CN109705212A

CN109705212A - 一种抑制prrs病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂

Info

Publication number: CN109705212A
Application number: CN201811476025.3A
Authority: CN
Inventors: 周恩民; 王立珍; 张璐
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2018-12-04
Filing date: 2018-12-04
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明的表达载体能够表达抗体治疗剂，所述抗体治疗剂能够进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，能抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。抗体治疗剂，可用于开发成治疗PRRS的药物。利用酶联免疫实验，证明抗体治疗剂与PRRS病毒Nsp9的互作。将细胞与抗体治疗剂共孵育，利用间接免疫荧光实验证明了抗体治疗剂能够进入细胞。同时利用抗体治疗剂进行病毒抑制试验，证明了抗体治疗剂能够抑制PRRS病毒的复制。

Description

一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂。

背景技术

目前，业内常用的现有技术是这样的：猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductive and respiratory syndrome,PRRS)又名蓝耳病，由PRRS病毒(PRRSV)感染所致的一种猪的急性传染病。由于PRRS病毒具有抗原变异性、嗜巨噬细胞性、抗体依赖性增强作用和持续性感染等特征，现有疫苗对该病的保护作用非常有限，而且目前还没有抗PRRS病毒的特效药物。因此，新型抗PRRS病毒药物的研发具有重要意义。

PRRS病毒为单股正链RNA病毒，其基因的复制和转录依赖于病毒自身编码的非结构蛋白，其中非结构蛋白Nsp9具有RNA依赖的RNA聚合酶活性，是病毒最重要的复制酶。最新的研究发现Nsp9不仅能与一些宿主细胞蛋白和病毒蛋白自身发生互作，对病毒影响病毒增殖，而且Nsp9与病毒的毒力也有着密切的关系。因此，Nsp9非常合适作为抗病毒药物的靶点。

综上所述，现有技术存在的问题是：尽管将防控PRRS病毒感染的注意力集中在研发疫苗，但是由于PRRS病毒基因的持续变异，现有疫苗对该病的保护作用非常有限。因此，利用基因工程抗体治疗剂抑制该病毒的复制将有利于提升抗该病的能力。本发明人所在团队在抗PRRS病毒感染研究领域处于国际领先地位(Taofeng Du,Yuchen Nan,Shuqi Xiao,Qin Zhao,and En-Min Zhou^*.Antiviral Strategies against PRRSV Infection.Trendsin Microbiol.2017:25(12),968-979.doi:10.1016/j.tim.2017.06.001.)。因此，本发明专利内容将有望开发出抗PRRS病毒的特效药物。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂。

本发明是这样实现的，一种抑制PRRS病毒复制的抗体，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述抑制PRRS病毒复制的抗体核苷酸序列的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂。

本发明的另一目的在于提供一种所述抗体治疗剂的合成与纯化方法，所述抗体治疗剂的合成与纯化方法包括以下步骤：

步骤一，利用PCR技术，扩增获得编码抗体治疗剂的DNA序列，酶切后，连接到原核表达载体pET21b中，获得原核表达载体；

步骤二，将表达载体转化入表达用感受态细胞内，活化后涂布于AMP抗性的LB琼脂平板上培养；

步骤三，挑取单克隆菌落，经IPTG诱导表达抗体治疗剂，表达的抗体治疗剂的C端带有His标签蛋白；经镍柱亲和层析法，获得纯度为90％以上的抗体治疗剂。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述抑制PRRS病毒复制的抗体的表达载体，所述表达载体包含核苷酸序列。

进一步，所述表达载体表达抗体治疗剂，抗体治疗剂进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。

本发明的另一目的在于提供一种包含所述抑制PRRS病毒复制的抗体的治疗PRRS药物。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：利用酶联免疫实验，证明抗体治疗剂与PRRS病毒Nsp9的互作。将细胞与抗体治疗剂共孵育，利用间接免疫荧光实验证明了抗体治疗剂能够进入细胞。同时利用抗体治疗剂进行病毒抑制试验，证明了抗体治疗剂能够抑制PRRS病毒的复制。

本发明通过原核表达得到了抗体治疗剂。此抗体治疗剂既具有进入细胞的功能，又可以特异性结合Nsp9，实现了纳米抗体在细胞内发挥抗PRRS病毒增殖的作用。该抗体治疗剂可以开发为治疗PRRS的药物，为PRRS的防治提供了一个新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。

附图说明

图1是本发明实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂的合成与纯化方法流程图。

图2是本发明实施例提供的抗体治疗剂核酸电泳图和抗体治疗剂蛋白电泳图；

图中：(a)抗体治疗剂核酸电泳图，泳道M是DNA分子标准；(b)抗体治疗剂蛋白电泳图，泳道M是蛋白质分子标准。

图3是本发明实施例提供的酶联免疫法(ELISA)实验鉴定抗体治疗剂与Nsp9互作示意图。

图4是本发明实施例提供的间接免疫荧光实验检测抗体治疗剂进入PAMs细胞中示意图。

图5是本发明实施例提供的不同PRRSV毒株接种细胞48小时后示意图；

图中：(a)细胞内PRRS病毒Nsp9基因水平；(b)培养上清中子代病毒滴度(TCID50)。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有疫苗对该病的保护作用非常有限，而且目前还没有抗PRRS病毒的特效药物的问题。本发明的抗体治疗剂可以开发为治疗PRRS的药物，为PRRS的防治提供了一个新的思路，对于实际生产有着极为重要的意义。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

本发明实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

本发明实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体具有DNA序列所编码的氨基酸序列。

本发明实施例提供的表达载体，含有DNA序列。表达载体能够表达抗体治疗剂，所述抗体治疗剂能够进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，能抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。抗体治疗剂，可用于开发成治疗PRRS的药物。

如图1所示，本发明实施例提供的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂的合成与纯化方法包括以下步骤：

S101：利用PCR技术，扩增获得编码抗体治疗剂的DNA序列，酶切后，连接到原核表达载体pET21b中，获得原核表达载体；

S102：将该表达载体转化入表达用感受态细胞内，活化后涂布于AMP抗性的LB琼脂平板上培养；

S103：挑取单克隆菌落，经IPTG诱导表达抗体治疗剂，表达的抗体治疗剂的C端带有His标签蛋白；经镍柱亲和层析法，获得纯度为90％以上的抗体治疗剂。

下面结合具体实施例对本发明的应用效果作详细的描述。

实施例1 原核表达抗体治疗剂：

通过两轮PCR(引物以及模板如下)，扩增得到编码抗体治疗剂的基因。使用NdeI与XhoI(购自NEB)酶切20μg pET21b原核表达载体及第二轮PCR回收产物，后用T4DNA连接酶于16℃过夜连接两片段。取10μl连接产物转化至50μl表达用感受态细胞BL21(DE3)中，活化后涂布于LB^AMP+琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单菌落于LB^AMP+液体培养基中37℃，220rpm培养12h，将菌液PCR鉴定为阳性的菌液进行测序分析。测序结果为阳性的菌液接种于LB^AMP+培养基中培养，待细菌生长至对数期，用1mM IPTG诱导抗体治疗剂的表达，37℃，220rpm培养6h后，4℃，10,000g离心10min收菌体。PBS重悬菌体，利用超声波破碎菌体后，4℃，12,000g离心10min，由于抗体治疗剂主要以包涵体形式表达，所以收集沉淀。将沉淀溶解于8M尿素，经镍柱(购自Roche公司)纯化得到纯度90％以上的抗体治疗剂。变形的抗体治疗剂在复性液中复性后，透析至0.01M PBS(PH7.2)中。通过超滤管将抗体治疗剂进行浓缩，0.22μm无菌滤膜过滤除菌后保存于-80℃待用。

第一轮PCR：

模板：pUC57-Nb6(由GenScript公司合成)

上游引物：

TGGCGGCAGCGGTGGTGGTGGCAGCGGTGGTGGCGGTAGCCAAGTTCAGCTGCAAGAA

下游引物：CCGCTCGAGGCTGCTCACGGTA

第二轮PCR：

模板：第一轮PCR回收产物

上游引物：

CCGCATATGCCTACGGTCGTAAGAAACGTCGTCAGCGTCGTCGTGGTGGTGGTGGCTGGGG

下游引物：CCGCTCGAGGCTGCTCACGGTA

蛋白复性液：(880mM L-精氨酸，55mM Tris，21mM NaCl，0.88mM KCl)PH8.2，10mMEDTA，150mM还原性谷胱甘肽，15mM氧化型谷胱甘肽。

实施例2 酶联免疫实验检测抗体治疗剂与Nsp9互作

首先，Nsp9用PBS(0.01M,pH7.2)包被ELISA板，每孔400ng，4℃过夜。ELISA板用PBS-T(PBS含0.5％体积的Tween-20)洗涤3次后，用封闭液(2.5％浓度的脱脂奶粉溶于PBS-T,200μl/孔)封闭1小时；洗涤3次，每孔加入不同稀释比例的抗体治疗剂反应1小时；洗涤3次，每孔加入鼠源抗His单克隆抗体反应1小时；洗涤3次，每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG反应1小时，洗涤3次；每孔加入100μl HRP底物(TMB)反应15分钟，每孔加入50μl 1M硫酸终止反应，用酶标仪在450nm下读取每孔的OD值。检测结果见图2，原核表达的抗体治疗剂能与PRRS病毒Nsp9发生特异性结合。

实施例3抗体治疗剂进入细胞

PAMs细胞复苏后，以每孔1×10⁶密度铺在24孔细胞培养板中，培养4h，弃去旧培养基，加入新的无血清RPMI 1640培养基，同时抗体治疗剂以终浓度为5μM加入每孔细胞培养基中，培养5h后，利用间接免疫荧光实验检测细胞内的抗体治疗剂。具体步骤如下：弃去上清，细胞用PBS洗3遍，加4％多聚甲醛，室温放置15min固定细胞，0.25％Triton X-100室温破膜10min。PBS洗3遍，1％BSA封闭后加鼠源His单克隆抗体，室温孵育1h。PBS洗3遍，加入Alexa488标记的羊抗鼠荧光二抗，在室温下放置1小时。PBS洗3次，加DAPI室温放置5min。PBS洗3次，封片后在荧光显微镜下观察。结果如图3显示抗体治疗剂能够进入PAMs细胞中。

实施例4病毒感染实验

PAMs细胞复苏后，以每孔1×10⁶密度铺在24孔细胞培养板中，培养4h，弃去旧培养基，加入新的培养基，接种0.01MOI的不同的PRRSV毒株(SD-16、JX-A1、GD-HD、VR2332、GZ11-G1)。感染后1h，抗体治疗剂以终浓度为30μM加入每孔细胞培养基中。感染48h后收集细胞与细胞上清，用于检测PRRS病毒Nsp9基因的表达和子代病毒滴度(TCID₅₀)。结果如图4显示，抗体治疗剂能够抑制基因I和II型PRRSV Nsp9基因在PAMs细胞中的表达，且加入抗体治疗剂的细胞上清中子代病毒滴度也显著低于阴性对照组。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 一种抑制PRRS病毒复制的抗体、表达载体及治疗剂

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 462

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Claims

1.一种抑制PRRS病毒复制的抗体，其特征在于，所述抑制PRRS病毒复制的抗体的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种包含权利要求1所述抑制PRRS病毒复制的抗体核苷酸序列的抑制PRRS病毒复制的抗体治疗剂。

3.一种如权利要求2所述抗体治疗剂的合成与纯化方法，其特征在于，所述抗体治疗剂的合成与纯化方法包括以下步骤：

4.一种包含权利要求1所述抑制PRRS病毒复制的抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体表达抗体治疗剂，抗体治疗剂进入细胞，并且特异性结合PRRS病毒非结构蛋白Nsp9，抑制PRRS病毒在PAMs细胞中的增殖。

6.一种包含权利要求1所述抑制PRRS病毒复制的抗体的治疗PRRS药物。