CN113274491B - 一种用于猪流行性腹泻的rna疫苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建方法。其构建为通过选取猪源的5’UTR、3’UTR与毒株的S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，能够快速应对当前流行野毒株的PEDV新毒株，能够高效迅速地针对变异病毒，本发明制备的猪流行性腹泻的RNA疫苗成本低、生产效率高，且能同时诱导细胞免疫与体液免疫，所制备的脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的PEDV新毒株，尤其是变异强毒株，减少了新疫苗开发的研发及生产周期，为新变异强毒株的防控提供有效的技术手段。

Description

一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建方法

技术领域

本发明属于RNA疫苗的技术领域，具体涉及一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建方法。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是一种常见的、急性、高度流行性的猪肠道病毒传染病，病原为猪流行性腹泻病毒(PEDV)。该病主要临床症状是腹泻，包括水样腹泻，以及其它包括呕吐、厌食、脱水和体重降低等症状，临床变化和症状与猪传染性胃肠炎(TGE)，猪流行性腹泻是导致仔猪早期死亡的主要疫病之一。

1971年英国首次报道了该病，然后欧洲各国相继开始流行，我国于1976年首次对该病有了报道，从20世纪80年代后期开始，PED在中国各地区蔓延开来，并于1995年开始用二联灭活苗或弱毒苗进行猪流行性腹泻病毒和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的联合预防。

2000年在国内开始流行，从2006年初开始，PEDV疫苗的免疫效果越来越差，免疫过的猪群照常爆发PEDV。从2010年起，高致病变异毒株在中国暴发流行，导致PED的发病率和死亡率大幅升高，严重影响中国养猪生产。病毒分离及检测数据表明本次大流行是由于变异PEDV毒株引起的，南方流行的毒株在长期传播过程中经历逐渐的基因变异，这种情况也可能造成了国内疫苗免疫失效，而且PEDV发生的突变会更多地集中在S基因，个别毒株是疫苗弱毒株或野毒株与疫苗毒株的重组病毒。

目前世界范围PEDV主要分为四种类型：亚洲经典毒株、亚洲变异毒株、美洲INDELs毒株及美洲强毒力毒株。其中亚洲经典毒株和美洲INDELs毒株为弱毒力毒株；亚洲变异毒株和美洲强毒力毒株为强毒力毒株。美洲强毒力毒株被认为来源于亚洲变异毒株。美洲INDELs毒株非常特殊，是由美洲强毒力毒株的骨架和亚洲经典毒株的S基因重组产生。在此背景下，相关科研人员针对病原及其疫苗开展了大量研究工作，也为PED的防控提供了理论依据。

早期对PED的防控主要采用组织灭活苗，但组织灭活苗病毒含量较低，免疫持久性不强，往往需要多次免疫，因此不利于规模化养殖场的大群免疫；有多种疫苗包括细胞灭活苗、弱毒疫苗以及亚单位疫苗等对毒株均有较好的免疫效果，但是PED之所以能在全球流行并给养殖户造成巨大经济损失，正是因为PEDV毒株基因型种类繁多且易发生基因变异，使得毒株毒力增强，因此现有疫苗难以发挥保护作用。国内猪流行性腹泻病毒毒株不仅已发生变异，形成新的毒株，而且毒株间存在基因差异，形成基因源多样性，这些因素都可以造成疫苗失效和疫病流行。传统的灭活苗和弱毒苗的研制需要一定的周期，疫苗的研发速度往往赶不上病毒的变异速度。临床上急需针对当前流行野毒株的PEDV新毒株疫苗。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建方法，通过选取猪源的5’UTR、3’UTR与毒株的S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，能够快速应对当前流行野毒株的PEDV新毒株。

本发明的技术内容如下：

本发明提供了一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗，所述RNA疫苗为采用含有5’UTR、猪流行性腹泻病毒的S蛋白、终止密码子、3’UTR以及polyA核酸的序列合成；

所述疫苗还包括纳米脂质颗粒，所述纳米脂质颗粒包裹RNA疫苗；

所述纳米脂质颗粒包括BHEM-Chol、PEG5k-b-PLGA11k、PLGA11k聚合物的混合物；

所述5’UTR、3’UTR的序列选取自猪源的猪血红蛋白或猪白蛋白，所选序列的同源性在50％～100％；

所述5’UTR、3’UTR分别选自三组不同的猪血红蛋白，其核酸序列分别为序列表SEQID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的三组；

所述5’UTR、3’UTR的三组序列选自GenBank中NCBI参考序列XM_21086967.1、XM_021086966.1、M_001005208.1；

所述猪流行性腹泻病毒的S蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，其核酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；

所述RNA疫苗的核酸序列包括如序列表SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ IDNO.11所示；

所述终止密码子，为TGA、TAA、TAG的自由组合，个数为1-10个；

所述polyA中的碱基A的个数为1-200个。

本发明还提供了一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗的构建方法，包括如下步骤：

选取5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸，所述RNA疫苗的核酸序列如序列表SEQ ID NO.9、SEQID NO.10、SEQ ID NO.11所示；

所述RNA疫苗包括由脂质纳米颗粒载体包裹，所述脂质纳米颗粒的制备原料包括聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k和BHEM-Chol；

所述脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的操作为：将RNA疫苗核酸溶液与BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k混合，超声得到油相-水相的初乳液，加入无核酸酶水再超声乳化得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的有机溶液去除，浓缩，即得到脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗；

所述RNA疫苗核酸溶液为RNA疫苗核酸使用无核酸酶水溶解得到；

所述BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k使用之前分别溶于色谱级三氯甲烷溶液中。

本发明的有益效果如下：

本发明的用于猪流行性腹泻的RNA疫苗，能够高效迅速地针对变异病毒，猪流行性腹泻的RNA疫苗成本低、生产效率高，且能同时诱导细胞免疫与体液免疫，所制备的脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗能够快速应对当前流行野毒株的PEDV新毒株，尤其是变异强毒株，减少了新疫苗开发的研发及生产周期，为新变异强毒株的防控提供有效的技术手段；

本发明的用于猪流行性腹泻的RNA疫苗的构建，选取猪源的5’UTR、3’UTR与毒株的S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列串联，得到RNA疫苗，采用脂质纳米颗粒作为RNA疫苗的运送载体，且脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗的使用能够高效表达，利用了纳米脂质体作为载体进行递送，脂质纳米颗粒具有核酸包封率高，能够有效转染，组织穿透性增强，细胞毒性和免疫原性低等特点，所述RNA疫苗可做到无细胞生产、且生产时无需导入有毒化学品，受微生物污染的机会也相对较低，RNA疫苗的安全性相对较高。

附图说明

图1为转录纯化后的RNA疫苗核酸的凝胶电泳图；

图2为脂质体颗粒包裹RNA疫苗的体外表达试验SDS-PAGE以及Western blot结果图；

图3为脂质体颗粒包裹RNA疫苗的抗体水平检测结果图；

图4为脂质体颗粒包裹RNA疫苗中和抗体滴度的测定结果图。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

若无特殊说明，本发明的所有原料和试剂均为常规市场的原料、试剂。

实施例

一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建：

1)重组菌构建：

选取5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列进行人工合成RNA疫苗的DNA于pUC57载体上，无缝克隆于pUC57的EcoRV酶切位点，并转化大肠杆菌DH5α，获得PEDV-S-pUC57-DH5α；

所述S蛋白可选用来自PEDV的其他毒株，也可以是S蛋白中的一段氨基酸序列或具有50-100％同源性的氨基酸序列，操作与上相同，在此不作重复赘述；

2)重组质粒

将获得的重组菌进行摇菌，按照常规方法提取质粒，参照质粒抽提试剂盒(E.Z.N.Plasmid MiniprEppendorf Kit I)说明书进行：

取菌液于1.5mL Ep管中12000r/min离心30s，弃上清；

加250μL溶液Ⅰ/RNase A，充分重悬菌泥；

加250μL溶液Ⅱ，颠倒4～6次混匀，室温作用2min至溶液变成澄清；

加350μL溶液Ⅲ，颠倒4～6次混匀以形成白色沉淀；

转移上清至DNA吸附柱中，室温静置2min。之后12000r/min离心1min，弃液；

加入500μL的Buffer HB，12000r/min离心1min，弃液；

加入750μL的DNA Wash Buffer，12000r/min离心1min，弃液，重复该步骤一次，再空管12000r/min离心1min；

移至新的1.5mLEp管中，加入50～100μL的TE室温下放置2min，12000r/min离心1min，洗脱的质粒于-20℃保存备用，取少量于1.0％琼脂糖凝胶中低压电泳检测质粒效果。

3)酶切线性化、纯化

对重组质粒进行QuickCut MluI酶切，酶切反应体系见表1，如下：

表1酶切反应体系

将上述成分加入0.5mL的EP管中，混匀，37℃酶切15min。纯化试剂盒进行纯化回收线性化重组质粒。

根据OMEGA公司的Cycle-pure纯化试剂盒使用说明书，线性化质粒进行纯化回收，方法如下：

(1)将线性化质粒收集在一个1.5ml的EP管中；

(2)加入6倍体积的Buffer CP于装有PCR产物的EP管中，小心混匀；

(3)将上述混合液全部加至试剂盒配的有滤膜的管HiBind spin-column中，10000r/min离心1min，弃去离心出来的溶液；

(4)加入700μL SPW Buffer，等待2～3min，10000r/min离心1min，弃去离心出来的溶液；

(5)重复步骤(4)；

(6)空管10000r/min离心1min；

(8)弃去下面的离心管，将柱子放入新的干净的1.5mL离心管中，在柱子中央加入50μL DNA Elution Buffer，室温下放置2min，10000r/min离心1min，收集离心管中的液体即为回收的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测后即用或-20℃冰箱保存备用。提高洗脱液的温度至55℃～80℃，有利于提高DNA的洗脱效率。

4)体外转录

采用体外转录试剂盒(mMESSAGE mMACHINE^TMT7 ULTRA Transcription Kit)对线性化的质粒进行体外转录。

5)纯化

采用纯化试剂盒(MEGA clear^TMTranscription Clean-Up Kit)对转录的产物进行纯化处理，即得RNA疫苗(mRNA)。

取来自猪源XM_21086967.1、XM_021086966.1、M_001005208.1序列的非翻译区的三组5’UTR、3’UTR，按照以上5个步骤制备成RNA疫苗核酸，并进行凝胶电泳鉴定，如图1所示。

6)脂质纳米颗粒的制备

6.1)将-80℃冰箱保存的聚合物PEG_5k-b-PLGA_11k，PLGA_11k和BHEM-Chol取出，平衡到室温后在干燥环境下开封，分别以60.0mg/mL，38.5mg/mL和21.0mg/mL的浓度溶于色谱级三氯甲烷溶液中；

6.2)将-80℃冰箱保存的mRNA溶液在冰上融化，使用无核酸酶水(DEPC水)调整其浓度为4mg/mL，在50mL无菌离心管中，依次加入25μL mRNA(0.1mg)，100μL BHEM-Chol(2mg)，350μLPEG_5k-b-PLGA_11k(21.875mg)和50μL PLGA_11k(1.925mg)；

6.3)将该离心管置于冰水中，超声探头用DEPC水冲洗后放入离心管的溶液中，在80W功率和冰水浴条件下，以超声5s停2s的方式超声乳化溶液60s，得到油相-水相的初乳液。随后，将5mLDEPC水沿管壁加入到初乳液中，并在同样条件下，以超声10s停2s的方式再次乳化60s，形成水相-油相-水相的复乳液；

6.4)将复乳液转移到DEPC处理并高压过的无菌无核酸酶100mL圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在低温条件下缓慢地减压旋蒸以除去乳液中的三氯甲烷，并浓缩其水溶液体积到1mL左右，制备好的脂质纳米颗粒包裹的mRNA转移到1.5mL EP管中保存于4C冰箱中待用。

7)检测细胞转染后的PEDV-S-mRNA脂质体表达情况：

1、取24孔板，接种PK-15细胞(200000个细胞/孔)，采用含10％血清无抗培养基培养18小时；

2、当细胞贴壁融合度约达60％时，在转染前一小时更换为无血清的Opti-MEM培养基，转染脂质纳米颗粒PEDV-S-mRNA(1μg RNA/孔)，培养6小时；

3、将培养基替换为新鲜的培养基，培养42小时。

4、1000g离心10min，收集上清液。

取上清液，进行非还原型SDS-PAGE，然后进行Western blot。Western blot采用的一抗为抗S蛋白的鼠源单克隆抗体，二抗为抗鼠源抗体。

如图2所示，表明脂质纳米颗粒PEDV-S-mRNA能够在PK-15细胞上高效表达，该方法制备的猪流行性腹泻RNA疫苗具有良好的应用前景。

8)PEDV-S-mRNA疫苗免疫小鼠及其抗体的测定

将6-8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为5组(每组5只)：PEDV-S-mRNA1组、PEDV-S-mRNA2组、PEDV-S-mRNA3组、商品灭活疫苗组、空白对照组。采用肌内免疫，试验第1天进行初次免疫，试验第28天进行加强免疫，PEDV-S-mRNA中的各组组每次免疫剂量相同，均为20g，体积为200L，商品灭活疫苗组注射剂量也为200L、空白注射组注射等体积的PBS(pH7.2，0.01M)。分别在二免14天后进行尾部采血，收集血清，用间接ELISA法测定抗体水平。如图3所示，结果显示PEDV-S-mRNA1、PEDV-S-mRNA2、PEDV-S-mRNA3实验组产生的抗体水平高于商品化的灭活疫苗。

9)血清中和试验中中和效价及抗体滴度的测定

对第42d的血清进行血清中和试验，结果显示PEDV-S-mRNA1、PEDV-S-mRNA2、PEDV-S-mRNA3实验组及商品化灭活疫苗组的中和抗体效价均显著高于PBS对照组。其中PEDV-S-mRNA1、PEDV-S-mRNA2、PEDV-S-mRNA3实验组中的中和抗体效价与灭活疫苗组相当，如下表所示：

表2疫苗中和抗体效价表

由图4可见，抗体滴度测定试验中PEDV-S-mRNA1、PEDV-S-mRNA2、PEDV-S-mRNA3实验组及商品化灭活疫苗组中和抗体滴度均高于2⁴，表明本发明制备的猪流行性腹泻RNA疫苗可以起到很好的保护作用，为PEDV的防控提供了有效的技术手段。

序列表

<110> 广州源博医药科技有限公司

<120> 一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗及其构建方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 62

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 1

ggctcaggcc ctcgcagccc cgcacgcttc tggtcccgac ccagactcag aaagaaccca 60

cc 62

<210> 2

<211> 117

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 2

gctggagcct cggagatccc cgccccgggg tggggccctc ttgcactctg cacacccccc 60

cttgcaccct gacctcctga tcgttgaata aagcctgagt gggctgcagt ctctgta 117

<210> 3

<211> 412

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 3

gtgtgcccag ccttagggcc acagcggggg gcacgtgctg atttgccccc ttcgctcctc 60

aggagagcgc ggccggggcc tagggacttc aacgggtaga acctggggcg aggataccac 120

ttccgggggg aaggtggacg cggcgggcgg gaagcagccg gtgggaagga gacgccccgg 180

cccgagtctc cgggttccgc cacagcctgg gagccaagcg cccgccgccc agccggtcgc 240

agacagtgcg tcgcgcgccc cctgccgtct gaaggccgct gcgcatcccg gcccgcgcca 300

gccaatgagc acggcgccgg cgggcgtgcc cctcgagccc caagcataaa ggctcaggcc 360

ctcgcagccc cgcacgcttc tggtcccgac ccagactcag aaagaaccca cc 412

<210> 4

<211> 117

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 4

gctggagcct cggagatccc cgccccgggg tggggccctc ttgcactctg cacacccccc 60

cttgcaccct gacctcctga tcgttgaata aagcctgagt gggctgcagt ctctgta 117

<210> 5

<211> 39

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 5

accttttctc ttctatcaac cccacaagcc tttggcaca 39

<210> 6

<211> 188

<212> DNA

<213> Sequence Artificial

<400> 6

acaacacagt gacaagcatc tcagactacc ctgagaataa gagaaagaga aatgaagacc 60

tagacttatc catctctttt tcttttctgt tggttttaaa ccaacaccct gtctaaagta 120

cacaaatttc tttaaatatt ttgcctcttt tctctgtgct acaattaata aaaaaatgaa 180

aagaatct 188

<210> 7

<211> 1385

<212> PRT

<213> Sequence Artificial

<400> 7

Met Lys Ser Leu Thr Tyr Phe Trp Leu Phe Leu Pro Val Leu Ser Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Ser Ala Asn Thr Asn Phe

20 25 30

Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val

35 40 45

Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr

50 55 60

Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile

65 70 75 80

Phe Leu Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser

85 90 95

Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala

100 105 110

Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe

115 120 125

Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Thr Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr

130 135 140

Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu

145 150 155 160

His Ser Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe

165 170 175

Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser Arg Val

180 185 190

Ala Thr Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr

195 200 205

Glu Pro Thr Tyr Tyr Met Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly

210 215 220

Ile Ser Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn Cys Ile Gly Tyr Ala Ala Asn

225 230 235 240

Val Phe Ala Thr Glu Pro Asn Gly His Ile Pro Glu Gly Phe Ser Phe

245 250 255

Asn Asn Trp Phe Leu Leu Ser Asn Asp Ser Thr Leu Val His Gly Lys

260 265 270

Val Val Ser Asn Gln Pro Leu Leu Val Asn Cys Leu Leu Ala Ile Pro

275 280 285

Lys Ile Tyr Gly Leu Gly Gln Phe Phe Ser Phe Asn Gln Thr Ile Asp

290 295 300

Gly Val Cys Asn Gly Ala Ala Val Gln Arg Ala Pro Glu Ala Leu Arg

305 310 315 320

Phe Asn Ile Asn Asp Thr Ser Val Ile Leu Ala Glu Gly Ser Ile Val

325 330 335

Leu His Thr Ala Leu Gly Thr Asn Phe Ser Phe Val Cys Ser Asn Ser

340 345 350

Ser Asp Pro His Leu Ala Thr Phe Ala Ile Pro Leu Gly Ala Ile Gln

355 360 365

Val Pro Tyr Tyr Cys Phe Leu Lys Val Asp Thr Tyr Asn Ser Thr Val

370 375 380

Tyr Lys Phe Leu Ala Val Leu Pro Pro Thr Val Arg Glu Ile Val Ile

385 390 395 400

Thr Lys Tyr Gly Asp Val Tyr Val Asn Gly Phe Gly Tyr Leu His Leu

405 410 415

Gly Leu Leu Asp Ala Val Thr Val Asn Phe Thr Gly His Gly Thr Asp

420 425 430

Asp Asp Val Ser Gly Phe Trp Thr Ile Ala Ser Thr Asn Phe Val Asp

435 440 445

Ala Leu Ile Glu Val Gln Gly Thr Ala Ile Gln Arg Ile Leu Tyr Cys

450 455 460

Asp Asp Pro Val Ser Gln Leu Lys Cys Ser Gln Val Ser Phe Asp Leu

465 470 475 480

Asp Asp Gly Phe Tyr Pro Ile Ser Ser Thr Asn Leu Leu Ser His Glu

485 490 495

Gln Pro Thr Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe

500 505 510

Val Asn Ile Thr Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn

515 520 525

Leu Ile Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val

530 535 540

Asp Thr Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Gly Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu

565 570 575

Gln Ser Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr

580 585 590

Ser Leu Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu

595 600 605

Phe Gly Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys

610 615 620

Gly Glu Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val Thr Asp

625 630 635 640

Val Ser Phe Met Thr Leu Asp Val Cys Thr Lys Tyr Thr Ile Tyr Gly

645 650 655

Phe Lys Gly Glu Gly Ile Ile Thr Leu Thr Asn Ser Ser Phe Leu Ala

660 665 670

Gly Phe Tyr Tyr Thr Ser Asp Ser Gly Gln Leu Leu Ala Phe Lys Asn

675 680 685

Val Thr Ser Gly Ala Val Tyr Ser Val Thr Pro Cys Ser Phe Ser Glu

690 695 700

Gln Ala Ala Tyr Val Asp Asp Asp Ile Val Gly Val Ile Ser Ser Leu

705 710 715 720

Ser Ser Ser Thr Phe Asn Ser Thr Arg Glu Leu Pro Gly Phe Phe Tyr

725 730 735

His Ser Asn Asp Gly Ser Asn Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser

740 745 750

Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser Gly Ser Ile Gly Tyr Val Pro Ser Gln

755 760 765

Ser Gly Gln Val Lys Ile Ala Pro Thr Val Thr Gly Asn Ile Ser Ile

770 775 780

Pro Thr Asn Phe Ser Met Ser Ile Arg Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Tyr

785 790 795 800

Asn Thr Pro Val Ser Val Asp Cys Ala Thr Tyr Val Cys Asn Gly Asn

805 810 815

Ser Arg Cys Lys Gln Leu Leu Thr Gln Tyr Thr Ala Ala Cys Lys Thr

820 825 830

Ile Glu Ser Ala Leu Gln Leu Ser Ala Arg Leu Glu Ser Ala Glu Val

835 840 845

Asn Ser Met Leu Thr Ile Ser Glu Glu Ala Leu Gln Leu Ala Thr Ile

850 855 860

Ser Ser Phe Asn Gly Asp Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Val Leu Gly Val

865 870 875 880

Ser Val Tyr Asp Pro Ala Ser Gly Arg Val Val Gln Lys Arg Ser Phe

885 890 895

Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Val Thr Asn Gly Leu Gly Thr

900 905 910

Val Asp Glu Asp Tyr Lys Arg Cys Ser Asn Gly Arg Ser Val Ala Asp

915 920 925

Leu Val Cys Ala Gln Tyr Tyr Ser Gly Val Met Val Leu Pro Gly Val

930 935 940

Val Asp Ala Glu Lys Leu His Met Tyr Ser Ala Ser Leu Ile Gly Gly

945 950 955 960

Met Val Leu Gly Gly Phe Thr Ala Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ser Tyr

965 970 975

Ala Val Gln Ala Arg Leu Asn Tyr Leu Ala Leu Gln Thr Asp Val Leu

980 985 990

Gln Arg Asn Gln Gln Leu Leu Ala Glu Ser Phe Asn Ser Ala Ile Gly

995 1000 1005

Asn Ile Thr Ser Ala Phe Glu Ser Val Lys Glu Ala Ile Ser Gln Thr

1010 1015 1020

Ser Lys Gly Leu Asn Thr Val Ala His Ala Leu Thr Lys Val Gln Glu

1025 1030 1035 1040

Val Val Asn Ser Gln Gly Ala Ala Leu Thr Gln Leu Thr Val Gln Leu

1045 1050 1055

Gln His Asn Phe Gln Ala Ile Ser Ser Ser Ile Asp Asp Ile Tyr Ser

1060 1065 1070

Arg Leu Asp Ile Leu Ser Ala Asp Val Gln Val Asp Arg Leu Ile Thr

1075 1080 1085

Gly Arg Leu Ser Ala Leu Asn Ala Phe Val Ala Gln Thr Leu Thr Lys

1090 1095 1100

Tyr Thr Glu Val Gln Ala Ser Arg Lys Leu Ala Gln Gln Lys Val Asn

1105 1110 1115 1120

Glu Cys Val Lys Ser Gln Ser Gln Arg Tyr Gly Phe Cys Gly Gly Asp

1125 1130 1135

Gly Glu His Ile Phe Ser Leu Val Gln Ala Ala Pro Gln Gly Leu Leu

1140 1145 1150

Phe Leu His Thr Val Leu Val Pro Gly Asp Phe Val Asn Val Ile Ala

1155 1160 1165

Ile Ala Gly Leu Cys Val Asn Asp Glu Ile Ala Leu Thr Leu Arg Glu

1170 1175 1180

Pro Gly Leu Val Leu Phe Thr His Glu Leu Gln Asn Thr Ala Thr Glu

1185 1190 1195 1200

Tyr Phe Val Ser Ser Arg Arg Met Tyr Glu Pro Arg Lys Pro Thr Val

1205 1210 1215

Gly Asp Phe Val Gln Ile Glu Ser Cys Val Val Thr Tyr Val Asn Leu

1220 1225 1230

Thr Arg Asp Gln Leu Pro Asp Val Ile Pro Asp Tyr Ile Asp Val Asn

1235 1240 1245

Lys Thr Leu Asp Glu Ile Leu Ala Ser Leu Pro Asn Arg Thr Gly Pro

1250 1255 1260

Ser Leu Ser Leu Asp Val Phe Asn Ala Thr Tyr Leu Asn Leu Thr Gly

1265 1270 1275 1280

Glu Ile Ala Asp Leu Glu Gln Arg Ser Glu Ser Leu Arg Asn Thr Thr

1285 1290 1295

Glu Glu Leu Gln Ser Leu Ile Tyr Asn Ile Asn Asn Thr Leu Val Asp

1300 1305 1310

Leu Glu Trp Leu Asn Arg Val Glu Thr Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Trp

1315 1320 1325

Val Trp Leu Ile Ile Phe Ile Val Leu Ile Phe Val Val Ser Leu Leu

1330 1335 1340

Val Phe Cys Cys Ile Ser Thr Gly Cys Cys Gly Cys Cys Gly Cys Cys

1345 1350 1355 1360

Gly Ala Cys Phe Ser Gly Cys Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gln Pro Tyr

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<400> 11

accttttctc ttctatcaac cccacaagcc tttggcacaa tgaagtcttt aacctacttc 60

tggttgttct taccagtact ttcaacactt agcctaccac aagatgtcac caggtgctca 120

gctaacacta attttaggcg gttcttttca aaatttaatg ttcaggcgcc tgcagttgtt 180

gtactgggcg gttatctacc tattggtgaa aaccagggtg tcaattcaac ttggtactgt 240

gctggccaac atccaactgc tagtggcgtt catggtatct ttcttagcca tattagaggt 300

ggtcatggct ttgagattgg catttcgcaa gagccttttg accctagtgg ttaccagctt 360

tatttacata aggctactaa cggtaacact aatgctactg cgcgactgcg catttgccag 420

tttcctagca ttaaaacatt gggccccact gctaataatg atgttacaac aggtcgtaac 480

tgcctattta acaaagccat cccagctcat atgagtgaac atagtgttgt cggcataaca 540

tgggataatg atcgtgtcac tgtcttttct gacaagatct attattttta ttttaaaaat 600

gattggtccc gtgttgcgac aaagtgttac aacagtggag gttgtgctat gcaatatgtt 660

tacgaaccca cctattacat gcttaatgtt actagtgctg gtgaggatgg tatttcttat 720

caaccctgta cagctaattg cattggttat gctgccaatg tatttgctac tgagcccaat 780

ggccacatac cagaaggttt tagttttaat aattggtttc ttttgtccaa tgattccact 840

ttggtgcatg gtaaggtggt ttccaaccaa ccattgttgg tcaattgtct tttggccatt 900

cctaagattt atggactagg ccaatttttc tcctttaatc aaacgatcga tggtgtttgt 960

aatggagctg ctgtgcagcg tgcaccagag gctctgaggt ttaatattaa tgacacctct 1020

gtcattcttg ctgaaggctc aattgtactt catactgctt taggaacaaa tttttctttt 1080

gtttgcagta attcctcaga tcctcactta gccaccttcg ccatacctct gggtgctatc 1140

caagtaccct attattgttt tcttaaagtg gatacttaca actccactgt ttataaattc 1200

ttggctgttt tacctcctac cgtcagggaa attgtcatca ccaagtatgg tgatgtttat 1260

gtcaatgggt ttggctactt gcatcttggt ttgttggatg ctgtcacagt taatttcact 1320

ggtcatggca ctgacgatga cgtttctggt ttttggacca tagcatcgac taattttgtt 1380

gatgcactta tcgaagttca aggaactgcc attcagcgta ttctttattg tgatgatcct 1440

gttagccaac tcaagtgttc tcaggtttca tttgaccttg acgatggttt ttaccccatt 1500

tcctctacaa accttctgag tcatgaacag ccaacttctt ttgttacttt gccatcattt 1560

aatgatcatt cttttgttaa tattactgtc tctgctgctt ttggtggtca tagtggtgcc 1620

aaccttattg catctgacac tactatcaat gggtttagtt ctttctgtgt tgacactaga 1680

caatttacca tttcactgtt ttataatgtt acaaacagtt atggttatgt gtctaaatca 1740

caggacagta attgcccttt caccttgcaa tctgttaatg attacctgtc ttttagcaaa 1800

ttttgtgttt ctaccagcct tttggctagt gcctgtacca tagatctctt tggttaccct 1860

gagtttggta gtggtgttaa gttcacgtcc ctttactttc aattcacaaa gggtgagttg 1920

attactggca cgcctaaacc acttgaaggt gttacggacg tttcttttat gactctggat 1980

gtgtgtacca agtatactat ctatggcttt aaaggtgagg gtatcattac ccttacaaat 2040

tctagctttt tggcaggttt ttattataca tctgattctg gacagttgtt agcttttaag 2100

aatgtcacta gtggtgctgt ttattctgtt acgccatgtt ctttttcaga gcaggctgca 2160

tatgttgatg atgatatagt gggtgttatt tctagtttgt ctagctccac ttttaacagt 2220

actagggagt tgcctggttt cttctaccat tctaatgatg gctctaattg tacagagcct 2280

gtgttggtgt atagtaacat aggtgtttgt aaatctggca gtattggcta cgtcccatct 2340

cagtctggcc aagtcaagat tgcacccacg gttactggga atattagtat tcccaccaac 2400

tttagtatga gtattaggac agaatattta cagctttaca acacgcctgt tagtgttgat 2460

tgtgctacat atgtttgtaa tggtaactct cgttgtaaac aattactcac ccagtacact 2520

gcagcatgta agaccataga gtcagcatta caactcagcg ctaggcttga gtctgctgaa 2580

gtcaactcta tgcttactat ttctgaagag gctctacagt tagctaccat cagttcgttt 2640

aatggtgatg gatataattt tactaatgtg ctgggtgttt ccgtgtatga ccctgcaagt 2700

ggcagggtgg tacaaaaaag gtctttcatt gaagacctgc tttttaataa agtggttact 2760

aatggccttg gtactgttga tgaagactat aagcgctgtt ctaatggccg ctctgtggca 2820

gatttagtct gtgcgcagta ttactctggt gtcatggtac tacctggtgt tgttgacgct 2880

gagaagcttc atatgtatag tgcgtctctc atcggtggta tggtgctagg aggttttact 2940

gcagcagcgg cattgccttt tagctatgct gttcaagcga gactcaatta tcttgcttta 3000

cagacggatg ttctacagcg gaaccagcaa ttgcttgctg agtcttttaa ttctgctatt 3060

ggtaatataa cttcagcctt tgagagtgtt aaagaggcta ttagtcaaac ttctaagggt 3120

ttgaacactg tggctcatgc gcttactaag gtccaagagg ttgttaattc gcagggtgca 3180

gctttgaccc aacttaccgt acagctgcaa cacaacttcc aagccatttc tagttctatt 3240

gatgacattt actcccgact tgacattctt tcagccgatg ttcaggtaga ccgtctcatc 3300

accggcagat tatcagcact taatgctttt gttgctcaaa cccttactaa gtatactgag 3360

gttcaggcta gcaggaaact agcacagcaa aaggttaatg agtgcgttaa atcgcaatct 3420

cagcgttacg gtttttgtgg tggtgatggc gagcacattt tctctctggt acaggccgca 3480

cctcaaggcc tgctgttctt acacacagta cttgtaccgg gtgattttgt aaatgttatt 3540

gccatcgctg gcttatgtgt taacgatgaa attgccctga ctctacgtga gcctggctta 3600

gtcttgttta cgcatgaact tcaaaatact gcgacggaat attttgtttc atcgcgacgt 3660

atgtatgaac ctagaaaacc taccgttggt gattttgttc aaattgagag ttgtgtggtc 3720

acctatgtca atttgactag agaccaacta ccagatgtaa tcccagatta catcgatgtt 3780

aacaaaacac ttgatgagat tttagcttct ctgcccaata gaactggtcc aagtctttct 3840

ctagatgttt ttaatgccac ttatcttaat cttactggtg aaattgcaga tttagagcag 3900

cgttcagagt ctctccgtaa tactacagaa gagcttcaaa gtcttatata taatatcaac 3960

aacacactag ttgaccttga gtggctcaac cgagttgaga catatatcaa gtggccgtgg 4020

tgggtttggt tgattatttt tattgttctc atctttgttg tgtcattact agtgttctgc 4080

tgcatttcca cgggttgttg tggatgctgc ggctgctgtg gtgcttgttt ttcaggttgt 4140

tgtaggggtc ctagacttca accttacgaa gcttttgaaa aggtccacgt gcagtgatga 4200

acaacacagt gacaagcatc tcagactacc ctgagaataa gagaaagaga aatgaagacc 4260

tagacttatc catctctttt tcttttctgt tggttttaaa ccaacaccct gtctaaagta 4320

cacaaatttc tttaaatatt ttgcctcttt tctctgtgct acaattaata aaaaaatgaa 4380

aagaatctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4440

aaaaaaaaaa aaaaaaaa 4458

Claims (1)

1.一种用于猪流行性腹泻的RNA疫苗的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

a）选取5’UTR、3’UTR、S蛋白、终止密码子、polyA核酸序列合成RNA疫苗的核酸序列构建于载体上，转染到细菌得到重组菌，将重组菌进行质粒提取得到重组质粒，将重组质粒进行酶切、转录、纯化得到RNA疫苗核酸，所述RNA疫苗核酸的序列如序列表SEQ ID NO.9、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.11之一所示；

b）使用脂质纳米颗粒包裹RNA疫苗核酸：步骤为将RNA疫苗核酸溶液与BHEM-Chol、PEG_5k-b-PLGA_11k、PLGA_11k混合，超声得到油相-水相的初乳液，加入无核酸酶水再超声乳化得到水相-油相-水相的复乳液，将复乳液中的有机溶液去除，浓缩，即得到脂质纳米颗粒包裹的RNA疫苗。