳性对照，稀释度达到1：5000后仍可见明显荧光的视为免疫成功，可以继续进行加强免疫。为刺激小鼠快速产生强烈免疫反应，于融合前3d进行加强免疫，注射二倍剂量的抗原。

2.1.2细胞融合

(1)骨髓瘤细胞的制备：融合前36～48h，将骨髓瘤细胞扩大培养，使细胞处于对数生长期。融合当天，将准备的3个75T细胞瓶的SP2/0细胞用20mL DMEM吹下后置于50mL离心管，备用。

(2)免疫脾细胞的制备：融合前摘除小鼠眼球采血，收集阳性血清并冻存。脱颈处死后放入75％酒精中消毒5min，注意消毒时间不宜过长。将小鼠倒卧在解剖板上，腹腔朝上，固定四肢。用消毒后的剪刀轻轻剪开腹腔，找到小鼠脾脏，用消毒后的镊子缓慢剥离周边组织，将脾脏取出，置于细胞培养皿中，再将四周结缔组织完全剥离。

用1mL注射器针头在小鼠脾脏上刺若干小孔，再用注射器吸取20mL DMEM培养基插入小鼠脾脏轻轻注射，脾细胞会随DMEM流出。收集流出的DMEM于50mL离心管中备用。

(3)脾细胞与骨髓瘤细胞融合：将SP2/0细胞和上一步准备的脾细胞1500rpm离心4min。离心后分别弃去上清液，再用10mL DMEM将两种细胞重悬并混合均匀，再1500rpm离心4min。取出后弃上清，震荡离心管，将底部细胞荡下，并使两种细胞完全混合。

将上述离心管放入装有37℃蒸馏水的烧杯中，吸取提前预热的PEG 1mL缓慢滴入离心管中(约1min滴完)，整个滴加过程要时刻晃动离心管混匀管中液体，随后静置1.5min。吸取1mL 37℃预热DMEM缓慢滴入管中，1min左右滴完，并不停晃动混匀。再吸取1mL预热DMEM缓慢滴入管中，30s左右滴完，并不停晃动混匀。在后续的2min不断加入预热DMEM并震荡混匀，补齐管中液体至10mL，1500rpm离心4min。用80mL含有10％Clone Easy和20％FBS的DMEM将细胞重悬后铺入4块96孔细胞培养板，每孔200μL，置37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

2.1.3阳性杂交瘤细胞的筛选及亚克隆

在融合后7～10d用显微镜观察96孔板中的细胞，待融合后的细胞在底部长成细胞团，细胞团的大小大约达到每个孔的1/4面积时，进行间接免疫荧光检测。将孵育后的载玻片利用荧光显微镜进行观察，视野中的细胞可见明显绿色荧光即为阳性，记录阳性孔的位置，利用有限稀释法和流式分选进行杂交瘤细胞亚克隆。亚克隆7～10d后，对间接免疫荧光阳性孔再次进行亚克隆，整个过程重复3～4次，当长有杂交瘤细胞的96孔板检测阳性率达到100％时，挑取1个孔进行逐步扩大培养，最后扩大至75T细胞瓶中大量冻存。

2.2单克隆抗体鉴定

2.2.1单克隆抗体的亚类鉴定

将筛选的EU1株用SBA Clonotyping^TM System/HRP按试剂盒说明书对其Ig亚类进行鉴定。

2.2.2单克隆抗体的特异性鉴定

将HuN4-F112株(HP-PRRSV，Lineage 8)、CH-1R株(经典毒株，Lineage 8)、SD-R株(类NADC30 PRRSV，Lineage 1)、LNTZJ1341(类NADC34 PRRSV，Lineage 1)、HNTZJ1714(类QYYZ PRRSV，Lineage 3)、RespPRRS MLV株(经典北美型毒株，Lineage 5)、ZD1株(欧洲株)、DV株(欧洲株)、HBL株(欧洲株)接种Marc-145细胞各两孔，在细胞出现10％CPE时，用PBS清洗两遍，再用无水乙醇固定半小时，倒掉后再用PBS清洗两遍。分别加入100ul单克隆抗体1C8/2C6的混合上清和EU1单抗上清，37℃孵育1h后用PBS洗涤3次，加入100ul1:200稀释的FITC标记羊抗鼠IgG抗体，37℃温育30min，洗涤后在倒置荧光显微镜下观察荧光强度。

2.2.3单克隆抗体的抗原性鉴定

取杂交瘤细胞EU1株细胞的培养上清，用DMEM将细胞培养上清按照1：1、1：2、1：4、1：8稀释后备用。

用碳酸盐缓冲液(0.05mol/L，pH值9.6)稀释灭活并纯化后的ZD1病毒，加入96孔酶联反应板，100μl/孔，置4℃包被过夜。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μl重复洗涤3次，拍干。每孔加入1％BSA封闭液300μl，置37℃封闭2h。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μl重复洗涤3次，拍干。

每孔加入稀释后EU1上清液100μl，同时设DMEM为阴性对照，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μl重复洗涤3次，拍干。每孔加入羊抗鼠IgG酶标抗体(1∶10000倍稀释)100μl，置37℃孵育30min。弃去孔内液体，每孔加入PBST 300μl，重复洗涤3次，拍干。每孔加入TMB底物溶液100μl，置37℃显色(避光孵育)15min。每孔加入终止液50μl，轻微震荡混合均匀后，在波长为450nm用酶标仪读取OD450nm值(应在加入终止液后15min内完成读数)，并记录结果。P/N比值大于2.1(P/N＝被检样品OD450nm值/阴性对照OD450nm值)，判为阳性。

2.2.4特异性识别EU-type PRRSV的单克隆抗体纯化

采用辛酸-饱和硫酸铵法对制备的腹水进行纯化，操作步骤简述如下：

(1)取3ml预处理过的腹水加6ml 0.06mol/L PH4.8醋酸缓冲液；腹水中加99ul辛酸室温搅拌30分钟，4℃静置2小时以上；取出11000rpm离心30分钟，弃沉淀；上清用2mol/LNaOH调PH至7.4。

(2)在4℃条件下加入饱和硫酸铵至50％饱和度，冰浴搅拌作用30分钟，4℃静置2小时以上；11000转离心30分钟，弃上清；沉淀溶于5ml 0.1M的PH7.4的PBS中；

(3)向沉淀悬浮物中边搅拌边加适量饱和硫酸铵溶液，使硫酸铵溶液中浓度为30％-40％，冰浴搅拌作用30分钟，4度静止2小时以上；11000转离心30分钟，取沉淀，将沉淀融入2ml 0.1M的PH7.4的PBS中；

(4)将沉淀悬浮液装入透析带中，在4℃用0.1M的PH7.4的PBS透析，2小时换液一次，透析2天。透析完成后，回收透析袋中的纯化腹水，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。

再用DEAE-Sephadex A-50(GE公司)柱层析进一步纯化单克隆抗体，回收纯化后的单克隆抗体，紫外分光光度计测定蛋白浓度，用SDS-PAGE进行纯度检测。

3结果

3.1一株特异性针对欧洲型PRRSV的单克隆抗体筛选

3.1.1免疫效果鉴定

对免疫三次后的小鼠进行尾部采血，1：5000稀释后利用IFA方法进行检测，结果显示，随机选择的三只小鼠均免疫成功可以进行加强免疫及细胞融合(图1)。

3.1.2单克隆抗体筛选

细胞融合10d后利用IFA方法检测杂交瘤细胞培养液上清，并将阳性孔亚克隆3次，每个亚克隆过程中都要对细胞培养液上清进行IFA检测，直至96孔板均为阳性，成功制备了能够分泌PRRSV特异性抗体的杂交瘤细胞系(图2)，制备单克隆抗体细胞系命名为EU1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC NO.23019。

3.2特异性识别欧洲型PRRSV单克隆抗体EU1的鉴定

3.2.1单克隆抗体的亚类鉴定

利用抗体亚类鉴定试剂盒对EU1进行抗体亚类鉴定，鉴定结果显示EU1重链为IgG2a，轻链为K链。

3.2.2单抗EU1特异性检测

EU1特异性检测结果显示，EU1与美洲型PRRSV毒株HuN4-F112株(HP-PRRSV，Lineage 8)、CH-1R株(经典毒株，Lineage 8)、SD-R株(类NADC30 PRRSV，Lineage 1)、RespPRRS MLV株(经典北美型毒株，Lineage 5)、LNTZJ1341株(类NADC34 PRRSV，Lineage1)、HNTZJ1714株(类QYYZ PRRSV，Lineage 3)均不反应，与欧洲型毒株ZD-1、DV和HBL株均反应良好(图3)。表明EU1仅与欧洲型PRRS毒株反应，而不与美洲型PRRS毒株反应。

3.3欧洲型PRRSV单克隆抗体EU1腹水纯化

经过纯化后的抗体利用紫外分光光度计对其蛋白浓度进行检测，结果为2.16mg/ml，经SDS-PAGE电泳检测显示，EU1获得较好的纯化，基本去除腹水中的杂蛋白，单克隆抗体的重链和轻链条带清晰(图4)。

实施例2特异性鉴定EU-type PRRSV抗体竞争ELISA方法的建立

1 EU-type PRRSV抗体竞争ELISA方法的建立

(1)抗原包被：以每孔455ng的纯化灭活病毒包被ELISA板，4℃过夜。

(2)封闭：取出包被好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干；加入300μl/孔封闭液，置37℃恒温培养箱孵育2h。从温箱中取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干。

(3)待检血清及一抗孵育：将待检血清与EU1单克隆抗体(实施例1制备)1：1混合后加入ELISA板，每孔加入100μl，同时设阳性血清和阴性血清做对照，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干。

(4)二抗孵育：将HRP-羊抗鼠IgG用PBST做10000倍稀释，每孔加入100μl，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干。

(5)底物显色：加入底物TMB进行显色，每孔加入100μl，置37℃恒温培养箱避光作用15min。

(6)终止反应：每孔加入50μl 2M H₂SO₄进行终止，酶标仪450nm处测量吸光度A值(OD450nm值)。

(7)计算血清抑制率：血清抑制率(％)＝(阴性对照OD450nm值-待检血清OD450nm值)/阴性对照OD450nm值×100％。

2 EU-C-ELISA与市售试剂盒的比较

(1)特异性比较

利用EU-C-ELISA方法与世纪元亨、Hipra、IDEXX和金诺市售试剂盒分别检测HP-PRRSV疫苗株、类NADC30 PRRSV、类NADC34 PRRSV、RespPRRS MLV和欧洲株感染后的血清，比较EU-C-ELISA与市售试剂盒的特异性。

(2)敏感性比较

将欧洲型PRRSV ZD1株免疫后的血清分别进行2倍倍比稀释，用EU-C-ELISA与世纪元亨、Hipra、IDEXX和金诺市售试剂盒分别进行检测，比较EU-C-ELISA与市售试剂盒的敏感性。

3结果

3.1包被抗原的制备

分子筛纯化后的ZD-1全病毒(已灭活)经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度为455ng/μL。

3.2 EU-C-ELISA方法的建立及反应条件的确定

经方阵滴定法建立的EU-C-ELISA方法的最佳反应条件见表1。

表1 EU-C-ELISA检测方法反应条件优化

3.3 EU-C-ELISA临界值的确定

按优化后的EU-C-ELISA方法检测586份阴性血清和213份欧洲型PRRSV阳性血清，MedCalcv15.8软件分析结果显示，临界值为45％，敏感性为97.7％，特异性为100％(图5)。因此，当血清样品的PI≥45％时，判定结果为阳性，当血清样品的PI<45％时，判定为阴性。

3.4 EU-C-ELISA特异性试验结果

利用该EU-C-ELISA方法检测副猪嗜血杆菌(HPS)、链球菌(SS)、传染性胸膜肺炎(APP)、传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、NADC30-like PRRSV SD-R株和WK108株、VR2332-like PRRSVSD192株、NADC34-like PRRSV DZD32-1901株、经典毒株CH-1R株、HP-PRRSV HuN4-F112株、欧洲型PRRSV ZD1株、WG9株和WK14株的阳性血清，结果显示该方法仅能与欧洲型PRRSV阳性血清特异性竞争包被抗原，美洲型各谱系毒株及其它猪病毒和细菌阳性血清PI值均远低于临界值(图6)，结果表明本研究建立的EU-C-ELISA方法能够特异性识别欧洲型PRRSV产生的抗体。

3.5 EU-C-ELISA重复性试验结果

利用建立的EU-C-ELISA方法，进行重复性试验，结果显示批内和批间重复试验变异系数均小于5％(表2)，表明该方法具有较好的重复性。

表2 EU-C-ELISA方法批内和批间重复性实验(n＝5)

3.6 EU-C-ELISA与市售试剂盒的比较

3.6.1 EU-C-ELISA与市售试剂盒特异性比较

利用本研究建立的EU-C-ELISA方法与两种市售欧洲型PRRSV ELISA抗体试剂盒进行比较，美洲型PRRSV NADC30-like PRRSV SD-R株(L1.8)、VR2332-like PRRSV SD192株(L5.1)、NADC34-like PRRSV DZD32-1901株(L1.5)、经典毒株CH-1R株(L8.7)、HP-PRRSVHuN4-F112株(L8.7)动物实验阳性血清中各选取5份进行检测，结果表明两种市售欧洲型抗体检测试剂盒均与部分美洲型PRRSV抗体存在交叉反应，欧洲型抗体检测试剂盒EU-PRRSVELISA(1)阳性率为20％，欧洲型抗体检测试剂盒EU-PRRSV ELISA(2)阳性率为50％，本发明建立的EU-C-ELISA方法检测均为阴性(图7)。

3.6.2 EU-C-ELISA与市售试剂盒敏感性比较

利用建立的EU-C-ELISA方法检测2倍倍比稀释的欧洲型PRRSV ZD-1株阳性血清，结果显示PRRSV阳性血清稀释倍数为1:16时抑制率仍大临界值；欧洲型抗体检测试剂盒EU-PRRSV ELISA(1)和EU-PRRSV ELISA(2)分别能检出最高4倍和2倍稀释的血清，IDEXX试剂盒和金诺试剂盒分别能检出最高8倍和2倍稀释的欧洲型PRRSV标准阳性血清(图8)，以上结果表明本发明建立的EU-C-ELISA方法具有更高的敏感性。

Claims (7)

1.分泌欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndromevirus,PRRSV)特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞系，其特征在于，所述的杂交瘤细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCC NO.23019，保藏时间为2021年8月4日。

2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞系分泌产生的特异性针对欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒试剂中的用途。

4.一种用于鉴别诊断欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求2所述的单克隆抗体。

5.如权利要求4所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括灭活的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒包被的ELISA板、HRP标记的羊抗鼠IgG、封闭液、洗涤液、稀释液、显色液以及终止液。

6.如权利要求5所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒用于鉴别诊断欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒感染时，按照以下步骤进行：

(1)抗原包被：以纯化灭活的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒包被ELISA板，4℃过夜；

(2)封闭：取出包被好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干；加入300μl/孔封闭液，置37℃恒温培养箱孵育2h；从温箱中取出封闭好的ELISA板，PBST洗涤3次，拍干；

(3)待检血清及一抗孵育：将待检血清与EU1单克隆抗体1：1混合后加入ELISA板，每孔加入100μl，同时设阳性血清和阴性血清做对照，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干；

(4)二抗孵育：将HRP标记的羊抗鼠IgG用PBST做10000倍稀释，每孔加入100μl，37℃恒温培养箱孵育30min，PBST洗涤3次，拍干；

(5)底物显色：加入底物TMB进行显色，每孔加入100μl，置37℃恒温培养箱避光作用15min；

(6)终止反应：每孔加入50μl 2M H₂SO₄进行终止，酶标仪450nm处测量吸光度A值；

(7)计算血清抑制率：血清抑制率(％)＝(阴性对照OD450nm值-待检血清OD450nm值)/阴性对照OD450nm值×100％。

7.如权利要求6所述的抗体竞争ELISA试剂盒，其特征在于，纯化灭活的欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒包被ELISA板的包被浓度为455ng/孔，封闭液为1％w/v BSA。

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