CN101979512A - 抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用。本发明提供了一种保藏号为CGMCC No.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3。本发明还提供了一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3产生。本发明的实验证明，用纯化的PRRSV JXA1株免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术，筛选出1株能稳定分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对其进行生物学特性鉴定，为进一步建立特异、敏感、快速的PRRSV检测方法奠定了基础。

Description

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是目前重要的猪传染病之一，本病以母猪发热、厌食、不孕、流产、产死胎、木乃伊胎、产弱仔及仔猪呼吸道症状和高死亡率为特征，俗称“蓝耳病”。该病1987年首先在美国爆发，造成严重经济损失，引起了国际上的广泛关注。我国于1996由郭宝清等从发病猪群分离病毒并确认为猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)。目前本病毒已造成我国很多省市猪群地方性流行。2006年，田克恭等确诊我国猪群发生的“猪无名高热征”主要是由变异的PRRSV感染引起，并分离出病毒，命名为PRRSV JXA1，该病表现出的特征：高热、高发病率、高死亡率，和较低的低治愈率。猪繁殖与呼吸综合征超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1，在专利ZL200710086549.7中公开，保藏号为：CGMCC No.1964。

PRRSV属于尼多病毒目，动脉炎病毒科，动脉炎病毒属，有囊膜的单股正链RNA病毒，直径50-65nm，基因组全长为约15kb。根据其病毒基因组和血清型特性，主要分为美洲型(ATCC VR-2332型)和欧洲型(LV型)，我国流行的主要为美洲型毒株。

目前对猪繁殖与呼吸综合征的检测技术包括：病毒分离、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)、间接免疫荧光(IFA)、RT-PCR等方法，但检测所需时间长，成本昂贵。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体及应用。

本发明提供了一种保藏号为CGMCC No.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3。

本发明还提供了一种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNo.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3产生。

所述的单克隆抗体在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒检测病毒抗原中的应用也是本发明保护的范围。

所述检测猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原方法包括间接免疫荧光检测法、抗原捕获酶联免疫检测法、免疫组织化学检测法或试纸条检测法。

所述试纸条检测法包括胶体金检测法或酶标检测法。

所述免疫组织化学检测法中，酶标抗体为羊抗鼠辣根过氧化物酶，显色用AEC酶底物显色试剂盒，样本为疑似PRRSV猪病料组织如肺、扁桃体、淋巴结等。

所述的单克隆抗体在检测猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用；或所述的单克隆抗体在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用，上述应用均是本发明保护的范围。

含有所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒也是本发明保护的范围；或含有所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速检测试纸条也是本发明保护的范围。

经筛选得到能稳定分泌的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3，该杂交瘤细胞株3C3的分类命名为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，已于2010年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4109。

本发明的实验证明，用纯化的PRRSV JXA1株免疫BALB/c小鼠，利用杂交瘤技术，筛选出1株能稳定分泌抗PRRSV单克隆抗体的杂交瘤细胞，并对其进行生物学特性鉴定，为进一步建立特异、敏感、快速的PRRSV检测方法奠定了基础。

附图说明

图1为单抗腹水IPMA阳性照片

图2为单抗腹水IPMA细胞对照照片

图3为3C3单克隆抗体蛋白免疫印迹结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、单克隆抗体的制备和生物学特性的测定

一、单克隆抗体的制备

1、毒种和细胞

猪繁殖与呼吸综合征超强变异株(Nsp21594-1680变异株)NVDC-JXA1CGMCCNo.1964，以下简称PRRSV JXA1株。

PRRSV JXA1株、Marc-145细胞、SP2/0细胞由中国动物疫病预防控制中心保存。

2、病毒增殖和纯化

PRRSV JXA1株接种已长成单层的Marc-145细胞，37℃吸附1h，加入维持液，待75％以上细胞出现细胞病变(CPE)时收获病毒，将收获的病毒液反复冻融三次，以6000rpm离心30min，收集上清液，在上清液加入PEG 6000(终浓度8％)4℃过夜搅拌，10000rpm离心60min。沉淀用1％原体积的PBS溶解，再经不连续蔗糖密度梯度40000rpm超速离心3h，收集提纯的病毒条带作为免疫原和ELISA检测用纯化PRRSV JXA1株病毒蛋白，以同方法处理、纯化不接毒正常培养Marc-145细胞作为对照蛋白，紫外分光光度计测其蛋白含量，-30℃保存备用。

3、BALB/c小鼠免疫

选择6-8周龄雌性BALB/c小鼠。用纯化的PRRSV JXA1株与等体积弗氏完全佐剂(Sigma公司，目录号为F5881)乳化均匀后，腹腔及背部皮下多点注射BALB/c小鼠，100μg/只；首免后第2周和第4周分别用用纯化的病毒与等体积弗氏不完全佐剂(Sigma公司，目录号为F5506)乳化后进行二免和三免；最后一次免疫2周后采血用间接ELISA测血清抗体效价。待ELISA效价达1∶10⁵以上时进行细胞融合。融合前3天，尾静脉或腹腔注射100μg不加佐剂的抗原液进行加强免疫。

4.骨髓瘤细胞(SP2/0)的培养

融合前36-48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养于75cm²细胞瓶内。融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000rpm离心5min，然后用DMEM营养液(GIBCO公司，目录号为12800-017)重新悬浮，取少量台盼蓝染色计数，保证细胞成活率大于90％以上，用于细胞融合。

5、免疫脾细胞的制备

在加强免疫后第三天取免疫小鼠，摘除眼球放血并分离血清作为抗体检测时阳性对照；将颈椎脱臼处死的小鼠置75％酒精中浸泡5min，置超净工作台蜡盘内；无菌取出小鼠脾脏，放入盛有10mL DMEM营养液的平皿中，轻轻漂洗，除去附着的结缔组织与脂肪；用剪刀剪碎脾脏，置于200目铜网上，用注射器内芯研磨脾脏，并用DMEM营养液冲洗使脾细胞全部通过网孔进入溶液中；将脾细胞溶液转入50mL离心管中，加DMEM营养液至30mL，混匀，1000rpm离心5min，弃上清液；同法离心、洗涤细胞一次，然后将细胞悬于10mL DMEM营养液中混匀；取上述细胞混悬液进行台盼蓝染色计数备用。

6、饲养细胞的制备

细胞融合的当日或前一日，将未经免疫的BALB/c小鼠(8-12周龄)眼球采血，颈椎脱臼处死，浸泡于75％酒精5min，置超净工作台蜡盘内，腹部向上固定；将BALB/c小鼠皮肤用消毒镊子提起，小心剪开腹部皮肤，分离皮肤与腹膜，充分暴露腹膜；用无菌注射器吸取适量DMEM营养液注入腹腔，按摩腹部，待腹腔细胞与注入的营养液充分混合后，轻轻吸回营养液加入无菌离心管内，重复冲洗2-3次；所得液体1000rpm离心5min，弃上清液。向沉淀中加入10mL DMEM营养液，重新吹散细胞，取上述细胞混悬液进行台盼蓝染色计数；用含HAT(Sigma公司，目录号H0262)的培养液悬浮细胞，调整细胞浓度为1-2×10⁵个/mL，加入96孔细胞培养板中(100μL/孔)，置于37℃、5％CO₂的培养箱中培养备用。

7、细胞融合

按常规方法将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞按5-10∶1比例混合于离心管内，1000rpm离心8min，弃上清液，轻轻弹击管底，使沉淀细胞松散均匀成糊状；用1mL移液管吸取预热至37℃的50％PEG(WT 1450Sigma公司，目录号P5402)(PH8.0)溶液1mL，沿转动的管壁缓缓滴入，控制在60s加完，然后将细胞悬液吸入移液管(时间控制在30s左右)，静置30s，再将其吹入离心管内(时间也控制在30s左右)；在5min内向离心管内加入25mL DMEM营养液终止融合作用；将融合后的细胞液1000rpm离心5min，弃上清液，用37℃水浴预热的含HAT培养液重悬；加入有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，置37℃、5％CO₂的培养箱中培养。每天记录细胞生长情况，融合后第四天，用1％HAT选择培养液半量换液，约7-10天，改用1％HT(Sigma公司，目录号H0137)选择培养液半量换液继续培养。

8、阳性杂交瘤细胞的筛选及克隆化

每天观察细胞的生长情况，融合后3-5天，可见有克隆细胞生长，待细胞集落生长至孔底的1/3-1/2时，对其上清液用间接ELISA和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)方法进行检测，对检测出特异性抗体阳性孔的细胞，以有限稀释法克隆三次，使阳性率达100％，注意及时冻存细胞，然后扩大培养以制备腹水，并将一部分细胞连续传代、冻存、复苏，观察细胞分泌单克隆抗体的稳定性。

经间接ELISA筛选并用进口LSI-PRRS商品化抗体检测试剂盒(法国LSI公司)和IPMA进行鉴定，3次亚克隆化获得了1株稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为3C3。该细胞株具有双亲代的生物学性质，腹腔接种给BALB/c小鼠后可以形成肿瘤，并稳定地产生特异性抗体，经稳定传代3个月后冻存于液氮中，3个月、6个月后复苏细胞生长良好，抗体分泌水平未见降低。

经筛选得到能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C3，该杂交瘤细胞株3C3的分类命名为抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞，已于2010年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4109。

9、单克隆抗体的制备

将筛选得到能稳定分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109采用扩大培养或同系小鼠体内诱生腹水法进行单克隆抗体的制备。

1)细胞扩大培养法进行单克隆抗体的制备：

采用生物反应器发酵培养法进行分泌抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109的大量培养，当细胞浓度达2×10⁶个细胞/mL以上时，采用边自动添加新鲜培养基边自动收集的方式收集培养的杂交瘤细胞3C3CGMCC No.4109上清液，3000rpm离心10min，将收集的细胞上清液进行超滤浓缩，得到浓缩的单克隆抗体(细胞上清液)。上述发酵培养中的培养基为GIBCO公司DMEM培养基，目录号为12800-017，培养时间7天-21天，培养条件：温度37℃，溶氧60％-80％，PH 7.2。

2)同系小鼠单克隆抗体腹水的制备：

选择20g以上BALB/c小鼠，每只腹腔内注射灭菌液体石蜡0.5mL；14d后，小鼠腹腔接种杂交瘤细胞3C3CGMCC No.4109(3-5×10⁵个细胞/只)；植入细胞后第7天起，每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，用9^#针头穿刺腹腔，采集腹水，一般可连续采集3-6次，将腹水以3000rpm离心10min，去除油脂和沉淀，收集上清液，测定抗体效价后，-30℃保存备用，得到单克隆抗体(腹水)。

10、单克隆抗体的纯化

将步骤9得到单克隆抗体(腹水)先进行预处理：加入鹿角胶(Sigma公司)和CaCl₂除去油脂类杂质和部分杂蛋白，12000rpm离心30min，再将上清液用0.22μm微孔滤膜(MILLIPORE公司)过滤，加入等体积0.01M PH 7.4的PBS缓冲液，用ProteinG Sepharose 4B层析柱(Amersham Biosciences公司)分离纯化，收集蛋白洗脱峰，以0.01M PH 7.4的PBS透析过夜，用截留分子量为30kD的滤膜(MILLIPORE公司超滤浓缩，得到纯化的单克隆抗体(腹水)，紫外分光光度计测其蛋白含量，-30℃保存备用。

将步骤9得到的浓缩的单克隆抗体(细胞上清液)按照上述方法直接进行纯化，得到纯化的单克隆抗体(细胞上清液)。

二、单克隆抗体的生物学特性的测定

1、抗体类及亚类的鉴定

按照SBA Clonotyping System/AP kit单抗亚型鉴定试剂盒(SouthernBiotechnology Associates，Inc.)说明书对上述步骤一得到的单克隆抗体进行类及亚类的鉴定。

结果为杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109分泌的单克隆抗体的重链为IgG_2a，轻链为kappa链。

2、ELISA效价的测定

用上述一得到纯化的PRRSV JXA1株病毒蛋白和Marc-145细胞对照蛋白(将蛋白用PH 9.6的碳酸盐缓冲液稀释成2μg/mL)包被酶标板100μL/孔，4℃过夜。用含3％BSA的PBST(0.01M PH 7.4含0.05％(体积百分比)Tween20的PBS)37℃封闭2h；用PBST溶液洗涤3次，分别加入10倍系列稀释(稀释液为0.01M PH 7.4的PBS)由步骤一得到的单克隆抗体(细胞上清液)和单克隆抗体(腹水)，100μL/孔，37℃孵育1h；用PBST溶液洗涤5次后加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠二抗(JacksonImmunoResearch，Inc.1∶5000稀释)100μL/孔37℃孵育1h；用PBST溶液洗涤5次后加入TMB(四甲基联苯胺)和过氧化氢的混合物(1∶1体积比混合)100μL/孔，37℃孵育显色15min。每孔加入50μL 0.2M的H₂SO₄终止反应，轻轻振荡混匀，用酶标仪测定每孔吸光度值(OD450值)，以实验组的OD_450nm/对照组的OD_450nm＞2.1的孔判为阳性(即P/N＞2.1时的最高稀释倍数为效价判定终点)。

采用步骤一中的方法制备SP2/0细胞培养上清液和SP2/0细胞腹水，作为阴性对照。

结果见表1和表2所示，由杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109得到的单克隆抗体细胞上清液和腹水与PRRSV JXA1株病毒蛋白的ELISA抗体滴度在1∶10⁴和1∶10⁷。

表1腹水间接ELISA检测OD值

表2细胞上清液间接ELISA检测OD值

3、免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)

将PRRSV JXA1株接种Marc-145细胞，待70％细胞出现细胞病变时收获细胞涂片，冷丙酮(4℃)固定，置-20℃保存备用。同时涂正常细胞(Marc-145细胞)作为对照。以上述步骤一得到的单克隆抗体(细胞上清液)和单克隆抗体(腹水)进行不同倍数稀释后，加入细胞涂片孔内，湿盒内37℃孵育30min，0.01M PH 7.4PBS漂洗3次，加入适当稀释的羊抗鼠辣根过氧化物酶(JacksonImmunoResearch，Inc.)湿盒内37℃孵育30min，PBS漂洗3次，加入AEC酶显色底物(北京中杉金桥生物技术有限公司)室温显色10min，PBS漂洗、吹干，光学显微镜下观察。以出现棕黄色至棕褐色判为阳性反应。

结果见图1和图2所示，图1为单抗腹水IPMA阳性照片，图2为单抗腹水IPMA细胞对照照片，可以看出，与对照相比，单克隆抗体(腹水)出现棕黄色至棕褐色。经过IPMA方法检测，单克隆抗体(细胞上清液)的IPMA抗体效价在1∶640，单克隆抗体(腹水)的IPMA效价在1∶5120。

4、杂交瘤细胞染色体数目检测

用传代培养3d处于对数生长期的上述一得到的抗PRRSV的单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109制片、染色后选择染色体分散良好、无重叠、无失散的细胞进行观察分析，记录其染色体数目。

结果为抗PRRSV的单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109的染色体数在90-112范围内变化，平均为102，该数值大于脾细胞染色体数(40)的2倍，小于脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和，表明抗PRRSV的单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109确为脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成。

5、单克隆抗体分泌稳定性测定

上述一得到的抗PRRSV的单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3CGMCC No.4109连续传代3个月代及液氮冻存后复苏，取培养上清液，按照步骤2中所述方法检测其抗体ELISA效价，以SP2/0细胞正常培养液为阴性对照。

结果抗体效价与上述步骤2的结果无显著差异，说明单克隆抗体分泌稳定性高。

6、单克隆抗体的抗原位点识别分析

将上述一得到的纯化的PRRSV JXA1株病毒蛋白和Marc-145细胞对照蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转印到硝酸纤维素膜(Nitrocellulose Membrane，NC)上进行蛋白免疫印迹(Western-Blot)分析。抗体为上述一的步骤9得到的单克隆抗体(细胞上清液)。

结果见图3所示，M：标准分子量预染蛋白；1.Marc-145细胞对照蛋白；2.PRRSVJXA1株病毒蛋白，可以看出，单克隆抗体(细胞上清液)与PRRSV JXA1株病毒蛋白在约19KD处出现一条清晰并且单一的条带，与Marc-145细胞对照蛋白无反应。

采用同样的方法检测单克隆抗体(腹水)，结果无显著差异。

7、单克隆抗体特异性鉴定

用间接ELISA法(按照商品化试剂盒说明书步骤操作，二抗为羊抗鼠酶标二抗)测定由一得到的单克隆抗体(腹水)与猪细小病毒(PPV，荷兰CEDI公司试剂盒)、猪伪狂犬病毒(PRV，美国IDEXX公司试剂盒)、猪瘟病毒(HCV，美国IDEXX公司试剂盒)、猪圆环病毒2型(PCV-2，荷兰CEDI公司试剂盒)反应的OD值，以阴性SP2/0细胞腹水作对照。

结果表明，单克隆抗体(腹水)与PPV、PRV、HCV、PCV-2均不反应。

采用同样的方法检测单克隆抗体(细胞上清液)，结果无显著差异。

由以上实验数据显示，本发明的这种抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体具有特异性强、敏感性高、效价高，而且稳定，特别适合用于制备猪繁殖与呼吸综合征病毒的检测试剂盒。

实施例2、单克隆抗体的应用

1、制备胶体金快速检测试纸条

1)制备胶体金结合物垫：按常规方法制备胶体金颗粒，将由实施例1得到的纯化的单克隆抗体标记到胶体金颗粒表面，用胶体金稀释液稀释均匀后喷在裁好的玻璃纤维膜上，冷冻干燥。

2)喷制检测膜：在同一块硝酸纤维素膜上，用Bio-Dot喷膜机喷上纯化的单克隆抗体(检测线)、羊抗鼠IgG(对照线)，对照线与检测线间隔3-7mm，放温箱中干燥，取出后密封保存备用。

3)组装试纸条：将样品吸收垫(玻璃纤维膜)、结合物垫、喷有检测线(T线)和对照线(C线)的硝酸纤维素膜、吸收垫(吸水垫)以次粘贴在PVC底板(PVC等硬质薄板)上，用Bio-Dot切割机将组装好的试纸切成3-6mm宽的试纸条，固定于塑料支撑板上，装入有干燥剂的铝箔袋内，密封，室温保存，得到胶体金快速检测试纸条。

4)试验方法

将待检样品(疑似PRRSV猪的血清、血浆或组织研磨液)在试纸条的加样孔缓慢加入3-5滴，20min内观察结果。

结果判定：

阳性：试纸条的对照线区(C)和检测线区(T)各出现一条紫红色线。

阴性：试纸条只在对照线区(C)出现一条紫红色线。

无效：试纸条未出现紫红线。

2、临床样品的免疫组化检测

1)制作病理切片：采取疑似PRRSV猪病料组织如肺、扁桃体、淋巴结等，按常规制备冰冻切片或石蜡切片，进行固定。2)免疫组化检测：取制备好的病料切片，按常规方法进行检测，即：切片封闭——加入稀释单克隆抗体——洗涤——加入酶标抗体——洗涤——加入底物显色——显微镜观察。

稀释单克隆抗体为由实施例1得到的纯化的单克隆抗体(腹水)经过稀释液(稀释液为0.01M PH为7.4的PBS)稀释400倍。

酶标抗体为羊抗鼠辣根过氧化物酶(JacksonImmunoResearch，Inc.)，显色底物采用AEC酶底物显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

3)判定标准：阳性和阴性对照片背景无特异性着色，阳性对照组织细胞胞浆呈黄色至棕褐色着染，实验成立；备检组织细胞胞浆、偶见胞核呈黄色至棕褐色着染，即可判为PRRSV抗原阳性。

Claims (6)

1.保藏号为CGMCC No.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3。

2.由保藏号为CGMCC No.4109的抗猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株3C3产生的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备猪繁殖与呼吸综合征病毒检测试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速检测试纸条中的应用。

5.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的试剂盒。

6.含有权利要求2所述的单克隆抗体的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的胶体金快速检测试纸条。

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