CN112089831A - 重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及疫苗制备领域，具体而言，涉及一种重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法。该方法包括将插入有RBD‑TT重组蛋白所对应的核酸片段的质粒转染到大肠杆菌；培养所述大肠杆菌，使其表达所述RBD‑TT融合蛋白，破碎菌体并分离所述RBD‑TT重组蛋白的包涵体粗提物；将所述包涵体粗提物用含尿素的变性液溶解后，通过阴离子交换色谱层析进行纯化，得到RBD‑TT重组蛋白粗纯样品；将所述RBD‑TT重组蛋白粗纯样品用稀释液稀释；过滤、用复性液进行复性，得到复性蛋白；将所述重组蛋白复性蛋白通过阴离子交换色谱层析进行纯化。

Description

重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗制备领域，具体而言，涉及一种重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）是一种人类新发现的冠状病毒，可引起急性感染性肺炎，严重时可导致急性呼吸窘迫综合征或脓毒性休克、甚至死亡。目前，临床上还未有特效的药物被证实有效用于新型冠状病毒的感染治疗，接种预防性疫苗是该病毒防控最为经济、有效的手段，因此有必要开展安全、有效的新型冠状病毒疫苗研究。
根据基因组特点，SARS-CoV-2病毒属于冠状病毒（CoV）亚科β属中Sarbecovirus亚属成员。SARS-CoV-2病毒基因组长度约为29.8Kb，5’端2/3的基因编码病毒复制相关的酶，剩下1/3的基因编码刺突蛋白（Spike，S）、小囊膜蛋白（Envelope，E）、膜蛋白（Membrane，M）、核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）四个结构蛋白以及其他一些辅助蛋白。和其他冠状病毒一样，SARS-CoV-2病毒的S蛋白暴露于病毒表面，由S1和S2两个非共价结合的亚基组成。其中S1亚基含有细胞受体的结合位点（receptor-binding domain，RBD）可与宿主细胞上的血管紧张素转换酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）结合，帮助病毒吸附并进入宿主细胞；S2亚基含有一个融合肽（fusion peptide，FP）、一个跨膜区（transmembranedomain，TM）以及两个七肽重复区（heptad repeat regions，HR），在病毒与细胞膜的融合过程中起关键作用。
现有的研究表明，S1亚基中的RBD区域被认为是病毒中和表位的富集区，能够诱导机体产生中和抗体。因此，以RBD区域为基础开展亚单位疫苗研究在理论上是切实可行的。但是，这种重组亚单位疫苗的免疫效果无法与传统的灭活疫苗相媲美，往往需要通过其他技术手段来提高其免疫原性。疫苗佐剂是提高疫苗免疫效果的途径之一，但是现有能够在临床中批准上市的疫苗佐剂除了铝佐剂之外，只有少数物质获批，且价格高昂。由此，研究者开展了分子内佐剂的研究，通过在抗原蛋白的末端连接具有免疫增强作用的分子肽来实现疫苗免疫原性的提升。这种分子内佐剂可以降低研发成本，有利于提高疫苗的质量控制，是一种行之有效新型疫苗设计方案。
借助分子内佐剂的免疫增强效应，构建一个高效表达具有良好免疫原性的重组新型冠状病毒亚单位疫苗，对于新型冠状病毒在人际传播的防治有着极大价值和意义。然而分子内佐剂会改变蛋白结构，使得重组新型冠状病毒亚单位疫苗表达效率降低。
发明内容
本发明的目的是提供一种重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，所述方法包括：
a）将含有SEQ ID NO：2所示的核酸片段的质粒转染到大肠杆菌，所述核酸片段能够表达RBD-TT融合蛋白；
b）培养所述大肠杆菌，使其表达所述RBD-TT融合蛋白，破碎菌体并分离所述RBD-TT重组蛋白的包涵体粗提物；
c）将所述包涵体粗提物用含尿素的变性液溶解后，通过阴离子交换色谱层析进行纯化，得到RBD-TT重组蛋白粗纯样品；
d）将所述RBD-TT重组蛋白粗纯样品用稀释液稀释；
每升所述稀释液中含有：尿素450~510克，精氨酸70~86克，还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，和缓冲物质，pH=9~10；
e）所述稀释后的RBD-TT重组蛋白依次用复性液1、复性液2、复性液3进行透析置换或切向流超滤复性；
所述每升复性液1中含有：精氨酸70~86克，还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸钠1~3克，碳酸氢钠3~6克，pH=9~10；
所述每升复性液2中含有：还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸钠1~3克，碳酸氢钠3~6克，pH=9~10；
所述每升复性液3中含有：还原性谷胱甘肽0.1~0.3克，碳酸钠0.5~1克，碳酸氢钠1~2克，pH=9~10；
f）将复性后的蛋白通过阴离子交换色谱层析进行纯化。
本发明还涉及用于在大肠杆菌中表达的RBD-TT重组蛋白所对应的分离的核酸片段，所述核酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
该核酸片段经过密码子优化的能够在大肠杆菌表达系统中高效表达。
本发明的有益效果为：
提供了一种具有强免疫原性、低成本、高产能的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法。所得疫苗重组新型冠状病毒亚单位疫苗可以高效诱导小鼠产生保护性中和抗体和特异性细胞免疫反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中RBD-TT重组蛋白表达电泳图谱；其中，M：蛋白分子量Marker；1、2：诱导表达前；3、4：诱导表达4小时；
图2为本发明一个实施例中不同稀释液配方对抗原效价的影响；
图3为本发明一个实施例中不同复性条件对抗原效价的影响；
图4为本发明一个实施例中RBD-TT重组蛋白纯化电泳图谱；其中，M：蛋白分子量Marker；1：纯化前样品；2：纯化后样品；3：疫苗原液样品；
图5为本发明一个实施例中重组新型冠状病毒亚单位疫苗诱导小鼠产生保护性中和抗体的几何平均数与RBD组比较结果；
图6为本发明一个实施例中RBD-TT试验组和RBD组诱导免疫小鼠淋巴细胞表达特异性伽马干扰素（INF-γ）和白介素4（IL-4）的结果比较。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，包括：
a）将含有SEQ ID NO：2所示的核酸片段的质粒转染到大肠杆菌，所述核酸片段能够表达RBD-TT融合蛋白；
b）培养所述大肠杆菌，使其表达所述RBD-TT融合蛋白，破碎菌体并分离所述RBD-TT重组蛋白的包涵体粗提物；
c）将所述包涵体粗提物用含尿素的变性液溶解后，通过阴离子交换色谱层析进行纯化，得到RBD-TT重组蛋白粗纯样品；
d）将所述RBD-TT重组蛋白粗纯样品用稀释液稀释；
每升所述稀释液中含有：尿素450~510克，精氨酸70~86克，还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，和缓冲物质，pH=9~10；
e）所述稀释后的RBD-TT重组蛋白依次用复性液1、复性液2、复性液3进行透析置换或切向流超滤复性；
所述每升复性液1中含有：精氨酸70~86克，还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸钠1~3克，碳酸氢钠3~6克，pH=9~10；
所述每升复性液2中含有：还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸钠1~3克，碳酸氢钠3~6克，pH=9~10；
所述每升复性液3中含有：还原性谷胱甘肽0.1~0.3克，碳酸钠0.5~1克，碳酸氢钠1~2克，pH=9~10；
f）将复性后的蛋白通过阴离子交换色谱层析进行纯化。
在一些实施方式中，每次透析置换所用复性液与蛋白液的透析置换体积比均独立地选自1：（50~1000），例如1：100、1：200、1：300、1:400、1：500、1：600、1:700、1：800、1：900，每次置换时间为4~6小时。
在一些实施方式中，每次切向流超滤复性所用复性液与蛋白液的超滤置换体积比独立地选自1：（2~5），例如1：3、1：4，每次切向流超滤进料压力为20bar~30bar。
在一些实施方式中，所述透析置换所用透析袋的孔径大小为5kd~30kd，还可以选择8kb、10kd、12kd、15kd、20kd或25kd。
在一些实施方式中，所述切向流超滤复性所用的切向流超滤膜包的孔径大小为5kd~30kd，还可以选择8kb、10kd、12kd、15kd、20kd或25kd。
在一些实施方式中，在步骤c）和f）中，所述阴离子交换色谱的交换基团包括二乙胺乙基或季氨基。
在一些实施方式中，在步骤d）中，按所述RBD-TT重组蛋白粗纯样品和所述稀释液体积比1：（1～10）进行稀释。
在一些实施方式中，每升所述稀释液中含有：尿素470~490克，精氨酸73~83克，还原性谷胱甘肽0.4~0.6克，甘油17~23克，和缓冲物质。
术语“质粒(Plasmid)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当质粒能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，质粒也被称为表达载体。质粒可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，在一些实施方式中，本发明所述质粒中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点（IRES）和其他表达控制元件（例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等）。
在一些实施方式中，所述质粒为pET28a大肠杆菌表达质粒。
在一些实施方式中，每升所述变性液中含有：氯化钠17~23克，尿素450~510克，和缓冲物质，pH=7.2~7.8。
在一些实施方式中，每升所述变性液中含有：氯化钠18~22克，尿素470~490克，和缓冲物质，pH=7.3~7.7。
如本文使用的术语“缓冲物质”指当酸或碱加入含有该缓冲物质的溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类物质的缓冲性质。缓冲物质一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH 7–pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH（参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers inbiological systems，CALBIOCHEM，1999）。缓冲液和缓冲溶液一般由缓冲盐或优选非离子缓冲液组分如TRIS和HEPES制备。可以在本发明的方法中使用的缓冲液优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液（PBS）、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇（TRIS）缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液（TBS）和TRIS/EDTA（TE）。在一些具体的实施方式中，所述缓冲物质为三羟甲基氨基甲烷。
在一些实施方式中，步骤b）中分离所述RBD-TT重组蛋白的包涵体粗提物的方法为离心。
在一些实施方式中，步骤c）中通过阴离子交换色谱层析进行纯化的方法为先用5个柱体积的变性液平衡层析柱，然后上样至层析柱中，收集流穿柱子的样品得到RBD-TT重组蛋白粗纯样品。
在一些实施方式中，步骤f）中将所述重组蛋白复性蛋白通过阴离子交换色谱层析进行纯化的方法为先用5个柱体积的变性液平衡层析柱，然后上样至层析柱中，收集流穿柱子的样品。
在一些实施方式中，所述培养为摇床振荡培养和/或发酵罐发酵培养。
在一些实施方式中，破碎菌体的方法为超声法。
在一些实施方式中，破碎菌体的过程中不使用烈性促溶剂（如盐酸胍、去污剂如十二烷基硫酸钠和硫氰酸盐）。
在一些实施方式中，破碎菌体所用的缓冲液中，每升含三羟甲基氨基甲烷2.0～2.8克，氯化钠15～25克，pH=7.7～8.3。
在一些实施方式中，在步骤b）中，培养所述大肠杆菌至对数生长期，在25℃~37℃温度条件下采用0.7mM/mL~1.3mM/mL的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂诱导大肠杆菌4~24小时，使其表达所述RBD-TT融合蛋白。
在一些实施方式中，步骤f）之后还包括：将所述重组蛋白复性蛋白过滤除菌，与佐剂进行配伍。
在一些实施方式中，所述佐剂选自角鲨烯、胞壁酰二肽、MF59、AS03、单磷脂酰脂质A，鞭毛蛋白、CpG-ODN、Poly（I：C），以及铝或钙盐的小分子中的一种或多种。这些佐剂均是本领域所熟知并可通过若干商业渠道获得的。
可与本发明所述RBD-TT重组蛋白一起应用的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如，氢氧化物或磷酸盐)。尤其适用于本发明的优选佐剂是氢氧化铝凝胶，诸如AlhydrogelTM。对氢氧化铝凝胶而言，是将所述嵌合体蛋白与该佐剂混合，使每一剂量含有大约50到大约800微克铝，优选含有大约400到大约600微克铝。另一种尤其优选的佐剂是可获得自SuperfosBiosector，Denmark的商标为Adju-PhosTM的磷酸铝。初期的磷酸铝颗粒具有板状形态，直径为大约50到大约100nm，产物中的最终颗粒尺寸为大约0.5到大约10μ。磷酸钙毫微粒(CAP)是由Biosante，Inc(Lincolnshire，IL)研制的一种佐剂。
在一些实施方式中，所述佐剂包括磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。
在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。
在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。
本发明还涉及用于在大肠杆菌中表达的RBD-TT重组蛋白所对应的分离的核酸片段，所述核酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1 稀释液的优化
(1)利用密码子兼并原则以及大肠杆菌对密码子的使用频率，以SEQ ID NO：1所述氨基酸序列为模板，设计出表达RBD-TT重组蛋白的核苷酸序列SEQ ID NO：2，并通过无缝克隆的方法将所合成的基因插入pET28a大肠杆菌表达质粒，得到重组表达质粒。将所得重组表达质粒通过42度热激活法转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并通过LB固体培养基平皿进行单克隆筛选，得到表达目的蛋白重组大肠杆菌单克隆菌落，挑取重组大肠杆菌单克隆菌落，用5毫升LB液体培养基37℃过夜培养，即得表达目的蛋白重组大肠杆菌种子液。
(2) 取重组大肠杆菌种子液，按1：100的比例接种于5毫升LB液体培养基37℃培养过夜、活化。将过夜培养后的菌液按1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养菌体OD600至0.7，然后加诱导剂（IPTG）进行诱导（诱导剂终浓度为1毫摩尔/毫升），诱导温度为37℃，连续诱导4小时。诱导前、后样品用SDS-PAGE蛋白电泳进行分析（图1），诱导后RBD-TT重组蛋白的表达量达菌体中蛋白的30%。
(3) 用离心机在6000转/分钟条件下离心20分钟收集诱导表达后的菌落沉淀，所得菌落沉淀用破菌缓冲液以1：20的质量体积比重悬，并用超音仪超声破碎菌落细胞壁，超声破碎后的菌液用离心机12000 转/分钟离心30分钟收集破菌沉淀。
(4) 所得破菌沉淀用变性液溶解，12000转/分钟离心30分钟收集上清。所得上清液用5毫升柱体积的DEAE阴离子交换层析柱进行层析纯化，层析条件如下：先用5个柱体积的变性液平衡层析柱，然后上样至层析柱中，收集流穿柱子的样品得到RBD-TT重组蛋白粗纯样品（图2）。
(5) 所得RBD-TT重组蛋白粗纯样品用稀释液稀释按体积比进行1：1稀释，依次用复性液1、复性液2、复性液3进行透析复性，得到复性蛋白。
所用不同稀释液配方如下：
稀释液1：三羟甲基氨基甲烷2.4克，尿素480克，还原性谷胱甘肽0.5克，加水溶解定容至1升，调节pH值为9.5。
稀释液2：三羟甲基氨基甲烷2.4克，尿素480克，还原性谷胱甘肽0.5克，甘油20克，加水溶解定容至1升，调节pH值为9.5。
稀释液3：三羟甲基氨基甲烷2.4克，尿素480克，精氨酸78克，还原性谷胱甘肽0.5克，加水溶解定容至1升，调节pH值为9.5。
稀释液4：三羟甲基氨基甲烷2.4克，尿素480克，精氨酸78克，还原性谷胱甘肽0.5克，甘油20克，加水溶解定容至1升，调节pH值为9.5。
每次透析置换所用复性液与蛋白液的透析置换比例均为1：500，每次置换时间为5小时，透析置换所用透析袋孔径10 kd。
(6) 所得复性蛋白稀释至0.1mg/mL，用酶联免疫法检测不同复性条件的抗原活性，方法如下：
1) 先将待检抗原样品用PBS稀释液进行不同稀释度的系列稀释：1：2、1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256稀释方法如下：取100微升待检抗原蛋白样品加入900微升PBS稀释液，混匀即成1：10样品；取100微升1：10样品加入800微升PBS稀释液，混匀即成1：90样品，如此类推稀释；各稀释度样品依次加入预包被ACE2受体蛋白的酶标板孔中，100微升/孔，每个稀释样品加两孔，同时在酶标板的另外孔中设立阴性孔2个，并留2孔作空白调零孔，放入37℃培养0.5小时，用PBS洗液洗板4次；
2）在上述酶标板的各孔中加入稀释度为1：2000的HRP标记的RBD蛋白多克隆抗体，100微升/孔，放入37℃培养0.5小时，用PBS洗液洗板4次；
3）在上述酶标板的各孔中加入TMB显色液，100微升/孔，放入湿盒中，于37℃保温15分钟；
4）在上述酶标板的各孔中加入终止液，50微升/孔，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，结果见表1；
5）判定结果：
Cutoff值=阴性对照孔平均A值×2.1=0.1260，（阴性对照平均A值大于0.05，按实际值计算）。
6）按照样品的A值≧Cutoff值，该样品判定为阳性样品；样品的A值﹤Cutoff值，该样品判为阴性。
所用溶液如下：
1、包被缓冲液(0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6):碳酸钠1.59克，碳酸氢钠 2.93克，加蒸馏水至1000毫升。
2、磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）：磷酸二氢钾0.2克，磷酸氢二钠 2.9克，氯化钠 8.0克，氯化钾 0.2克，Tween-20 0.5毫升，加蒸馏水至1000毫升。
3、PBS洗液：1000毫升磷酸盐缓冲液中，加入0.5毫升吐温20。
4、封闭液：100毫升PBS洗液中加入1克牛血清白蛋白，溶解混匀。
5、终止液（2N 硫酸）：取浓硫酸10毫升，缓慢加入80毫升水中，冷却待用。
结果如图2所示，从图中可以看出，不同稀释液配方对抗原效价的影响差别很大，其中经稀释液4处理过的样品抗原效价最好。
所用溶液如下：
LB液体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，加水溶解定容至1升。
LB固体培养基：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，加水定容至1升。
破菌缓冲液：三羟甲基氨基甲烷2.4克，氯化钠29.22克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。
变性液：三羟甲基氨基甲烷2.4克，氯化钠29.22克，尿素480g，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.5。
稀释液：三羟甲基氨基甲烷2.4克，尿素480克，精氨酸78克，还原性谷胱甘肽0.5克，甘油20克，加水溶解定容至1升，调节pH值至9.5。
复性液1：精氨酸78克，还原性谷胱甘肽0.5克，甘油20克，碳酸钠2克，碳酸氢钠4.5克，pH=9.5。
复性液2：还原性谷胱甘肽0.5克，甘油20克，碳酸钠2克，碳酸氢钠4.5克，pH=9.5。
复性液3：还原性谷胱甘肽0.2克，碳酸钠0.75克，碳酸氢钠1.5克，pH=9.5。
洗脱液：碳酸钠1.5克，碳酸氢钠3克，甘油5克，58.44克加水溶解定容至1升。
实施例2重组条件的筛选
按照实施例1中步骤（1）~（5）进行操作，稀释液选择稀释液4，复性条件通过三个方案进行比较：方案1，依次用复性液1、复性液3进行切向流超滤复性；方案2，依次用复性液2、复性液3进行切向流超滤复性；方案3，依次用复性液1、复性液2、复性液3进行切向流超滤复性；每次切向流超滤复性所用复性液与蛋白液的超滤置换比例均为1：3，每次切向流超滤进料压力为25bar，切向流超滤膜包的孔径大小为10 kd）。
采用下面的步骤（6）：
(6) 所得RBD-TT重组蛋白复性样品稀释至0.1mg/mL，用酶联免疫法检测不同复性条件的抗原效价。
结果如图3所示：方案3所得抗原效价最高。
实施例3 重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备
按照实施例2中步骤（1）~（5）进行操作（稀释液选择稀释液4，复性条件为依次用复性液1、复性液2、复性液3进行切向流超滤复性）。
采用下面的步骤（6）和（7）：
(6) 所得RBD-TT重组蛋白复性样品，通过DEAE阴离子交换色谱层析进行纯化，层析条件如下：先用5个柱体积的透析液平衡层析柱，然后上样至层析柱中，用20%洗脱液进行洗脱得到疫苗原液（图4）。
(7) 将所得重组蛋白疫苗原液用0.22微米过滤器过滤除菌，加入终浓度为1毫克/毫升的铝佐剂，分装，即得到所需重组新型冠状病毒亚单位疫苗。
实施例4 重组新型冠状病毒亚单位疫苗诱导机体产生保护性中和抗体
（1）按照实施例2的制备方法制备得到RBD重组蛋白疫苗。
（2）取4周龄雌性小鼠30只，分成RBD-TT试验组、RBD重组蛋白组和对照组三组，每组10只，RBD-T试验组RBD-TT重组亚单位蛋白疫苗，免疫剂量为40μg/只；RBD重组蛋白组免疫单独的RBD重组蛋白疫苗，免疫剂量为40μg/只；对照组肌肉注射等量的换相液加铝佐剂。之后间隔一周加强免疫两次，在末次免疫两周后采集血清，所得血清60°C热灭活30分钟。
（3）用无血清培养基倍比稀释小鼠血清（1:2~1:32），分别与新型冠状病毒稀释液（1000 半数细胞感染数（TCID50）/毫升）按体积1:1混合，37度孵育1小时。
（4）按3×105/孔细胞量将Vero E6细胞接种至96孔细胞培养板中，37度条件下培养细胞至单层。弃去细胞培养板中培养液，无钙镁缓冲液洗涤2次后，按100微升/孔的量加入步骤（3）中的病毒抗体混合液，并补充等体积的病毒维持液，每个血清稀释度设置8个复孔。同时设立无病毒、无血清和空白组作为阴性对照，37度、5%CO2条件下培养3天，观察细胞病变状况。按Reed-Muench两氏法计算抗体血清效价。结果如图5所示，RBD-TT试验组可以有效诱导机体产生针对新型冠状病毒的中和抗体的几何平均数（GMT）为256，与对照组比，有显著性差异。而单独的RBD重组蛋白组中和抗体的几何平均数为64，表明TT肽可以有效增加RBD蛋白的免疫原性，使得该疫苗的免疫效果得到保证。
本实施例中所用材料和溶液如下所示，但不限于此：
所用Vero E6细胞来自美国模式培养物集存库（ATCC）。
无钙镁缓冲液：氯化钠8克、氯化钾0.2克、磷酸氢二钠1.44克、磷酸二氢钾0.24克，用盐酸调节溶液的pH值至7.4，加水溶解定容至1升。
病毒维持液：用市售的DMEM细胞培养基加入1%的胎牛血清配制而成。
实施例5 重组新型冠状病毒亚单位疫苗诱导机体产生特异性细胞免疫反应
（1）取4周龄雌性小鼠30只，分成RBD-TT试验组、RBD重组蛋白组和对照组三组，每组10只，RBD-T试验组RBD-TT重组亚单位蛋白疫苗，免疫剂量为40μg/只；RBD重组蛋白组免疫单独的RBD重组蛋白疫苗，免疫剂量为40μg/只；对照组注射等量的换相液加铝佐剂。之后间隔一周加强免疫两次，在末次免疫两周后采集血清，所得血清60°C热灭活30分钟。
（2）在初次免疫后第14天处死小鼠，无菌条件下取脾脏轻轻碾压，获得脾脏细胞悬液。所得脾脏细胞悬液用红细胞裂解液作用5分钟后加PBS中和，1000转/分钟离心弃上清，再用无血清RPMI-1640培养基洗涤两次，最后将细胞沉淀重悬于5%血清RPMI-1640培养基中，获得小鼠脾淋巴细胞悬液。
（3）将小鼠脾淋巴细胞悬液稀释至3×106个细胞/毫升，按照酶联斑点免疫检测说明书进行操作。
结果显示：RBD-TT试验组和RBD组均可以诱导免疫小鼠淋巴细胞表达特异性伽马干扰素（INF-γ）和白介素4（IL-4），且RBD-TT试验组所的特异性伽马干扰素（INF-γ）和白介素4（IL-4）高于RBD组（见图6）。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 浙江普康生物技术股份有限公司；中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所；杭州医学院；中国医学科学院医学实验动物研究所
<120> 重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 258
<212> PRT
<213> artificial sequence
<400> 1
Met Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro
1 5 10 15
Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe
20 25 30
Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn
35 40 45
Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn
50 55 60
Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys
65 70 75 80
Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile
85 90 95
Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile
100 105 110
Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile
115 120 125
Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn
130 135 140
Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg
145 150 155 160
Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly
165 170 175
Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln
180 185 190
Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser
195 200 205
Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser
210 215 220
Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu
225 230 235 240
Thr Gly Gly Gly Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile
245 250 255
Phe Glu
<210> 2
<211> 777
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 2
atggttgaga aaggtatcta ccagacctct aacttccgtg ttcagccgac cgaatctatc 60
gttcgtttcc cgaacatcac caacctgtgc ccgttcggtg aagtgttcaa cgctacccgt 120
ttcgcttctg tttacgcttg gaaccgtaaa cgtatctcta actgcgttgc tgactactct 180
gttctgtaca actctgctag cttctctacc ttcaaatgct acggtgttag tccgaccaaa 240
ctgaacgacc tgtgcttcac caacgtttac gctgacagct tcgttatccg tggtgacgaa 300
gttcgtcaga tcgctccggg tcagaccggt aagatcgctg actacaacta caaactgccg 360
gacgacttca ccggttgcgt tatcgcttgg aactctaata acctggactc taaagttggt 420
ggtaactaca actacctgta ccgtctgttc cgtaaatcta acctgaaacc gttcgaacgt 480
gacatctcta ccgaaatcta ccaggctggt tctactccgt gcaacggtgt tgaaggtttc 540
aactgctact tcccgctgca gtcttacggt ttccagccga ccaacggtgt tggttaccag 600
ccgtaccgtg ttgtggttct gagctttgaa ctgctgcacg ctccggctac tgtttgcggt 660
ccgaagaaat ctaccaacct ggttaagaac aaatgcgtta acttcaactt caacggtctg 720
actggtggcg gtcagtacat caaagctaac tctaaattca tcggtatctt cgaataa 777

Claims (14)

1.一种重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括：
a）将含有SEQ ID NO：2所示的核酸片段的质粒转染到大肠杆菌，所述核酸片段能够表达RBD-TT融合蛋白；
b）培养所述大肠杆菌，使其表达所述RBD-TT融合蛋白，破碎菌体并分离所述RBD-TT重组蛋白的包涵体粗提物；
c）将所述包涵体粗提物用含尿素的变性液溶解后，通过阴离子交换色谱层析进行纯化，得到RBD-TT重组蛋白粗纯样品；
d）将所述RBD-TT重组蛋白粗纯样品用稀释液稀释；
每升所述稀释液中含有：尿素450~510克，精氨酸70~86克，还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，和缓冲物质，pH=9~10；
e）所述稀释后的RBD-TT重组蛋白依次用复性液1、复性液2、复性液3进行透析置换或切向流超滤复性；
所述每升复性液1中含有：精氨酸70~86克，还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸钠1~3克，碳酸氢钠3~6克，pH=9~10；
所述每升复性液2中含有：还原性谷胱甘肽0.3~0.7克，甘油15~25克，碳酸钠1~3克，碳酸氢钠3~6克，pH=9~10；
所述每升复性液3中含有：还原性谷胱甘肽0.1~0.3克，碳酸钠0.5~1克，碳酸氢钠1~2克，pH=9~10；
f）将复性后的蛋白通过阴离子交换色谱层析进行纯化。
2.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，每次透析置换所用复性液与蛋白液的透析置换体积比均独立地选自1：（50~1000），每次置换时间为4~6小时。
3.根据权利要求2所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述透析置换所用透析袋孔径为5kd~30kd。
4.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，每次切向流超滤复性所用复性液与蛋白液的超滤置换体积比独立地选自1：（2~5），每次切向流超滤进料压力为20 bar~30bar。
5.根据权利要求4所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述切向流超滤复性所用的切向流超滤膜包的孔径大小为5kd~30kd。
6.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤c）和f）中，所述阴离子交换色谱的交换基团包括二乙胺乙基或季氨基。
7.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤d）中，按所述RBD-TT重组蛋白粗纯样品和所述稀释液体积比1：（1～10）进行稀释。
8.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述质粒为pET28a大肠杆菌表达质粒。
9.根据权利要求1所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，每升所述变性液中含有：氯化钠17~23克，尿素450~510克，和缓冲物质，pH=7.2~7.8。
10.根据权利要求1或9所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述缓冲物质为三羟甲基氨基甲烷。
11.根据权利要求1~9任一项所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，在步骤b）中，培养所述大肠杆菌至对数生长期，在25℃~37℃温度条件下采用0.7mM/mL~1.3mM/mL的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导剂诱导大肠杆菌4~24小时，使其表达所述RBD-TT融合蛋白。
12.根据权利要求1~9任一项所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，步骤f）之后还包括：将所述重组蛋白复性蛋白过滤除菌，与佐剂进行配伍。
13.根据权利要求12所述的重组新型冠状病毒亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述佐剂包括磷酸铝佐剂和/或氢氧化铝佐剂。
14.用于在大肠杆菌中表达的RBD-TT重组蛋白所对应的分离的核酸片段，其特征在于，所述核酸片段的序列如SEQ ID NO：2所示。
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