CN113801209A - 一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法，所述新型冠状病毒重组蛋白为CRM‑RBD重组蛋白，所述CRM‑RBD重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述CRM‑RBD重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，利用所述核苷酸序列通过以下步骤制备得到重组纳米蛋白颗粒：构建得到大肠杆菌重组表达菌；培养大肠杆菌重组表达菌得到发酵液；获得包涵体粗提物；变性溶解得到包涵体变性蛋白；纯化得到纯化重组蛋白；复性得到复性后蛋白；对复性后蛋白进行分离纯化，得到重组纳米蛋白颗粒。本发明的新型冠状病毒重组蛋白对新冠病毒原型株、贝塔变异株、德尔塔变异株均具有中和保护效果。

Description

一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白及其制备 方法

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，特别是涉及一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法。

背景技术

自严重急性呼吸系统综合征2型冠状病毒（severe acute respiratory syndromecoronavirus 2，SARS-CoV-2）在全球爆发以来，目前还没有针对SARS-CoV-2的特效药，因此能否研制出一款安全、有效的新冠疫苗成为预防和控制新冠肺炎的关键。目前全世界科研人员正在加速研发新冠疫苗，目前已有112种候选疫苗进入临床实验，有15种疫苗获得紧急使用，其中进入临床实验的亚单位疫苗有38种，2种亚单位疫苗获得紧急使用。

随着感染人数的增加和疫情的持续，新型冠状病毒不断进化和变异，陆续产生多种新冠病毒变异株。这些变异株的S蛋白发生氨基酸突变，特别是受体结合区或单克隆抗体结合位点氨基酸突变引起病毒的传播力和致病力改变以及部分免疫逃逸等。RBD区域的氨基酸突变有D614G、N501Y、E484Q/K、K417N/T、L452R，而RBD是SARS-CoV-2中与ACE2（血管紧张素转化酶2）结合的区域，也是多种中和抗体竞争性结合的区域。因此，RBD区域的氨基酸突变最有可能导致病毒免疫逃逸。目前世界卫生组织将重要变异株划分为关切变异株（variant of concern，VOC）和关注变异株（variant of interest，VOI）。关切变异株有：Alpha、Beta、Gamma、Delta及Lambda，其中Delta新冠变异株具有传播力强、感染潜伏期短、致病性强、发病进程快等特点，逐渐成为全球主要的流行毒株，并导致多个国家和地区的疫情反弹。Lambda目前已在29个国家和地区流行，显示出较强的传染性和降低疫苗中和能力。

因此，有必要进一步研究针对新冠病毒不同变异株（具有交叉保护作用）且免疫效果较好的广谱或多价疫苗。

发明内容

基于此，本发明的目的是提供一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法。

一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，所述新型冠状病毒重组蛋白为CRM-RBD重组蛋白，所述CRM-RBD重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，编码所述CRM-RBD重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，利用所述核苷酸序列通过以下步骤制备得到重组纳米蛋白颗粒：

将序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列插入表达载体并构建得到大肠杆菌重组表达菌；

培养所述大肠杆菌重组表达菌至对数生长期，用诱导剂诱导得到发酵液；

将所述发酵液通过细胞破碎和离心处理获得包涵体粗提物；

将所述包涵体粗提物用变性剂变性溶解，得到包涵体变性蛋白；

将所述包涵体变性蛋白用阳离子交换层析进行纯化，得到纯化重组蛋白；

用复性液对所述纯化重组蛋白进行液体置换复性，得到复性后蛋白；所述复性液含有2-6克/升甘氨酸、0.5~2克/升乙二胺四乙酸二钠和0.1-0.5克/升吐温-80，pH值为8.5~10；

对所述复性后蛋白进行超滤浓缩，然后用分子筛层析柱进行分离纯化，得到重组纳米蛋白颗粒。

在其中一个实施例中，通过分子克隆技术将编码所述CRM-RBD重组蛋白的核苷酸序列插入大肠杆菌表达载体得到重组表达质粒，并通过热激活法转化大肠杆菌得到所述大肠杆菌重组表达菌。

在其中一个实施例中，所述大肠杆菌重组表达菌在30~37℃温度条件下培养至对数生长期，然后在25~37℃温度条件下用诱导剂诱导4~24小时，得到所述发酵液。

在其中一个实施例中，所述细胞破碎的方法选自于超声破碎和高压匀浆破碎中的一种或多种。

在其中一个实施例中，使用变性缓冲液将所述包涵体粗提物变性溶解，所述变性缓冲液由酸碱缓冲液和所述变性剂组成，所述变性缓冲液的pH值为6~9。

在其中一个实施例中，所述变性剂选自尿素和盐酸胍中的一种。

在其中一个实施例中，所述酸碱缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种。

本发明还提供了一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白，根据如上所述的制备方法制备得到，所述重组纳米蛋白颗粒的颗粒大小为10-20纳米。

在其中一个实施例中，所述重组纳米蛋白颗粒与铝佐剂配伍混匀后，能诱导机体产生针对新冠病毒原型株、贝塔变异株和德尔塔变异株的中和保护抗体。

在其中一个实施例中，所述重组纳米蛋白颗粒与铝佐剂配伍混匀后，能诱导机体产生针对新冠病毒特异性的细胞免疫反应。

在其中一个实施例中，所述重组纳米蛋白颗粒与铝佐剂配伍混匀后，能产生比单独RBD蛋白更强的体液免疫和细胞免疫。

本发明构建了一种新型冠状病毒重组蛋白，并采用特定的制备方法制备得到重组蛋白纳米颗粒，从而具有同时针对新冠病毒原型株、贝塔变异株、德尔塔变异株的广谱中和抗原活性。新型冠状病毒重组蛋白CRM-RBD通过具有免疫佐剂效果的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白与RBD抗原结构蛋白进行融合设计形成，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，其中第1~193位为CRM197的功能区，第194~208位为两个蛋白的融合链接结构，第209~461位为SARS-CoV-2抗原结构蛋白（RBD）。CRM-RBD重组蛋白借助通过大肠杆菌表达后，采用特定的制备方法，可以有效提高蛋白的免疫活性，提高机体的体液免疫水平和细胞免疫水平。经过实验证明，将CRM-RBD重组蛋白通过大肠杆菌表达，层析柱分离、纯化、复性，最终制备得到具有良好免疫原性的具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白。

附图说明

图1为实施例1中CRM-RBD重组蛋白的纯化电泳图谱；其中， M：蛋白分子量Marker；1：诱导前菌液；2：诱导后菌液；3：破菌；4：破菌液上清；5：柱层析上样；6：柱层析洗脱；7：复兴前样品；8：复性后样品；9：分子筛上样；10：分子筛纯化；

图2为实施例1中所得具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白原液的粒径扫描图；

图3为实施例1中所得具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白原液的透射电镜照片；

图4为实施例2中所述中和抗体检测结果；

图5为实施例3中所述特异性细胞免疫检测结果；

图6为实施例4中所述中和抗体检测结果；

图7为实施例4中所述特异性细胞免疫检测结果；

图8为实施例5中所述中和抗体检测结果；

图9为实施例5中所述特异性细胞免疫检测结果；

图10为实施例6中所述抗原活性检测结果。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1 具有广谱中和活性新型冠状病毒重组蛋白的制备

（1）将核苷酸序列SEQ ID NO：2，通过Xho I和Nco I两个酶切位点将所合成的基因插入pET28a大肠杆菌表达质粒，得到重组表达质粒。将所得重组表达质粒通过42度热激活法转入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，并通过LB固体培养基平皿进行单克隆筛选，得到表达目的蛋白的重组大肠杆菌单克隆菌落，挑取重组大肠杆菌单克隆菌落至5毫升LB液体培养基37℃过夜培养，即得重组大肠杆菌活化液。

（2）取步骤（1）所得重组大肠杆菌活化液，按体积比1：100的比例接种于5毫升LB液体培养基37℃培养过夜培养。将过夜培养后的菌液按体积比1：100的比例接种于新鲜的LB液体培养基中，37℃培养菌体OD₆₀₀至0.6，加入1毫摩尔/升异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，在30℃条件下诱导表达4小时。

（3）用离心机在6000转/分钟条件下离心20分钟收集步骤（2）诱导表达后的菌落沉淀，所得菌落沉淀用破菌缓冲液以1：20的质量体积比重悬，并用超音仪超声破碎菌落细胞壁，超声破碎后的菌液用离心机12000 转/分钟离心30分钟收集破菌沉淀。

（4）步骤（3）所得破菌沉淀用变性液溶解，12000 转/分钟离心30分钟收集上清。所得上清液用5毫升柱体积（CV）的CaptoS阳离子层析柱进行纯化，层析条件如下：先用5个CV的变性液平衡层析柱，然后上样至层析柱中，再用5个CV的变性液平衡层析柱，最后用阶梯洗脱的方式洗脱得到重组蛋白纯化液，纯化结果如图1所示。

（5）将步骤（4）所得重组蛋白纯化液置于含有10千道尔顿膜包的切向流透析装置中用换相液进行透析换相，换相后的蛋白溶液浓缩8倍后，用300m毫升柱体积的Superdex200pg分子筛层析柱进行纯化，纯化条件如下：先用换相液平衡层析柱，然后上样15毫升至层析柱中，再用平衡液平衡层析柱，收取UV280第二个峰所对应的蛋白溶液即得具有广谱中和活性新型冠状病毒重组蛋白原液。纯化结果如图1所示。

（6）取步骤（5）所得具有广谱中和活性新型冠状病毒重组蛋白原液室温静置平衡10min后，取1ml用Zetasizer pro激光粒度仪在动态光散射（DLS）下测量蛋白粒径大小，结果如图2所示，所得蛋白颗粒平均直径为9.55nm。

（7）取步骤（5）所得具有广谱中和活性新型冠状病毒重组蛋白原液滴加在铜网载膜上，滴上1%浓度的磷钨酸负染液，染色1-2min后用滤纸吸去负染液，再用去离子水清洗铜网1～2次，再用滤纸吸去水，待干燥后置于透射电镜下观察。结果如图3所示，电镜下看以看到分布均匀的直径10nm左右的蛋白颗粒。

所述LB液体培养基配方：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，加水溶解定容至1升。

所述LB固体培养基配方：胰化蛋白胨10克，酵母提取物5克，氯化钠10克，琼脂粉15克，加水定容至1升。

所述破菌缓冲液配方：三羟甲基氨基甲烷1.21克，氯化钠17.75克，加水溶解定容至1升，调节pH值至8.0。

所述变性液配方：三羟甲基氨基甲烷1.21克，尿素480g，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0。

所述洗脱液配方：三羟甲基氨基甲烷1.21克，氯化钠58.44克，尿素480g，加水溶解定容至1升，调节pH值至7.0。

所述换相液配方：甘氨酸1.5克，乙二胺四乙酸二钠1.48克，聚山梨酯80 0.2g，加水溶解定容至1升，调节pH值至9.5。

所述CaptoS、Superdex200pg为市售商品化填料。

实施例2 具有广谱中和活性新型冠状病毒重组蛋白诱导机体产生广谱中和抗体

（1）按照实施例1的制备方法制备得到具有广谱中和活性新型冠状病毒重组CRM-RBD蛋白，与铝佐剂混合配伍制备得到含有50微克/毫升蛋白、0.5毫克/毫升铝佐剂的疫苗样品。

（2）取4周龄Babl/c小鼠，分成实验组及对照组，每组6只。实验组免疫1毫升疫苗样品，对照组免疫0.5毫克/毫升的铝佐剂。共免疫三针，免疫间隔28天。在末次免疫两周后采集血清。

（4）将小鼠血清倍比稀释（1:40-1:5120），分别与新型冠状病毒稀释液（1000 半数细胞感染数（TCID50）/毫升）按体积1:1混合，37度孵育1小时。

（5）取步骤（3）中的病毒抗体混合液，按100uL/孔加至长满单层Vero E6细胞的96孔细胞培养板中，并补充等体积的病毒维持液，每个血清稀释度设置8个复孔。同时设立无病毒、无血清和空白组作为阴性对照，37度、5%CO₂条件下培养7天，观察细胞病变状况。按Reed-Muench两氏法计算抗体血清效价。

结果如图4所示：与对照组比，实验组小鼠血清具有明显的分别针对新冠病毒原型株、贝塔株及德尔塔株中和活性，且对新冠病毒原型株、贝塔株及德尔塔株的中和抗体水平差异不显著，表明所得新型冠状病毒重组蛋白具有广谱中和活性。

实施例3 具有广谱中和活性新型冠状病毒重组蛋白诱导机体产生广谱的特异性细胞免疫

（1）按照实施例1的制备方法制备得到具有广谱中和活性新型冠状病毒重组CRM-RBD蛋白，与铝佐剂混合配伍制备得到含有50微克/毫升蛋白、0.5毫克/毫升铝佐剂的疫苗样品。

（2）取4周龄Babl/c小鼠，分成实验组及对照组，每组6只。实验组免疫1毫升疫苗样品，对照组免疫0.5毫克/毫升的铝佐剂。共免疫三针，免疫间隔28天。在末次免疫两周后采集血清。

（3）取Babl/c小鼠脾脏制备细胞悬液，用红细胞裂解液红细胞，PBS清洗两次，用10% FBS 1640培养基重悬，淋巴细胞计数。稀释至淋巴细胞数为5×10⁶个/毫升。每孔加100微升细胞，分别用新冠病毒原型株、贝塔株及德尔塔株的RBD混合肽库作为刺激物，每只小鼠细胞作复孔，按照试剂盒说明书检测每只小鼠脾淋巴细胞中特异性分泌IFN-γ的效应T细胞数。

（4）结果如图5所示，所得新型冠状病毒重组亚单位蛋白疫苗可以有效诱导机体产生针对新冠病毒原型株、贝塔株及德尔塔株的特异性细胞免疫反应。

实施例4融合抗原的比较

（1）按照实施例1的制备方法制备得到具有广谱中和活性新型冠状病毒重组CRM-RBD蛋白，同时将SEQ ID NO：3插入大肠杆菌表达系统按照实施例1的制备方法制备RBD蛋白。分别将CRM-RBD蛋白和RBD蛋白与铝佐剂混合配伍制备得到含有50微克/毫升蛋白、0.5毫克/毫升铝佐剂的疫苗样品。

（2）取4周龄Babl/c小鼠，分成CRM-RBD组、RBD组及对照组，每组6只。CRM-RBD组免疫1毫升CRM-RBD蛋白疫苗样品， RBD组免疫1毫升RBD蛋白疫苗样品，对照组免疫0.5毫克/毫升的铝佐剂。共免疫三针，免疫间隔28天。在末次免疫两周后采集血样和脾脏。

（3）将小鼠血清按1:5000稀释，分别加入等体积的1:1000稀释的不同变异株（包括原型株、贝塔株及德尔塔株）的辣根过氧化物酶标记的RBD蛋白混匀，37℃孵育25分钟，每孔加入100微升，37℃孵育15分钟，洗板5次显色终止，用酶标仪在450nm吸光度下读板值（OD450），同时以稀释液作为阴性对照。以血清抗体竞争性抑制RBD-HRP与ACE-2蛋白的亲和力作为来检测中和抗体活性，计算公式如下：抑制率=（1-血清样品OD450÷阴性对照OD450）×100%。结果显示：CRM-RBD组可以显著提升RBD蛋白的中和抗体水平（图6所示）。

（4）按照实施例3步骤（3）的方法，检测CRM-RBD组、RBD组及对照组小鼠的特异性细胞免疫反应。结果显示：CRM-RBD组可以显著提升RBD蛋白的特异性细胞免疫水平（图7所示）。

实施例5重组蛋白表达方式比较

（1）将SEQ ID NO：3插入大肠杆菌表达系统按照实施例1的制备方法制备RBD蛋白，同时购买市售的CHO细胞表达的RBD蛋白（CHO-RBD）和293细胞表达的RBD蛋白（293-RBD）。分别将RBD蛋白、CHO-RBD蛋白以及293-RBD，分别与铝佐剂混合配伍制备得到含有50微克/毫升蛋白、0.5毫克/毫升铝佐剂的疫苗样品。

（2）取4周龄Babl/c小鼠，分成RBD蛋白组、CHO-RBD蛋白组、293-RBD组及对照组，每组6只。RBD蛋白组、CHO-RBD蛋白组、293-RBD组免疫1毫升蛋白疫苗样品，对照组免疫0.5毫克/毫升的铝佐剂。共免疫三针，免疫间隔28天。在末次免疫两周后采集血样和脾脏。

（3）按照实施例4步骤（3）的方法检测血清抗体的中和活性。结果如图8所示， RBD蛋白组、CHO-RBD蛋白组、293-RBD组均产生了较高的中和抗体。

（4）按照实施例3步骤（3）的方法检测小鼠的特异性细胞免疫反应，结果如图9显示， RBD蛋白组可以产生特异性细胞免疫反应，而CHO-RBD蛋白组、293-RBD组无法产生特异性细胞免疫反应。

实施例6换相液配方筛选

（1）按照实施例1的制备方法制备得到重组蛋白纯化液。

（2）将步骤（1）所得重组蛋白纯化液置于含有10千道尔顿膜包的切向流透析装置中分别用换相液1和换相液2进行透析换相，换相后的蛋白溶液浓缩8倍后，用300m毫升柱体积的Superdex200pg分子筛层析柱进行纯化，得到重组蛋白原液。

（3）取步骤（2）所述换相液1和换相液2透析换相所得重组蛋白原液室温静置平衡10min后，取1ml用Zetasizer pro激光粒度仪在动态光散射（DLS）下测量蛋白粒径大小。结果显示：换相液1和换相液2所得蛋白纳米粒大小差别较大，换相液1所得蛋白纳米颗粒平均大小为45nm，换相液2所得蛋白纳米颗粒平均大小为9.5nm。

（4）所得复性蛋白稀释至0.1mg/mL，用PBS稀释液按1:2-1:256进行倍比稀释；各稀释度样品依次加入预包被ACE2受体蛋白的酶标板孔中，100微升/孔，每个稀释样品加两孔，同时在酶标板的另外孔中设立阴性孔2个，并留2孔作空白调零孔，放入37℃培养0.5小时，洗板4次加入稀释度为酶标抗体， 37℃培养0.5小时，洗板4次；显色液，置于酶标仪在450nm波长下，用空白孔调零后检测吸光度A值，以阴性对照孔平均A值的2.1倍作为阈值，以大于阈值的最大稀释倍数作为蛋白抗原活性效价。结果显示：换相液1所得蛋白抗原活性为16，换相液2所得蛋白抗原活性为256。吐温80的加入明显提高了蛋白的抗原活性（图10）。

所用换相液配方如下：

换相液1：甘氨酸1.5克，乙二胺四乙酸二钠1.48克，加水溶解定容至1升，调节pH值至9.5。

换相液2：甘氨酸1.5克，乙二胺四乙酸二钠1.48克，聚山梨酯80 0.2g，加水溶解定容至1升，调节pH值至9.5。

综上所述，本发明构建了一种新型冠状病毒重组蛋白CRM-RBD，并采用特定的制备方法制备得到重组蛋白纳米颗粒，从而具有同时针对新冠病毒原型株、贝塔变异株、德尔塔变异株的广谱中和抗原活性。CRM-RBD重组蛋白借助通过大肠杆菌表达后，采用特定的制备方法，可以有效提高蛋白的免疫活性，提高机体的体液免疫水平和细胞免疫水平。

以下为序列信息：

SEQ ID NO：1：

GADDVVDSSKSFVMENFSSYHGTKPGYVDSIQKGIQKPKSGTQGNYDDDWKEFYSTDNKYDAAGYSVDNENPLSGKAGGVVKVTYPGLTKVLALKVDNAETIKKELGLSLTEPLMEQVGTEEFIKRFGDGASRVVLSLPFAEGSSSVEYINNWEQAKALSVELEINFETRGKRGQDAMYEYMAQACAGNRVRRGGGGSGGGGSGGGGSNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLE

SEQ ID NO：2：

GGCGCAGACGACGTAGTAGATTCTAGCAAATCCTTCGTTATGGAGAACTTCAGCTCTTATCACGGCACCAAACCAGGCTACGTAGACTCCATCCAGAAAGGTATCCAGAAGCCGAAATCTGGTACTCAAGGCAACTATGATGATGACTGGAAAGAGTTCTACAGCACCGATAACAAATACGATGCAGCGGGTTACTCTGTGGATAACGAGAACCCGCTGTCCGGCAAAGCAGGTGGTGTGGTTAAAGTAACCTATCCAGGCCTGACTAAAGTGCTGGCGCTGAAAGTGGACAACGCGGAAACCATCAAGAAAGAGCTGGGTCTGAGCCTGACTGAGCCGCTGATGGAACAGGTTGGCACCGAAGAGTTCATCAAGCGTTTCGGCGATGGTGCTTCCCGTGTGGTACTGAGCCTGCCATTTGCTGAAGGTTCTAGCTCTGTTGAGTACATTAACAACTGGGAACAAGCGAAAGCCCTGTCCGTAGAGCTGGAAATCAACTTCGAGACTCGCGGTAAACGTGGTCAAGATGCTATGTACGAATACATGGCACAGGCGTGCGCTGGCAACCGTGTACGTCGTGGTGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTTCTAACATCACCAACCTGTGCCCGTTTGGCGAAGTGTTTAACGCAACCCGCTTTGCAAGCGTCTATGCATGGAACCGTAAACGTATTAGCAACTGTGTGGCCGATTATTCAGTTCTGTATAACAGCGCGAGCTTTTCTACCTTTAAATGTTATGGTGTGAGTCCGACCAAACTGAACGATCTGTGTTTTACCAATGTCTATGCAGATAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAAGTTCGTCAGATTGCACCGGGTCAGACCGGTAAAATTGCAGATTATAATTATAAACTGCCTGATGATTTTACCGGTTGTGTTATTGCCTGGAATTCAAATAATCTGGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAATTATCTGTATCGTCTGTTTCGCAAAAGTAATCTGAAACCGTTTGAACGTGATATTAGCACGGAAATTTATCAGGCCGGTTCCACACCGTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGCTATTTTCCGCTGCAGAGCTATGGTTTTCAGCCGACCAATGGTGTTGGTTATCAGCCGTATCGTGTTGTTGTTCTGAGTTTTGAACTGCTGCATGCCCCGGCGACCGTTTGTGGTCCGAAAAAGAGCACCAATCTGGTTAAAAATAAATGTGTTAACTTTAACTTTAACGGTCTGACCGGTACCGGTGTTCTGACCGAAAGCAATAAAAAGTTTCTGCCGTTTCAGCAGTTTGGTCGCGATATTGCAGATACCACAGATGCAGTTCGTGATCCGCAGACGCTGGAA

SEQ ID NO：3：

ATGGGCGCAGACGACGTAGTAGATTCTAGCAAATCCTTCGTTATGGAGAACTTCAGCTCTTATCACGGCACCAAACCAGGCTACGTAGACTCCATCCAGAAAGGTATCCAGAAGCCGAAATCTGGTACTCAAGGCAACTATGATGATGACTGGAAAGAGTTCTACAGCACCGATAACAAATACGATGCAGCGGGTTACTCTGTGGATAACGAGAACCCGCTGTCCGGCAAAGCAGGTGGTGTGGTTAAAGTAACCTATCCAGGCCTGACTAAAGTGCTGGCGCTGAAAGTGGACAACGCGGAAACCATCAAGAAAGAGCTGGGTCTGAGCCTGACTGAGCCGCTGATGGAACAGGTTGGCACCGAAGAGTTCATCAAGCGTTTCGGCGATGGTGCTTCCCGTGTGGTACTGAGCCTGCCATTTGCTGAAGGTTCTAGCTCTGTTGAGTACATTAACAACTGGGAACAAGCGAAAGCCCTGTCCGTAGAGCTGGAAATCAACTTCGAGACTCGCGGTAAACGTGGTCAAGATGCTATGTACGAATACATGGCACAGGCGTGCGCTGGCAACCGTGTACGTCGTGGTGGTGGCGGTTCTGGCGGTGGTGGTAGCGGTGGTGGTGGTTCTAACATCACCAACCTGTGCCCGTTTGGCGAAGTGTTTAACGCAACCCGCTTTGCAAGCGTCTATGCATGGAACCGTAAACGTATTAGCAACTGTGTGGCCGATTATTCAGTTCTGTATAACAGCGCGAGCTTTTCTACCTTTAAATGTTATGGTGTGAGTCCGACCAAACTGAACGATCTGTGTTTTACCAATGTCTATGCAGATAGCTTTGTTATTCGTGGTGATGAAGTTCGTCAGATTGCACCGGGTCAGACCGGTAAAATTGCAGATTATAATTATAAACTGCCTGATGATTTTACCGGTTGTGTTATTGCCTGGAATTCAAATAATCTGGATAGCAAAGTGGGTGGTAATTATAATTATCTGTATCGTCTGTTTCGCAAAAGTAATCTGAAACCGTTTGAACGTGATATTAGCACGGAAATTTATCAGGCCGGTTCCACACCGTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGCTATTTTCCGCTGCAGAGCTATGGTTTTCAGCCGACCAATGGTGTTGGTTATCAGCCGTATCGTGTTGTTGTTCTGAGTTTTGAACTGCTGCATGCCCCGGCGACCGTTTGTGGTCCGAAAAAGAGCACCAATCTGGTTAAAAATAAATGTGTTAACTTTAACTTTAACGGTCTGACCGGTACCGGTGTTCTGACCGAAAGCAATAAAAAGTTTCTGCCGTTTCAGCAGTTTGGTCGCGATATTGCAGATACCACAGATGCAGTTCGTGATCCGCAGACGCTGGAA

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 浙江普康生物技术股份有限公司

杭州医学院

<120> 一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 461

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Ala Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn

1 5 10 15

Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln

20 25 30

Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp

35 40 45

Asp Trp Lys Glu Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly

50 55 60

Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val

65 70 75 80

Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val

85 90 95

Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu

100 105 110

Pro Leu Met Glu Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly

115 120 125

Asp Gly Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser

130 135 140

Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser

145 150 155 160

Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp

165 170 175

Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg

180 185 190

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

195 200 205

Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg

210 215 220

Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val

225 230 235 240

Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys

245 250 255

Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn

260 265 270

Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile

275 280 285

Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro

290 295 300

Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp

305 310 315 320

Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys

325 330 335

Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln

340 345 350

Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe

355 360 365

Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln

370 375 380

Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala

385 390 395 400

Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys

405 410 415

Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu

420 425 430

Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala

435 440 445

Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu

450 455 460

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggcgcagacg acgtagtaga ttctagcaaa tccttcgtta tggagaactt cagctcttat 60

cacggcacca aaccaggcta cgtagactcc atccagaaag gtatccagaa gccgaaatct 120

ggtactcaag gcaactatga tgatgactgg aaagagttct acagcaccga taacaaatac 180

gatgcagcgg gttactctgt ggataacgag aacccgctgt ccggcaaagc aggtggtgtg 240

gttaaagtaa cctatccagg cctgactaaa gtgctggcgc tgaaagtgga caacgcggaa 300

accatcaaga aagagctggg tctgagcctg actgagccgc tgatggaaca ggttggcacc 360

gaagagttca tcaagcgttt cggcgatggt gcttcccgtg tggtactgag cctgccattt 420

gctgaaggtt ctagctctgt tgagtacatt aacaactggg aacaagcgaa agccctgtcc 480

gtagagctgg aaatcaactt cgagactcgc ggtaaacgtg gtcaagatgc tatgtacgaa 540

tacatggcac aggcgtgcgc tggcaaccgt gtacgtcgtg gtggtggcgg ttctggcggt 600

ggtggtagcg gtggtggtgg ttctaacatc accaacctgt gcccgtttgg cgaagtgttt 660

aacgcaaccc gctttgcaag cgtctatgca tggaaccgta aacgtattag caactgtgtg 720

gccgattatt cagttctgta taacagcgcg agcttttcta cctttaaatg ttatggtgtg 780

agtccgacca aactgaacga tctgtgtttt accaatgtct atgcagatag ctttgttatt 840

cgtggtgatg aagttcgtca gattgcaccg ggtcagaccg gtaaaattgc agattataat 900

tataaactgc ctgatgattt taccggttgt gttattgcct ggaattcaaa taatctggat 960

agcaaagtgg gtggtaatta taattatctg tatcgtctgt ttcgcaaaag taatctgaaa 1020

ccgtttgaac gtgatattag cacggaaatt tatcaggccg gttccacacc gtgtaatggt 1080

gttgaaggtt ttaattgcta ttttccgctg cagagctatg gttttcagcc gaccaatggt 1140

gttggttatc agccgtatcg tgttgttgtt ctgagttttg aactgctgca tgccccggcg 1200

accgtttgtg gtccgaaaaa gagcaccaat ctggttaaaa ataaatgtgt taactttaac 1260

tttaacggtc tgaccggtac cggtgttctg accgaaagca ataaaaagtt tctgccgttt 1320

cagcagtttg gtcgcgatat tgcagatacc acagatgcag ttcgtgatcc gcagacgctg 1380

gaa 1383

<210> 3

<211> 1386

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggcgcag acgacgtagt agattctagc aaatccttcg ttatggagaa cttcagctct 60

tatcacggca ccaaaccagg ctacgtagac tccatccaga aaggtatcca gaagccgaaa 120

tctggtactc aaggcaacta tgatgatgac tggaaagagt tctacagcac cgataacaaa 180

tacgatgcag cgggttactc tgtggataac gagaacccgc tgtccggcaa agcaggtggt 240

gtggttaaag taacctatcc aggcctgact aaagtgctgg cgctgaaagt ggacaacgcg 300

gaaaccatca agaaagagct gggtctgagc ctgactgagc cgctgatgga acaggttggc 360

accgaagagt tcatcaagcg tttcggcgat ggtgcttccc gtgtggtact gagcctgcca 420

tttgctgaag gttctagctc tgttgagtac attaacaact gggaacaagc gaaagccctg 480

tccgtagagc tggaaatcaa cttcgagact cgcggtaaac gtggtcaaga tgctatgtac 540

gaatacatgg cacaggcgtg cgctggcaac cgtgtacgtc gtggtggtgg cggttctggc 600

ggtggtggta gcggtggtgg tggttctaac atcaccaacc tgtgcccgtt tggcgaagtg 660

tttaacgcaa cccgctttgc aagcgtctat gcatggaacc gtaaacgtat tagcaactgt 720

gtggccgatt attcagttct gtataacagc gcgagctttt ctacctttaa atgttatggt 780

gtgagtccga ccaaactgaa cgatctgtgt tttaccaatg tctatgcaga tagctttgtt 840

attcgtggtg atgaagttcg tcagattgca ccgggtcaga ccggtaaaat tgcagattat 900

aattataaac tgcctgatga ttttaccggt tgtgttattg cctggaattc aaataatctg 960

gatagcaaag tgggtggtaa ttataattat ctgtatcgtc tgtttcgcaa aagtaatctg 1020

aaaccgtttg aacgtgatat tagcacggaa atttatcagg ccggttccac accgtgtaat 1080

ggtgttgaag gttttaattg ctattttccg ctgcagagct atggttttca gccgaccaat 1140

ggtgttggtt atcagccgta tcgtgttgtt gttctgagtt ttgaactgct gcatgccccg 1200

gcgaccgttt gtggtccgaa aaagagcacc aatctggtta aaaataaatg tgttaacttt 1260

aactttaacg gtctgaccgg taccggtgtt ctgaccgaaa gcaataaaaa gtttctgccg 1320

tttcagcagt ttggtcgcga tattgcagat accacagatg cagttcgtga tccgcagacg 1380

ctggaa 1386

Claims (11)

1.一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述新型冠状病毒重组蛋白为CRM-RBD重组蛋白，所述CRM-RBD重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示，编码所述CRM-RBD重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，利用所述核苷酸序列通过以下步骤制备得到重组纳米蛋白颗粒：

将序列如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列插入表达载体并构建得到大肠杆菌重组表达菌；

培养所述大肠杆菌重组表达菌至对数生长期，用诱导剂诱导得到发酵液；

将所述发酵液通过细胞破碎和离心处理获得包涵体粗提物；

将所述包涵体粗提物用变性剂变性溶解，得到包涵体变性蛋白；

将所述包涵体变性蛋白用阳离子交换层析进行纯化，得到纯化重组蛋白；

用复性液对所述纯化重组蛋白进行液体置换复性，得到复性后蛋白；所述复性液含有2-6克/升甘氨酸、0.5~2克/升乙二胺四乙酸二钠和0.1-0.5克/升吐温-80，pH值为8.5~10；

对所述复性后蛋白进行超滤浓缩，然后用分子筛层析柱进行分离纯化，得到重组纳米蛋白颗粒。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，通过分子克隆技术将编码所述CRM-RBD重组蛋白的核苷酸序列插入大肠杆菌表达载体得到重组表达质粒，并通过热激活法转化大肠杆菌得到所述大肠杆菌重组表达菌。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述大肠杆菌重组表达菌在30~37℃温度条件下培养至对数生长期，然后在25~37℃温度条件下用诱导剂诱导4~24小时，得到所述发酵液。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述细胞破碎的方法选自于超声破碎和高压匀浆破碎中的一种或多种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，使用变性缓冲液将所述包涵体粗提物变性溶解，所述变性缓冲液由酸碱缓冲液和所述变性剂组成，所述变性缓冲液的pH值为6~9。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述变性剂选自尿素和盐酸胍中的一种。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述酸碱缓冲液选自磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和甘氨酸缓冲液中的一种。

8.一种具有广谱中和活性的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，根据权利要求1~7任一项所述的制备方法制备得到，所述重组纳米蛋白颗粒的颗粒大小为10-20纳米。

9.根据权利要求8所述的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，所述重组纳米蛋白颗粒与铝佐剂配伍混匀后，能诱导机体产生针对新冠病毒原型株、贝塔变异株和德尔塔变异株的中和保护抗体。

10.根据权利要求8所述的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，所述重组纳米蛋白颗粒与铝佐剂配伍混匀后，能诱导机体产生针对新冠病毒特异性的细胞免疫反应。

11.根据权利要求8所述的新型冠状病毒重组蛋白，其特征在于，所述重组纳米蛋白颗粒与铝佐剂配伍混匀后，能产生比单独RBD蛋白更强的体液免疫和细胞免疫。

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