CN111138535A

CN111138535A - 一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用

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Publication number: CN111138535A
Application number: CN202010069365.5A
Authority: CN
Inventors: 南雨辰; 周恩民; 武春燕
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-05-12
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111138535B

Abstract

本发明采用对PRRSV‑I和PRRSV‑II型病毒都具有中和活性的单克隆抗体5D9制作免疫增强剂，所形成的免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，IFN‑γ分泌T细胞显著升高，提示在灭活病毒免疫过程中，PRRSV特异性抗体5D9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强CTL反应。动物试验表明，本发明制备的免疫复合物的免疫保护率相比仅采用商业化佐剂ISA 206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。

Description

一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用

技术领域：

本发明属于生物领域，具体涉及一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用，可以用于猪繁殖与呼吸综合征的治疗药物的开发。

背景技术：

疫苗主要可分为减毒活疫苗，灭活疫苗以及通过基因工程技术表达的蛋白亚单位疫苗。在以上的三种类型疫苗中，灭活疫苗及蛋白亚单位疫苗安全性最高，但由于免疫进入机体后无法增殖，因此难以有效刺激宿主免疫系统，往往需要多次免疫，并且刺激机体所产生的免疫反应主要以体液免疫应答为主（抗体），难以刺激机体产生细胞免疫应答（杀伤性T细胞，CTL），因此对于一些病毒性传染病，灭活疫苗或亚单位疫苗保护效果存在缺陷。

IgM为机体在感染时产生的第一种抗体类型，与其他类型的抗体不同，IgM为五聚体结构，因此具有独特的生物学活性。IgM可以结合补体C1通过经典途径来激活补体反应，刺激局部的天然免疫应答，同时IgM可以通过其恒定区（Fc）结合抗原提呈细胞（APC）表面的Fc受体，来促进APC的抗原加工提呈能力，促进适应性免疫应答（体液免疫应答，细胞免疫应答）的启动。而我们认为，通过使用特异性识别抗原的IgM与抗原结合成为“IgM-抗原”复合物来免疫动物，可以增强机体免疫系统对于抗原的适应性免疫应答。

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndromevirus，PRRSV）引起的以母猪流产和仔猪呼吸障碍为主要特征的病毒性传染病，并能引起严重的免疫抑制。该病毒已在全球猪群中广泛传播，给世界养猪业造成了巨大的经济损失，已成为全球规模化猪场的主要疫病之一，也是全球猪病控制上的一大难题。现有的PRRSV的防控主要依靠减毒活疫苗和灭活疫苗，现有的证据显示减毒活疫苗的在生产实践中尽快可诱导机体产生免疫保护，但被免疫动物排毒（疫苗毒株），在免疫猪群中长期存在，毒力返祖以及与野生流行毒株重组等缺点。另一方面，尽管灭活疫苗安全性较好，但由于灭活疫苗免疫动物后刺激适应性免疫应答较弱，因此难以形成有效保护，市场接受度不高。

发明内容：

为了解决现有PRRSV灭活疫苗存在的问题，本发明鉴定出一株PRRSV广谱中和抗体5D9，对于PRRSV-I型和PRRSV-II型病毒均具有较高的中和活性，进一步将其制备成免疫增强剂，用于PRRSV疫苗的制备，所述广谱中和抗体5D9与灭活PRRSV病毒进行结合形成“IgM-灭活病毒”免疫复合物，所述“IgM-灭活病毒”复合物型疫苗对于疫苗诱导的细胞免疫应答的提升作用。

为解决以上技术问题，本发明采用如下技术手段;

一种免疫增强剂，所述免疫增强剂包含PRRSV广谱中和抗体5D9，所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9的编码DNA，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：

所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID No：3所示；

所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID No：4所示。

所述单克隆抗体5D9为IgM亚型。

本发明还请求保护所述免疫增强剂在制备PRRSV疫苗中的应用。

所述疫苗为PRRSV灭活疫苗或或亚单位疫苗。

本发明还请求保护一种免疫复合物，其是由广谱中和抗体5D9与灭活PRRSV病毒进行结合形成“IgM-灭活病毒”免疫复合物。

本发明还请求保护所述免疫复合物的制备方法，其特征在于，其是将PRRSV-SD16病毒粒子灭活后与单克隆抗体5D9（以质量计算）按照1:5-10的比例混合，37℃放置2小时形成复合物。

本发明还请求保护一种PRRSV灭活疫苗，所述灭活疫苗包含所述免疫复合物和佐剂。

优选的，所述佐剂为油包水佐剂，更优选为Montanide™ ISA 206。

基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：

本发明采用PRRSV病毒液-SD16作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经细胞融合，病毒感染Marc145细胞筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系，获得鼠单克隆抗体5D9。用ELISA技术测定该单克隆抗体5D9的亚型为IgM型单克隆抗体。PRRSV-I型和PRRSV-II型病毒感染Marc145细胞，利用IFA技术用该单克隆抗体进行检测，证明单克隆抗体5D9对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒具有广谱反应性。随后用其进行病毒中和实验，利用Westernblot技术和qPCR技术证明该单克隆抗体对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒都具有中和活性，可阻止病毒入侵，保护机体免受感染。试验表明，当“IgM-灭活病毒”免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，IFN-γ分泌T细胞显著升高（增加2倍），提示在灭活病毒免疫过程中，PRRSV特异性IgM-5D9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强CTL反应。动物试验表明，本发明制备的“IgM-灭活病毒”免疫复合物的免疫保护率相比仅采用商业化佐剂ISA 206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。

附图说明：

图1：单克隆抗体5D9病毒中和实验结果图：图1-A为Western blot检测结果，其中SD16表示PRRSV-SD16病毒；Isotype Control为同型对照组，即未感染PRRSV的小鼠IgM；N表示基于PRRSV-N蛋白检测表征的病毒繁殖水平；α-Tublin为α微管蛋白，作为Western blot内参。图1-B为基于荧光定量PCR检测PRRSV-N基因mRNA表达水平的检测结果。

图2：单克隆抗体5D9广谱反应活性测定结果图。

图3：单克隆抗体5D9广谱中和活性测定结果图。

图4：免疫流程图。

图5：小鼠抗体水平检测图。

图6：流式细胞仪分选图谱。

具体实施方式：

下面列出具体实施方案对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚得得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1：单克隆抗体5D9的制备和鉴定

1.1杂交瘤细胞系的建立

将PRRSV病毒SD16（由西北农林动物医学院免疫生物学实验室提供）作为免疫原，用弗氏完全佐剂（Sigma公司）1:1混合乳化，免疫6周龄雌性Balb/c小鼠（由西安交通大学提供），腹部皮下注射，剂量为（3×10^7 PFU/只），每14天加强免疫一次。第三次免疫后7天尾静脉采血用IFA检测小鼠血清中抗免疫原的抗体效价，效价最好的的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，免疫原用生理盐水1:1混匀，剂量为（3×10^7 PFU/只）。

1.2细胞融合

（1）无菌获取免疫后小鼠的脾细胞，以扩大培养好的小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）,两者比例5:1，将50ml离心管中脾细胞悬液和瘤细胞悬液1000rpm离心10min。

（2）离心后分别弃尽上清，各添加10ml不完全1640培养基，用吸管重新悬浮细胞，用吸管将10ml脾细胞悬液添加到10ml瘤细胞悬液中，充分混匀。1000rpm离心10min。离心完成后，弃上清，用手指轻轻弹击离心管底部，使细胞松散呈糊状，散在管底壁上。

（3）准备37℃水浴烧杯，将离心管置于烧杯中，右手用吸管吸取1ml PEG1500（Roche公司），沿离心管壁，尽量接近细胞处缓缓加入PEG，右手始终不停均匀转动离心管，时间控制在60s。

（4）轻轻摇晃，缓缓添加15ml培养基，终止融合，充分混匀，在水浴中静置5min。700rpm离心8min弃上清，添加HAT培养基10ml，补加HAT培养基至所需的量。用吸管将细胞悬液滴加在含有饲养细胞的96孔板中，每孔添加1滴，大约200μl每孔。添加完毕后，将96孔板置于37℃，5%CO₂温箱中培养。

1.3 挑克隆

融合后七天，显微镜下观察，选取已经出现大小适中的细胞团的孔，细胞量大约占孔1/2。检测前一天将Marc145铺板并感染PRRSV病毒，取融合成功孔的上清进行IFA试验检测筛选，阳性孔进行亚克隆筛选，并转入24孔板扩大培养并冻存，至到筛选出阳性的杂交瘤细胞。

1.4 杂交瘤上清培养法大量制备单克隆抗体

用RPMI-1640培养基（Gbico公司）大量培养筛选得的杂交瘤细胞，培养24h后取上清室温3000g离心10min去除其中细胞碎片。

1.5 单克隆抗体的纯化

（1）将离心去除完细胞碎片的上清与饱和硫酸铵等量混合，在4℃下沉淀30min。

（2）沉淀完成后，4℃下2500rpm离心30min，弃上清取沉淀，用20mM，pH8.0的Tris-HCL重悬，透析过夜。

（3）透析完后，2500rpm离心10min，弃上清。所得沉淀用PBS重悬。平衡好Protein LResin后，向柱中缓慢加入最终得到的重悬液样品，用PBS洗涤填料去除杂蛋白，直至洗涤液OD₂₈₀值至0.01。

（4）向Protein L Resin层析柱中加入甘氨酸洗脱目的蛋白，并立刻用1M Tris-HCL（pH8.0）按适中比例中和洗脱液至pH 7-8。最后将所得样品再次透析至PBS，4℃8h，重复3次，收集样品，即得到该发明所得的单克隆抗体5D9。

1.6 单克隆抗体的亚型鉴定和测序

（1）亚型鉴定：用亚型测定试剂盒（Sigma公司）进行测定，测得其亚型为IgM。

（2）单克隆抗体可变区序列测定：

1.6.1 总RNA提取：取10^6个细胞，Trizol裂解，加入氯仿分层获取RNA，异丙醇沉淀后用乙醇洗涤，干燥，用DEPC水溶解RNA。

1.6.3反转录PCR：取500ngRNA，加入Oligo（dT）,Random,dNTP及5×RT buffer，反转录酶（Takara公司），37℃25min，85℃5sec，4℃终止反应获得cDNA,之后进行PCR扩增。

1.6.3将扩增得到的重链和轻链可变区克隆至pMD18-T，送至公司测序，使用IMGT/V-QUEST数据库进行数据比对分析。经测序，

所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID No：3所示；

所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID No：4所示。

根据密码子编码规则，可知：

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

实施例2：单克隆抗体5D9的中和活性测定

2.1 中和活性测定

利用该单克隆抗体5D9进行病毒中和实验，以检测其中和活性。用PAM细胞铺至24孔板，分别接入0.01MOI不同型的PRRSV SD16病毒，每种病毒分别和100μg/ml，200μg/ml，300μg/ml，400μg/ml的抗体，37℃孵育1h之后换液，36h后进行Western blot和qPCR检测，确定其具有中和活性。具体结果参见图1。

基于图1的结果可知，使用PRRSV在宿主体内的天然靶细胞肺泡巨噬细胞（PAMs）在体外培养，使用纯化的单克隆抗体5D9按照0.05,0.1,0.2,0.4μM/mL（微摩尔每毫升）浓度与0.01M PRRSV-SD16病毒在37℃培养1小时，接种后PAMs，接种24小时后收集样品，分别通过western blot和荧光定量PCR检测PRRSV-N基因在蛋白和mRNA水平的表达，显示5D9单抗对PRRSV病毒的抑制作用呈现出剂量依赖型增加。

2.2单克隆抗体5D9广谱反应活性测定

分别用PRRSV-I和PRRSV-II型病毒感染Marc145细胞，用该单抗作为一抗进行IFA试验检测。具体检测结果参见图2。

基于图2的结果可知，使用PRRSV-II型病毒经典毒株（VR2332，CH1a），高致病PRRSV-2毒株（GD-HD，SD16），以及PRRSV-II经典毒株突变株VR2385，以及PRRSV-2新型突变毒株NADC30，和PRRSV-I型毒株GZ11感染MACR-145细胞，24小时后使用4%多聚甲醛溶液固定细胞，含有0.5% TritonX100的PBS对固定细胞进行破膜处理，使用5D9（红色荧光通道）和PRRSV多克隆猪阳性血清（绿色通道，阳性对照）对细胞进行免疫荧光染色后可发现5D9可识别所有PRRSV病毒所感染的MARC-145细胞，表明单克隆抗体5D9对PRRSV-I和PRRSV-II型病毒具有广谱反应性。

2.3单克隆抗体5D9广谱中和活性测定

挑选目前在国内广泛流行的代表性PRRSV毒株，高致病PRRSV（JXA1，GD-HD），经典PRRSV毒株（VR2332, CH1a）和突变毒株（VR2385，NADC30），以0.4微摩尔每毫升的剂量加入抗体37℃孵育后感染PAMs细胞，荧光定量PCR检测PRRSV-N基因表达，基于图3的结果可知，发现单克隆抗体5D9可广谱抑制不同PRRSV毒株的感染。

实施例3：

3.1 抗原的制备及与抗体的复合（以下以PRRSV病毒为例）

使用PRRSV-SD16毒株感染Marc145细胞，在病毒感染72小时后收集病毒培养上清液，将足够量的病毒培养上清以12000g离心力离心1小时去除细胞碎片，通过Labscale TFF 切滤仪使用100kD分子量滤膜（EMD Millipore公司)使用100kD分子量滤膜浓缩50倍，再通过液相色谱纯化PRRSV-SD16病毒粒子。

使用千分之一浓度的β-丙内脂处理病毒并于4度放置过夜灭活病毒，37度水浴锅放置1小时降解β-丙内脂后，将病毒与单克隆抗体5D9（以质量计算）按照1:5的比例混合，37℃放置2小时形成复合物。

3.2疫苗的配制及小鼠免疫

将复合后的“IgM-灭活病毒”免疫复合物（以体积计算）以46:54比值与Montanide™ISA 206 油包水佐剂，混合乳化后，按照每只小鼠120uL疫苗的剂量免疫，2周后免疫第二次。在此过程中，还设置了3个对照组。其中组1为灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ ISA206 +5D9 (50μg)；组2为灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ ISA 206；组3为灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)；组4为PBS，其免疫程序为：在首次免疫前1天采血保存；首次免疫后2周进行第二次免疫，第二次免疫后2周采血，并处死小鼠进行细胞水平分析。

3.3 抗体水平检测

用IDEXX-PRRS3X-ELISA检测稀释至1-20的小鼠血清样品中的PRRSV抗体水平，具体结果如图5所示。

基于图4可知，除PBS对照组小鼠外，所有小鼠在第二次免疫后均出现血清转化。所述组1（灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ ISA 206 +5D9 (50μg)）和组2（灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ ISA 206）均能诱导小鼠产生较高的抗体水平，其相比仅组3仅注射灭活病毒而言，所产生的抗体浓度更高。

3.4抗原特异性杀伤性T细胞免疫应答的检测

小鼠CD8+杀伤性T细胞的采集，在第二次免疫两周后处死小鼠，采集小鼠脾脏并使用单细胞滤网研磨后，使用抗PE标记的CD4抗体和FITC标记的CD8抗体进行染色，流式细胞仪分选CD8阳性T细胞，用于后继检测，其典型流式细胞仪分选图谱如图5所示。

结果显示，不同组间CD4+和CD8+T细胞百分比相似，观察组间无显著差异。

3.4 抗原特异性CD8杀伤性T细胞的检测

将从未免疫小鼠体内分选获得的树突状细胞（DC细胞）使用PRRSV-SD16病毒（1MOI）刺激24小时以模拟体内抗原加工提呈的过程，将5×10³个病毒刺激过DC细胞，与1×10⁴个CD8杀伤性T细胞在V型底96孔板中进行共培养刺激72小时后，使用IFN-γ酶联免疫斑点检测试剂盒（R&D公司产品）检测CD8杀伤性T细胞的增殖，不同组别的酶联免疫斑点图如图6所示。

结果显示，在刀豆蛋白A（ConA）刺激的CD8⁺T细胞中观察到斑点，而在幼稚小鼠组的CD8⁺T细胞中未检测到斑点。PBS免疫组和单纯灭活病毒免疫组观察到少量斑点（少于10个），两组间无显著性差异。当使用正常的水包油疫苗佐剂时，只观察到IFN-γ点的数量略有增加，这表明正常的疫苗佐剂不能增强灭活病毒疫苗引起的CTL反应。然而，当“IgM-灭活病毒”免疫复合物与佐剂联合免疫小鼠时，IFN-γ分泌T细胞显著升高（增加2倍），提示在灭活病毒免疫过程中，PRRSV特异性IgM-5D9与正常的水包油佐剂联合免疫可增强CTL反应。

实施例4：仔猪免疫攻毒保护试验

筛选PRRSV抗原抗体双阴性的35-40日龄健康仔猪40头，按10头每组分为4组，第一组试验猪免疫实施例3中“3.2疫苗的配制”制备得到的组1疫苗（灭活的PRRSV-SD16病毒粒子(10μg)+ ISA 206 +5D9 (50μg)）；第二组的试验猪免疫过程中采用实施例3中“3.2疫苗的配制”制备得到的组2疫苗（灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ ISA 206）（对照组1）；第三组试验猪免疫市售弱毒活疫苗，第四组试验猪为空白对照组。在免疫后第28天使用高致病性PRRSV-SD16强毒株肌肉注射攻毒感染，于攻毒前2天以及攻毒后21天持续监测实验动物体温与临床表现，并于攻毒后第21天剖杀试验动物，观察剖检病变，重点记录肺脏病变情况。PRRSV攻毒后发病标准，即：（1）连续3日体温高于41℃或咳嗽与呼吸困难症状；（2）剖检可见片状的肺部实变。具体结果见表1。

表1 仔猪的免疫保护试验结果

组别

疫苗

临床症状

高体温症状

肺部实变

发病判断

保护率

第一组

灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ISA 206 +5D9 (50μg)

0/10

100%

第二组

灭活的PRRSV-SD16病毒粒子 (10μg)+ISA 206

1/10

0/10

1/10

90%

第三组

市售弱毒活疫苗

2/10

3/10

2/10

3/10

70%

第四组

PBS

10/10

0%

结果表明，本发明制备的“IgM-灭活病毒”免疫复合物的免疫保护率最高（表1），其相比仅采用商业化佐剂ISA 206制备得到的疫苗以及商品化的弱毒疫苗能够达到更高的保护效力。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种免疫增强剂及其在疫苗制备中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 574

<212> PRT

<213> 单克隆抗体5D9重链氨基酸序列(人工合成)

<400> 1

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Arg Gly

20 25 30

Tyr Ser Trp His Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Gly Asn Tyr Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu

115 120 125

Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly

130 135 140

Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn

145 150 155 160

Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr

165 170 175

Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Ser

180 185 190

Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Ile

195 200 205

His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val

210 215 220

Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly

225 230 235 240

Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu Ala Thr

245 250 255

Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Gly Trp Glu

260 265 270

Ala Arg Gly Ile Trp Leu Pro Pro Gln Ile Arg Trp Thr Ile Arg Glu

275 280 285

Gln Arg Ile His His Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr

290 295 300

Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val

305 310 315 320

Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala

325 330 335

Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe

340 345 350

Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser

355 360 365

Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser

370 375 380

Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn

385 390 395 400

Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Ala Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp

405 410 415

Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro

420 425 430

Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His

435 440 445

Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu

450 455 460

Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala

465 470 475 480

Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu

485 490 495

Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe

500 505 510

Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser

515 520 525

Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu

530 535 540

Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr

545 550 555 560

Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr

565 570

<210> 2

<211> 213

<212> PRT

<213> 单克隆抗体5D9轻链氨基酸序列(人工合成)

<400> 2

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Thr Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Arg Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Tyr Pro Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Pro Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro

100 105 110

Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn

130 135 140

Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn

145 150 155 160

Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr

180 185 190

Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Asn Glu Cys

210

<210> 3

<211> 1722

<212> DNA

<213> 单克隆抗体5D9重链核苷酸序列(人工合成)

<400> 3

gaggtgcagc tgcagcagtc aggacctgac ctggtgaaac cttctcagtc actttcactc 60

acctgcactg tcactggcta ctccatcacc agaggttata gctggcactg gatccggcag 120

tttccaggaa acaaactgga atggatgggc tacatacact acagtggtag cactaactac 180

aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240

ctgcagttga attctgtgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagatatggt 300

aactactggt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc agagagtcag 360

tccttcccaa atgtcttccc cctcgtctcc tgcgagagcc ccctgtctga taagaatctg 420

gtggccatgg gctgcctggc ccgggacttc ctgcccagca ccatttcctt cacctggaac 480

taccagaaca acactgaagt catccagggt atcagaacct tcccaacact gaggacaggg 540

ggcaagtacc tagccacctc gcaggtgttg ctgtctccaa agagcatcct tgaaggttca 600

gatgaatacc tggtatgcaa aatccactac ggaggcaaaa acagagatct gcatgtgccc 660

attccagctg tcgcagagat gaaccccaat gtaaatgtgt tcgtcccacc acgggatggc 720

ttctctggcc ctgcaccacg caagtctaaa ctcatctgcg aggccacgaa cttcactcca 780

aaaccgatca cagtatcctg gctaaaggga tgggaagctc gtggaatctg gcttccacca 840

cagatccggt ggaccatccg agaacaaagg atccaccacc cccaaaccta caaggtcata 900

agcacactta ccatctctga aatcgactgg ctgaacctga atgtgtacac ctgccgtgtg 960

gatcacaggg gtctcacctt cttgaagaac gtgtcctcca catgtgctgc cagtccctcc 1020

acagacatcc taaccttcac catccccccc tcctttgccg acatcttcct cagcaagtcc 1080

gctaacctga cctgtctggt ctcaaacctg gcaacctatg aaaccctgaa tatctcctgg 1140

gcttctcaaa gtggtgaacc actggaaacc aaaattaaaa tcatggaaag ccatcccaat 1200

ggcaccttca gtgctaaggg tgcggctagt gtttgtgtgg aagactggaa taacaggaag 1260

gaatttgtgt gtactgtgac ccacagggat ctgccttcac cacagaagaa attcatctca 1320

aaacccaatg aggtgcacaa acatccacct gctgtgtacc tgctgccacc agctcgtgag 1380

caactgaacc tgagggagtc agccacagtc acctgcctgg tgaagggctt ctctcctgca 1440

gacatcagtg tgcagtggct tcagagaggg caactcttgc cccaagagaa gtatgtgacc 1500

agtgccccga tgccagagcc tggggcccca ggcttctact ttacccacag catcctgact 1560

gtgacagagg aggaatggaa ctccggagag acctatacct gtgttgtagg ccacgaggcc 1620

ctgccacacc tggtgaccga gaggaccgtg gacaagtcca ctggtaaacc cacactgtac 1680

aatgtctccc tgatcatgtc tgacacaggc ggcacctgct at 1722

<210> 4

<211> 639

<212> DNA

<213> 单克隆抗体5D9轻链核苷酸序列(人工合成)

<400> 4

gacattgtgc tcacccagtc tacagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atatcctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgtact ggtaccagca gaagccagga 120

tcctccccca aaccctggat ttatcgcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgctcgc 180

ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcagtat catagttacc cgtacacgtt cggagggggg 300

accaagccgg aaataaaacg ggctgatgct gcaccaactg tatccatctt cccaccatcc 360

agtgagcagt taacatctgg aggtgcctca gtcgtgtgct tcttgaacaa cttctacccc 420

aaagacatca atgtcaagtg gaagattgat ggcagtgaac gacaaaatgg cgtcctgaac 480

agttggactg atcaggacag caaagacagc acctacagca tgagcagcac cctcacgttg 540

accaaggacg agtatgaacg acataacagc tatacctgtg aggccactca caagacatca 600

acttcaccca ttgtcaagag cttcaacagg aatgagtgt 639

Claims

1.一种免疫增强剂，所述免疫增强剂包含PRRSV广谱中和抗体5D9，所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：

所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示；

所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。

2.根据权利要求1的免疫增强剂，所述PRRSV广谱中和单克隆抗体5D9的编码DNA，包括重链可变区和轻链可变区，其特征在于：

所述重链可变区的编码DNA序列如SEQ ID No：3所示；

所述轻链可变区的编码DNA序列如SEQ ID No：4所示。

3.根据权利要求1的免疫增强剂，所述单克隆抗体5D9为IgM亚型。

4.根据权利要求1的免疫增强剂在制备PRRSV疫苗中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，所述疫苗为PRRSV灭活疫苗或或亚单位疫苗。

6.一种免疫复合物，其是由广谱中和抗体5D9与灭活PRRSV病毒进行结合形成“IgM-灭活病毒”免疫复合物。

7.根据权利要求6所述免疫复合物的制备方法，其特征在于，其是将PRRSV病毒粒子灭活后与单克隆抗体5D9（以质量计算）按照1:5-10的比例混合，37℃放置2小时形成复合物。

8.一种PRRSV灭活疫苗，所述灭活疫苗包含权利要求6所述的免疫复合物和佐剂。

9.根据权利要求8所述的灭活疫苗，所述佐剂为油包水佐剂，更优选为Montanide™ISA 206。